JP5977234B2 - 対象の3−dゲノム領域配列決定戦略 - Google Patents
対象の3−dゲノム領域配列決定戦略 Download PDFInfo
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Description
本発明の一実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)場合によっては、好ましくは制限酵素で、ステップd)のDNAを断片化するステップ、
f)場合によっては、少なくとも1つのアダプターとステップd)又はe)の断片化されたDNAを連結させるステップ、
g)場合によっては、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップd)又はe)のDNAを増幅する、又は少なくとも1つのアダプターとハイブリダイズする少なくとも1つの他のプライマーを使用してステップf)のDNAを増幅するステップ、
h)好ましくはハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップd)、e)、f)又はg)の(増幅された)連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、
i)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップを含む方法を提供する。
別の実施形態では、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)場合によっては、好ましくは制限酵素で、ステップd)のDNAを断片化するステップ、
f)ステップd)又はe)のDNAを環状化するステップ、
g)場合によっては、及び好ましくは、標的ヌクレオチド配列を含む環状化されたDNAを、好ましくは標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用して、増幅するステップ、
h)ハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチドを含む(増幅された)連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、
i)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップを含む方法を提供する。
一実施形態では、2つの標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列を決定するための方法を提供する。この方法は、増幅ステップまでは前述したのと同じステップを含むことができる。ここで増幅ステップは、1つの標的ヌクレオチド配列ではなく2つを使用する。2つの標的ヌクレオチド配列用に、1つのプライマーがそれぞれの標的ヌクレオチド配列用である、2つの異なるプライマーをPCR反応中で使用する。2つの標的ヌクレオチド配列由来の2つのプライマー結合部位が連結DNA断片中に存在するとき、プライマー結合部位が正しい配向を有するという条件で、2つのプライマーは2つのプライマー結合部位間の配列を増幅する。環状化連結DNA断片を有することは有利であり得る。正しい配向を有する2つのプライマー結合部位に関する確率は、線状連結DNA断片と比較して高いからである(線状連結DNA断片に関する4配向の1つと比較して、4配向ののうち2つが増幅する)。さらなる実施形態では、2つの標的ヌクレオチド配列以外に、対象のゲノム領域はさらなる標的ヌクレオチドを含み、それぞれの標的ヌクレオチド用にPCR増幅反応中でプライマーを使用する。一増幅において多重の標的ヌクレオチドと対応するプライマーを組合せることによって、プライマーの組合せがアンプリコンを生成する確率が増大する。
連結DNA断片の配列を決定するステップは、ハイスループット配列決定を含むことが好ましい。ハイスループット配列決定法は当技術分野でよく知られており、原則として本発明中での任意の方法の使用を企図することができる。ハイスループット配列決定技術は、(例えば、Roche、Illumina又はApplied Biosystemsによって提供される)製造者の説明書に従って実施することができる。一般に、配列決定用アダプターを(増幅された)連結DNA断片に連結させることが可能である。例えば本明細書に記載するPCRを使用することにより線状又は環状化断片を増幅する場合、増幅産物は線状であり、アダプターの連結が可能である。アダプター配列の連結に適した末端(例えば、平滑、相補性付着末端)を提供することができる。或いは、PCR又は他の増幅法に使用するプライマー(複数可)は、増幅ステップg)中にアダプター配列を含む増幅産物が形成されるように、アダプター配列を含むことができる。環状化断片が増幅しない場合、標的ヌクレオチド配列を含むDNA断片と連結したDNA断片が完全な状態に保たれるように、例えば好ましくはインバースPCR反応用のプライマー結合部位間の制限酵素を使用することにより、環状化断片を断片化することができる。配列決定用アダプターを、本発明の方法のステップc)及びf)中に含めることもできる。これらの配列決定用アダプターは、これらのステップ中で既に場合によっては使用された可能性があるアダプターのアダプター配列の一部として含めることができ、及び/又は、別の配列決定用アダプターをこれらのステップ中でさらに提供することができる。
さらに本発明の方法に従い、架橋DNAのサンプルから、多重の対象のゲノム領域の配列を決定する。それぞれの対象のゲノム領域用に、それに対応するプライマー(複数可)を設計することができる標的ヌクレオチド配列を提供する。多重の対象のゲノム領域は重複する可能性もある対象のゲノム領域であってよく、したがって配列を決定することができるその大きさは増大し得る。例えば、標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域の配列が1MBを典型的に含み、部分的に重複する対象のゲノム領域と、例えばそれぞれ対応する標的ヌクレオチド配列を含む0.1MBの重複を組合せる場合、5つの対象のゲノム領域の組合せは4.6MB(0.9+3×(0.1+0.8)+0.1+0.9=4.6MB)の配列をもたらし、したがって配列を決定又は他の場合分析することができる対象のゲノム領域の大きさは大幅に増大するであろう。対象のゲノム領域内の明確な距離での多重の標的ヌクレオチド配列を使用して、ゲノム領域全体の平均範囲及び/又は範囲の均一性を増大することもできる。
1)ステップb)の断片を同定するステップ、
2)ゲノム領域に断片を割り当てるステップ、
3)断片の配列からゲノム領域のコンティグを構築するステップを含む。
