JP5978579B2 - γ‐Glu‐X‐Yの製造方法 - Google Patents
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ルシステイン合成酵素はGSH1遺伝子またはgshA遺伝子に、グルタチオン合成酵素はGSH2遺伝子またはgshB遺伝子にコードされていることが知られており、その性質が調べられてきた。
(2)γ‐Glu‐X(XはCysおよびその誘導体を除くアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す)およびY(Yはアミノ酸またはアミノ酸誘導体)を含有する原料に、グルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Glu‐X‐Yを生成する工程を含む、γ‐Glu‐X‐Yの製造方法。
(3)前記グルタチオン合成酵素および/またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が、該酵素の活性を有する微生物の培養物または該培養物の処理物である、前記γ‐Glu‐X‐Yの製造方法。
(4)前記グルタチオン合成酵素および/またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が精製された酵素である、前記γ‐Glu‐X‐Yの製造方法。
(5)前記グルタチオン合成酵素および/またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が固定化酵素である、前記γ‐Glu‐X‐Yの製造方法。
(6)前記グルタチオン合成酵素および/またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・ユチリス(Candida utilis)、およびエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)からなる群より選ばれる微生物由来である、前記γ‐Glu‐X‐Yの製造方法。
(7)グルタチオン合成酵素遺伝子および/またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の発現が強化されている微生物を、Glu、X(XはCysおよびその誘導体を除くアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す)、およびY(Yはアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す)からなる群より選ばれる少なくとも1種のアミノ酸および/またはアミノ酸誘導体が添加された培地で培養し、培地中にγ‐Glu‐X‐Yを生成および蓄積させ、培養物中からγ‐Glu‐X‐Yを採取することを特徴とする、γ‐Glu‐X‐Yの製造方
法。
(8)Glu、X(XはCysおよびその誘導体を除くアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す)、およびY(Yはアミノ酸またはアミノ酸誘導体を表す)からなる群より選ばれる少なくとも1種のアミノ酸および/またはアミノ酸誘導体を生産する能力を有し、且つ、グルタチオン合成酵素遺伝子および/またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の発現が強化されている微生物を培養し、培地中にγ‐Glu‐X‐Yを生成および蓄積させ、培養物中からγ‐Glu‐X‐Yを採取することを特徴とする、γ‐Glu‐X‐Yの製造方法。
(9)前記微生物が、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、前記γ‐Glu‐X‐Yの製造方法。
(10)前記エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒア・コリであり、前記コリネバクテリウム属に属する微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムである、前記γ‐Glu‐X‐Yの製造方法。
(11)前記グルタチオン合成酵素遺伝子および/またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子がサッカロマイセス・セレビジエ、カンジダ・ユチリス、およびエシェリヒア・コリからなる群より選ばれる微生物由来である、前記γ‐Glu‐X‐Yの製造方法。(12)前記YがGlyである、前記γ‐Glu‐X‐Glyの製造方法。
(13)前記XがValである、前記γ‐Glu‐Val‐Glyの製造方法。
(14)前記XがnValである、前記γ‐Glu‐nVal‐Glyの製造方法。
本発明により、γ‐グルタミルトリペプチドであるγ‐Glu‐X‐Yを製造することができる。γ‐Glu‐X‐Y中のGluは、グルタミン酸を示す。また、「‐」はペプチド結合を表す。γ‐Gluの「γ」とは、グルタミン酸のγ位のカルボキシル基を介してXが結合していることを意味する。
