JP5968973B2 - 植物形質転換効率を改善するための多重形質転換エンハンサー配列の使用 - Google Patents
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Description
1)4×オーバードライブ配列の合成
4×30bpのオーバードライブ(OD)配列(5' caaacaaacatacacagcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcaca 3';配列番号:18)、2×30bpのオーバードライブ・プライマー対5' caaacaaacatacacagcgacttattcacacaaacaaacatacacagcgacttattcaca 3' (Xd463;配列番号:1)および5' tgtgaataagtcgctgtgtatgtttgtttgtgtgaataagtcgctgtgtatgtttgtttg 3' (Xd464;配列番号:2)を合成し、混合して、Stratagene(La Jolla,CA)からの高信頼性PfuTurbo(登録商標)ポリメラーゼの存在下、20サイクルでPCR増幅した。PCR産物を1%アガロースゲル上で分画し、100−300bpの範囲のサイズに相当するゲルの部分を取り出し、精製し、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのTOPO Xero blunt PCRベクターに連結した。繰り返しのスタッキングを配列決定によって確認した。4×30bpのオーバードライブ・インサートのみをつづくマルチコピー・オーバードライブ構築物のクローニングに利用したが、6×までのオーバードライブ配列がPCR後に観察された。
6×8bp TSSリピートプライマー対:
5' ctgacgaactgacgaactgacgaactgacgaactgacgaactgacgaa 3'(Xd465;配列番号:3)および5' ttcgtcagttcgtcagttcgtcagttcgtcagttcgtcagttcgtcag 3'(Xd466;配列番号:4)を合成して等しく混合し、Stratagene(La Jolla,CA)からのPfuTurbo(登録商標)ポリメラーゼの存在下、5サイクルで増幅した。100−300bpのサイズのゲルスライスを切り出し、精製し、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのTOPO Xero blunt PCRベクターに連結した。35×までのTSSリピートを配列決定によって確認したが、18×TSSリピートのみをさらなるクローニングのために保存した。オーバードライブおよびTSSのサイズは、PCRサイクルおよび切り出したゲルの位置に依存した。
24bpのRBの正面にオーバードライブまたはTSSを位置させるために、ノパリンRBにEcoRI部位を導入した((pMON83900の)RBの上流から11bp離れて)。EcoRIで消化した対応するTOPOクローニングベクターから4×オーバードライブまたは18×TSSを切り出し、EcoRIによって開環したpMON83900に挿入して、各々、pMON83903およびpMON83909を得た。
形質転換頻度ならびに低コピー数のT-DNA挿入を含むおよびベクター骨格配列を欠失する事象(例えば、E.coli由来のoriV)の比率を改善するさらなるオーバードライブおよびTSSエンハンサー配列のスタッキングの能力を評価するために、米国特許出願公開2004/244075に実質的に記載されたように、トウモロコシ(Zea mays)細胞をoriVを含有するベクターpMON80105、pMON80121、pMON87465またはpMON87466で形質転換した。表1に示すように、スタックしたエンハンサー配列を含む構築物の使用は、形質転換頻度における統計学的に有意な増大を生じた。これらの構築物を用いて、高比率の品質のTFも得た。品質TFは、TFおよび1または2のコピーを有する事象を組合せる。また、1または2のコピーを有する事象のパーセントも増大した。
形質転換頻度ならびに低コピー数のT-DNA挿入を含むおよびベクター骨格配列を欠失する事象(例えば、E.coli由来のoriV)の比率を改善するさらなるオーバードライブおよびTSSエンハンサー配列のスタッキングの能力を評価するために、米国特許第6,384,301号に実質的に記載されたように、ダイズ(Glycine max)細胞をoriVを含有するベクターpMON83898、pMON83902、pMON87462またはpMON87464で形質転換した。スタックした4×オーバードライブおよび18×TSSエンハンサーの配列は、各々、配列番号:10および配列番号:11に見出される。対照の処理は、オーバードライブまたはTSS配列を欠く、pMON83898での形質転換からなる。表2−3に示すように、スタックした形質転換エンハンサー配列を含む構築物の使用は、形質転換頻度の増大を生じた。単一コピーおよび骨格を含まない事象の頻度も増大した(表3;5段)。また、1またはそれを超えるコピーを有する事象のパーセントも増大した。
上記で使用したpTiA6のオーバードライブ配列(配列番号:17)に加えて、他のオーバードライブ配列(逆相補的配列を含む)が当該技術分野で知られており(例えば、ShurvintonおよびReam,1991)、同様にして用いることができる。これらの配列には限定されるものではないが、数ある中で、pTiAB3(GenBank M63056)からのもの(TGTGAATAAATCGCTGTGTATGTTTGTTTG;配列番号:8)およびpTi15955(GenBank AF242881)からのもの(TTGTCTAAATTTCTGTATTTGTTTGTTTG:配列番号:9)、および共通配列AAACAAACATACACAGCGACTTATTCACA (配列番号:13)およびTAARTYNCTGTRTNTGTTTGTTTG (配列番号:19,Toroら,1988)が含まれ得る。実施例1に記載したようにプライマーを合成し、ついでPCRを行って、数ある中で、pMON83902、pMON80121、pMON87462およびpMON87465に類似する組換えプラスミドの構築に使用するこれらの配列を含むDNAセグメントを作製した。作物植物は、1またはそれを超えるこれらの形質転換エンハンサー配列を含む構築物で形質転換することができ、形質転換頻度ならびに低コピー数T-DNA挿入を含むおよびベクター骨格配列を欠失する事象の比率を改善するそれらの能力について評価することができる。