別の実施形態では、遺伝子突然変異の有無を同定するための方法を提供する。
i)複数のサンプルのコンティグをアラインメントするステップ、
j)複数のサンプル由来の対象のゲノム領域における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法を提供する。
i)参照配列とコンティグをアラインメントするステップ、
j)対象のゲノム領域における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法を提供する。
h)(増幅された)連結DNA断片の決定した配列と参照配列をアラインメントするステップ、
i)決定した配列における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む。
h)複数のサンプルの(増幅された)連結DNA断片の決定した配列をアラインメントするステップ、
i)決定した配列における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法を提供する。
既に前述したように、異種細胞集団(例えば、異なる起源の細胞、又は正常細胞及び遺伝的に突然変異した細胞(例えば、癌細胞)を含む生物由来の細胞)由来の架橋DNAのサンプルが提供されるとき、(例えば、細胞中の異なる対立遺伝子由来の異なるゲノム環境、又は異なる細胞由来の異なるゲノム環境であってよい)異なるゲノム環境に対応するそれぞれの対象のゲノム領域に関して、コンティグを構築することができる。さらに、遺伝子突然変異を保有する断片又は連結DNA断片の割合を決定することができ、それは遺伝子突然変異を保有する対立遺伝子又は細胞の割合と相関し得る。DNA断片の連結はランダムなプロセスであり、連結DNA断片の一部であるDNA断片の集結及び順序は独自であってよく、単細胞及び/又は細胞由来の1つの対象のゲノム領域を表す。さらに、断片化ステップb)が例えば超音波処理などのランダムな断片化プロセスを含む場合、DNAが破壊された点は、特に(独自の断片末端をも有し得る)それと連結する他のDNA断片の文脈内で、他の独自の特徴をもたらす可能性がある。
j)断片における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
k)遺伝子突然変異を保有する断片の数を決定するステップ、
l)遺伝子突然変異を保有していない断片の数を決定するステップ、
m)遺伝子突然変異を保有する断片の割合を計算するステップ、
を含む方法を提供する。
i)ステップb)の断片を同定するステップ、
j)断片における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
k)遺伝子突然変異を有する又は有さない断片を保有するステップf)の連結産物を同定するステップ、
l)遺伝子突然変異を有する断片を有する連結産物の数を決定するステップ、
m)遺伝子突然変異を有さない断片を有する連結産物の数を決定するステップ、
n)遺伝子突然変異を有する連結産物の割合を計算するステップ、
を含む方法を提供する。
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)場合によっては、好ましくは制限酵素で、ステップd)のDNAを断片化するステップ、
f)場合によっては、少なくとも1つのアダプターとステップd)又はe)の断片化されたDNAを連結させるステップ、
g)好ましくはIII型制限酵素認識部位を有する5’オーバーハングを含有し(2)標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用して標的ヌクレオチド配列を含むステップd)又はe)の連結DNA断片を増幅する、又は(1)好ましくはIII型制限酵素認識部位を有する5’オーバーハングを含有し(2)標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマー、及び少なくとも1つのアダプターとハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用してステップf)の連結DNA断片を増幅するステップ、
h)III型制限酵素で対象の増幅ヌクレオチド配列を消化するステップ、次に切り離された二本鎖プライマー配列を除去するためのサイズ選択ステップ、
i)好ましくは超音波処理によってDNAを断片化するステップ、
j)場合によっては、次世代配列決定に必要な二本鎖アダプター配列を連結させるステップ、
k)好ましくはハイスループット配列決定法を使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップd)、e)、f)又はg)の(増幅された)連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、
l)決定した配列から対象のゲノム領域内の遺伝的変異を同定し、対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法を提供する。
SUM149PT細胞を、RPMI/10%FCS/penstrepを含む完全なプレート状態まで150cm2皿において培養する。皿の事前の分割及び計数によって、150cm2皿全体は約20×106個のSUM149PT細胞を含有することを示した。
培養した細胞はPBSで洗浄し、室温において10分間PBS/10%FCS/2%ホルムアルデヒドで固定する。細胞はその後洗浄及び回収し、溶解バッファー(50mMのトリス−HCl、pH7.5、150mMのNaCl、5mMのEDTA、0.5%のNP−40、1%のTX−100及び1×完全プロテアーゼ阻害剤(Roche#11245200)中に取り込ませ、氷上で10分間インキュベートする。細胞はその後洗浄し、MilliQ中に取り込ませる。
固定した溶解細胞はNIaIII(New England Biolabs #R0125)で消化する。
NIaIII酵素を熱失活させ、その後T4DNAリガーゼ(Roche、#799009)を使用して連結ステップを実施する。
このサンプルに、Prot K(10mg/ml)を加え65℃でインキュベートする。RNase A(10mg/ml、Roche#10109169001)を後に加え、サンプルは37℃でインキュベートする。次に、フェノール−クロロホルム抽出を実施し、DNAを含む上清は沈殿させペレット状にする。ペレットは10mMのトリス−HCl、pH7.5中に溶かす。
消化及び連結サンプルはNspI(New England Biolabs #R0602S)で消化する。
