JP5992135B2 - 連続発酵による乳酸の製造方法 - Google Patents
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Description
2 分離膜エレメント
3 水頭差制御装置
4 気体供給装置
5 攪拌機
6 レベルセンサ
7 培地供給ポンプ
8 pH調整溶液供給ポンプ
9 pHセンサ・制御装置
10 温度調節器
11 発酵液循環ポンプ
12 膜分離槽
13 支持板
14 流路材
15 分離膜
16 凹部
17 集水パイプ
18 分離膜束
19 上部樹脂封止層
20 下部樹脂封止層
21 支持フレーム
22 集水パイプ
条件
探針:SiNカンチレバー(Digital Instruments(株)製)
走査モード コンタクトモード(気中測定)
水中タッピングモード(水中測定)
走査範囲:10μm、25μm 四方(気中測定)
5μm、10μm 四方(水中測定)
走査解像度:512×512
試料調製:測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに15分浸漬後、RO水中に24時間浸漬し洗浄した後、風乾する。
・チロシン要求性:tyr1
・イソロイシン、バリン要求性:ilv1、ilv2、ilv3、ilv5
・フェニルアラニン要求性:pha2
・グルタミン酸要求性:GLU3
・トレオニン要求性thr1、thr4
・アスパラギン酸要求性:asp1、asp5
・セリン要求性:ser1、ser2
・アルギニン要求性:arg1、arg3、arg4、arg5、arg8、arg9、arg80、arg81、arg82、arg84
・ウラシル要求性:ura1、ura2、ura3、ura4、ura6
・アデニン要求性:ade1、ade2、ade3、ade4、ade5、ade6、ade8、ade9、ade12、ADE15
・リシン要求性:lys1、lys2、lys4、lys5、lys7、lys9、lys11、lys13、lys14
・トリプトファン要求性:trp1、trp2、trp3、trp4、trp5
・ロイシン要求性:leu1、leu2、leu3、leu4、leu5
・ヒスチジン要求性:his1、his2、his3、his4、his5、his6、his7、his8。
サッカロマイセス・セレビセNBRC10505株にアフリカツメガエル由来のL−乳酸脱水素酵素遺伝子(以下、XLDHとも言う。)を導入して得られた乳酸を生産する能力を有する酵母を高次倍数体化することで、乳酸を生産する能力を有する高次倍数体酵母を作成した。さらに、以下で詳しく説明するように、栄養要求性の復帰や、温度感受性変異の性質を付与した。高次倍数体酵母を作成するために用いた酵母と、以下に説明する方法で作成した酵母を表2に示す。以下に、LDHの挿入、温度感受性変異の付与、栄養要求性の復帰方法について詳細な手順を説明する。
XLDH(配列番号1)のクローニングはPCR法により行った。PCRには、アフリカツメガエルの腎臓由来cDNAライブラリー(STRATAGENE社製)より付属のプロトコールに従い調製したファージミドDNAを鋳型とした。
pTRS102を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド(配列番号4,5)をプライマーセットとしたPCRにより、XLDH及びTDH3ターミネーター配列を含む1.3kbのPCR断片を増幅した。ここで配列番号4は、PDC1遺伝子の開始コドンから上流60bpに相当する配列が付加されるようデザインした。
SED1遺伝子座への導入は、参考例1で作製したpTRS102を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド(配列番号5,9)をプライマーセットとしたPCRにより、アフリカツメガエル由来のLDH遺伝子及びTDH3ターミネーター配列を含む1.3kbのPCR断片を増幅した。ここで配列番号9は、SED1遺伝子の開始コドンから上流60bpに相当する配列が付加されるようデザインした。
TDH3遺伝子座への導入は、pTRS102のTDH3ターミネーターをADH1ターミネーターに変更したプラスミドを作製した。
温度感受性変異の付与は、特開2008−048726号公報に記載されている、pdc5遺伝子に温度感受性変異を有する酵母SW015株と、温度感受性変異を付与したい酵母とを接合させることによって得た。該2倍体酵母を子嚢形成培地で子嚢形成させ、マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得し、それぞれ一倍体細胞についての栄養要求性を調べることで、取得した一倍体細胞の中から、PDC1遺伝子、SED1遺伝子、TDH1遺伝子座のいずれかにXLDHが挿入され、かつ、PDC5遺伝子に温度感受性変異を有する(34℃で生育不能)株を選択した。
つづいて、栄養要求性の復帰方法を説明する。
リジン要求性を復帰させる場合には以下の方法を用いた。フナコシ社製のBY4741のゲノムDNA を鋳型とし、オリゴヌクレオチド(配列番号21,22)をプライマーセットとしたPCRにより、LYS2遺伝子の前半約2kbのPCR断片を増幅させた。上記のPCR断片を1%アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、形質転換操作を行い、LYS2遺伝子のアンバー変異を解除した。リジン非添加培地で培養することにより、リジン合成能が復帰した形質転換株を選択した。
ロイシン要求性を復帰させる場合には、以下の方法を用いた。プラスミドPRS425 を鋳型とし、オリゴヌクレオチド(配列番号23,24)をプライマーセットとしたPCRにより、LEU2遺伝子のPCR断片約2kbを増幅させた。上記のPCR断片を1%アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、形質転換操作を行い、LEU2遺伝子の変異を解除した。ロイシン非添加培地で培養することにより、ロイシン合成能が復帰した形質転換株を選択した。
アデニン要求性を復帰させる場合には、以下の方法を用いた。プラスミドPRS422 を鋳型とし、オリゴヌクレオチド(配列番号25,26)をプライマーセットとしたPCRにより、ADE2遺伝子のPCR断片約2kbを増幅させた。上記のPCR断片を1%アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、形質転換操作を行い、ADE2遺伝子の変異を解除した。アデニン非添加培地で培養することにより、アデニン合成能が復帰した形質転換株を選択した。
