JP5958865B2

JP5958865B2 - 抗老化関連遺伝子発現促進剤

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Publication number: JP5958865B2
Application number: JP2014015776A
Authority: JP
Inventors: 千尋高橋; 太輔西村; 正人杉
Original assignee: LS CORPORATION CO.,LTD.
Current assignee: LS CORPORATION CO.,LTD.
Priority date: 2014-01-30
Filing date: 2014-01-30
Publication date: 2016-08-02
Anticipated expiration: 2034-01-30
Also published as: JP2015140338A

Description

本発明は、大麦若葉を有効成分とする抗老化関連遺伝子であるスーパ−オキサイドディスムターゼ（活性酸素消去酵素；以下ＳＯＤと略す）の遺伝子発現促進剤に関する。

現在、先進諸国では、寿命の延長が顕著である。なかでも我が国は世界有数の長寿国である。しかし近年、運動量の減少やストレスの増加、食事の欧米化によるカロリーの過剰摂取、栄養バランスの欠如等により健康寿命の延長には至っていない。

健康寿命の延長には抗老化が必要となっている。抗老化、換言すれば寿命を延長させる一つの手段として、カロリー制限が挙げられている。カロリー制限は、酵母、線虫、げっ歯類という幅広い生物種に対して寿命延長モデルとして確立している。さらに、アカゲザルを使ったカロリー制限に関する実験により、霊長類の新陳代謝に変化を及ぼし延命効果を高めるという、有力な証拠が提示されている（非特許文献１）。

また、生体の酸化反応と抗酸化反応のバランスが前者に傾いた酸化ストレスの状態においては、老化、癌、生活習慣病の病態に酸化ストレスが関与していることが明らかとなってきている（非特許文献２）。

この老化の原因の１つとされる酸化ストレスの影響を受けにくくすることにより寿命が延長されると考えられる。食餌を制限すると、転写因子ＰＨＡ−４のｍＲＮＡ量の増加と共にＳＯＤをコードする幾つかの遺伝子の発現も上昇する（非特許文献３、４）。即ち、食餌制限により酸化ストレスの影響を受けにくくなると考えられる。遺伝子組換えによりＳＯＤを過剰発現させることにより寿命が延長することが報告されていることからも（非特許文献５）、酸化ストレスの低減は抗老化に有効、即ち、細胞内のＳＯＤ遺伝子発現量を上昇させることにより寿命の延長を見込むことができると考えられる。

カロリー制限による寿命延長効果は、ヒトにも一定の効果があると考えられる。しかしながら、カロリー制限は、精神的ストレスを増加し、感染に対する抵抗性を低下させる可能性が考えられ、管理された条件下におけるアカゲザルでの結果がそのままヒトに当てはまらない可能性がある。従って、カロリー制限に替わる新たな抗老化法の開発が求められている。

また、抗老化物質をスクリーニングする方法としては、線虫（Caenorhabditis elegans、以下C.elegansとする）を用いた寿命測定試験や、各種動物の老化関連遺伝子の発現量解析が挙げられる。C.elegansは老化研究に適したモデル動物として広く知られている。その老化プロセスは遺伝子レベルでも研究が進められ、ヒトを始めとする哺乳類の老化研究をはじめ欠かせないモデル系である（非特許文献６）。その平均寿命は遺伝的に制御され一定（２０℃でおよそ２０日）である上、加齢と共に細胞内及び組織の代謝活性が低下し、過酸化物が蓄積するなど高等動物と同様のプロセスを経て死に至る。即ち、C.elegansの寿命は細胞及び組織の老化の指標といえる。これらのことは、C.elegansの寿命を延ばすことが老化を抑制することに他ならないことを意味する。

老化関連遺伝子と考えられているＳＯＤ遺伝子発現量を測定する場合は、一般的な定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いることができる。ＳＯＤは、活性酸素の１種であるスーパーオキシド（・Ｏ_２ ⁻）を消去する酵素として知られており、なかでも、ＳＯＤは、ミトコンドリア等で発生する活性酸素を除去する酵素である。ＳＯＤは、運動により活性化され、ＳＯＤを活性化することにより、心臓動脈の疾患による病気や死の可能性を減らすことも報告されている（非特許文献７）。