このサンプルに、Prot K(10mg/ml)を加え65℃でインキュベートする。RNase A(10mg/ml、Roche#10109169001)を後に加え、サンプルは37℃でインキュベートする。次に、フェノール−クロロホルム抽出を実施し、DNAを含む上清は沈殿させペレット状にする。ペレットは10mMのトリス−HCl、pH7.5中に溶かす。富化鋳型はここで終了し、保存又は直接続行することができる。
Brca1遺伝子座のPCR富化に使用するプライマーは、約20kbのプライマーセットの空間、即ち「観察点」で、NIaIII制限断片の制限部位近辺(<50bp)において逆方向ユニークプライマーとして設計する(図2及び表1参照)。
(Expand Long鋳型ポリメラーゼと共に供給される)2.5μlの10×PCRバッファー3
0.5μlのdNTP(10mM)
(1μg/μlのプライマーストックから1/7希釈した)0.5μlのフォワードプライマー
(1μg/μlのプライマーストックから1/7希釈した)0.5μlのリバースプライマー
0.375μlのExpand Long鋳型ポリメラーゼ(Roche#11759060001)
100ngの富化鋳型
25μlの合計体積までのXμlのMilli−Q
標準SOLiDプロトコールに従い、SOLiD配列決定用のライブラリー調製を進める。
異なる観察点からの読み取り分布値は、観察点部位周辺で最も高かった。さらなる統計値は表2中に示す。観察点ライブラリーC、D及びEからの配列読み取り値によって2288delT突然変異を同定した。BRCA1遺伝子のどの配列が含まれなかったかも決定し、観察点Aから15807塩基対が含まれず、Bからは50124塩基対が含まれなかった。C、D、及びEから、全てのBRCA1配列が含まれた。
Claims (43)
- 標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
架橋DNAを断片化するステップ、
断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
架橋を逆行させるステップ、
架橋の逆行後に得られ、標的ヌクレオチド配列を含む連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
決定した配列を使用して対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。 - 標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)標的ヌクレオチド配列を含むステップd)の連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
f)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。 - 標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)ステップd)のDNAを断片化するステップ、
f)標的ヌクレオチド配列を含むステップe)の連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
g)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。 - 標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)少なくとも1つのアダプターとステップd)の断片化されたDNAを連結させるステップ、
f)標的ヌクレオチド配列を含むステップe)の連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
g)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。 - 標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップd)の連結DNA断片を増幅するステップ、
f)標的ヌクレオチド配列を含むステップe)の増幅された連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
g)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。 - 標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)ステップd)のDNAを断片化するステップ、
f)少なくとも1つのアダプターとステップe)の断片化されたDNAを連結させるステップ、
g)標的ヌクレオチド配列を含むステップf)の連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
h)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。 - 標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)少なくとも1つのアダプターとステップd)の断片化されたDNAを連結させるステップ、
f)標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマー、及び少なくとも1つのアダプターとハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用してステップe)の連結DNA断片を増幅するステップ、
g)標的ヌクレオチド配列を含むステップf)の増幅された連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
h)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。 - 標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)ステップd)のDNAを断片化するステップ、
f)標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用して、標的ヌクレオチド配列を含むステップe)の連結DNA断片を増幅するステップ、
g)標的ヌクレオチド配列を含むステップf)の増幅された連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
h)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。 - 標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)ステップd)のDNAを断片化するステップ、
f)少なくとも1つのアダプターとステップe)の断片化されたDNAを連結させるステップ、
