CN102791813A - 表面涂布的结构和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使化合物共价附着于不锈钢、锡、铁或钛基底上的方法,通过使所述基底的显露的表面与含有衍生自IV型绿脓杆菌(P.aeruginosa)(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环的合成菌毛蛋白肽接触以便使所述菌毛蛋白肽与所述显露的表面结合并使所述化合物与所述菌毛蛋白肽共价连接。还公开通过所述方法形成的基底和利用所述用途的生物传感器器件。还公开了改进某些金属的抗腐蚀性、粘合力、硬度和电子逸出功的方法。
Description
发明领域
本发明涉及采用IV型绿脓杆菌(P.aeruginosa)(T4P)菌毛蛋白肽的材料涂层的领域及其应用。
背景技术
细菌的IV型菌毛是宿主克隆所必需的并且许多革兰氏阴性细菌的IV型菌毛是有毒的,一些***的IV型菌毛还可能在发病机理中起作用。IV型菌毛从细菌的表面伸出并介导与生物和非生物表面的特异性附着。负责这种结合的菌毛结合区编码于位于该蛋白质的C-末端区的12-17二硫环区域内,仅含有该区域的合成肽例如由来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)IV型菌毛蛋白的残基128-144组成的二硫环肽已显示与生物的和非生物的表面结合。
本申请发明人和同事最近已证明,菌毛蛋白衍生的蛋白质纳米管(PNT)高亲和性地与不锈钢结合,并且该结合事件已显示是C-末端端连的(tip-associated),通过对应于IV型菌毛蛋白肽结合区的合成肽竞争性抑制PNT结合来实现。(Yu,B.等人,J.Bionanoscience,1:73-83(2007)。本申请发明人和同事然后进一步证明,衍生自C-末端受体结合区的菌毛蛋白肽,当与非生物表面诸如不锈钢、锡、铝、钛、铬、塑料、玻璃、硅酸盐、陶瓷和它们的混合物结合时,能抑制该涂布的表面上细菌生物膜的形成(U.S.20080287367)。
现已发现,含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环的合成的菌毛蛋白肽与一些金属的结合显著增强金属的某些纯粹的表面性质,即,独立于生物膜形成,且在一些金属 中改变表面的电学性质,通过一定方式使得这种表面电学性质可以用于例如生物传感器应用中。
发明内容
一方面,本发明包括使化合物共价附着于由不锈钢、锡、铁或钛形成的基底的一个或多个显露的表面的方法。该方法包括(i)使所述材料的显露的表面与含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个附加的残基的合成肽接触,以使该菌毛蛋白肽与显露的表面共价结合,和(ii)在使所述肽与所述基底结合之前或之后,直接地或间接地使所述化合物共价附着于所述菌毛蛋白肽。所述接触的步骤可优先使化合物位于金属的显露的晶粒边界区。
菌毛蛋白肽可由L-氨基酸、D-氨基酸、D-和L-氨基酸的混合物或逆向-反转(retro-inverso)型的D-氨基酸形成。
优选的T4P 菌毛蛋白肽含有序列K/A/S/T-C-T/K/A-S/T-D/T/N-Q/V/A-D/E-E/P/A/N-Q/M/K-F/Y-I/T/R/L-P-K/N-G/T-C-S/D/T/Q/N-K/N/D/T(SEQ ID NO:10)。示范性的肽含有被称为SEQ ID NO:3、4或9的序列。
另一个优选的T4P菌毛蛋白肽含有序列S/T-I-D-W-G/A-C-A/T-S-D/A-S-N-A-V/T-S/--S--G/A-T-D/A-R/Q-N/G-M/F-P/T-A/G-L/M-T/A-A-G-T/S-L/V-P-A/Q-R/E-F-A-P-S/A-E/Q-C-R(SEQ ID NO:11)。示范性的肽含有被称为SEQ ID NO:1和2的序列。
在基底是多孔的或网状的情况下,可以实施涂布步骤以便使菌毛蛋白肽与由材料中的孔或网眼确定的内表面结合。
用于附着于基底的示范性的化合物包括多肽、寡糖、脂质、核酸和小的有机分子。
所述方法中考虑的其他基底金属是元素周期表第4-6行、第9-12列的过渡金属,包括钴、镍、铜、锌、钌、铑、钯、银、镉、锇、铂、金、铬和汞,它们的混合物和合金、准金属硅和锗、和它们的氧化物。
本申请还公开通过以上方法形成的具有共价附着的化合物的不锈钢、锡、铁或钛基底。由于T4P菌毛蛋白肽共价附着于基底的表面,所述基底具有不同的逸出功。所述基底可以是可植入医疗器件的一部分,其中,共价附着的化合物(直接或间接附着的)优选地是生物活性化合物,例如骨形态形成因子。或者,所述基底可以用作生物传感器器件中的电流传感器元件,用于检测对分析物相关的配体与表面结合受体的结合的响应中通过基底表面的电流的变化,其中,所述受体直接附着于菌毛蛋白肽或通过高亲和性的结合对(例如生物素/亲和素对或亮氨酸拉链/卷曲螺旋对)间接附着于菌毛蛋白肽。
在一个更普遍的方面,其利用菌毛蛋白肽与各种材料(包括玻璃、聚合物、乳胶、硅酸盐(见下文))的高亲和性结合,本发明包括使非菌毛蛋白衍生的化合物附着于具有由一种或这些材料组成的表面的器件的方法,其通过使菌毛蛋白肽附着于此类表面和在这种附着之前或之后直接地或间接地使所述化合物共价附着于菌毛蛋白肽。如上所述,可以通过高亲和性结合对来实施间接的附着。也考虑通过这种方法形成的涂布的器件。
更普遍地,分析物检测器件可包括具有金属、塑料、陶瓷、玻璃或硅酸盐基底的分析物检测器件,所述基底的表面上通过合成肽附着有化合物,所述合成肽含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环并且所述化合物共价附着于该合成肽上。所述器件包括用于检测分析物相关的分子与基底上的化合物的结合的检测器。
本发明还包括处理表面具有显露的晶粒边界区的不锈钢、锡、铁或钛金属材料的方法中的改进,以增加表面硬度并降低材料的腐蚀速率。所述方法包括使材料中的显露的表面边界区与含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个附加的残基的合成的菌毛蛋白肽在有效地使显露的晶粒边界区的电子逸 出功变化至少0.2EFW单位并使显露的晶粒边界区的硬度(通过用原子力显微镜的尖端以给定力冲击金属表面产生的纳米刻痕来测定)增加至少20%的条件下接触。
所述方法中考虑的其他金属是元素周期表第4-6行、第9-12列的过渡金属,包括钴、镍、铜、锌、钌、铑、钯、银、镉、锇、铂、金、铬和汞,它们的混合物和合金、准金属硅和锗、和它们的氧化物。
在基底是不锈钢的情况下,所述涂布可有效地使被涂布表面的腐蚀速率降低至少30%,腐蚀速率通过通过所述表面的腐蚀电流来测定。在材料是多孔的或网状的情况下,可以实施涂布步骤以便使菌毛蛋白肽与由材料中的孔或网眼确定的内表面结合。表面接触步骤可有效地使菌毛蛋白肽与所述晶粒边界区选择性地结合,由此通过优先保护其晶粒边界区处的表面来增强金属表面的硬度和抗腐蚀性。
菌毛蛋白肽可由L-氨基酸、D-氨基酸、D-和L-氨基酸的混合物或逆向-反转(retro-inverso)型的D-氨基酸形成。
优选的T4P 菌毛蛋白肽含有序列K/A/S/T-C-T/K/A-S/T-D/T/N-Q/V/A-D/E-E/P/A/N-Q/M/K-F/Y-I/T/R/L-P-K/N-G/T-C-S/D/T/Q/N-K/N/D/T(SEQ ID NO:10)。示范性的肽含有被称为SEQ ID NO:3、4或9的序列。
另一个优选的T4P菌毛蛋白肽含有序列S/T-I-D-W-G/A-C-A/T-S-D/A-S-N-A-V/T-S/--S--G/A-T-D/A-R/Q-N/G-M/F-P/T-A/G-L/M-T/A-A-G-T/S-L/V-P-A/Q-R/E-F-A-P-S/A-E/Q-C-R(SEQ ID NO:11)。示范性的肽含有被称为SEQ ID NO:1和2的序列。