ＳＯＤ発現量を上昇させる素材として、アントシアニン含有馬鈴薯由来のアントシアニン含有物（特許文献１）や、リンゴ、ナシに含まれるフラボノイドであるフロレチン、プロポリスや薬用植物エキスに含まれるフラボノイドであるガランギン（特許文献２）が報告されている。

他方、大麦若葉は、食物繊維、カリウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、銅などのミネラル、ビタミンＢ１、ビタミンＣ、カロチンなどのビタミンといった栄養分が多く含まれることが知られ、腸内環境の改善、コレステロールの吸収抑制、食後の血糖値の急上昇防止作用があるとされ、健康食品の素材として利用されている（特許文献３）。その他、大麦若葉から抽出されたペンタペプチドを含有する血小板凝集阻止剤が知られている（特許文献４）。

特開２００８−１２０７２３号公報特開２００７−３２６７９９号公報特開２００４−２１５５７８号公報特開平９−２４９６９３号公報

Science Vol. 325, Issue 5937 日本薬理学雑誌 2005; 125: 125-128. J Cell Sci 121, 407-412. Nature 2007; 447: 550-555 Genetics. 2002 Jun;161(2):661-72 Nature Cell Biology 11, 1305-1314 (2009) Proc. Nat'l. Acad. Sci., U.S.A., VOL77, 2777; (1980)

ＳＯＤを経口摂取しても胃酸などにより分解されてしまうと考えられることから、ＳＯＤそのものを経口摂取するのではなく、体内のＳＯＤ発現量を上昇させ、ヒトが本来持っているＳＯＤ活性を上昇させることが求められている。本発明の課題は、カロリー制限とは異なる手法による新たな抗老化アプローチとして、摂取して安全な寿命延長又は老化防止の作用を有するＳＯＤ遺伝子発現促進剤を提供することにある。

本発明者らは、抗老化関連遺伝子であるＳＯＤの遺伝子発現量を解析することは、カロリー制限と同様の抗老化効果をもつ物質のスクリーニングに非常に有効であると考え、天然の食品素材を標的としたスクリーニングを行い、大麦若葉の搾汁が抗老化関連遺伝子であるＳＯＤ遺伝子の発現を促進させ、抗老化作用を有することを見いだし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、大麦若葉を有効成分として含有し、哺乳類体内の哺乳類ＳＯＤ発現量を上昇させることを特徴とする哺乳類ＳＯＤの遺伝子発現促進剤に関する。

本発明によると、摂取して安全かつ有効な、抗老化関連遺伝子であるＳＯＤの遺伝子発現促進剤を提供することができる。

ヒト正常繊維芽細胞を大麦若葉の搾汁のスプレードライ粉末含有培地で培養したときの細胞内ＳＯＤ１及びＳＯＤ２の発現量を測定した結果を示す図である。線虫を大麦若葉の搾汁のスプレードライ粉末含有培地で培養したときの線虫生存率の測定結果を示す図である。線虫を大麦若葉の搾汁のスプレードライ粉末含有培地で培養し、１０％線虫生存率における日数の測定結果を示す図である。

本発明のＳＯＤの遺伝子発現促進剤としては、大麦若葉を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、ＳＯＤの種類としては、ヒトを含む哺乳類で存在が知られているＳＯＤ１、ＳＯＤ２、ＳＯＤ３等を挙げることができる。また、本発明のＳＯＤの遺伝子発現促進とは、ＳＯＤ遺伝子のｍＲＮＡへの転写促進、ｍＲＮＡの翻訳促進等によるＳＯＤの発現量を上昇させることをいう。