g)標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマー、及び少なくとも1つのアダプターとハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用してステップf)の連結DNA断片を増幅するステップ、
h)標的ヌクレオチド配列を含むステップg)の増幅された連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
i)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。 - ステップd)のDNAを断片化するステップe)が、制限酵素でステップd)のDNAを断片化することを含む、請求項3、6、8及び9のいずれか一項に記載の方法。
- 連結DNA断片又は増幅された連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップが、ハイスループット配列決定を使用して配列を決定することを含む、請求項2〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)ステップd)のDNAを環状化するステップ、
f)ハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチドを含む連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
g)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。 - 標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)ステップd)のDNAを断片化するステップ、
f)ステップe)のDNAを環状化するステップ、
g)ハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチドを含む連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、
h)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。 - 標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)ステップd)のDNAを環状化するステップ、
f)標的ヌクレオチド配列を含む環状化されたDNAを増幅するステップ、
g)ハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチドを含む増幅された連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、及び
h)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。 - 標的ヌクレオチド配列を含む対象のゲノム領域のコンティグを構築するための方法であって、
a)架橋DNAのサンプルを提供するステップ、
b)架橋DNAを断片化するステップ、
c)断片化された架橋DNAを連結させるステップ、
d)架橋を逆行させるステップ、
e)ステップd)のDNAを断片化するステップ、
f)ステップe)のDNAを環状化するステップ、
g)標的ヌクレオチド配列を含む環状化されたDNAを増幅するステップ、
h)ハイスループット配列決定を使用して、標的ヌクレオチドを含む増幅された連結DNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップ、
i)決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む方法。 - ステップd)のDNAを断片化するステップe)が、制限酵素でステップd)のDNAを断片化することを含む、請求項13又は15に記載の方法。
- 環状化されたDNAを増幅するステップが、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを使用して増幅することを含む、請求項12〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 対象のゲノム領域が1つ以上の標的ヌクレオチド配列をさらに含み、増幅ステップにおいて、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするプライマーを提供し、対応する1つ以上の他の標的ヌクレオチド用の1つ以上のプライマーを提供し、プライマーを使用して、連結DNA断片を増幅し、又は環状化されたDNAを増幅する、請求項5、7〜11及び14〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 断片化ステップb)が超音波処理、次に酵素によるDNA末端修復を含む、請求項2〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 断片化ステップb)が制限酵素による断片化ステップを含む、請求項2〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 連結ステップc)が、断片間にアダプター配列を連結するアダプターの存在下で実施される、請求項19又は20に記載の方法。
- ステップb)において複数のサブサンプルを処理し、それぞれのサブサンプル用に異なる認識部位を有する制限酵素を使用する、請求項20又は21に記載の方法。
- 請求項10又は16に記載の制限酵素でステップd)のDNAを断片化するステップを含み、断片化ステップe)が、ステップb)の制限酵素の認識配列より長い認識配列を有する制限酵素を使用して断片化することを含む、請求項22に記載の方法。
- 多重の対象のゲノム領域の配列を決定する、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 連結DNA断片を増幅するステップにおいて、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマー中に識別子が含まれる、請求項5、7〜11及び14〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 標的ヌクレオチド配列を含む連結DNA断片又は増幅された連結DNA断片を、捕捉用プローブにより捕捉し、標的ヌクレオチド配列を含まない連結DNA断片又は増幅された連結DNA断片から標的ヌクレオチド配列を含む連結DNA断片又は増幅された連結DNA断片を分離する、請求項2〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 連結DNA断片を増幅するステップの前又は後にサイズ選択ステップを実施する、請求項5、7〜11及び14〜26のいずれか一項に記載の方法。
