JP5979789B2 - 表面コーティング構造物及び方法 - Google Patents
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Description
i)材料の露出表面をIV型緑膿菌(P. aeruginosa)(T4P)ピリンのC末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィドループ及び前記ループのN末端側又はC末端側のいずれか又は両方上に0−10、好ましくは0−5の追加的残基を含む合成ペプチドと接触させ、ピリンペプチドを露出表面に共有結合させる工程、及び
ii)ペプチドを前記支持体に結合する前又は後に、化合物をピリンペプチドに直接的に又は間接的に共有結合させる工程、を含む。前記接触させる工程が、材料の露出した粒界領域に前記化合物を優先的に局在させてよい。
移植する前に、機器の露出表面を、
IV型緑膿菌(P. aeruginosa)(T4P)ピリンのC末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィドループ、及び
(ii)前記ループのN末端側又はC末端側のいずれか又は両方上に0−10、好ましくは0−5の追加的残基、及び
D−アミノ酸、L−及びD−アミノ酸の混合物、又はレトロインバーソ(RI)形態でのD−アミノ酸から構成されること、
を含む合成ピリンペプチドとコーティングすることを含む前記方法を含む。1つの好ましい実施態様においては、医療機器のコーティングを施した部分はステンレス鋼、スズ、鉄又はチタニウム表面である。
(i)IV型緑膿菌(P. aeruginosa)(T4P)ピリンのC末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィドループ、
(ii)前記ループのN末端又はC末端のいずれか又は両方上に0−10好ましくは0−5の追加的残基、及び
(iii)D−アミノ酸、L−及びD−アミノ酸の混合物、又はレトロインバーソ(RI)形態でのD−アミノ酸の構成、
を有する合成ピリンペプチドとコーティングすることを特徴とする前記機器を含む。露出表面はステンレス鋼、スズ、鉄又はチタニウム表面でよい。
(i)ステンレス鋼、スズ、鉄、チタニウム、クロム、プラスチック、ガラス、シリケート、セラミックス、及びその混合物から成る群から選択された材料から作られた固体担体を、IV型緑膿菌(P. aeruginosa)(T4P)ピリンのC末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィドルを含む、及び前記ループのN末端又はC末端のいずれか又は両方上に0−10好ましくは0−5の追加的残基を含む、合成ピリン・ペプチドに、切断リンカーを介して、目的ポリペプチドのN又はC末端にて、結合された目的ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含む組成物と接触させる工程、
(ii)、この接触させる工程により、固体支持体への融合タンパク質を付ける工程、
(iii)、固体担体を洗浄し、組成物中の非結合成分を除去する工程、
(iv)、融合タンパク質中のリンカーを切断するのに効果的な薬剤で、洗浄した固体担体を処理し、それにより、固体担体から無傷の形態の目的のポリペプチドを放出する工程、及び
(v)放出された目的のポリペプチドを固体担体から分離させる工程、
により、目的のポリペプチドを得る方法を含む。ピリン・ペプチドはアミノ酸形態を有してよく、好ましい配列は、上記に言及した。
「線毛(pilus)」は多くのバクテリアの表面で見つけられた細い付属器官である。
図1A−1Dは、シーケンス情報が利用可能な様々なバクテリアの属/種/株のジスルフィドループを含むC末端ピリンペプチド領域に関する配列を示す。所望の配列はジスルフィドループ配列(システイン残基(C)で始まり及び終了し、いくつかの場合、ループの一方の側に5までもしくはそれ以上の残基を含む)を含む。一文字の英字アミノ酸指示は標準規則によるものである。ペプチドの正常な酸化体では、ペプチドは、システイン残基間のジスルフィド架橋を含んでいる。
ある態様においては、本発明は、材料の腐食の速度を低減するために、露出した粒界領域を有する表面があるステンレス鋼、スズ、鉄又はチタニウム金属材料を処理するための改善された方法を含む。方法は、別々に又はパッシベーションのような多くの他の耐食方法のうちの1つと組み合わせて使用されてもよい。金属材料は、粒界領域を有する単一の露出面や複数の処理される外部表面を有し得、又は材料の外部表面からアクセス可能な空隙又は内部の網目を有してよい。理解されるように、この方法は、例えば、酸化雰囲気中で、又は塩基性か酸性の液体のような腐食性液体との接触によって、化学腐蝕にさらされるあらゆる、ステンレス鋼、スズ、鉄、又はチタニウム金属材料を処理するいずれの場合にも適している。
このセクションは、増加した耐食性に加えて、その耐食性を増強するために金属表面を処理するための典型的な方法、及び次のことを実施する発明をサポートするために行われた研究について記述する。
(i)処理した表面の低減した付着力、
(ii)処理した表面の改変した電子仕事関数、
(iii)処理した表面の増加した硬度、
(iv)低減したコンダクタンス、及び
(v)少なくとも2か月の期間にわたるコーティング安定性。