本发明还包括使玻璃硬化的方法,其通过用含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个附加的残基的合成的菌毛蛋白肽涂布玻璃的外表面。菌毛蛋白肽可以具有上述的氨基酸形式和优选的序列。
本申请还公开减少机器中彼此移动接触的元件之间的摩擦的方法,其通过用含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结 合蛋白的二硫环、(ii)并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个附加的残基的合成的菌毛蛋白肽涂布元件的接触表面。菌毛蛋白肽可以具有上述的氨基酸形式和优选的序列。
在另一个方面,本发明包括包含金属植入结构(例如钛或不锈钢结构)的骨植入物,其一部分设计成放置于骨区内或倚靠着骨区,并且该部分上携带包含含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10、优选地0-5个附加的残基的合成的菌毛蛋白肽与骨形态形成的偶联物的骨形态形成肽的涂层。
为了用作关节替代植入物,涂布的部分被设计成放置于骨的皮层区内,偶联物可以是菌毛蛋白肽和骨形态形成因子的共价偶联物,骨形态形成因子可选自RGD和骨形态形成因子BMP2-BMP7。
为了用作牙齿植入物,涂布的部分可以包括被设计成放置于上颌或下颌骨中形成的孔之内的植入物柄,偶联物可以是菌毛蛋白肽和骨形态形成因子的共价偶联物,骨形态形成因子可选自RGD和骨形态形成因子BMP2-BMP7。
本申请还公开含有可展开的基底(例如不锈钢、钛或铬基底)的血管内支架,所述基底在其外表面区上携带含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白肽的C-末端受体结合蛋白的二硫环并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个附加的残基的合成的菌毛蛋白肽的涂层。支架可用含有抗再狭窄化合物的药物释放涂料进一步涂布。
在另一个方面,本发明包括抑制对***或植入受试者的医疗器件的炎性反应的方法,其通过用合成的菌毛蛋白肽涂布(包括在植入之前)器件的显露的表面,所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环,(ii)并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个附 加的残基,且由D-氨基酸、D-和L-氨基酸的混合物或逆向-反转(RI)型的D-氨基酸组成。在一个优选的实施方式中,器件的涂布的部分是不锈钢、锡、铁或钛表面。
在一个相关的方面,本发明包括当植入身体中时具有显露于炎性反应细胞的表面的医疗器件,其中,此类表面用用含有(i)衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白肽的C-末端受体结合蛋白的二硫环,和(ii)位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或同时位于这两末端侧的0-10、优选地0-5个附加的残基,且(iii)由D-氨基酸、D-和L-氨基酸的混合物、或逆向-反转(RI)型的D-氨基酸组成的合成的菌毛蛋白肽涂布。显露的表面可以是不锈钢、锡、铁或钛表面。
在另一个的方面,本发明包括通过以下步骤获得感兴趣的多肽的方法,(i)使由选自不锈钢、锡、铁、钛、铬、塑料、玻璃、硅酸盐、陶瓷和它们的混合物的材料形成的固体载体与含有融合多肽(fusion polypeptide)的组合物接触,所述融合多肽包含在其N-或C-末端通过可断裂连接头与合成的菌毛蛋白肽连接的感兴趣的多肽,所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环和位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个附加的残基,(ii)通过这种接触,使所述融合蛋白(fusion protein)附着于固体载体,(iii)洗涤该固体载体以除去组合物中未结合的组分,(iv)用有效地使融合蛋白中的连接头断裂的试剂处理洗涤过的固体载体,由此从固体载体上释放完整形式的感兴趣的多肽,和(v)使被释放的感兴趣的多肽与固体载体分离。菌毛蛋白肽可以具有上述的氨基酸形式和优选的序列。
融合蛋白中的连接头可以包括使连接头容易被所选的蛋白水解酶断裂的氨基酸序列,处理步骤(iv)可以包括在所选的蛋白水解酶的存在下保温固体载体。
当结合附图阅读以下本发明的详细说明时,本发明的这些和其他目的和特征将变得更明白。
附图简述
图1A-1D显示多个细菌属/种/菌株中IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合区的序列;
图2A和2B的图显示对未涂布的不锈钢或用K122-4(2A)和PAO(2B)菌毛蛋白肽涂布的不锈钢进行的粘合力测量;
图3A和3B的图显示未涂布的不锈钢或用K122-4(3A)和PAK(3B)菌毛蛋白肽涂布的不锈钢的电子逸出功(EWF);
图4显示在两个月的时期内的涂布的和未涂布的不锈钢的EWF测量值;
图5显示在800nM负荷下涂布多肽的和未涂布的不锈钢的力位移(force displacement)曲线;
图6A和6B显示在20μN(6A)和50μN(6B)负荷下进行的纳米刻痕试验的结果;
图7A和7B是在增加负荷下的涂布多肽的(7A中是PAO,7B中是K122-4)和未涂布的不锈钢的位移测量值图;
图8A和8B是未涂布的(8A)和涂布T4P17菌毛蛋白肽(8B)的不锈钢基底与AFM尖端之间的电流的导电率AFM表面图;
图9A-9B是涂布的和未涂布的不锈钢表面的腐蚀性能的测量,其显示涂布菌毛蛋白的不锈钢的腐蚀电流(Icorr)显著小于未涂布的不锈钢的腐蚀电流(9A),涂布菌毛蛋白的和未涂布的不锈钢的腐蚀电位(Ecorr)没有显著区别(9B);
图10A和10B的图显示涂布菌毛蛋白的不锈钢的腐蚀速率显著低于未涂布的不锈钢(10A),抗极化性显著高于未涂布的不锈钢(10B);
图11显示,当菌毛蛋白肽与另一个肽(在此例子中,亮氨酸-拉链型E螺旋或E/K卷曲螺旋)偶联时,与金属表面结合的菌毛蛋白肽的腐蚀抑制作用可逆转;
图12A-12C的照底显示未涂布的(12A)、用菌毛蛋白肽涂布的(12B)或用具有附着于菌毛蛋白的螺旋-螺旋双链体的菌毛蛋白肽涂布的不锈钢样品上的腐蚀的视觉效应;
图13显示,在采用增加量的外来肽的竞争性结合分析中,已结合的菌毛蛋白肽没有被从不锈钢表面置换;
图14是未涂布的和涂布K-122-4菌毛蛋白肽的不锈钢样品的XPS图;
图15A和15B显示涂布L-型和D-型菌毛蛋白肽两者的不锈钢样品上的粘合力的测量值(15A)和涂布相同的L-型和D-型菌毛蛋白肽的不锈钢样品上的EWF力的测量值(15B);
图16A和16B显示菌毛蛋白肽(D-型)与不锈钢支架(16A)和与玻璃表面(16B)紧密结合的能力;
图17A和17B的柱形图显示与不锈钢样品结合的L-氨基酸和D-氨基酸菌毛蛋白的相对抗蛋白酶消化性;
图18A和18B的示意图显示根据本发明的一个实施方式构造的生物传感器器件的运行;
图19显示生物传感器中的分析物结合步骤,其中,分析物结合试剂R通过菌毛蛋白肽直接附着于生物传感器表面;
图20显示生物传感器中的分析物结合步骤,其中,分析物结合试剂R通过菌毛蛋白肽卷曲螺旋复合物附着于生物传感器表面;
图21显示本发明的生物传感器中的不同的检测结构;
图22A和22B是结合分析物与受体结合之前和之后生物传感器中记录的循环伏安法图,其中,22B是图22A中矩形面的放大图;
图23A和23B显示根据本发明的一个更普遍的实施方式构造的分析物检测器件;
图24A-24D的柱形图显示T4P17菌毛蛋白肽与不锈钢(24A)、冠状支架(24B)、Foley(乳胶)导管(24C)和中央静脉(硅氧烷)导管(24D)的结合;