- ゲル抽出クロマトグラフィー、ゲル電気泳動又は密度勾配遠心分離を使用してサイズ選択ステップを実施する、請求項27に記載の方法。
- 20〜20,0000塩基対の間、50〜10,0000塩基対の間又は100〜3,000塩基対の間のサイズのDNAを選択する、請求項27又は28に記載の方法。
- 対象のゲノム領域の細胞における倍数性が1を超える場合、それぞれの倍数性に関して、決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップにおいてコンティグを構築する、請求項2〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップが、
1)ステップb)の断片を同定するステップ、
2)ゲノム領域に断片を割り当てるステップ、
3)ゲノム領域のコンティグを構築するステップ
を含む、請求項2〜30のいずれか一項に記載の方法。 - ゲノム領域に断片を割り当てるステップ2)が、異なる連結産物を同定するステップ、及び同定した断片に異なる連結産物をカップリングさせるステップを含む、請求項31に記載の方法。
- 遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、請求項2〜32のいずれか一項に記載の、架橋DNAのサンプルを提供するステップから、決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップまでのステップを含み、複数のサンプルのコンティグを構築し、以下のさらなるステップ:
j)複数のサンプルのコンティグをアラインメントするステップ、
k)複数のサンプル由来の対象のゲノム領域における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法。 - 遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、請求項2〜32のいずれか一項に記載の、架橋DNAのサンプルを提供するステップから、決定した配列から対象のゲノム領域のコンティグを構築するステップまでのステップを含み、以下のさらなるステップ:
j)参照配列とコンティグをアラインメントするステップ、
k)対象のゲノム領域における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法。 - 遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、請求項2〜29のいずれか一項に記載の、架橋DNAのサンプルを提供するステップから、連結DNA断片又は増幅されたDNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップまでのステップを含み、以下のさらなるステップ:
i)連結DNA断片又は増幅されたDNA断片の決定した配列と参照配列をアラインメントするステップ、
j)決定した配列における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法。 - 遺伝子突然変異の有無を同定するための方法であって、請求項2〜29のいずれか一項に記載の、架橋DNAのサンプルを提供するステップから、連結DNA断片又は増幅されたDNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップまでのステップを含み、連結DNA断片又は増幅されたDNA断片の複数のサンプル配列を決定し、以下のさらなるステップ:
i)複数のサンプルの連結DNA断片又は増幅されたDNA断片の決定した配列をアラインメントするステップ、
j)決定した配列における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
を含む方法。 - 異種である疑いがある細胞集団から遺伝子突然変異を保有する断片の割合を決定するための方法であって、請求項2〜29のいずれか一項に記載の、架橋DNAのサンプルを提供するステップから、連結DNA断片又は増幅されたDNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップまでのステップを含み、以下のさらなるステップ:
i)ステップb)の断片を同定するステップ、
j)断片における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
k)遺伝子突然変異を保有する断片の数を決定するステップ、
l)遺伝子突然変異を保有していない断片の数を決定するステップ、
m)遺伝子突然変異を保有する断片の割合を計算するステップ、
を含む方法。 - 異種である疑いがある細胞集団から遺伝子突然変異を有する断片を保有する連結産物の割合を決定するための方法であって、請求項2〜29のいずれか一項に記載の、架橋DNAのサンプルを提供するステップから、連結DNA断片又は増幅されたDNA断片の配列の少なくとも一部分を決定するステップまでのステップを含み、以下のさらなるステップ:
i)ステップb)の断片を同定するステップ、
j)断片における遺伝子突然変異の有無を同定するステップ、
k)遺伝子突然変異を有する又は有さない断片を保有する連結DNA断片を同定するステップ、
l)遺伝子突然変異を有する断片を保有する連結DNA断片の数を決定するステップ、
m)遺伝子突然変異を有さない断片を保有する連結産物の数を決定するステップ、
n)遺伝子突然変異を保有する連結産物の割合を計算するステップ、
を含む方法。 - ステップj)において、参照配列とアラインメントすることによって、及び/又は複数のサンプルの断片配列を比較することによって、遺伝子突然変異の有無を同定する、請求項37又は38に記載の方法。
- 遺伝子突然変異がSNP、欠失、挿入、逆位及び/又は転座である、請求項33〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 欠失及び/又は挿入を有するサンプルからの断片及び/又は連結産物の数を、参照サンプルと比較することによって、欠失及び/又は挿入を同定する、請求項40に記載の方法。
- 分析した断片における染色体切断部位の存在に基づいて、欠失、挿入、逆位及び/又は転座を同定する、請求項41に記載の方法。
- DNA断片、連結DNA断片、及び/又は対象のゲノム領域におけるメチル化ヌクレオチドの有無を決定する、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
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