本発明における大麦若葉としては、二条大麦、四条大麦、六条大麦、裸大麦等のHordeum vulgare種に属する大麦の、穂が実る前の背丈が２０〜４０ｃｍ程度に成長した若葉そのものやその処理物、例えば、大麦若葉の搾汁処理物、粉砕処理物、細断処理物、乾燥処理物、焙煎処理物、抽出処理物、粉末化処理物、凍結処理物の他、搾汁・乾燥粉末化処理物、細断・乾燥処理物、粉砕・濾過処理物（ピューレ、ジュース）、細断・熱湯抽出処理物等のこれらの組み合わせ処理物を挙げることができる。例えば、大麦若葉の搾汁粉末は、大麦若葉を刈り取り、圧搾により搾り出した液をスプレードライにより乾燥することにより調製することができる。この搾汁粉末は、そのままで、あるいは他の賦形剤等を配合して、本発明のＳＯＤの遺伝子発現促進剤として好適に利用できる。

本発明のＳＯＤの遺伝子発現促進剤は、寿命延長又は老化防止のための、予防・治療剤やサプリメントや食品添加物や飼料添加物として用いることができる。ここで、寿命延長とは、ヒトを含む動物の寿命を延ばすことをいい、また老化防止とは、ヒトを含む動物の身体的能力の低下、身体の機能の低下など身体に現れる老化現象を防止することをいう。かかる寿命延長又は老化防止効果は、大麦若葉を有効成分とするＳＯＤの遺伝子発現促進剤が、ＳＯＤ遺伝子のｍＲＮＡへの転写促進、ｍＲＮＡの翻訳促進等によるＳＯＤの発現量を上昇させることにより、老化の原因であるスーパーオキシドの除去がさかんに行われることで奏される。

本発明のＳＯＤ遺伝子の発現促進剤や、上記予防・治療剤、サプリメント、食品添加物、又は飼料添加物の剤型としては、粉剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤などを挙げることができ、これらの剤型は、従来から知られている通常の製剤方法で調製することができる。例えば、医薬品製剤や飲食品製剤の製造上許可される担体、賦形剤、香料、乳化剤、防腐剤、分散剤等と混合して成型することができる。上記賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロース、セルロース、メチルセルロース、澱粉、水、精製水、アルコール、グリセリン等を挙げることができる。これら製剤は通常経口的に投与される。また、必要に応じてさらに他の有効成分を配合することもできる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

［大麦若葉］
刈り取った大麦若葉１０ｋｇを圧搾し、得られた搾汁８ｋｇをスプレードライにより乾燥、粉末化し、大麦若葉搾汁粉末０．５ｋｇを得た。この粉末をＭ９緩衝液に懸濁し、０．４５μｍフィルターを通しろ過滅菌し、評価サンプルとした。なお、評価サンプル作製には、グリーンバイオアクティブ株式会社の製法（http://green-gbc.co.jp/technology/）及び特許第４６００８５３号を参考にして行った。

［培地及び緩衝液］
１）Ｍ９緩衝液組成（１Ｌ当たり）
Ｎａ_２ＨＰＯ_４６０ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４３０ｇ、ＮａＣｌ５０ｇ、１ＭＭｇＳＯ_４１ｍｌ、２％ゼラチン１０ｍｌをイオン交換水１Ｌに溶かし、１２１℃、２０分間滅菌した。
２）Ｓ−Ｂａｓａｌ緩衝液組成（１Ｌ当たり）
ＮａＣｌ５．８４ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４６．８１ｇを、イオン交換水１Ｌに溶解し、１２１℃、２０分間滅菌した。液温が６０℃程度になるまで放冷し、コレステロール／エタノール（５ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ加えた。
３）Ｓ−液体培地（１Ｌ当たり）
Ｓ−Ｂａｓａｌ緩衝液１Ｌに、１ＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ６．０）１０ｍｌ、１ＭＣａＣｌ_２３ｍｌ、１ＭＭｇＳＯ_４３ｍｌ、Trace metal solution １０ｍｌを加えた。（全て滅菌済みのものを使用）
４）Trace metal solution組成（１Ｌ当たり）
ＥＤＴＡ・２Ｎａ１．８６ｇ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．６９ｇ、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ０．２０ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．２９ｇ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．０２５ｇをイオン交換水１Ｌに溶かし、１２１℃、２０分間滅菌した。