コーティング金属の改変された電子仕事関数及び増強された耐浸蝕性は、ピリン・ペプチドがコーティング表面の電子特性を変化させたことを示し、金属の自由電子軌道を変更させるペプチド及び金属の間の共有結合の形成を示唆する。この発見の追加的サポートは、このサブセクションの中で報告されるペプチド置換アッセイ及びX線光電子分光法(XPS)研究からもたらされる。
粒界は、多結晶体中の2つの粒子(又は晶子)間の境界である。粒界は結晶構造の欠陥で、材料の電気的及び熱伝導性を減少させる傾向がある。ほとんどの粒界中の高い界面エネルギー及び比較的弱い結合形成は、しばしばそれらに腐食の発現及び固形物から新しい相の沈殿のための好ましい部位を作る。
金属(ステンレス鋼)サンプルに結合する、ピリンペプチドのD形態及びRI形態の能力及びピリンコーティング材料の特性を検討するために、K122−4ピリンペプチドのD及びRI形態を合成し、同じピリンペプチドのL形態に対して試験した。ステンレス鋼プレートは、L形態ピリン・ペプチド(3つの異なるバッチ)、D形態ピリン又はRI形態ピリンでコーティングし、1枚のプレートはコーティングしなかった。
また、ピリン・ペプチド結合がコーティングした材料の硬度を増加することができる能力は、本発明の別の態様に従って、板ガラス又は自動車安全ガラスのような、他の硬い材料表面に利用することができる。この適用では、掃除されたガラス表面が、ピリンの層で表面をコーティングするのに効果的な条件の下にてピリン・ペプチドで接触される。支持体に結合したタンパク質の量をHRPアッセイを使用して、上記のように測定した。図16Bで見られるように、D形態ペプチドは、SDS処理によってでさえ除去に抵抗して、ガラス表面にしっかりと結合され、コントロール・ペプチドで行ったのより、ステンレス鋼ステントに結合されたピリン・ペプチドは約2倍であった。
このセクションは、検体に特異的な目標化合物(例えばレセプター)が発明に係るピリン・ペプチドを介して検出表面に付けられている診断装置への本発明の適用を考える。検出表面がピリン・ペプチドに共有結合で結合する金属である場合、下記に記載するように、金属表面と電子的相互作用を通じて、装置は電子バイオセンサー・モードで機能してよい。
(i)上記に詳述するように、支持体へのピリン・ペプチドの共有結合及びピリンへの直接的又は間接的化合物の共有結合、言い換えると、ピリン化合物複合体を介する、という手段で、本発明の本態様は、例えば、レセプターなどの化合物が支持体にて共有結合する金属支持体を含む。未結合ピリンペプチドについて上記に説明のように、コーティングした支持体は、最初に金属表面へ結合していないピリン・ペプチドを付着させること、続いて、結合ピリンへ化合物を共有結合することにより、あるいは最初にピリン化合物複合体を作り、続いて、金属表面へのその複合体を結合することにより、作成される。ピリン・ペプチドに化合物を共有結合で結合する方法は、例えば、アミン又はカルボキシル基を介して直接的な化学結合により、又は二官能基カップリング試薬を使用することによって行うなど、周知である。化合物がそれ自体ペプチドである場合、ピリン化合物複合体は組み換え又は固相合成によって融合タンパク質として形成することができる。コーティングした支持体は、金属表面へのピリン結合による改変された表面電子特性を有し、下記に詳述されるように、本発明を実証するために行なわれた試験は、表面結合化合物に検体関連分子が結合することにより、支持体表面を流れる電流が調整されることを示し、支持体にわたって流れる電流の変化によって、そのような結合態様を記録することを可能にする。以下に見られるように、化合物も、支持体に(例えばE/Kコイルド‐コイル複合体によって)共有結合で間接的に結合してよい。
図18Aと18Bは、発明の実施態様に従って構築されたバイオセンサー・アッセイ装置32を示す。装置は、金属検出プレート34上にピリン・ペプチド・コーティングで観察された、改変された電子特性の有益性を有する。すなわち、プレート34は、ステンレス鋼、スズ、鉄、又はチタニウムのような金属から作られ、ピリン・ペプチドによってコーティングされた場合、改変された電子表面性質を有する。上記のように、ピリン・コーティングは、プレート表面を上記のピリン・ペプチド36及び検体を結合する部分38の複合体にさらすことにより、又は結合した、非複合体ピリン・ペプチドに化合物を付けることにより形成される。プレートはそれ自体、その側面が装置中の壁40によって形成され、部分的に水性の導電媒体42で充填される浅いバイオセンサー反応容器41の下部表面を形成する。
図23Aと23Bは、プレート18を有する検体探知装置16を示し、そのプレートの上部の検出表面がピリン・ペプチド20及び検体‐特異的ターゲット分子22の複合体でコーティングされる。プレートはピリン・ペプチドが結合する様々な材料から作られてよいが、プレートは、好ましくは、ピリンがそれに共有結合で結合する、ステンレス鋼、スズ、鉄、及びチタニウム表面のような金属である。共有結合は、生産、タンパク質安定性、コーティング安定性の容易さの点から多くの利点を与える。また、装置は、25で示されるように検出表面を照らすために、例えばUV源のような、ビーム源24及び光検出器26を含む。
例えば、ステンレス鋼、スズ、鉄、及びチタニウム表面のような、ある金属表面に結合するペプチドついて、上記に記載の試験は、ペプチドと金属の間の共有結合の(電子共有)結合の形成を示して、ピリン・ペプチド結合が金属の表面の電子特性を改変することを実証する。この発見は、ステンレス鋼、スズ、鉄、及びチタニウム表面に、例えばペプチド、脂質、核酸、代謝産物、又は薬物分子のような、生物活性の分子を共有結合で結合するための方法及びピリン・ペプチドを介して、露出した機器の金属に共有結合で結合する生物活性化合物を有する新しい医療機器を提供する。