ウラシル要求性を復帰させる場合には、以下の方法を用いた。プラスミドpRS426を鋳型とし、オリゴヌクレオチド(配列番号27,28)をプライマーセットとしたPCRにより、URA3遺伝子のPCR断片約2kbを増幅させた。上記のPCR断片を1%アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、形質転換操作を行い、URA3遺伝子の変異を解除した。ウラシル非添加培地で培養することにより、ウラシル合成能が復帰した形質転換株を選択した。
その1〜9の方法を組み合わせて得られた形質転換体を接合させ、栄養要求性のない2倍体原栄養株を得た。さらに2倍体原栄養株を子嚢形成培地で子嚢形成させ、マイクロマニピュレーターで子嚢を解剖し、それぞれの一倍体細胞を取得した。取得した一倍体細胞の栄養要求性を調べ、SD培地(表1)で生育した株について、栄養要求性が復帰したと判断し、1倍体原栄養株とした。
乳酸は、培養液の遠心上清について、以下の条件でHPLC法により乳酸量を測定することで確認した。
移動相:5mM p−トルエンスルホン酸(流速0.8mL/min)
反応液:5mM p−トルエンスルホン酸、20mM ビストリス、0.1mM EDTA・2Na(流速0.8mL/min)
検出方法:電気伝導度
温度:45℃。
移動相 :1mM 硫酸銅水溶液
流速:1.0ml/min
検出方法 :UV254nm
温度:30℃。
光学純度(%)=100×(L−D)/(L+D)
ここで、LはL−乳酸の濃度、DはD−乳酸の濃度を表す。
樹脂としてポリフッ化ビニリデン(PVDF)樹脂を、また溶媒としてN,N−ジメチルアセトアミド(DMAc)をそれぞれ用い、これらを90℃の温度下に十分に攪拌し、下記組成を有する原液を得た。
[原液]
・PVDF:13.0重量%
・DMAc:87.0重量%。
[凝固浴]
・水 :30.0重量%
・DMAc:70.0重量%。
重量平均分子量41.7万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ38重量%と62重量%の割合で170℃の温度で溶解し、原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度20℃のγ-ブチロラクトン80重量%水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
参考例1で作製した酵母HI003株を用いて、図1の連続発酵装置と表3に示す組成のSC4培地によって乳酸の製造を行った。培地は、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には、上記の参考例3で作製した多孔性膜を用いた。
・発酵反応槽容量:2(L)
・膜分離槽容量:0.5(L)
・使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜(参考例3)
・膜分離エレメント有効濾過面積:60cm2
・温度調整:32(℃)
・発酵反応槽通気量:0.05(L/min)
・膜分離槽通気量:0.3(L/min)
・発酵反応槽攪拌速度:100(rpm)
・pH調整:8N Ca(OH)2によりpH5に調整
・乳酸発酵培地供給速度:50〜300ml/hr.の範囲で可変制御
・発酵液循環装置による循環液量:0.1(L/min)
・膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(膜間差圧:0.1kPa〜20kPa未満で制御)
・分離膜エレメントを含む培養槽は121℃、20minのオートクレープにより高圧蒸気滅菌。
参考例1で作製した酵母HI003株を用いて、図2に示す連続発酵装置と表3に示す組成のSC4培地を用い、乳酸の製造を行った。培地は、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメント部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。分離膜には上記の参考例3で作製した多孔性分離膜を用いた。
・発酵反応槽容量:2(L)
・使用分離膜:ポリフッ化ビニリデン濾過膜(参考例3)
・膜分離エレメント有効濾過面積:120cm2
・温度調整:32(℃)
・発酵反応槽通気量:0.05(L/min)
・乳酸発酵培地供給速度:50〜300ml/hr.の範囲で可変制御
・発酵反応槽攪拌速度:800(rpm)
・pH調整:8N Ca(OH)2によりpH5に調整
・膜透過水量制御:膜間差圧による流量制御
(膜間差圧:0.1kPa〜20kPa未満で制御)
・分離膜エレメントを含む培養槽は121℃、20minのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
分離膜に上記の参考例4で作成した多孔性膜を用いた以外は実施例1と同条件で実施、評価した。750時間の連続発酵試験を行った結果を表6に示す。本発明の乳酸の製造方法により、安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
分離膜に上記の参考例4で作成した多孔性分離膜を用いた以外は実施例2と同条件で実施評価した。770時間の発酵試験を行った結果を表6に示す。発明の乳酸の製造方法により安定した、乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
菌体を用いた発酵形態として最も典型的な回分発酵を行い、そのL−乳酸生産性を評価した。表3に示すSC4培地を用い、図1の膜分離型の連続発酵装置の発酵反応槽1のみを用いた回分発酵試験を行った。培地は、121℃の温度で15分間高圧蒸気滅菌して用いた。この比較例1でも、菌体として上記の参考例1で作成した酵母HI003株を用い、生産物である乳酸の濃度および培養液中の糖類の定量には、上記の参考例2に示したHPLCを用いた。
・発酵反応槽容量:2(L)
・温度調整:30(℃)
・発酵反応槽通気量:0.05(L/min)
・発酵反応槽攪拌速度:100(rpm)
・pH調整:8N Ca(OH)2によりpH5に調整
・培養槽は121℃、20minのオートクレーブにより高圧蒸気滅菌。