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載したものを補充する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、出典明示して本明細書の一部とみなす。
米国特許第5,004,863号;米国特許第5,094,945号;米国特許第5,107,065号;米国特許第5,159,135号;米国特許第5,273,894号;米国特許第5,276,268号;米国特許第5,561,236号;米国特許第5,569,834号;米国特許第5,591,616号;米国特許第5,627,061号;米国特許第5,633,435号;米国特許第5,637,489号;米国特許第5,646,024号;米国特許第5,750,871号;米国特許第5,846.797,米国特許第5,981,840号;米国特許第6,040,497号;米国特許第6,506,559号;米国特許第6,624,344号;米国特許第6,384,301号;米国特許第7,022,896号;米国特許第7,060,876号;
米国特許出願番号09/084,942号;米国特許出願番号09/127,735号;米国特許出願番号09/423,143号;
米国特許出願公開2002/0168707 A1;米国特許出願公開2003/0188345;米国特許出願公開2004/0140376;米国特許出願公開2004/244075;米国特許出願公開2006/0041956
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配列番号:1 2X OD配列調製用のフォワードプライマーXd463
配列番号:2 2X OD配列調製用のリバースプライマーXd464
配列番号:3 6X TSS配列調製用のフォワードプライマー Xd465
配列番号:4 6X TSS配列調製用のリバースプライマーXd466
配列番号:5 pTiA6の24 bpコアOD
配列番号:6 8bp 1x TSS配列
配列番号:7 pTiA6の30 bp 1x OD;配列番号:17の逆方向相補体
配列番号:8 pTiAB3からの1X OD配列
配列番号:9 pTi15955からの1X OD
配列番号:10 4X 積層OD
配列番号:11 18X 積層TSS
配列番号:12 1X OD配列を含むボーダー領域
配列番号:13 部分OD配列
配列番号:14 1X ODを含むノパリンRB領域
配列番号:15 4X ODを含むノパリンRB領域
配列番号:16 18X TSSを含むノパリンRB領域
配列番号:17 1X OD;配列番号:7の逆方向相補体
配列番号:18 4X 積層OD;配列番号:10の逆方向相補体
配列番号:19 共通OD配列(Toroら, 1988)
配列番号:20 共通8 bpコアOD配列
Claims (13)
- 配列番号:20、配列番号:20の完全長に相補的な配列またはそれらの組合せの2またはそれを超えるコピーを含む形質転換エンハンサー配列に作動可能に連結されたT-DNAボーダー配列を含む、組換えDNA構築物。
- エンハンサー配列が少なくとも4コピーの該配列を含む、請求項1記載の構築物。
- ボーダー配列が右側ボーダー(RB)配列である、請求項1記載の構築物。
- ボーダー配列が左側ボーダー(LB)配列である、請求項1記載の構築物。
- RB配列がノパリンTiプラスミドからのものである請求項3記載の構築物。
- RB配列がオクトピンTiプラスミドからのものである請求項3記載の構築物。
- 請求項1記載の構築物で形質転換したトランスジェニック細胞。
- 植物または細菌の細胞として規定される、請求項7記載の細胞。
- 細胞がアグロバクテリウムの細胞である、請求項8記載の細胞。
- 細胞がリゾビウムの細胞である、請求項8記載の細胞。
- 植物細胞が、ダイズ、トウモロコシ、ワタ、キャノーラ、イネ、コムギ、アルファルファ、インゲン、ラッカセイ、タバコ、ヒマワリ、オオムギ、トウヂサ属の各種植物(beet)、ブロッコリ、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、キュウリ、ナス、ニラネギ、レタス、メロン、エンバク、タマネギ、エンドウ、コショウ、ラッカセイ、ジャガイモ、カボチャ、ハツカダイコン、サトウモロコシ、ホウレンソウ、カボチャ(squash)、テンサイ、トマトおよびスイカよりなる群から選択される植物からのものである、請求項8記載の細胞。
- 請求項1記載の構築物で形質転換したトランスジェニック植物。
- ダイズ、トウモロコシ、ワタ、キャノーラ、イネ、コムギ、アルファルファ、インゲン、ラッカセイ、タバコ、ヒマワリ、オオムギ、トウヂサ属の各種植物(beet)、ブロッコリ、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、キュウリ、ナス、ニラネギ、レタス、メロン、エンバク、タマネギ、エンドウ、コショウ、ラッカセイ、ジャガイモ、カボチャ、ハツカダイコン、サトウモロコシ、ホウレンソウ、カボチャ(squash)、テンサイ、トマトおよびスイカよりなる群から選択される、請求項12記載のトランスジェニック植物。
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