JP5955632B2 - ヒアルロン酸産生促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、皮膚の荒れ、シワ、弾性低下等を防止するのに有用なヒアルロン酸産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進用飲食品及びヒアルロン酸産生促進用化粧料に関する。さらに詳しくは、本発明は、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニンをタンパク質分解酵素で分解して得られるアンジオジェニン分解物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤に関する。

近年、皮膚のメカニズムに関する研究が進められ、皮膚の乾燥感や肌荒れの原因として、加齢による新陳代謝の減衰によるもののほか、太陽光などの紫外線、乾燥、酸化等の作用が複雑に関与している（非特許文献１、２）。これらの因子は、真皮の主要なマトリックス成分であるヒアルロン酸を顕著に減少させることが明らかとなっている（非特許文献３）。ヒアルロン酸はその分子中に水分を保持することができ、それにより、皮膚をしっとりとした状態に保つ働きを有している。しかし、これらの作用によりヒアルロン酸が破壊され皮膚の水分保持機構が損なわれると、肌は、乾燥し荒れた状態になるとともに、シワやたるみを増した状態になる。

このような皮膚における水分保持機能の改善剤として、ヒアルロン酸やコラーゲンなどを配合した化粧料が数多く提案されているが、これらは皮膚表面における保湿効果を発揮するのみであり、肌の機能低下を本質的に改善し得るものではなかった。その他、皮膚細胞賦活剤としてビタミン類や生薬類が使用されているが、やはり、肌の機能低下を治療するまでには至っていないのが現状である。以上のことから、真皮層の主要な成分の一つであるヒアルロン酸の生合成を促進させることにより、皮膚のシワやたるみを防止でき、しかも安全性の点でも問題のないヒアルロン酸産生促進剤が望まれていた。

一方、関節液中のヒアルロン酸は、関節軟骨の表面を覆い、関節機能の円滑な作動に役立っている。正常人関節液中のヒアルロン酸濃度は約２．３ｍｇ／ｍＬであるが、関節リウマチの場合、関節液中のヒアルロン酸濃度は約１．２ｍｇ／ｍＬへと低下し、同時に関節液の粘度も著しく低下する（非特許文献４）。また、化膿性関節炎や痛風性関節炎などでも関節リウマチの場合と同様、ヒアルロン酸含量の低下が起こることが知られている（非特許文献５参照）。

上記疾患において、潤滑機能の改善、関節軟骨の被覆・保護、疼痛抑制及び病的関節液の性状改善をするために、関節液中のヒアルロン酸量を増加させることが行われている。例えば、関節リウマチ患者にヒアルロン酸ナトリウムの関節注入療法を行うと、上記の改善が認められている（非特許文献６）。同様に、外傷性関節症、骨関節炎や変形性関節症においても、ヒアルロン酸の関節注入療法による上記の改善効果が報告されている（非特許文献７）。以上のことから、ヒアルロン酸産生の促進は、肌荒れ等の皮膚疾患、関節リウマチや外傷性関節症、骨関節炎、変形性関節症といった関節疾患の予防、治療に有効である。しかし、上記疾患の治療は長期にわたり、しかも医師の処方を必要とする。したがって、日常の生活の中で手軽に治療できるヒアルロン酸産生促進剤を含有するクリームあるいは飲食品が望まれていた。

Archives of Dermatology, 第138巻, 11号, 1462頁, 2002年 American Journal of Clinical Dermatology, 第4巻, 11号, 771頁, 2003年 The American Journal of Pathology, 第171巻, 5号, 1451頁, 2007年 Arthritis Rheumatism, 第10巻, 357頁, 1967年 The Lancet, 第351巻, 197頁, 1998年 Rheumatology International, 第22巻, 4号, 2002年 Canadian Medical Association Journal, 第172巻, 8号, 1039頁, 2005年

本発明は、安全性の点で問題のないヒアルロン酸産生促進剤を提供することを課題とする。また、本発明は、そのような物質を配合したヒアルロン酸産生促進用飲食品及びヒアルロン酸産生促進用化粧料を提供することを課題とする。