图25A和25B是蛋白质印记(25A)和柱形图(25B),显示D-菌毛蛋白肽涂层对针对未涂布的和涂布菌毛蛋白的钛或不锈钢表面的PBMC免疫反应的影响;和
图26A和26B显示蛋白质印记(26A)和柱形图(26B),显示D-菌毛蛋白肽涂层对针对未涂布的和涂布菌毛蛋白的钛或不锈钢表面的人巨噬细胞免疫反应的影响。
发明详述
I.定义
“菌毛”是在许多细菌的表面上发现的毛状附属物。
菌毛蛋白是用于菌毛的蛋白质亚单位的通用术语。
“IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白”指绿脓杆菌细菌用于产生能动力的菌毛结构,通过使菌毛的末梢附着于生物的或非生物的表面并收缩菌毛以便拖动细菌向前来实现。所有IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛含有C-末端受体结合区,其为被氧化的形式,含有可归类为12-残基环或17-残基环的二硫环。图1显示其C-末端菌毛区已排序的多个细菌种的二硫环区。
“衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环”指其氨基酸序列对应于已知的细菌二硫环氨基酸序列的二硫环,诸如称为SEQ ID NO:4的绿脓杆菌菌株PAK序列,或者作为两个或更多个不同的细菌种和/或细菌菌株之间二硫环序列中的一个或多个氨基酸变化的变种形成的一个序列,诸如SEQ ID NO:10中含有的序列之一,其作为四个绿脓杆菌菌株PAK、PAO、PA82935和K-122-4的二硫环序列的复合物形成。
“合成肽”指通过固相或重组肽合成法形成的肽。
“由不锈钢、锡、铁或钛形成的基底”表示由不锈钢、锡、铁或钛或这些金属中的两种或更多种的混合物形成的金属基底,或用不锈钢、锡、铁或钛或它们的混合物涂布的金属或非金属基底。基底可以 含有小比例的其他金属,尤其地来自周期表第4-6行、第9-12列的过渡金属,包括钴、镍、铜、锌、钌、铑、钯、银、镉、锇、铂、金、铬(存在于不锈钢中)和汞。“T4P菌毛蛋白肽共价附着于由不锈钢、锡、铁或钛形成的金属基底”表示菌毛蛋白肽通过键附着于金属表面,这种附着(i)抵制被游离的菌毛蛋白肽置换,且(ii)具有变化的电子逸出功(EWF)-表明材料的表面电子轨道(e-orbital)发生变化。菌毛蛋白肽共价附着于此类金属基底还可以以下各项为特征(i)表面粘合力的改变、(ii)表面硬度的改变、(iii)导电率的改变和/或(iv)结合能峰的改变(通过X-射线光电子光谱(XPS)观察到)。
“具有共价结合的化合物的金属基底”表示具有与基底表面共价结合的T4P菌毛蛋白肽和与菌毛蛋白肽直接或间接共价结合的不是菌毛蛋白蛋白质的另一部分的化合物的基底。当化合物通过高亲和性结合对(诸如卷曲螺旋亮氨酸-拉链对、生物素-亲和素对等)与菌毛蛋白肽连接时,其中,所述对的一个成员与菌毛蛋白肽共价连接,另一个成员与化合物共价连接,化合物与T4P菌毛蛋白肽间接共价结合。
金属基底的“显露的晶粒边界区”指出现晶粒边界,即,形成基底的金属原子的两个多晶方向的界面处的基底的表面。
“使菌毛蛋白肽优先位于显露的晶粒边界区”表示,菌毛蛋白肽和共价附着于菌毛蛋白肽的任意化合物在晶粒边界区比在晶粒边界区之间的显露的表面区具有更高的分子浓度和/或更大的表面涂层的厚度。
II.菌毛蛋白肽
图1A-1D显示序列信息可获得的各种细菌属/种/菌株的含二硫环的C-末端菌毛蛋白肽区的序列。给出的序列包括二硫环序列(以半胱氨酸残基(C)开始和结束)并在一些情况下包括在所述环任意一侧的至 多5个或更多个残基。单字母氨基酸符号对应于标准的惯例。在肽的正常的氧化形式中,肽含有在半胱氨酸之间的二硫桥。
本发明中采用的合成肽包括或衍生自图1A-1D中显示的一种或多种序列。当所述序列包括显示的一种序列时,其可以包括单独的二硫环,或者所述环可以另外包括在环的N-末端侧或C-末端侧中任意一侧或这两侧的至多十个、优选地五个或更少的残基,其中,附加的非环残基典型地包括或衍生自一个或多个相邻的非环序列。更普遍地,环区和非环区的序列都可通过使这些序列(优选地在二硫环中具有相同的或几乎相同的数量的残基的序列)排成一行而衍生自两个或更多个序列。例如,在图1A中,对应于绿脓杆菌菌株PAO(SEQ ID NO:3)、PAK(SEQ ID NO:4)、PA82935(SEQ ID NO:7)和K122-4(SEQ ID NO:9)的四个肽含有14-基体(mer)二硫环。通过使来自图1A中的四种绿脓杆菌菌株的二硫环序列排成一行,组合的序列K/A/S/T-C-T/K/A-S/T-D/T/N-Q/V/A-D/E-E/IP/A/N-Q/M/K-F/Y-I/T/R/L-P-K/N-G/T-C-S/D/T/Q/N-K/N/D/T(SEQ ID NO:10)形成了。该17残基的多肽(也一般称为T4P17)包括14个二硫环残基,单个上游(N-末端侧)非环残基和两个下游非环残基。该序列内示范性的序列包括衍生出SEQ ID:10的实际四个不同的序列,即,对应于PAK(SEQ ID NO:3)、PAO(SEQ ID NO:4)、PA82935(SEQ ID NO:7)和K-122-4(SEQ ID NO:9)的序列。
作为另一个例子,两个绿脓杆菌菌株G7-09(SEQ ID NO:1)和PA110594(SEQ ID NO:2)形成复合序列S/T-I-D-W-G/A-C-A/T-S-D/A-S-N-A-V/T-S/--S--G/A-T-D/A-R/Q-N/G-M/F-P/T-A/G-L/M-T/A-A-G-T/S-L/V-P-A/Q-R/E-F-A-P-S/A-E/Q-C-R(SEQ ID NO:21)。
一旦选择了菌毛蛋白肽序列,其可通过标准的重组方法或固相合成法合成。例如,由pRLD-E质粒重组表达E-螺旋(E-coil)PAK(128-144)ox,其中,利用合成的寡聚核苷酸框内剪接PAK(128-144)ox DNA序列与E螺旋并根据已知的技术在大肠杆菌(E. Coli)菌株BL-21中表达(参见例如Giltner等人,Mol.Microbiology(2006)59(4):1083和其中引用的文献)。通过金属亲和色谱纯化表达的肽,通过质谱法(mass-spectroscopy)和N-末端蛋白质测序确定纯度和二硫桥的形成。
在一个实施方式中,本发明中采用的菌毛蛋白肽由L-氨基酸,即,具有天然的L-异构体形式的氨基酸形成。可通过常规的重组方法和固相合成方法来形成由所有L-氨基酸组成的菌毛蛋白肽。
在另一个实施方式中,菌毛蛋白肽由D-氨基酸或D-和L-氨基酸的混合物组成。在菌毛蛋白肽中包括D-氨基酸的一个目的是增加肽被肽可能接触的一种或更多种蛋白酶水解的抗蛋白酶水解性。例如,假单胞菌属细菌具有一批蛋白酶,包括弹性蛋白酶、金属蛋白酶和典型的似胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶,它们在肽断裂中需要或以赖氨酸和/或精氨酸残基为目标。因此,可合成菌毛蛋白肽以便含有D-赖氨酸,例如在K122-4菌毛蛋白肽中的K136和K140处。优选地,在制备对尽可能多的蛋白酶具有抗性的肽中,菌毛蛋白肽应该完全由D-氨基酸形成。可通过常规的固相法、在合成中利用活化的D-或L-氨基酸试剂形成由所有D-氨基酸或D-和L-氨基酸的混合物组成的菌毛蛋白肽。(参见例如Guichard,G.,等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA Vol.91,pp.9765-9769,October 1994)