参考例1で作製した酵母HI003−1B株を用いた以外は、実施例1と同条件により評価した。その結果、600時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を表6に示す。この結果、高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
参考例1で作製した酵母HI003−1B株を用いた以外は、実施例2と同条件で実施評価した。その結果、600時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を表6に示す。この結果、高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
参考例1で作製した酵母HI003−1B株を用いた以外は、実施例3と同条件で実施評価した。その結果、500時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を表6に示す。この結果、高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
参考例1で作製した酵母HI003−1B株を用いた以外は、実施例4と同条件で実施評価した。その結果、500時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を表6に示す。この結果、高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
参考例1で作製した酵母SU014−3B株を用いた以外は実施例1と同条件で、実施、評価した。その結果、300時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を表6に示す。この結果、栄養非要求性酵母もしくは高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
参考例1で作製した酵母SU014−3B株を用いた以外は実施例2と同条件で、実施、評価した。その結果、280時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を表6に示す。この結果、栄養非要求性酵母もしくは高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
参考例1で作製した酵母SU014-3B株を用いた以外は実施例3と同条件で、実施、評価した。その結果、350時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を表6に示す。この結果、栄養非要求性酵母もしくは高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
参考例1で作製した酵母SU014−3B株を用いた以外は実施例4と同条件で、実施、評価した。その結果、270時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を表6に示す。この結果、栄養非要求性酵母もしくは高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
表4に記載の乳酸発酵培地を用いた以外は実施例1と同条件で実施評価した。800時間の発酵試験を行った結果を表7に示す。SC4培地よりも栄養源の少ない乳酸発酵培地も、本発明の乳酸の製造方法により、安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
表4に記載の乳酸発酵培地を用いた以外は実施例2と同条件で実施評価した。800時間の発酵試験を行った結果を表7に示す。SC4培地よりも栄養源の少ない乳酸発酵培地も、本発明の乳酸の製造方法により、安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
表4に記載の乳酸発酵培地を用いた以外は実施例3と同条件で実施評価した。800時間の発酵試験を行った結果を表7に示す。SC4培地よりも栄養源の少ない乳酸発酵培地も、本発明の乳酸の製造方法により、安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
表4に記載の乳酸発酵培地を用いた以外は実施例4と同条件で実施評価した。800時間の発酵試験を行った結果を表7に示す。SC4培地よりも栄養源の少ない乳酸発酵培地も、本発明の乳酸の製造方法により、安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
参考例1で作製した酵母SU014株を用いた以外は実施例5と同条件で実施、評価した。700時間の連続発酵試験を行った結果を表7に示す。栄養非要求性の高次倍数体酵母よりも乳酸対糖収率および乳酸生産速度においてやや劣るものの、長期間安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
参考例1で作製した酵母SU014株を用いた以外は実施例6と同条件で実施、評価した。700時間の発酵試験を行った結果を表7に示す。栄養非要求性の高次倍数体酵母よりも乳酸対糖収率および乳酸生産速度においてやや劣るものの、長期間安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
参考例1で作製した酵母SU014株を用いた以外は実施例7と同条件で実施、評価した。650時間の連続発酵試験を行った結果を表7に示す。栄養非要求性の高次倍数体酵母よりも乳酸対糖収率および乳酸生産速度においてやや劣るものの、長期間安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
参考例1で作製した酵母SU014株を用いた以外は実施例8と同条件で実施、評価した。670時間の発酵試験を行った結果を表7に示す。栄養非要求性の高次倍数体酵母よりも乳酸対糖収率および乳酸生産速度においてやや劣るものの、長期間安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
表4に示す乳酸発酵培地を用いた以外は、比較例1と同条件で実施、評価した。回分発酵の結果を表7に示す。発酵時間が短く、乳酸対糖収率、乳酸生産速度が本発明の実施例より劣っていた。
参考例1で作成したSU014株を用いた以外は、比較例2と同条件で実施、評価した。回分発酵の結果を表7に示す。発酵時間が短く、乳酸対糖収率、乳酸生産速度が本発明の実施例より劣っていた。