本発明者らは、これらの課題を解決するために、広く食品素材に含まれているヒアルロン酸産生促進作用を示す物質について、鋭意、探索を進めたところ、アンジオジェニンあるいはそのアンジオジェニンをペプシンやパンクレアチンなどのタンパク質分解酵素で分解して得られるアンジオジェニン分解物が、皮膚（***を含む）、関節等、生体内（表皮細胞や真皮細胞等）におけるヒアルロン酸の産生が促進されることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下の態様を含むものである。
（１）アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
（２）前記アンジオジェニン分解物が、分子量５００以上、８０００以下であることを特徴とする（１）に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
（３）前記アンジオジェニン分解物が、アンジオジェニンをタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする（１）記載のヒアルロン酸産生促進剤。
（４）前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする（３）記載のヒアルロン酸産生促進剤。
（５）アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を有効成分とするスキンケア剤。
（６）前記スキンケアが、肌荒れの予防及び／又は改善であることを特徴とする（５）記載のスキンケア剤。
（７）（１）〜（４）のいずれかに記載のアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を配合したヒアルロン酸産生促進用飲食品。
（８）（１）〜（４）のいずれかに記載のアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を配合したヒアルロン酸産生促進用化粧料。
（９）アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を経口摂取又は塗布することによる肌質の改善方法。
（１０）アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を１日あたり９．４μｇ以上経口摂取するか、又は０．００１〜２重量％になるよう配合した組成物を塗布することによる肌質の改善方法。

本発明により、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進用飲食品及びヒアルロン酸産生促進用化粧料が提供される。本発明のヒアルロン酸産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進用飲食品及びヒアルロン酸産生促進用化粧料は、ヒアルロン酸産生を促進させる作用を有する。

本発明のヒアルロン酸産生促進剤の特徴は、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を有効成分とすることにある。アンジオジェニンは血管形成因子の一つであり、血管形成活性により、外傷、潰瘍、臓器移植、循環機能不全等の疾患への使用が示唆されているほか、養毛、育毛剤に使用する例（特開平４−２１０６１８号公報）、美白剤として使用する例が知られている（特開平６−３１２９２２号公報）。しかし、アンジオジェニン及びその分解物が皮膚ヒアルロン酸産生促進作用を持ち、ヒアルロン酸産生促進剤として有用であることについては知られていない。

本発明のアンジオジェニンは哺乳動物の乳から調製する。給源としては、ウシ、水牛、ヒト、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等の乳があげられる。アンジオジェニンは、公知の物質であって、市販されているものであるが、それを製造するには、公知の方法、例えば特開平２−２９６０００号公報に記載されるように陽イオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過クロマトグラフィーを組み合わせてアンジオジェニンを精製する方法等を工業的に有利に利用することができる。また、本発明では、遺伝子工学的手法により生産されたアンジオジェニンも使用し得る。

アンジオジェニン分解物は、上記のアンジオジェニンをトリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素で分子量が８，０００以下となるように限定分解したペプチド混合物を使用することが可能である。但し、分子量の下限は５００以上であることが好ましい。

本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、経口投与あるいは塗布することにより、ヒアルロン酸産生促進効果を発揮する。本発明のヒアルロン酸産生促進剤を経口投与するに際しては、有効成分であるアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物をそのままの状態で用いることもできるが、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。本発明において、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口剤は、例えば、澱粉、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法によって製剤化される。この種の製剤には、前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料等を適宜使用することが出来る。より具体的には、結合剤としては、例えば、澱粉、デキストリン、アラビアガム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられる。また、崩壊剤としては、例えば、澱粉、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶性セルロース等が挙げられる。界面活性剤としては、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル等が、滑沢剤としては、タルク、ロウ、蔗糖脂肪酸エステル、水素添加植物油等が、流動性促進剤としては無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。

さらには、これらのアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物をそのままあるいは製剤化した後、これを栄養剤や飲食品等に配合することも可能である。また、Ｎ-アセチルグルコサミンやＮ-メチル-Ｌ-セリン等の従来からヒアルロン酸産生に有効な作用を持つと考えられている成分とともにアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を配合すれば、一層のヒアルロン酸産生促進作用が期待できる。なお、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物は、比較的熱に対して安定であるので、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を含む原料を通常行われるような条件で加熱殺菌することも可能である。

本発明のヒアルロン酸産生促進剤を塗布するに際しては、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能で、好ましい組成物として軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、粉末等が挙げられる。例えば、本発明のヒアルロン酸産生促進剤をワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸、ポリエチレングリコール等の界面活性剤、無機塩、ロウ、樹脂、水及び、要すればパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の保存料に混合することによって、ヒアルロン酸産生促進用化粧料や医薬品を製造することができる。