在另一个实施方式中,菌毛蛋白肽由沿相反的序列方向,即,羧基端至氨基端方向合成的D-氨基酸组成,以产生所谓的逆向-反转(RI)菌毛蛋白肽。逆向-反转(RI)型的菌毛蛋白肽还具有更强的抗蛋白酶性的优点,并因此在本文中所述的应用中是有利的,在所述应用中涂布菌毛蛋白的材料暴露于蛋白酶,例如在生物调节中或在经受细菌生长的环境中。合成RI型肽的方法在例如Fletcher,M.D.和Campbell,M.M.,Partially Modified Retro-Inverso Peptides:Development,Synthesis,and Conformational Behavior,Chem Rev,1998,98:763-795中有详细描述,该文献通过引用结合于此。
III.处理金属表面
在一个方面,本发明包括处理表面具有显露的晶粒边界区的不锈钢、锡、铁或钛金属材料的改进的方法,以降低材料的腐蚀速率。该方法可单独地或与一种其他抗腐蚀的方法(诸如钝化)组合使用。金属材料可以具有单个具有晶粒边界区的显露的表面或多个待处理的外表面,或含有可从材料外表面到达的孔或内部网眼。如将被理解的,该方法适合对经受化学腐蚀的任意不锈钢、锡、铁或钛金属材料的任何处理,所述化学腐蚀发生于例如氧化的气氛中或通过与腐蚀性液体(例如碱性或酸性液体)接触。
在实施方法期间,金属材料可首先洗涤一次或多次,例如在乙醇浴中,以便除去污染物。然后,在有效地使菌毛蛋白与材料的显露的表面共价结合的条件下使材料与菌毛蛋白的溶液接触。在一个典型的处理方法中,将材料放置于肽浓度为2μg/mL至50μg/mL菌毛蛋白(例如10μg/mL)的菌毛蛋白肽在接近中性pH(例如pH 7)的水性缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)中的溶液中,并使材料与该溶液接触一段时间(例如5-120分钟)直到合适的菌毛蛋白肽涂层已形成。
或者,可以用菌毛蛋白溶液喷射待涂布的材料,且使其与雾化的溶液在高湿度环境中接触需要的接触时间(例如5-120分钟)。
在另一个实施方式中,将菌毛蛋白涂料施加于金属表面的所选区域,例如在微制造(microfabrication)操作中,或将肽选择性地施加于材料上显露的晶粒边界区。在该实施方式中,以区域特异性方式(例如通过喷墨打印机或类似手段)将肽的溶液递送至材料的显露的表面。
IIIA.处理方法和金属表面性质的改变
本部分描述了处理金属表面以增强其抗腐蚀性的示范性的方法和支持本发明中进行的研究,所述研究证明,除了增强的抗腐蚀性以外,(i)被处理表面的粘合力降低、(ii)被处理表面的电子逸出功改变、 (iii)被处理表面的硬度增加、(iv)导电率减小且(V)在至少两个月的时期内涂层稳定。
样品制备 将商品级3042B光泽表面(20规格)不锈钢板(1mm厚)切割成尺寸为1cm x1cm的样品。样品在1140□、于空气中煅烧1小时并在空气中冷却。使用120、240、320、400、600和800#粒度的砂纸抛光表面,随后用1200#粒度砂纸进行最终抛光。
使用上述的抛光规程抛光尺寸为1cm x1cm x 1cm的铝和不锈钢样品。这些样品在抛光之前都没有进行煅烧。
用肽或单体菌毛涂布样品 使用商品洗碟肥皂将不锈钢和铝样品洗涤1分钟,随后用蒸馏水冲洗。然后伴随温和的搅拌将样品浸入95%乙醇中15分钟,用蒸馏水冲洗,浸入试剂级丙酮中1分钟。用蒸馏水冲洗样品5次,随后使其风干。将样品浸入含有10μg/mL肽或单体菌毛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中并伴随温和的搅拌于室温(RT)下保温(incubate)1小时。除去溶液、用蒸馏水洗涤样品6次并使样品风干。
使用上述规程清洁碳钢样品,但在丙酮洗涤步骤之后代替地用100%甲醇冲洗样品并立即将样品浸入100%甲醇中以便防止当曝露于水时导致的快速的空气腐蚀。将肽溶解在100%甲醇中,10μg/mL的最终浓度用于浸没碳钢样品。伴随温和的搅拌于RT下将样品保温1小时。用100%甲醇洗涤样品6次并使其风干。
粘合力测量 使用原子力显微镜(AFM)测量尖端半径为50-70nm的标准的涂布Au的AFM四氮化三硅尖端和涂布肽的表面之间的粘合力。为了确定AFM尖端和涂布的表面之间的粘合力,以“接触”模式使用AFM。使尖端接近表面,使它们接触,测量将尖端拉离表面时悬臂的偏转(deflection)。通过激光束测定偏转的总量,其反映粘合力。如果悬臂的弹簧常数是已知的,可从激光束偏转定量确定粘合力。在该研究中,悬臂弹簧常数是0.06N/m。对每次实验,每个样品获得20至50个粘合力测量值。
涂布K122-4或PAO菌毛蛋白肽的不锈钢样品的粘合力研究的结果分别绘制在图2A和2B中。如从图2A中看到的,涂布的金属的粘合力集中在约5-40nN(毫微牛顿)的范围内,平均值约20nN,比较未涂布的样品,其中粘合力集中在约40-75nN、平均值约60nN。用PAO菌毛蛋白涂层获得类似的结果。由于粘合力是电子活力(例如范德华(Van de Walls)相互作用)的反映,可推断出肽涂层起到掩蔽金属表面的电子层的作用。
对涂布肽的铝板的类似的粘合力测量显示,涂布的和未涂布的板的粘合力几乎没有区别。
逸出功测量 用SKP370扫描开尔文探针(Scanning Kelvin Probe)照惯例测量涂布的和未涂布的不锈钢样品的电子逸出功(EWF)。使用振动电容探针并通过偏移“隔板”电位(swept backing potential)操作该技术,测量扫描探针参考尖端和样品表面之间的逸出功差。被研究的样品是如同粘合力研究中使用的那些,除了还检验用PAK菌毛蛋白肽涂布的样品以外。
研究的结果绘制在图3A中(关于未涂布的和涂布K122-4菌毛蛋白肽的样品)和图3B中(关于未涂布的和涂布PAO-和PAK菌毛蛋白肽的样品)。对于所有三种涂层,菌毛蛋白肽涂层使表面EWF提高了至少约0.5eV,达到约5eV的最终值。
对涂布肽的铝板的类似的EWF测量显示,涂布的和未涂布的板的EWF几乎没有区别。
肽涂层的稳定性 图4显示在涂布后2个月的时间期限内对涂布K122-4菌毛蛋白肽的样品进行的测量的结果。在这两个月的研究时期内观察到涂布的样品相对于未涂布的片具有更高的EFW,表明至少两个月是涂层稳定性。
纳米刻痕/硬度 使用triboscope(Hysitron,Minneapolis,USA)检验涂布肽的样品的机械性能的改变。triboscope是纳米机械探针和AFM的组合。该探针是金刚石锥体形维氏硬度计压头,具有150nm的标称半 径、100nN的力灵敏度(force sensitivity)和0.2nm的位移分辨率。在纳米刻痕过程中,对于每次刻痕获取力-深度曲线,从该曲线获得尖端进入样品表面的总深度位移。使用50至800μN的力操作纳米刻痕试验。对每个力负荷获取五条力-深度曲线。
图5中显示涂布肽的(深色)和未涂布的(浅色)不锈钢在50至800μN的负荷范围下的力-位移曲线。在800μN负荷下的总位移显示在图的顶部,对于涂布的片,该值在45-55nm范围内,对于未涂布的片,该值在约90-95nm。基于该试验,涂布的片的硬度几乎是未涂布的片的两倍。更普遍地,涂层有效地使不锈钢、锡、铁或钛金属表面的硬度增加至少约20%、优选地至少约30%、最大50%或更大。
图6A和6B绘制涂布的和未涂布的片在20μN(6A)和50μN(6B)下产生的纳米刻痕的位移。与来自图5的数据一致,涂布的片的硬度比未涂布的片高约20%-100%。
相同类型的研究绘制在图7A和7B中,图(7A)针对涂布PAO的且在50-800μN的力范围内,图(7B)针对涂布K122-4的且在50-400μN的力范围内,结果基本上相同。在两种情况中,涂布菌毛蛋白肽几乎使金属样品的表面硬度翻倍。
对涂布肽的铝板的类似的纳米刻痕试验显示,涂布的和未涂布的板的表面硬度几乎没有改变。
增加的导电率 导电率是材料传导电流的能力的量度。测量表面导电率的一个标准方法使用原子力显微镜(AFM)来测量在规定的低电压偏电压(potential bias)下从表面上特定的位置流至AFM尖端的电流。AFM显示作为特定的颜色定量的表面和尖端之间的电流(以pA计),未涂布的和涂布菌毛蛋白的不锈钢板的电流分别用图8A和8B中不同的灰色阴影代表。通常,较深至较浅的阴影表示较大至较小的电流(28.0至24.5pA)。从这两幅图中观察到,图8A中的未涂布的不锈钢样品的表面区在样品表面上变化很大且具有表示较高电流的突出的深色阴影,然而图8B中的涂布菌毛蛋白样品的表面区域主要是低导电 率的且导电率图均匀很多。这些结果与来自图3A和3B的EWF数据一致,图3A和3B表明涂布菌毛蛋白的材料具有高很多的金属逸出功(提取表面电子所需的功的量度)。