本発明に用いられるグルタチオン合成酵素は、γ‐Glu‐Xを基質として認識し、Yと結合させることでγ‐Glu‐X‐Yを生成する反応を触媒する活性を有する限り特に限定されない。本発明において、当該反応を触媒する活性を、グルタチオン合成酵素活性という。なお、本発明に用いられるグルタチオン合成酵素は、あらゆるXおよびYに関してグルタチオン合成酵素活性を示す必要はなく、Xとして選択されたアミノ酸またはアミノ酸誘導体およびYとして選択されたアミノ酸またはアミノ酸誘導体に関してグルタチオン合成酵素活性を示せばよい。また、複数種のγ‐Glu‐X‐Yが製造される場合に、単一のグルタチオン合成酵素が当該複数種のγ‐Glu‐X‐Y全てを生成する反応を触媒する活性を有する必要はなく、Xおよび/またはYに応じて複数種のグルタチオン合成酵素を利用してもよい。なお、本発明において、グルタチオン合成酵素は、γ‐Glu‐Cysまたはγ‐Glu‐Cys誘導体と、Glyとから、GSHまたはγ‐Glu‐Cys誘導体‐Glyを生成する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
を示す必要はなく、Xに応じて複数種のγ‐グルタミルシステイン合成酵素を利用してもよい。なお、本発明において、γ‐グルタミルシステイン合成酵素は、Gluと、CysまたはCys誘導体とから、γ‐Glu‐Cysまたはγ‐Glu‐Cys誘導体を生成する反応を触媒する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
合成酵素をコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、それらをコードする遺伝子は、配列番号1,7,11,または17に示す塩基配列のバリアントであってもよい。各遺伝子のバリアントは、配列番号1,7,11,または17に示す塩基配列を参考にして、BLAST等によって検索出来る(http://blast.genome.jp/)。また、各遺伝子のバリアントは、各遺伝子のホモログを含む。各遺伝子のホモログとしては、任意の生物、例えば酵母等の真核微生物、あるいは腸内細菌やコリネ型細菌等の細菌の染色体を鋳型にして、例えば配列番号1,7,11,または17の塩基配列に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRで増幅可能な遺伝子が挙げられる。
得るプローブ、例えば配列番号1,7,11,または17に示す塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、グルタチオン合成酵素活性またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは、60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度、温度で、1回、より好ましくは2〜3回洗浄する条件が挙げられる。
本発明に用いられる酵素を取得する方法は特に限定されない。本発明に用いられる酵素は、該酵素の活性を有する生物、例えば、該酵素の活性を有する微生物の野生株または変異株から調製することができる。また、本発明に用いられる酵素は、該酵素の活性が増強された生物から調製することができ、そのような生物としては、遺伝子工学的手法により本発明に用いられる酵素をコードする遺伝子の発現が増強された形質転換体が挙げられる。なお、「酵素の活性が増強される」とは、本来的に該酵素の活性を有する微生物において該酵素の活性を増大させることに限られず、本来的には該酵素の活性を有さない微生物に該酵素の活性を付与することを含む。
ー等が挙げられる。また、強力なプロモーターへの置換は、後述する遺伝子の翻訳効率の向上や遺伝子のコピー数の増加と組み合わせて利用できる。
本発明のγ‐Glu‐X‐Yの製造方法(以下、本発明の方法ともいう)は、グルタチオン合成酵素の活性を利用することを特徴とする。
γ‐Glu‐X‐Yは、酵素を用いた酵素法により製造することができる。
キナーゼとポリリン酸を添加する方法(J. Biosci. Bioeng., 91, 557‐563 (2001))、およびクレアチンホスホリラーゼとクレアチンリン酸を添加する方法等が挙げられる。
γ‐Glu‐X‐Yは、上述の酵素法に限られず、微生物を用いた発酵法によっても製造することができる。
せ、菌体内および/または培養液中にγ‐Glu‐X‐Yを蓄積させることができる。基質として用いられるGlu、X、およびYは、培地に添加されてもよく、用いられる微生物により生合成されてもよい。γ‐グルタミルシステイン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の活性を有する微生物は、γ‐グルタミルシステイン合成酵素および/またはグルタチオン合成酵素の活性が増強されている微生物であるのが好ましい。
れたodhA欠損株に、V197M変異を有するmviN遺伝子を導入した組換え株(特開2010‐161970)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来gltA(クエン酸シンターゼ)遺伝子を導入したパントエア・アグロメランスAJ13355株(特許第4285582号)、エシェリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株(米国特許出願公開第2003‐0148474号明細書)などが例示できる。L‐バリン生産菌としては、エシェリヒア・コリVL1970株(米国特許第5658766号)、エシェリヒア属に属し、生育のためにリポ酸を要求する変異および/またはH+‐ATPaseを欠損する変異を有する菌株、および、これらの性質に加えて、少なくともilvG、ilvM、ilvEおよびilvDの各遺伝子を発現し、且つ、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないilvGMEDAオペロンを含むDNA断片が細胞内に導入されたエシェリヒア属細菌(WO96/06926)などが例示できる。