［ＳＯＤの遺伝子発現解析］
ヒト正常繊維芽細胞（Neonatal Normal Human Dermal Fibroblasts：ＮＨＤＦ）を用いて、ＳＯＤの遺伝子発現解析を行った。ロンザジャパン株式会社より購入したＮＨＤＦを、牛胎児血清を１０％含有するダルベッコ最小培地（ＤＭＥＭ）で２代継代し、ワーキングセルバンクを調製し、更に１代継代し、実験用として用いた。ＮＨＤＦをセミコンフルエントまで培養し、１％の大麦若葉搾汁粉末を含む上記培地に交換した。実験コントロールには培地のみを用いた。その後３７℃インキュベータ内で４８時間培養を行った。

培養が終了した細胞をセルスクレイパーを用いて回収し、遺伝子発現解析用サンプルとした。遺伝子発現解析用サンプルからのtotal ＲＮＡの抽出は、QIAGEN RNeasy Midi Kitを用いて行った。抽出したtotal ＲＮＡをエタノール沈殿し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、３０分）を行った。ピペットで上清を除去し、更に完全にエタノールを除くために、室温で風乾した。その後、１００μｌのRNase Free waterでtotal ＲＮＡを溶解し、水で１０倍希釈を行ってから、２６０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度から、total ＲＮＡ量の計算を行った。計算値から、１μｇ／μｌとなるようにtotal ＲＮＡ濃度を調整した。total ＲＮＡからｃＤＮＡを合成するため、滅菌済みマイクロチューブにtotal ＲＮＡ溶液５μｌ（total ＲＮＡ重量として５μｇ）、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_{１２−１８}プライマー１μｌ（０．５μｌ／ｍｌ）及び、１０ｍＭｄＮＴＰｍｉｘ１μｌ、RNase Free Waterを６μｌ加えタッピングし、よく混合した。６５℃に設定した湯浴で５分加温後、氷上に１分間放置した。５×First Strand Buffer ４μｌ、０．１ＭＤＴＴ１μｌを加え混合し、Superscript(R)III Reverse Transcriptase １μｌを加え５０℃で１時間酵素反応させた。その後、７０℃に設定した湯浴で１５分加温し、酵素反応を停止した。溶液が冷却したことを確認し、エタノール沈殿を行った。遠心分離後上清を捨て、真空乾燥機にて残ったエタノールを完全に揮発させ、精製ｃＤＮＡを得た。精製ｃＤＮＡを滅菌水で溶解し２６０ｎｍの吸光度を測定した。吸光度の値から算出したｃＤＮＡ量から、定量ＲＴ−ＰＣＲ時の検量線として、０．０００１μｇ／μｌ、０．００１μｇ／μｌ、０．０１μｇ／μｌ、０．１μｇ／μｌとなるように濃度調整を行い、サンプルは０．０１μｇ／μｌとなるように調整した。定量ＲＴ−ＰＣＲ用９６穴プレート１穴当たり、上記濃度のｃＤＮＡ１０μｌ、SYBR Green １２．５μｌ、プライマー（Ｌ）（配列：（ＳＯＤ−１）TGGCCGATGTGTCTATTGAA、（ＳＯＤ−２）TTGGCCAAGGGAGATGTTAC）０．１μｌ、プライマー（Ｒ）（配列：（ＳＯＤ−１）AACGACTTCCAGCGTTTCCT、（ＳＯＤ−２）AGTCACGTTTGATGGCTTCC）０．１μｌ、滅菌水２．３μｌを添加した。定量ＲＴ−ＰＣＲ条件は表１の条件で行った。なお、内部標準として、ｍＲＮＡの増幅するためのプライマーであるＧＡＰ−ＤＨのプライマー（Ｌ）配列：GTCAGTGGTGGACCTGACCT及びプライマー（Ｒ）配列：TGCTGTAGCCAAATTCGTTGを用いた。