抗腐蚀性 有多种技术可用于研究材料表面的抗腐蚀性或对腐蚀的敏感性。一种方法是测量固定的电位下通过金属板的电流。测得的电流反映表面电子在氧化还原形式之间的往复,更大的电流表明更大的腐蚀潜力。图9A中的绘图显示对如上制备的3042B光泽表面(20规格)不锈钢板(未涂布的或涂布K-122-4菌毛蛋白肽的)测得的电流(Icorr)。结果显示涂布的板的Icorr低很多,表示更高的抗腐蚀性。
可能被问及,以上研究中观察到的Icorr区别是否与电流首先开始流经金属表面时的电位(Ecorr)有关。通过观察金属中的电流首先开始流动时的电位(Ecorr)来研究这个问题。研究的结果(显示在图9B中)表明,涂布的和未涂布的金属样品具有类似的Ecorr值,表示图9A中看到的lcorr值的区别不是由两个样品之间电压电位响应的区别造成的。
图10A中绘制了涂布K-122-4的和未涂布的样品的腐蚀速率测量值(以密耳(milliinch)/年(mpy)度量)。结果与图9A中看到的Icorr的区别一致。具体地,当比较平均速率时,菌毛蛋白肽涂层显示使腐蚀速率降低了超过三倍。
腐蚀监测中另一个广泛使用的技术是抗极化性,定义为自由腐蚀电位下的电位电流密度曲线的斜率,得到可以通过已知的数学关系与腐蚀电流相关的阻抗值Rp。图10B绘制涂布的和未涂布的不锈钢的Rp值,显示肽涂层显著提高作为抗腐蚀性的量度的Rp。
令人感兴趣的是,当菌毛蛋白与具有强偶极和/或高电荷密度的另一种肽偶联时,在此例子中,所述另一种肽是亮氨酸拉链型E螺旋或相同的E螺旋(其已在E螺旋/K螺旋对中与带相反电荷的K螺旋结合),菌毛蛋白肽在抑制腐蚀中的作用可逆转。如图11中看到的,未涂布的不锈钢样品的腐蚀速率显著低于具有菌毛蛋白-E或E/K螺旋形式的结合的菌毛蛋白的样品。
对以上讨论的各种不锈钢样品的腐蚀测试的视觉效应参见于图12A-12C。在该研究中,样品或者是未涂布的(12B)或者用菌毛蛋白肽(12A)或与E/K卷曲螺旋对偶联的菌毛蛋白肽涂布的。在每种情况下,样品在稀盐溶液中经历上述的腐蚀测试。与未涂布的板相比,涂布菌毛蛋白的板显示极小的表面腐蚀,而菌毛蛋白-偶联物涂层看起来显著加强腐蚀。
总之,用含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个附加的残基的合成的菌毛蛋白肽涂布金属例如不锈钢、锡、铁或钛,有效地增加金属表面的硬度和抗腐蚀性。增加的抗腐蚀性通过改变,例如金属表面的电子逸出功增加至少0.2EFW单位以及上述Icorr、腐蚀速率和Rp值的改变来证明。提高的硬度通过纳米刻痕减小了至少20%来证明,所述纳米刻痕通过用原子力显微镜的尖端以给定力冲击金属表面而产生。
所述方法中考虑的其他金属是元素周期表第4-6行、第9-12列的过渡金属,包括钴、镍、铜、锌、钌、铑、钯、银、镉、锇、铂、金和汞,它们的混合物和合金、准金属硅和锗和它们的氧化物。
IIIB.菌毛蛋白肽与被处理的金属共价结合的附加证据
涂布的金属的改变的电子逸出功和增强的抗腐蚀性表明,菌毛蛋白肽已改变了涂布的表面的电学性质,暗示肽与金属之间共价键的形成,其改变了金属的自由电子轨道。这种发现的附加的支持来自本分部中报道的肽置换分析和X-射线光电子光谱学(XPS)研究。
肽/菌毛置换分析 化合物和基底之间的共价相互作用的一个指示是在溶质形式的化合物存在下保温复合物时不能从基底上置换化合物。在此,研究外来菌毛蛋白肽置换与不锈钢表面结合的菌毛蛋白肽的能力。如上所述清洁1mm厚的商品级3042B光泽表面(20规格)不锈钢板。这些板不进行煅烧或抛光。将这些板装配到96孔Schleicher 和Schuell Minifold TM System(Mandel Scientific)中。将五十微升含有10μg/mL生物素化的PAK肽或生物素化的纯化的菌毛的溶液加入孔(5个平行测定)中并在RT下伴随温和的搅拌将该集合管保温1小时。用lx PBS洗涤孔六次。向平行测定孔中加入增加量(0至10μg/mL)的未标记的PAK肽并在RT下伴随温和的搅拌将该钢集合管保温1小时。随后用PBS洗涤孔六次。使用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)评估结合的生物素化的肽或菌毛的置换。将链霉抗生物素蛋白-HRP(Sigma)稀释500倍,每孔加入100μL并在RT下将该集合管保温1小时。每孔加入150微升显影缓冲液(含有1mM 2,2′-连氮基-双-(3-乙基苄基噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)(Sigma)和0.03%(v/v)过氧化氢的0.01M柠檬酸钠缓冲液,其pH为4.2)。在RT下伴随温和的搅拌将该集合管保温10分钟。将反应溶液转移至96孔平底微滴定板(Corning)中,使用FLUOstar OPTIMA平板分析仪(BMG LABTECH)确定在405nm处的吸收。
如从图13中绘制的数据看到的,即使在较高浓度的可溶性菌毛蛋白肽时,也没有可测量的来自金属表面的结合菌毛蛋白肽的损失,证明结合的菌毛蛋白肽与未结合的多肽相平衡,表明多肽和金属表面之间的共价键连接。多肽与金属表面的共价结合的其他证据由以下的抗腐蚀性研究提供。
XPS特性 X-射线光电子光谱学(XPS)是测量元素组成和材料内存在的元素的电子状态的定量光谱学技术。通过用一束X-射线照射材料同时测量从被分析的材料的上部1至10nm逃逸的电子的动能和数量来获得XPS光谱。XPS需要超高真空(UHV)条件。
使用轴-165光谱仪(Axis-165Spectrometer)(Kratos Analytical)检验从未涂布的和涂布菌毛蛋白的样品光发射的电子。从两种样品发射的电子的光谱显示于图14中。如看到的,涂布菌毛蛋白的样品含有结合能约为100和150eV的两个独特的峰,它们在未涂布的样品中不存在。一个可能性是这两个峰代表由于偶联的电子结合而充分向红移的硫- 金属键。没有N或O与金属结合的证据,表明菌毛蛋白与金属之间可能的共价(共享电子)键相互作用是与菌毛蛋白肽中两个硫原子中的一个或两个发生的。
IIIC.晶粒边界效应
晶粒边界是多晶材料中两个晶粒或晶体之间的界面。晶粒边界是晶体结构中的缺陷,且易于降低材料的电和热传导率。大多数晶粒边界中的高界面能和较弱的结合经常使它们成为腐蚀开始和从固体沉淀出新的相的优先位点。
由于晶粒边界可作为腐蚀的起始点,所以,确定菌毛蛋白肽与金属表面结合是否优先发生在晶粒边界位点是令人感兴趣的。为了研究这个问题,将使用涂布菌毛蛋白-肽的AFM尖端的上述粘合力研究进一步精细化为研究晶粒内和晶粒边界处的粘合力作用。该研究中的“试验”和“对照”表面是用PAO菌毛蛋白肽或具有打乱的PAO氨基酸序列的肽涂布的不锈钢板。对于各样品,测量晶粒内和晶粒边界处的粘合力。
如从以下表1中给出的结果看到的,在晶粒边界内,菌毛蛋白肽的粘合力比具有打乱的序列的相同的材料的粘合力小约20nN,在晶粒边界处,小约43nN。该结果表明,或者菌毛蛋白肽优先定位于晶粒边界处,即,肽在晶粒边界处具有更大的涂层厚度,或者相同水平的菌毛蛋白结合在晶粒边界处产生更大的粘合力作用。在任何一种情况下,这个数据可解释通过使菌毛蛋白肽与金属表面结合所观察到的抗腐蚀作用的大小。
表1:晶粒边界区对粘合力的作用
IIID.通过D-和RI-型菌毛蛋白进行菌毛蛋白肽结合
为了检验D-和RI-型菌毛蛋白肽与金属(不锈钢)样品结合的能力和涂布菌毛蛋白的材料的特征,合成D-和RI-型K122-4菌毛蛋白肽并相对L-型的相同的菌毛蛋白肽进行测试。用L-型菌毛蛋白多肽(三个不同批次)、D-型菌毛蛋白或RI-型菌毛蛋白涂布不锈钢板,一个板不涂布。