サッカロマイセス・セレビシエS288C株(ATCC No.26108)のグルタチオン合成酵素をコードするGSH2遺伝子の発現プラスミドpET‐GSH2を以下の手順で構築し、エシェリヒア・コリに導入した。なお、構築手順の概要を図1に示す。
まず、酵母用発現プラスミドpAUR‐GSH2を、タカラバイオに委託し、以下の手順で構築した。
続いて、エシェリヒア・コリ用発現プラスミドpET‐GSH2を以下の手順で構築した。
GSH2と命名した。なお、サッカロマイセス・セレビシエS288C株由来GSH2遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号1および配列番号2に示す。
実施例1で得られたエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET‐GSH2を100μg/mlのアンピシリンを含む3mLのLB培地の入った試験管に接種し37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液のうち2mlを100mlのLB培地が入った試験管に接種した。37℃で2時間振とう培養後、終濃度が0.5mmol/Lになるようにイソプロピル‐β‐D‐チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して、さらに30℃で4時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
Fast Flow(GE Healthcare社製)を用い、マニュアルに従いHisタグ付加組換え型Gsh2を精製し、続いて、PD‐10カラム(GE Healthcare社製)を用いて、マニュアルに従い脱塩を行った。この精製および脱塩されたGsh2を、精製Gsh2として以降の実験に用いた。
実施例2で取得したサッカロマイセス・セレビシエS288C株由来の精製Gsh2を用い、γ‐グルタミルバリン(γ‐Glu‐Val)あるいはγ‐グルタミルノルバリン(γ‐Glu‐nVal)を基質とするγ‐グルタミルトリペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液(pH8.0)200μlをそれぞれ調製し、37℃で16時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製Gsh2 12.4μg/200μl
Tris‐HCl(pH8.0) 100 mmol/L
γ‐Glu‐Valまたはγ‐Glu‐nVal 12.5mmol/L
グリシン 12.5mmol/L
アデノシン三リン酸(ATP) 12.5mmol/L
硫酸マグネシウム 12.5mmol/L
ジチオスレイトール(DTT) 2 mmol/L
(2)分離カラム:Synergi 4μ Hydro‐RP 80A、内径4.6mm、長さ250mm、粒子径4μm(Phenomenex社製)
(3)カラム温度:40℃
(4)移動相A:50mMリン酸バッファー(pH2.5)
(5)移動相B:アセトニトリル
(6)流速:1.0ml/min
(7)溶出条件:溶出は、移動相Aおよび移動相Bの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Bの比率は以下の通りである。0分(0%)、0分〜5分(0%〜2.5%)、5分〜15分(2.5%)、15分〜30分(2.5%〜40%)、30分〜30.1分(40%〜0%)、30.1分〜50分(0%)。
(8)検出:UV210nm
(1)HPLC:Agilent1200シリーズ
(2)分離カラム:Unison UK‐Phenyl、内径2.0mm、長さ100mm、粒子径3μm(Imtakt社製)
(3)カラム温度:40℃
(4)移動相A:25mMギ酸水溶液をアンモニア水でpH6.0に調整した水溶液
(5)移動相B:メタノール
(6)流速:0.25ml/min
(7)溶出条件:溶出は、移動相Aおよび移動相Bの混合液を用いて行った。混合液に対する移動相Bの比率は以下の通りである。0分(5%)、0分〜17分(5%〜40%)、17分〜17.1分(40%〜80%)、17.1分〜19分(80%)、19分〜19.1分(80%〜5%)、19.1分〜27分(5%)。
(2)検出モード:Selected Ion Monitoring(ポジティブイオンモード)
(3)選択イオン:表1
エシェリヒア・コリK‐12 W3110株のグルタチオン合成酵素をコードするgshB遺伝子の発現プラスミドpET‐gshBを以下の手順で構築した。なお、構築手順の概要を図2に示す。