遺伝子発現解析の結果、大麦若葉を添加した細胞ではＳＯＤ１及びＳＯＤ２のｍＲＮＡの発現量が上昇した（図１）。

［大麦若葉よる寿命延長効果］
１％の大麦若葉搾汁粉末を懸濁したＭ９緩衝液を、０．４５μｍフィルターを用いてろ過滅菌し、評価サンプルとした。

Ｓ−液体培地に、Escherichia coli OP50株（以後ＯＰ５０）を、ＯＤ_６６０の値が０．９となるように添加、調製した。この培地に、１ｍｌ程度のC.elegans溶液を加え、２０℃のインキュベーター内で４日間培養して、C.elegansの培養物を得た。

C.elegansの世代を統一するために、同調培養を行った。具体的には、C.elegansを上記培養方法にて大量飼育し、Ｓ−液体培地から卵を抱えたC.elegansを回収し、１５ｍｌ遠心管に移した。５〜１０分間静置し、C.elegansを沈殿させ、上清を除去した。新たにＭ９緩衝液を１ｍｌ加え軽くピペッティングし、１．５ｍｌマイクロチューブに移した。５分間静置し、C.elegansを沈殿させ、上清を除去した。新たにＭ９緩衝液を１ｍｌ加え、更に２６６μｌの次亜塩素酸ナトリウム、１３３μｌのＮａＯＨを加え、室温で激しく転倒混合し、C.elegansの身体を溶解させ、卵を回収した。その後、８００×ｇで５分間遠心分離し、卵を沈殿させた。上清を捨て１．４ｍｌのＭ９緩衝液を加え、８００×ｇで５分間遠心分離した。この操作を５回繰り返し、卵の洗浄を行った。上清を捨て回収した卵に新たに１ｍｌのＳ−ｂａｓａｌ緩衝液を加え、ピペットマンを用いて、ＯＰ５０を含まないＳ−液体培地１０ｍｌに添加し、２０℃で一晩培養して、孵化させた。孵化を確認したら、ＯＰ５０を含むＳ−液体培地を１０ｍｌ加え、更に２４時間２０℃のインキュベーターで培養した。

線虫生存率の測定を行った。一般的な蓋付き平底６ウェルプレートを用意し、同調培養後の孵化したC.elegansを１ウェルあたり３０匹加えこれをｎ＝１とした。実験の再現性を高める為、１群当たり３ウェルを用いてｎ＝３とした。使用した培地はＳ−液体培地にＯＰ５０と５−フルオロ−２′−デオキシウリジン（終濃度０．０４ｍＭ）、評価サンプルを添加したものを使用し、以後、マイクロピペットを用いて一日おきに、生存しているC.elegansの数をカウントしながら、新たに調製したＳ−液体培地の入ったウェルへ移動した。培養初日の生存C.elegans数３０匹から、培養日数ごとに何割のC.elegansが生存し続けているかを計算し線虫生存率とした。なお、５−フルオロ−２′−デオキシウリジンは、ＤＮＡ合成阻害剤であり、寿命試験中に次世代のC.elegansが混入し正確な生存率を求めることができなくならないように、培養最終日まで加え続けた。

線虫生存率の測定を行った結果、コントロールに比べ大麦若葉の搾汁粉末を投与した群において寿命延長効果が確認された（図２）。生存率が１０％になるまでの日数を比較しても、図２同様、コントロールに比べ大麦若葉の搾汁粉末を投与した群において有意な寿命延長効果が確認された（図３）。

Claims

大麦若葉を有効成分として含有し、哺乳類体内の哺乳類ＳＯＤ発現量を上昇させることを特徴とする哺乳類ＳＯＤ（スーパ−オキサイドディスムターゼ）の遺伝子発現促進剤。