首先检验所述板的粘合力的改变,类似于以上针对图2A和2B所报道的研究。如图15A中看到的,对所有三种形式的菌毛蛋白肽,都看到粘合力相对于未涂布的板大幅减小。
将对相同的六个样品的EWF测量值(如以上针对图3A-3B所述地进行)绘制在图15B中。令人感兴趣的是,D-氨基酸形式给出比其他五个板中任意一个(包括未涂布的板)低很多的EWF,然而RI-型给出与L-型菌毛蛋白样品相当或高于L-型菌毛蛋白样品的EWF。
该结果表明D-和RI-型菌毛蛋白肽都能以改变金属表面的电学性质的方式与不锈钢板相互作用。
通过比较肽与或者未涂布的、或者用生物素化的对照肽(打乱的菌毛蛋白序列的或其非结合区)、或者用生物素化的D-型菌毛蛋白肽涂布的不锈钢支架的结合来研究D-型菌毛蛋白与不锈钢紧密结合的能力。通过首先于37℃下用3%SDS溶液洗涤表面、随后在PBS中进行另外的数次洗涤来测量与各支架表面结合的肽的量。将洗涤的表面与链霉抗生素蛋白-HRP(辣根过氧化物酶)一起保温,然后接触ABTS基底,阅读405nm处的吸收。如图16A中看到的,约两倍于对照肽的D-型菌毛蛋白肽与不锈钢支架结合。
为了研究与金属结合的D-型菌毛蛋白肽相对于与金属结合的L-型菌毛蛋白肽的抗酶蛋白水解性,用L-型肽、D-型肽和对照(打乱的菌毛蛋白序列)一式两份涂布不锈钢板。然后使来自每二份的一个样品与0.25%浓度的胰蛋白酶、1mM、pH 7.4的EDTA在37℃下一起保温。之后,通过上述HRT分析法分析样品的结合蛋白。
图17A显示在接触胰蛋白酶之前和之后的L-型菌毛蛋白的结合肽水平。如看到的,通过蛋白酶处理除去超过一半的菌毛蛋白肽。相反,结合的D-型菌毛蛋白肽的量基本上没有受到蛋白酶消化的影响(图17B)。该结果证明(i)L-型肽与不锈钢的共价结合不给予抗蛋白酶消化的保护作用,且(ii)结合的D-型菌毛蛋白肽基本上得到抗蛋白酶水解的保护。
IIIE.相关应用
根据本发明的另一个方面,还可利用通过菌毛蛋白肽结合增加涂布的材料的硬度的能力,以便硬化其他材料诸如平板玻璃或汽车安全玻璃的表面。在该应用中,使清洁的玻璃表面与菌毛蛋白肽在一定条件下接触,所述条件有效地使表面涂布有菌毛蛋白层。使用HRP分析如上测量与基底结合的蛋白质的量。如图16B中看到的,D-型肽与玻璃表面紧密结合,抵抗即使通过SDS处理的除去作用,约两倍于对照肽的菌毛蛋白肽与不锈钢支架结合。
在另一个应用中,表面处理用于增强机器中相互移动接触的涂布的金属表面的润滑性。在此,通过在形成共价附着的菌毛蛋白涂层的条件下如上使部件接触菌毛蛋白肽来预处理目标机器组件以增强表面润滑性。或者,在操作期间或在暂时的关机期间可将菌毛蛋白肽的溶液施加于机器的接触表面,以便在机器操作过程中维持机器组件的更佳的润滑性。
IV.涂布的金属基底和生物传感器器件
本部分考虑本发明应用于诊断器件,其中,使分析物-特异性目标化合物(例如受体)通过本发明的菌毛蛋白肽附着于检测表面。在检测表面是与菌毛蛋白肽共价结合(通过与金属表面的电子相互作用)的金属时,所述器件可以电子生物传感器模式起作用,如下所述。
IVA.具有其价结合的化合物的金属基底
本发明的该方面包括金属基底,化合物(例如受体)通过以下方式共价附着于所述金属基底表面,(i)如上所述,菌毛蛋白肽共价附着于基底,且化合物直接地或间接地共价附着于菌毛蛋白,即,通过菌毛蛋白-化合物偶联物。或者通过首先使未偶联的菌毛蛋白肽与金属表面接触、随后使化合物与结合的菌毛蛋白共价连接,或者通过首先形成菌毛蛋白-化合物偶联物、随后使该偶联物与金属表面结合(如上针对未偶联的菌毛蛋白肽所述的)来形成涂布的基底。使化合物与菌毛蛋白肽共价连接的方法,例如通过经氨基或羧基基团直接化学偶合或使用双功能偶合试剂,是众所周知的。化合物本身是肽时,可通过重组合成法或固相合成法作为融合蛋白形成菌毛蛋白-化合物偶联物。由于菌毛蛋白与金属表面的结合,涂布的基底已改变表面电学性质,支持本发明进行的研究(下面详细叙述)显示,通过分析物相关分子和与表面结合的化合物的结合调节通过基底表面的电流,使通过通过基底的电流的改变来记录此类结合事件成为可能。如以下将看到的,还可以使化合物间接地共价附着于基底,例如通过E/K卷曲螺旋复合物。
IVB.具有与菌毛蛋白结合的基底的生物传感器器件
图18A和18B显示根据本发明的一个实施方式构造的生物传感器分析器件32。该器件利用通过金属检测板34上的菌毛蛋白-肽涂层观察到的改变的电学性质。即,板34由当涂布菌毛蛋白肽时具有改变的电学表面性质的金属(例如不锈钢、锡、铁或钛)形成。如上,通过使板表面与以上的菌毛蛋白肽36和分析物-结合部分38的偶联物接触,或 通过使化合物与已结合的未偶联的菌毛蛋白肽连接来形成菌毛蛋白涂层。板本身形成浅的生物传感器反应容器41的下表面,所述容器的侧部由该器件中的壁40形成,容器中部分填充水性导电介质42。
该器件中的生物传感器电路包括伸入容器中的电极44、电源46和电流表48,其中,相反的电路连接位于检测板的下面。
图19和20显示生物传感器的两种表面结构。在图19中,受体(配体结合)分子(R)与菌毛蛋白肽(钩形部分)共价连接,菌毛蛋白肽反过来与生物传感器表面共价偶合。通过(i)菌毛蛋白肽与基底表面的结合相互作用和(ii)受体R对导电性的影响来确定生物传感器基底上的导电率。当配体L(例如分析物)与受体结合时,表面上的电学性质进一步受到调节,造成观察的生物传感器电流的改变。图21中所示的电流改变是在配体与受体结合后从较大的电流变为较小的电流。
在图20中,通过菌毛蛋白/K螺旋偶联物与基底表面的共价结合,随后与受体-E螺旋偶联物的卷曲螺旋相互作用,受体R间接地与基底表面偶合。在该实施方式中,形成生物传感器表面涂层的偶联物是菌毛蛋白肽和K螺旋、与受体R和可与R结合的配体L偶联的E螺旋的三元偶联物。在该实施方式中,生物传感器首先与分析物反应,使分析物与涂层结合,掩蔽表面的K螺旋位点。该反应可作为因K-螺旋的掩蔽造成的电流改变被直接读取,或者可在此阶段加入E-螺旋试剂以便与E-螺旋结合,所述E螺旋与分析物反应后仍未掩蔽的K-螺旋的量成比例。
图22A和22B是生物传感器相互作用的伏安循环曲线(voltameter cycle curve),其中,组氨酸(His)部分(受体)通过图20中所示的卷曲螺旋构型与基底表面结合。图22A显示与E-螺旋复合的K-螺旋上展示的组氨酸部分的完整的循环伏安曲线(cyclic voltalmetry curve),所述E-螺旋在加入专门针对该组氨酸部分的抗组氨酸抗体后通过菌毛蛋白结构本身与不锈钢共价连接。图22B显示循环伏安曲线的左手部分的放大图,证明不仅在正偏压下而且在负偏压中通过抗体与组氨酸部分 的结合改变了电流。抗组氨酸抗体与组氨酸受体的结合产生最低的电流循环,证明随着“分析物”与生物传感器表面的结合电流下降了。当组氨酸受体通过菌毛蛋白肽直接与生物传感器表面结合时,获得类似的结果,所采用的分析物是抗组氨酸抗体。
为了理解传感器的运作,考虑来自下表2的抗腐蚀性数据是有用的,表2显示以下各项的Icorr、Ecorr、腐蚀速率和Rp数据:(i)未涂布的不锈钢板(未改性的)、(ii)用与E-螺旋(带负电荷的亮氨酸拉链)肽偶联的菌毛蛋白肽(E-PAK)的不锈钢板、(iii)用已经与带相反电荷的K-螺旋肽结合的相同的偶联物(即肽与E-螺旋/K-螺旋异二聚体偶联)(K-E-PAK)涂布的第三不锈钢板。考虑Icorr栏,该数据显示E-PAK与板结合显著增加其Icorr值,与对单独的PAK菌毛蛋白观察到的作用相反(见表9A)。当偶联物是被中和的(K-E-PAK)时,Icorr值远小于未涂布的金属,类似于针对未偶联的多肽观察到的作用。从该数据观察到对Ecorr、腐蚀速率和Rp值的类似的作用,即,通过与带相反电荷的K螺旋的结合来中和E-螺旋的作用大幅度地改变E-PAK菌毛蛋白结合产生的表面效应。
表2.不锈钢上菌毛蛋白偶联物的抗腐蚀性数据
Icorr | Ecorr | 腐蚀速率 | Rp | |