実施例4で得られたエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET‐gshBを100μg/mlのアンピシリンを含む5mLのLB培地の入った試験管に接種し37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液のうち1mlを50mlのLB培地が入った試験管に接種した。37℃で2時間振とう培養後、終濃度が1mmol/Lになるようにイソプロピル‐β‐D‐チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して、さらに37℃で3時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
実施例5で取得したエシェリヒア・コリK‐12 W3110株由来の精製GshBを用い、γ‐グルタミルバリン(γ‐Glu‐Val)あるいはγ‐グルタミルノルバリン(γ‐Glu‐nVal)を基質とするγ‐グルタミルトリペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液(pH8.0)200μlをそれぞれ調製し、37℃で16時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製GshB 43.6μg/200μl
Tris‐HCl(pH8.0) 100 mmol/L
γ‐Glu‐Valまたはγ‐Glu‐nVal 12.5mmol/L
グリシン 12.5mmol/L
アデノシン三リン酸(ATP) 12.5mmol/L
硫酸マグネシウム 12.5mmol/L
ジチオスレイトール(DTT) 2 mmol/L
スアナライザーでの選択イオンは、表1に記載のγ‐Glu‐nVal‐Glyの選択イオンに準ずる。
カンジダ・ユチリスATCC22023株のγ‐グルタミルシステイン合成酵素をコードするGSH1遺伝子の発現プラスミドpET‐GSH1を以下の手順で構築し、エシェリヒア・コリに導入した。なお、構築手順の概要を図3に示す。
まず、酵母用発現プラスミドpAUR‐GSH1を、タカラバイオに委託し、以下の手順で構築した。
続いて、エシェリヒア・コリ用発現プラスミドpET‐GSH1を以下の手順で構築した。
する約2.0kbのDNA断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液からEthachinmate(ニッポンジーン社製)を用いて該DNA断片を精製し、25μlのdH2Oに溶解した。次に、得られたDNA溶液全量を用い、該DNA断片を制限酵素NheIおよびXhoIで切断した後、MinElute Reaction Cleanup Kitを用いて精製し、15μlのBuffer EBに溶解した。
実施例7で得られたエシェリヒア・コリRosetta2(DE3)pLysS/pET‐GSH1を100μg/mlのアンピシリンおよび30μg/mlのクロラムフェニコールを含む3mLのLB培地の入った試験管に接種し37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液のうち2mlを100mlのLB培地が入った坂口フラスコに接種した。37℃で2時間振とう培養後、終濃度が0.5mmol/Lになるようにイソプロピル‐β‐D‐チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して、さらに30℃で4時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
実施例8で取得したカンジダ・ユチリスATCC22023株由来の精製Gsh1を用い、ノルバリンを基質とするγ‐グルタミルジペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液(pH8.0)200μlを調製し、37℃で16時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製Gsh1 24.6μg/200μl
Tris‐HCl(pH8.0) 100 mmol/L
ノルバリン 12.5mmol/L
グルタミン酸 12.5mmol/L
アデノシン三リン酸(ATP) 12.5mmol/L
硫酸マグネシウム 12.5mmol/L
ジチオスレイトール(DTT) 2 mmol/L
エシェリヒア・コリK‐12 W3110株のγ‐グルタミルシステイン合成酵素をコードするgshA遺伝子の発現プラスミドpQE‐gshAを以下の手順で構築した。なお、構築手順の概要を図4に示す。
W3110株の染色体DNAのgshA遺伝子の開始コドンを含む領域の5’末端にNcoI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーLは、gshA遺伝子のC末端塩基配列と相補的な塩基配列の5’末端にXhoI認識配列を含む塩基配列を付加したものである。
Kitを用いて精製し、15μlのBuffer EB(QIAGEN社製)に溶解した。
実施例10で得られたエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pQE‐gshAを100μg/mlのアンピシリンを含む5mLのLB培地の入った試験管に接種し30℃で16時間振とう培養した。得られた培養液のうち1mlを50mlのLB培地が入った坂口フラスコに接種した。30℃で5時間振とう培養後、終濃度が1mmol/Lになるようにイソプロピル‐β‐D‐チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して、さらに30℃で16時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