感染又は細胞の損傷/ストレスによって伝達した炎症に加えて、莫大な量の医原性の炎症は、医療機器類によって引き起こされる。非生物学的適合の医療機器へのヒト組織、細胞、及びタンパク質の露出は、臨床効果が非常に過小評価される、機能障害の宿主レスポンスを引き起こす。実施例は、組織反応、及び血管グラフト、人工関節及び他の移植可能な装置を含む医療用人工装具の挿入に続く機能障害の創傷治癒を含む。同様に、白血球及び凝固系の活性は、心肺バイパスと血液透析のような体外循環血液回路に定期的にさらされる患者に重大な罹患率をもたらす。これらのイベントは、さらに急性及び慢性疾患を持った患者の治癒、再生及びリハビリテーションに影響を与える。
(i)IV型緑膿菌(P. aeruginosa)(T4P)ピリンのC末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィド・ループ、
(ii)前記ループのN又はC末端側上のいずれかの0−10、好ましくは、0−5の、追加的残基、及び
(iii)D−アミノ酸、D、Lアミノ酸の混合物、又はレトロインバーソ(RI)形態でのD−アミノ酸から構成されること
を含む合成ピリン・ペプチドでコーティングされていることを特徴とする。
(i)IV型緑膿菌(T4P)ピリンのC末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィド・ループ、
(ii)ループのNあるいはC末端側のどちらか又は両方上の0−10、好ましくは、0−5の追加の残基、及び
(iii)D−アミノ酸、DとLアミノ酸の混合物、又はレトロインバーソ(RI)形態でのD−アミノ酸の構成
を有する合成ピリン・ペプチドで機器の露出表面をコーティングすることにより、対象内に移植された医療機器に対する炎症反応を防止する方法も含む。
Claims (12)
- ステンレス鋼、スズ、鉄、又はチタニウムから作られた支持体の露出表面の一以上に化合物を共有結合させる方法であって、前記支持体の露出表面を、IV型緑膿菌(P. aeruginosa)(T4P)ピリンのC末端レセプター結合タンパク質に由来するジスルフィドループ及び前記ループのN末端側又はC末端側のいずれか又は両方上に0−10の追加的残基を含む天然又は合成ピリンペプチドと、接触させる工程、それにより前記ピリンペプチドを前記露出表面に共有結合させる工程、及び
前記接触させる工程及び前記共有結合させる工程の前又は後に、前記化合物を前記ピリンペプチドに共有結合させる工程、を含む前記方法。 - 前記支持体表面が露出した粒界領域を有すること、及び前記接触させる工程が露出した粒界領域に前記化合物を優先的に局在させるために効果的であること、を特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ピリンペプチドがL−アミノ酸で作られることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ピリンペプチドがD−アミノ酸、L−及びD−アミノ酸の混合物、又はレトロインバーソ(RI)でのD−アミノ酸で作られることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ピリンペプチドが配列番号10として同定された配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ピリンペプチドが配列番号3、4、又は9として同定された配列を含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記化合物がペプチド類、オリゴサッカロイド類、脂質類、核酸類、及び小さな有機分子類からなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記支持体が多孔性又は網状であること、及びコーティングする工程が前記ピリンペプチドを前記支持体中の孔又は網目により形成された内側の面に結合させることを効果的にすること、を特徴とする請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法により作られた共有結合した化合物を有するステンレス鋼、スズ、鉄、又はチタニウム支持体の製造方法であって、前記支持体表面へのピリンペプチドの結合及び前記化合物が前記ピリンペプチドに共有結合することにより、前記支持体が改変された電子仕事関数を有することを特徴とする前記支持体の製造方法。
- 請求項9に記載の製造方法により製造された支持体が、移植可能な医療機器の一部であることを特徴とする請求項9に記載の支持体の製造方法。
- 請求項10に記載の製造方法により製造された支持体を使用するバイオセンサー装置の製造方法であって、さらに、表面結合レセプターへの検体関連リガンドの結合に応答して支持体表面にわたって電流の変化を検出するための検出器を含み、ここで、前記レセプターは前記化合物それ自身であるか又は前記化合物に高親和性結合により付着していることを特徴とする前記装置の製造方法。
- 共有結合した前記化合物がK又はEコイルであること、及びレセプターがE/Kコイルドコイル複合体を通して表面に結合すること、を特徴とする請求項11に記載のバイオセンサー装置の製造方法。
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