(nAmps) | (mV) | (mpy) | (Ohms/cm2) | |
E-PAK | 1940 | 87.2 | 0.1981 | 121.722 |
K-E-AK | 273 | 36.1 | 0.2492 | 130.145 |
未改性的 | 802 | 4.2 | 0.0547 | 303.141 |
从以上的说明可理解生物传感器的各种优点。首先,因为使分析物结合受体与生物传感器表面直接共价连接的菌毛蛋白肽影响生物传感器表面的电子活力,所以,通过配体结合改变表面复合物的大小和电荷产生直接的效应,例如电流减小。第二,分子与金属表面的相互作用从根本上不同于与塑料的相互作用,金属表面电子与分子直接相互作用的电子活力或能力决定相互作用的程度和力。不形成氧化物 层的金属(诸如金)具有非常活跃的表面电子(由于晶体的边缘效应的缘故)并容易将材料吸收至它们的表面。这些材料易感于蛋白质和来自样品基质的其他分子的非特异性吸附并因此不能用作生物传感器平台。金属(诸如不锈钢)经历表面氧化以形成钝态的氧化物层(钝化的),最大程度减少非特异性结合事件并且不容易使材料与它们的表面结合(因此它们可广泛用于医药和食品行业)4-6。生物传感器应用中,使用T4P17肽容易地使特异性肽/蛋白质组分与钝化的不锈钢结合的能力对改善检测配体-受体相互作用中的信噪比(signal to noise ratio)具有重大优势。如上所述,T4P17与不锈钢结合介导电子转移并可在接触偏压时起到生物传感器的作用。以上报道的研究证明了响应配体与结合于金属表面的菌毛蛋白-受体偶联物的结合来调节通过生物传感器表面的电子流的能力。
IVE.具有与菌毛蛋白结合的基底的普通分析器件
图23A和23B显示分析物-检测器件16,其具有上检测表面用菌毛蛋白肽20和分析物-特异性目标分子22的偶联物涂布的板18。虽然所述板可以由与菌毛蛋白肽结合的各种材料形成。但是,其优选是与菌毛蛋白共价结合的金属诸如不锈钢、锡、铁和钛表面。这种共价结合在生产的容易、蛋白质稳定性和涂层稳定性方面提供多种优点。所述器件中还包括用于照射检测表面(如25处显示的)的光束源24(例如UV光源)和光检测器26。
在操作中,检测板的表面覆盖含有感兴趣的分析物的流体样品,在图12B中显示为可溶性的分析物分子30,使这些与检测表面上的分析物-特异性分子22反应。在显示的荧光检测器中,反应混合物可以含有荧光标记的抗体或能特异性地与结合于检测表面的分析物反应的其他结合试剂。然后,洗涤检测表面以除去未结合的组分。现在分析反应表面的结合的荧光的存在和水平(如图12B中所示,在27处显示发射的荧光)来完成分析。
将理解,方便的荧光分析可以并入该器件中。例如,菌毛蛋白肽可以含有荧光部分且分析物-结合部分可以包括有效地淬灭来自菌毛蛋白荧光部分的荧光的荧光淬灭剂。在该实施方式中,分析物与分析物结合部分的结合有效地掩蔽淬灭剂的作用,在发生分析物与分析物结合部分结合时产生更强的荧光。
在一个替代的实施方式中,菌毛蛋白肽和分析物结合部分可分别包括第一和第二荧光物质,当在给定的激发波长下激发时,它们有效地产生荧光共振能量转移。在该构造中,分析物与分析物结合物质的结合有效地抑制此类能量转移,减少观察到的荧光。
V.具有涂布的金属表面的医疗器件
以上报道的关于肽与某些金属表面(例如不锈钢、锡、铁和钛表面)结合的研究证明,菌毛蛋白肽的结合改变金属的表面电学性质,表明肽和金属之间共价(电子共享)键的形成。这个发现提供了使生物活性分子(例如肽、脂质、核酸和代谢物)或药物分子共价附着于不锈钢、锡、铁和钛表面的新的方法,和具有通过菌毛蛋白肽使生物活性化合物共价附着于显露的器件的金属表面的新的医疗器件。
所述方法中考虑的其他金属是元素周期表第4-6行、第9-12列的过渡金属,包括钴、镍、铜、锌、钌、铑、钯、银、镉、锇、铂、金和汞,它们的混合物和合金、准金属硅和锗和它们的氧化物。
在该方法中,使金属表面与含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个附加的残基的合成的菌毛蛋白肽接触。
如果事先已经制备菌毛蛋白肽以包括共价连接的生物活性分子,单独的接触步骤导致生物活性分子共价附着于金属表面。制备肽(在该例子中是菌毛蛋白肽)与生物活性分子的偶联物的方法是众所周知的,包括形成肽和肽生物活性分子的融合蛋白和使用特异性的化学改 性反应来提供使生物活性分子与肽共价连接的反应位点。例如,菌毛蛋白肽的固相合成法中的最后步骤可以包括加入可用于与生物活性分子的共价反应的反应性基团(例如醛)。
或者,可在肽附着于金属表面之后使生物活性分子与菌毛蛋白肽反应,再次采用常规的双官能团试剂或特异性的化学基团反应化学以便使生物活性分子与金属表面上结合的菌毛蛋白共价偶联。
另一个应用(用于获得感兴趣的多肽)通过首先合成含有上述类型菌毛蛋白肽与感兴趣的多肽的融合蛋白(例如通过重组多肽合成法)来实施。然后,使该融合蛋白与不锈钢、锡、铁、钛、铬、塑料、玻璃、硅酸盐、陶瓷或它们的混合物形成的固体载体接触,由此通过菌毛蛋白肽部分与载体的连接使融合蛋白附着于载体上。
在洗涤载体以便除去未结合的物质后,用能从结合的菌毛蛋白肽上特异性地断裂感兴趣的多肽的试剂处理载体。这可以包括用能特异性地断裂融合蛋白中确定序列的连接头的蛋白水解酶处理载体,或用能特异性断裂融合蛋白中的连接头的化学的或辐射能源处理载体。然后,以充分纯化的形式从载体上洗提或洗脱释放的感兴趣的多肽
结合法的另一个应用是制备具有希望的表面性质或在其表面上携带希望的生物活性分子的可植入器件。例如,根据本发明的骨植入物包括不锈钢或钛植入结构,该结构的一部分设计成放置于骨区内或倚靠着骨区。为了促进骨与植入物的连接,用上述的合成菌毛蛋白肽和骨形态形成因子(例如RGD或骨形态形成因子BMP2-BMP7)的偶联物涂布该部分。
在相关的应用中,将菌毛蛋白肽施加于金属或聚合物支架的表面,产生具有改善的表面性质(例如较小的促进表面反应的倾向)的本发明的支架,所述表面反应可导致血管内植入位点处的不希望的凝血或瘢痕化。所述涂层可替代地由菌毛蛋白肽和生物活性分子的偶联物形成,例如具有生物可释放连接头(例如菌毛蛋白和药物之间的酯连接头)的菌毛蛋白-limus药物偶联物。
如以下将看到的,涂布的金属表面显著减少了身体能达到的抗器件的炎性反应。
VI.具有减少的炎性反应的医疗器件
除了由感染或细胞损伤/应力介导的发炎以外,大量的医原性发炎是由医疗器械引起的。人组织、细胞和蛋白质暴露于非生物相容的医疗器件引发功能失调性宿主反应,其临床效应被大大低估。例子包括医疗假体(包括血管移植物(vascular graft)、人造关节和其它可植入器件)***后的组织反应和功能失调性伤口愈合。类似地,白细胞和凝血***的激活导致有规律地接触体外循环(诸如心肺旁路和血液透析)的垂危病人的高发病率。这些事件进一步影响罹患急性和慢性疾病的病人的愈合、再生和康复。
根据本发明的另一个方面,已发现对医疗器件中使用的某些金属(例如钛)的炎性反应,通过用D-氨基酸、D-和L-氨基酸的混合物和逆向-反转(RI)型的D-氨基酸形成的菌毛蛋白肽涂布金属表面。在一个研究中,使人外周血单核细胞(PBMC)在标准的细胞培养条件下单独或在钛或不锈钢板(其或是未涂布的或用D-型菌毛蛋白肽涂布)的存在下保温。于37℃在RPMI介质中保温24小时后,分析培养介质的细胞因子IL-1β,其是PBMC中炎性反应的指示物。分析作为内部处理(housekeeping)对照的微管蛋白。图25A显示对五个样品中每一个测定的IL-1β和微管蛋白的蛋白质印迹。如看到的,D-型菌毛蛋白肽涂层有效地抑制不锈钢和钛样品中的炎性反应。在图25B中显示的柱形图中可定量看到针对钛样品的这种作用。