実施例11で取得したエシェリヒア・コリK‐12 W3110株由来の精製GshAを用い、バリンあるいはノルバリンを基質とするγ‐グルタミルジペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液(pH8.0)200μlをそれぞれ調製し、37℃で16時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製GshA 38.6μg/200μl
Tris‐HCl(pH8.0) 100 mmol/L
バリンあるいはノルバリン 12.5mmol/L
グルタミン酸 12.5mmol/L
アデノシン三リン酸(ATP) 12.5mmol/L
硫酸マグネシウム 12.5mmol/L
ジチオスレイトール(DTT) 2 mmol/L
実施例11で取得したエシェリヒア・コリK‐12 W3110株由来の精製GshAおよび実施例5で取得したエシェリヒア・コリK‐12 W3110株由来の精製GshBを用い、γ‐グルタミルトリペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液(pH8.0)200μlをそれぞれ調製し、37℃で16時間反応を行ったところ、0.048mmol/Lのγ‐Glu‐Val‐Glyおよび1.2mmol/Lのγ‐Glu‐nVal‐Glyが生成した。
〔反応液組成〕
精製GshA 19.3μg/200μl
精製GshB 21.8μg/200μl
Tris‐HCl(pH8.0) 100 mmol/L
バリンあるいはノルバリン 12.5mmol/L
グルタミン酸 12.5mmol/L
グリシン 12.5mmol/L
アデノシン三リン酸(ATP) 12.5mmol/L
硫酸マグネシウム 12.5mmol/L
ジチオスレイトール(DTT) 2 mmol/L
サッカロマイセス・セレビシエS288C株のγ‐グルタミルシステイン合成酵素をコードするGSH1遺伝子(以下、同遺伝子をScGSH1、同遺伝子にコードされるγ‐グルタミルシステイン合成酵素をScGsh1ともいう)の発現プラスミドpET−ScGSH1を以下の手順で構築し、エシェリヒア・コリに導入した。なお、構築手順の概要を図5に示す。
まず、酵母用発現プラスミドpAUR−ScGSH1を、タカラバイオに委託し、以下の手順で構築した。
導入し、酵母用発現プラスミドpAUR‐ScGSH1を作成した。
続いて、エシェリヒア・コリ用発現プラスミドpET−ScGSH1を以下の手順で構築した。
Cleanup Kitを用いて精製し、10μlのBuffer EBに溶解した。
配列番号22に示す。
実施例14で得られたエシェリヒア・コリRosetta2(DE3)pLysS/pET−ScGSH1を100μg/mlのアンピシリン及び30μg/mlのクロラムフェニコールを含む3mLのLB培地の入った試験管に接種し37℃で16時間振とう培養した。得られた培養液のうち2mlを100mlのLB培地が入った坂口フラスコに接種した。37℃で2時間振とう培養後、終濃度が0.5mmol/Lになるようにイソプロピル−β―D―チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加して、さらに30℃で4時間培養した。培養液を遠心分離して湿菌体を取得した。
実施例15で取得したサッカロマイセス・セレビシエS288C株由来の精製ScGsh1を用い、バリン、ノルバリン、あるいはα‐アミノ酪酸(Abu)を基質とするγ‐グルタミルジペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液(pH8.5)200μlをそれぞれ調製し、30℃で24時間反応を行った。
〔反応液組成〕
精製ScGsh1 40.5μg/200μl
Tris‐HCl(pH8.5) 50 mmol/L
バリン、ノルバリン、またはα‐アミノ酪酸 10 mmol/L
グルタミン酸 10 mmol/L
アデノシン三リン酸(ATP) 10 mmol/L
硫酸マグネシウム 10 mmol/L
ジチオスレイトール(DTT) 2 mmol/L
グリセロール 20 %(Vol./Vol.)
の生成
実施例15で取得したサッカロマイセス・セレビシエS288C株由来の精製ScGsh1と実施例2で取得したサッカロマイセス・セレビシエS288C株由来の精製Gsh2を用い、γ‐グルタミルトリペプチドの生成を検討した。下記組成の反応液(pH9.0)200μlを調製し、30℃で8時間反応を行ったところ、0.11mmol/Lのγ‐Glu‐Valおよび0.08mmol/Lのγ‐Glu‐Val‐Glyが生成した。
〔反応液組成〕
精製ScGsh1 127 μg/200μl
精製Gsh2 7 μg/200μl
Tris‐HCl(pH9.0) 50 mmol/L
バリン 10 mmol/L
グルタミン酸 10 mmol/L
グリシン 10 mmol/L
アデノシン三リン酸(ATP) 10 mmol/L
硫酸マグネシウム 10 mmol/L
ジチオスレイトール(DTT) 2 mmol/L
グリセロール 20 %(Vol./Vol.)