参考例1で作製した酵母SU014−3B株を用いた以外は実施例5と同条件で、実施、評価した。その結果、300時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を表7に示す。この結果、高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
参考例1で作製した酵母SU014−3B株を用いた以外は実施例6と同様に実施、評価した。その結果、280時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を表7に示す。この結果、高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
参考例1で作製した酵母SU014-3B株を用いた以外は実施例7と同様に実施、評価した。その結果、1倍体酵母の場合、350時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を表7に示す。この結果、高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
参考例1で作製した酵母SU014-3B株を用いた以外は実施例8と同様に実施、評価した。その結果、270時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を表7に示す。この結果、高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
膜分離エレメント有効濾過面積を240cm2に拡大し、表5に記載の乳酸発酵培地2を用いた以外は、実施例1と同条件で実施、評価した。1400時間の発酵試験を行った結果を図6〜8に示す。本発明の乳酸の製造方法により、長期間安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
膜分離エレメント有効濾過面積を240cm2に拡大し、表5に記載の乳酸発酵培地2を用いた以外は、実施例3と同条件で実施、評価した。1350時間の発酵試験を行った結果を図6〜8に示す。本発明の乳酸の製造方法により、長期間安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
参考例1で作製した酵母SE001株を用いた以外は、実施例13と同条件で実施、評価した。1350時間の発酵試験を行った結果を図9〜11に示す。本発明の乳酸の製造方法により、長期間安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
参考例1で作製した酵母SE001株を用いた以外は、実施例14と同条件で実施、評価した。1350時間の発酵試験を行った結果を図9〜11に示す。本発明の乳酸の製造方法により、長期間安定した乳酸の連続発酵による製造が可能であった。
参考例1で作製した酵母SU014-3B株を用いた以外は実施例13と同条件で、実施、評価した。その結果、300時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を図9〜11に示す。この結果、高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
参考例1で作製した酵母SU014-3B株を用いた以外は実施例14と同条件で、実施、評価した。その結果、280時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を図9〜11に示す。この結果、高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
参考例1で作製した酵母SE001−1A株を用いた以外は実施例15と同条件で、実施、評価した。その結果、300時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を図9〜11に示す。この結果、高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
参考例1で作製した酵母SE001−1A株を用いた以外は実施例16と同条件で、実施、評価した。その結果、270時間で膜間差圧が20kPa以上になり培養を終了した。その連続発酵試験結果を図9〜11に示す。この結果、高次倍数体酵母を用いた方が長期間安定して乳酸を製造できることが明らかになった。
Claims (9)
- 乳酸脱水素酵素遺伝子が導入された乳酸を生産する能力を有する高次倍数体かつ栄養非要求性である酵母の培養液を平均細孔径が0.01μm以上1μm未満の多孔性膜で濾過処理し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を該培養液に保持または還流し、かつ、発酵原料を該培養液に追加することを特徴とする連続発酵による乳酸の製造方法。
- 多孔性膜の膜間差圧を0.1kPa以上20kPa未満の範囲にして濾過処理することを特徴とする請求項1に記載の乳酸の製造方法。
- 高次倍数体酵母が2倍体であることを特徴とする請求項1または2に記載の乳酸の製造方法。
- 連続発酵の乳酸対糖収率が70%以上であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
- 連続発酵の培養液中の乳酸蓄積濃度が40g/L以上であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
- 連続発酵の乳酸生産速度が7.5g/L/h以上であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
- 連続発酵を400時間以上継続させることを特徴とする請求項4〜6のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
- 酵母がサッカロミセス(Saccharomyces)属に属することを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
- 酵母がサッカロミセス・セレビセ(Saccharomyces cerevisiae)であることを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
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