本発明のヒアルロン酸産生促進剤の経口投与による有効量は、その製剤形態、投与方法、使用目的、及びこれを適用される患者の年齢、体重、病状により適宜規定され一定でないが、ラットを用いた動物実験の結果によると、ヒアルロン酸産生促進作用を示すためには、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物をラット体重１ｋｇ当たり９．４μｇ以上摂取する必要があることが判った。したがって、外挿法によると、通常、成人一人当たり一日９．４μｇ以上のアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を摂取すれば効果が期待できるので、この必要量を確保できるよう飲食品に配合するか、あるいは、医薬として投与すれば良い。なお、投与は必要に応じて一日数回に分けて行うことも可能である。

本発明のヒアルロン酸産生促進剤の塗布による有効量は、剤形により異なるが、適用する組成物全量を基準として、好ましくは、０．００１〜２重量％となるように、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を配合すれば良い。ただし、入浴剤のように使用時に希釈されるものは、さらに配合量を増やすことができる。

以下に、実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、これらは単に本発明の実施態様を例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

陽イオン交換樹脂のスルホン化キトパール（富士紡績株式会社製）４００ｇを充填したカラム（直径５ｃｍ×高さ３０ｃｍ）を脱イオン水で十分洗浄した後、このカラムに未殺菌脱脂乳４０リットル（ｐＨ ６．７）を流速２５ｍｌ/ｍｉｎで通液した。通液後、このカラムを脱イオン水で十分洗浄し、２．０Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ炭酸緩衝液(ｐＨ ７．０)で溶出した。そしてアンジオジェニンを含有する溶出画分をＳ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に吸着させ、脱イオン水で十分洗浄し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した後、０〜２．０Ｍ塩化ナトリウムのリニアグラジエントで吸着した画分を溶出し、アンジオジェニンを含む画分を回収した。そしてその画分をＨｉＬｏａｄ １６/６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーで処理し、アンジオジェニンを多く含む画分１．８ｇを得た。なお、このようにして得られたアンジオジェニンを多く含む画分中のアンジオジェニン含量は１０％であり、そのままヒアルロン酸産生促進剤として使用可能である。

陽イオン交換樹脂であるスルホン化キトパール（富士紡績社製）３，０００ｇを充填したカラムを脱イオン水で十分に洗浄した後、このカラムに未殺菌脱脂乳１００Ｌ（ｐＨ ６．７）を通液した。次に、このカラムを脱イオン水で十分洗浄した後、０．１〜２．０Ｍ塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出した。そして、アンジオジェニンを含有する溶出画分をＳ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陽イオン交換クロマトグラフィー（アマシャムバイオサイエンス社製）で分画し、得られたアンジオジェニン含有画分を９０℃で１０分間加熱処理し、遠心分離することにより沈澱を除去した。さらに、このアンジオジェニン含有画分をＭｏｎｏ Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２ゲル濾過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びC4逆相クロマトグラフィーで順次処理し、アンジオジェニン５５ｍｇ（試料Ａ）を得た。なお、このようにして得られたアンジオジェニンの純度は９９％であり、そのままヒアルロン酸産生促進剤として使用可能である。

実施例２で得られたアンジオジェニン５．０ｍｇを、水１０ｍｌに懸濁し、最終濃度が０．０１％となるようにパンクレアチンを加え、３７℃で５分から６時間、酵素処理を行った。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥して、アンジオジェニン分解物４．０ｍｇ（試料Ｂ、Ｃ、Ｄ）を得た。なお、このようにして得られたアンジオジェニン分解物の平均分子量は、Ｂが約３，０００、Ｃが約５００、Ｄが約３００であった。画分Ｂ、Ｃ、Ｄは、そのままヒアルロン酸産生促進剤として使用可能である。

［試験例１］
実施例２で得られた試料Ａ及び実施例３で得られた試料Ｂ乃至Ｄについて、ラットを用いた動物実験によりヒアルロン酸産生促進作用を調べた。７週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラットを、生理食塩水投与群（コントロール群）、実施例１で得られた試料Ａをラット体重１ｋｇ当たり５μｇ投与する群（Ａ−１群）、実施例１で得られた試料Ａをラット体重１ｋｇ当たり５０μｇ投与する群（Ａ−２群）、実施例２で得られた試料Ｂ乃至Ｄをラット体重１ｋｇ当たり５μｇ投与する群（Ｂ−１〜Ｄ−１群）、実施例２で得られた試料Ｂ乃至Ｄをラット体重１ｋｇ当たり５０μｇ投与する群（Ｂ−２〜Ｄ−２群）の９試験群（ｎ＝６）に分け、それぞれを毎日１回ゾンデで経口投与して１０週間飼育した。皮膚のヒアルロン酸量については、試験前日に剃毛したラットを屠殺後速やかに回収した皮膚組織（各３００ｍｇ）を測定に供した。加熱によりタンパク変性させた皮膚組織をアクチナーゼによりタンパク質を分解し、さらにヒアルロニダーゼにて分解したヒアルロン酸をＨＰＬＣ法にて測定した。その結果を表１に示す。