配列番号1:サッカロマイセス・セレビシエ由来のGSH2遺伝子の塩基配列
配列番号2:サッカロマイセス・セレビシエ由来のGsh2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:サッカロマイセス・セレビシエ由来のGSH2遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー(プライマーA)
配列番号4:サッカロマイセス・セレビシエ由来のGSH2遺伝子を増幅するためのリバースプライマー(プライマーB)
配列番号5:サッカロマイセス・セレビシエ由来のGSH2遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー(プライマーC)
配列番号6:サッカロマイセス・セレビシエ由来のGSH2遺伝子を増幅するためのリバースプライマー(プライマーD)
配列番号7:エシェリヒア・コリ由来のgshB遺伝子の塩基配列
配列番号8:エシェリヒア・コリ由来のGshBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号9:エシェリヒア・コリ由来のgshB遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー(プライマーE)
配列番号10:エシェリヒア・コリ由来のgshB遺伝子を増幅するためのリバースプライマー(プライマーF)
配列番号11:カンジダ・ユチリス由来のGSH1遺伝子の塩基配列
配列番号12:カンジダ・ユチリス由来のGsh1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号13:カンジダ・ユチリス由来のGSH1遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー(プライマーG)
配列番号14:カンジダ・ユチリス由来のGSH1遺伝子を増幅するためのリバースプライマー(プライマーH)
配列番号15:カンジダ・ユチリス由来のGSH1遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー(プライマーI)
配列番号16:カンジダ・ユチリス由来のGSH1遺伝子を増幅するためのリバースプライマー(プライマーJ)
配列番号17:エシェリヒア・コリ由来のgshA遺伝子の塩基配列
配列番号18:エシェリヒア・コリ由来のGshAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号19:エシェリヒア・コリ由来のgshA遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー(プライマーK)
配列番号20:エシェリヒア・コリ由来のgshA遺伝子を増幅するためのリバースプライマー(プライマーL)
配列番号21:サッカロマイセス・セレビシエ由来のGSH1遺伝子の塩基配列
配列番号22:サッカロマイセス・セレビシエ由来のGsh1タンパク質のアミノ酸配列配列番号23:サッカロマイセス・セレビシエ由来のGSH1遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー(プライマーM)
配列番号24:サッカロマイセス・セレビシエ由来のGSH1遺伝子を増幅するためのリバースプライマー(プライマーN)
配列番号25:サッカロマイセス・セレビシエ由来のGSH1遺伝子を増幅するためのフォワードプライマー(プライマーO)
配列番号26:サッカロマイセス・セレビシエ由来のGSH1遺伝子を増幅するためのリバースプライマー(プライマーP)
Claims (9)
- Glu、X、およびYを含有する原料に、グルタチオン合成酵素およびγ‐グルタミルシステイン合成酵素を作用させることによりγ‐Glu‐X‐Yを生成する工程を含む、γ‐Glu‐X‐Yの製造方法であって、
前記γ‐グルタミルシステイン合成酵素が以下のA)〜I)から選ばれるものであり、
A)サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
B)カンジダ・ユチリス(Candida utilis)微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
C)エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
D)配列番号12のアミノ酸配列からなるタンパク質
E)配列番号18のアミノ酸配列からなるタンパク質
F)配列番号22のアミノ酸配列からなるタンパク質
G)配列番号12のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
H)配列番号18のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
I)配列番号22のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
前記グルタチオン合成酵素が以下のJ)〜O)から選ばれるものであり、
J)サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)微生物由来のグルタチオン合成酵素
K)エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)微生物由来のグルタチオン合成酵素
L)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質
M)配列番号8のアミノ酸配列からなるタンパク質
N)配列番号2のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
O)配列番号8のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
前記YがGlyであり、かつ、前記XがVal又はnValである、製造方法。 - γ‐Glu‐XおよびYを含有する原料に、グルタチオン合成酵素を作用させることによりγ‐Glu‐X‐Yを生成する工程を含む、γ‐Glu‐X‐Yの製造方法であって、
前記グルタチオン合成酵素が以下のJ)〜O)から選ばれるものであり、
J)サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)微生物由来のグルタチオン合成酵素
K)エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)微生物由来のグルタチオン合成酵素
L)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質
M)配列番号8のアミノ酸配列からなるタンパク質
N)配列番号2のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
O)配列番号8のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