进行类似的研究以便测试人THP-1巨噬细胞对相同样品的炎性反应,但是包括由用代表非结合的菌毛蛋白肽序列的对照肽1或2涂布的不锈钢或钛形成的附加的样品。随后,于37℃在RPMI介质中使涂布和未涂布的样品与THP-1巨噬细胞保温72小时。随后,分析培养介质和细胞裂解物的细胞因子IL-1β和内部处理蛋白质微管蛋白。在图26A中 的两种蛋白质印迹给出了结果。如看到的,单独的钛激发强炎性反应,但D-型菌毛蛋白涂层大幅减少这种炎性反应。图26B中给出的针对不锈钢样品的量化程度更高的图显示,虽然对未涂布的不锈钢的炎性反应相当小,但是,D-多肽涂层抑制了该作用。从两个对照多肽样品(其显示中等的和强的反应)可明白,D-型菌毛蛋白涂层的作用是相当特异性的。
在一个方面,本发明包括具有当植入身体中时暴露于炎性反应细胞的表面的医疗器件,其中,这些表面用含有(i)衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环,和(ii)位于所述环的N-末端侧或C-末端侧的0-10个、优选地0-5个附加的残基,且(iii)由D-氨基酸、D-和L-氨基酸的混合物或逆向-反转(RI)型的D-氨基酸组成的合成的菌毛蛋白肽涂布。
图24A-24D中的结合研究证明D-型菌毛蛋白肽与各种医疗器件和器件表面(包括不锈钢(图24A)、铬钴支架(图24B)、乳胶导管(图24C)和硅氧烷静脉导管(图24D))紧密结合。在各例子中,样品或者未涂布(图24中的空白的柱)、或者涂布了对照的打乱的菌毛蛋白序列(带阴影线的柱)或D-型菌毛蛋白肽。随后,洗涤样品并通过上述HRT分析法分析样品的结合的蛋白质。对所有样品,结合的菌毛蛋白肽的水平远高于对照的水平,不锈钢显示形成结合程度最高的涂层。本发明包括植入或暂时植入受试者身体的其它医疗器件,包括金属和非金属的支架、由各种可弯曲的材料形成的导管、支托在导管末端的器具和心脏瓣膜和其它血管瓣膜,其中,所述器件包括暴露于体内的炎性反应的表面并且涂布了D-型或RI型菌毛蛋白肽。
在一个相关的方面,本发明还包括通过在植入器件之前用合成的菌毛蛋白肽涂布器件的显露的表面来抑制对植入受试者内的医疗器件的炎性反应的方法,所述合成的菌毛蛋白肽含有(i)衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环、(ii)位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个、优选地0-5个附加的残 基、且(iii)由D-氨基酸、D-和L-氨基酸的混合物或逆向-反转(RI)型的D-氨基酸组成。
虽然已经针对具体的实施方式和应用说明了本发明,但是,应理解,在不脱离本发明的情况下可做出各种修改。
图1A
图1B
图1C
图1D
Claims (26)
1.使化合物共价附着于由不锈钢、锡、铁或钛形成的基底的一个或多个显露的表面上的方法,所述方法包括:
使所述基底的显露的表面与含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个附加的残基的合成的菌毛蛋白肽接触,由此使所述菌毛蛋白肽与所述显露的表面共价结合,和
在所述接触和结合之前或之后,使所述化合物与菌毛蛋白肽共价连接。
2.权利要求1的方法,其中,所述基底表面具有显露的晶粒边界区,所述接触有效地使所述化合物优先定位于显露的晶粒边界区。
3.权利要求1的方法,其中,所述菌毛蛋白肽由L-氨基酸形成。
4.权利要求1的方法,其中,所述菌毛蛋白肽由D-氨基酸、D-和L-氨基酸的混合物或逆向-反转(RI)型的D-氨基酸形成。
5.权利要求1的方法,其中,所述菌毛蛋白肽含有被称为SEQ IDNO:10的序列。
6.权利要求5的方法,其中,所述菌毛蛋白肽含有被称为SEQ IDNO:3、4或9的序列。
7.权利要求1的方法,其中,所述化合物选自肽、寡糖、脂质、核酸和小的有机分子。
8.权利要求1的方法,其中,所述材料是多孔的或网状的,且所述涂布有效地使所述菌毛蛋白肽与由所述材料内的孔或网眼确定的内表面结合。
9.通过权利要求1的方法形成的具有共价附着的化合物的不锈钢、锡、铁或钛基底,其中,所述基底由于所述菌毛蛋白肽与所述基底表面的结合而具有改变的电子逸出功,且所述化合物与所述菌毛蛋白肽共价连接。
10.权利要求10的基底,其是可植入医疗器件的一部分。
11.采用权利要求10的基底的生物传感器器件,其还包括用于检测响应分析物相关配体与表面结合的受体的结合的通过基底表面的电流变化的检测器,其中,所述受体或者是所述化合物本身,或者通过与所述化合物的高亲和性连接与所述化合物连接。
12.权利要求11的生物传感器器件,其中,所述共价结合的化合物是K或E螺旋,且所述受体通过E/K卷曲螺旋复合物与所述表面结合。
13.在处理表面具有显露的晶粒边界区的不锈钢、锡、铁或钛金属材料的方法中为了降低所述材料的腐蚀速率的改进,其包括:
使所述材料中的显露的表面边界区与合成的菌毛蛋白肽在有效地使显露的晶粒间界区的电子逸出功变化至少0.2EFW单位并使显露的晶粒间界区的硬度增加至少20%的条件下接触,所述合成的菌毛蛋白肽含有衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环并含有位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个附加的残基,所述硬度通过用原子力显微镜的尖端以给定力冲击金属表面产生的纳米刻痕来测定。
14.权利要求13的改进,其中,所述金属材料是不锈钢,且所述接触步骤使被涂布表面的腐蚀速度降低了至少30%,所述腐蚀速率通过通过所述表面的腐蚀电流来测定。
15.权利要求13的改进,其中,所述金属材料是多孔的或网状的,且实施所述接触步骤以便使所述菌毛蛋白肽与由所述材料内的孔或网眼确定的内表面结合。
16.权利要求13的改进,其中,所述金属材料具有显露的晶粒边界区,且所述接触步骤有效地使所述菌毛蛋白肽与所述晶粒边界区选择性地结合,由此通过优先保护金属表面的晶粒边界区处的表面来增强金属表面的硬度和抗腐蚀性。
17.权利要求13的改进,其中,所述菌毛蛋白肽由L-氨基酸形成。
18.权利要求13的改进,其中,所述菌毛蛋白肽由D-氨基酸、L-和D-氨基酸的混合物或逆向-反转(RI)型的D-氨基酸形成。
19.权利要求13的改进,其中,所述菌毛蛋白肽含有被称为SEQID NO:10的序列。
20.权利要求19的改进,其中,所述菌毛蛋白肽含有被称为SEQID NO:3、4或9的序列。
21.抑制对设计成植入受试者内的医疗器件的炎性反应的方法,所述方法包括:
在植入所述器件之前,用合成的菌毛蛋白肽涂布所述器件的显露的表面,所述合成的菌毛蛋白肽含有(i)衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白的C-末端受体结合蛋白的二硫环、(ii)位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两个末端侧的0-10个附加的残基且(iii)由D-氨基酸、D-和L-氨基酸的混合物或逆向-反转(RI)型D-氨基酸组成。
22.权利要求21的方法,其中,所述菌毛蛋白肽含有被称为SEQID NO:10的序列。
23.权利要求22的方法,其中,所述菌毛蛋白肽含有被称为SEQID NO:3、4或9的序列。
24.权利要求20的方法,其中,所述医疗器件是以下中一种:(i)具有外表面用所述菌毛蛋白肽涂布的管的留置导管、(ii)具有用所述菌毛蛋白肽涂布的外部不锈钢、锡、铁或钛表面的假体器件和(iii)具有用所述菌毛蛋白肽涂布的外部不锈钢、钛或聚合物表面的血管内支架。
25.当植入身体中时具有暴露于炎性反应细胞的表面的医疗器件,其中,此类表面用含有(i)衍生自IV型绿脓杆菌(T4P)菌毛蛋白肽的C-末端受体结合蛋白的二硫环,和(ii)位于所述环的N-末端侧或C-末端侧或这两末端侧的0-10个附加的残基,且(iii)由D-氨基酸、D-和L-氨基酸的混合物或逆向-反转(RI)型D-氨基酸组成的合成的菌毛蛋白肽涂布。
26.权利要求25的器件,其中,在植入后暴露于炎性反应细胞的表面是不锈钢、锡、铁或钛表面。
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