前記YがGlyであり、かつ、前記XがVal又はnValである、製造方法。 - 前記グルタチオン合成酵素および/またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が、該酵素の活性を有する微生物の培養物または該培養物の処理物である、請求項1または2に記載のγ‐Glu‐X‐Yの製造方法。
- 前記グルタチオン合成酵素および/またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が精製された酵素である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のγ‐Glu‐X‐Yの製造方法。
- 前記グルタチオン合成酵素および/またはγ‐グルタミルシステイン合成酵素が固定化酵素である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のγ‐Glu‐X‐Yの製造方法。
- グルタチオン合成酵素遺伝子およびγ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の発現が強化されている微生物を、Glu、X、およびYからなる群より選ばれる少なくとも1種のアミノ酸および/またはアミノ酸誘導体が添加された培地であって、少なくともXが添加された培地で培養し、培地中にγ‐Glu‐X‐Yを生成および蓄積させ、培養物中からγ‐Glu‐X‐Yを採取することを特徴とする、γ‐Glu‐X‐Yの製造方法であって、
前記γ‐グルタミルシステイン合成酵素が以下のA)〜I)から選ばれるものであり、
A)サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
B)カンジダ・ユチリス(Candida utilis)微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
C)エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
D)配列番号12のアミノ酸配列からなるタンパク質
E)配列番号18のアミノ酸配列からなるタンパク質
F)配列番号22のアミノ酸配列からなるタンパク質
G)配列番号12のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
H)配列番号18のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
I)配列番号22のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
前記グルタチオン合成酵素が以下のJ)〜O)から選ばれるものであり、
J)サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)微生物由来のグルタチオン合成酵素
K)エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)微生物由来のグルタチオン合成酵素
L)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質
M)配列番号8のアミノ酸配列からなるタンパク質
N)配列番号2のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
O)配列番号8のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
前記YがGlyであり、かつ、前記XがVal又はnValである、製造方法。 - Glu、X、およびYからなる群より選ばれる少なくとも1種のアミノ酸および/またはアミノ酸誘導体を生産する能力を有し、Valの生産能が付与または増強され、且つ、グルタチオン合成酵素遺伝子およびγ‐グルタミルシステイン合成酵素遺伝子の発現が強化されている微生物を培養し、培地中にγ‐Glu‐X‐Yを生成および蓄積させ、培養物中からγ‐Glu‐X‐Yを採取することを特徴とする、γ‐Glu‐X‐Yの製造方法であって、
前記γ‐グルタミルシステイン合成酵素が以下のA)〜I)から選ばれるものであり、
A)サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
B)カンジダ・ユチリス(Candida utilis)微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
C)エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)微生物由来のγ‐グルタミルシステイン合成酵素
D)配列番号12のアミノ酸配列からなるタンパク質
E)配列番号18のアミノ酸配列からなるタンパク質
F)配列番号22のアミノ酸配列からなるタンパク質
G)配列番号12のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
H)配列番号18のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
I)配列番号22のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、γ‐グルタミルシステイン合成酵素活性を有するもの
前記グルタチオン合成酵素が以下のJ)〜O)から選ばれるものであり、
J)サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)微生物由来のグルタチオン合成酵素
K)エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)微生物由来のグルタチオン合成酵素
L)配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質
M)配列番号8のアミノ酸配列からなるタンパク質
N)配列番号2のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
O)配列番号8のアミノ酸配列と同一性90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であって、グルタチオン合成酵素活性を有するもの
前記YがGlyであり、かつ、前記XがValである、製造方法。 - 前記微生物が、エシェリヒア属またはコリネバクテリウム属に属する微生物である、請求項6または7に記載のγ‐Glu‐X‐Yの製造方法。
- 前記エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒア・コリであり、前記コリネバクテリウム属に属する微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項8に記載のγ‐Glu‐X‐Yの製造方法。
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