この結果、１０週間後の可溶性画分中ヒアルロン酸量は、コントロール群に比べ、すべての試験群で有意に高い値を示した。このことから、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物には、ヒアルロン酸産生促進作用があることが明らかとなり、ヒアルロン酸産生促進剤として有用であることが示された。また、このヒアルロン酸産生促進作用はアンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物をラット体重１ｋｇ当たり最低５．０μｇ投与した場合に認められることが明らかとなった。

［試験例２］
実施例２で得られた試料Ａ及び実施例３で得られた試料Ｂ、Ｃ、Ｄについて、正常ヒト線維芽細胞株〔白人女性の皮膚より採取されたＣＣＤ４５ＳＫ（ＡＴＣＣＲＬ １５０６）〕を用いた実験によりヒアルロン酸産生促進作用を調べた。１０容量％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳと略記）含有変法イーグル培地（ＭＥＭ、１０‐１０１、大日本製薬社製）を用いて、正常ヒト線維芽細胞株を４×１０^４個／ウエル／０．４ｍｌとなるように２４ウエルプレートに播種して、５％炭酸ガス、飽和水蒸気下、３７℃で２４時間培養した後、０．６容量％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に置換した。そして、実施例２で得られた試料Ａ及び実施例３で得られた試料Ｂ、Ｃ、Ｄを、各ウエルに０．１容量％となるように添加（ｎ＝６）して、７２時間培養して培養液を得た。このようにして得られた培養液より、ヒアルロン酸量（バイオテック トレーディング パートナーズ社製）を測定した。なお、対照として、アンジオジェニン又はアンジオジェニン分解物を添加しないで同様の試験を行った。その結果を表２に示す。

これによると、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を添加した群は、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を添加していない群（対照）に比べていずれも２倍以上のヒアルロン酸産生促進能を示した。このことから、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物には、皮膚線維芽細胞に働きかけ、ヒアルロン酸産生を促進する作用があることが明らかとなり、ヒアルロン酸産生促進剤として有用であることが示された。

表３に示す配合のヒアルロン酸産生促進用飲料を常法により製造した。製造した飲料の風味は良好で、常温１年間保存によっても風味が劣化することはなく、沈殿等の問題もなかった。

表４に示す配合のドウを常法により作製し、成形した後、焙焼してヒアルロン酸産生促進用ビスケットを製造した。

表５に示す配合のヒアルロン酸産生促進剤を常法により製造した。

表６に示す配合の化粧水を常法により製造した。

表７に示す配合のクリームを常法により製造した。

［試験例３］
実施例７で得られた化粧水及び実施例８で得られたクリームを用いて、実使用テストを行った。比較品としては、アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を除いた以外は実施例７及び８と同じ配合のものを用いた。顔面のたるみや小ジワが認められる乾燥肌を有する成人女性２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ａ、Ｂ群）に、また、手に肌荒れが認められる女性２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ｃ、Ｄ群）に分け、Ａ群の顔面には本発明品の化粧水２ｇを、Ｂ群の顔面には比較品の化粧水２ｇを、Ｃ群の手指には本発明品のクリーム２ｇを、Ｄ群の手指には比較品のクリーム２ｇを、それぞれ１日２回通常の使用状態と同様に１０日間塗布した。結果を表８に示す。

表８の結果より、本発明品の化粧水は、比較品の化粧水に比べて、乾燥感の改善、肌荒れ等の改善が顕著であり、ヒアルロン酸産生促進効果に優れていることが実証された。また、本発明品のクリームについても、比較品のクリームに比べて、乾燥感の改善、肌荒れに顕著な改善がみられ、肌荒れ等の自然増悪抑制効果を有することが明らかとなった。

［試験例４］
変形性関節炎による軽度の痛みを有する患者２０名を対象に、実施例３に示す被験食を１日１回飲用し、１年間の臨床試験を行った。関節の疼痛および機能の評価を、疼痛に対するビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）、及び、関節炎の関節における疼痛、機能、および硬直に関するＷｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ ａｎｄ ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ（ＷＯＭＡＣ）指標にて変形性関節症の評価を行った。結果を表９に示す。

表９の結果より、本発明品の被験食は、比較品の被験食に比べて、関節の疼痛および機能の改善が顕著であり、ヒアルロン酸産生促進効果に優れていることが実証された。

Claims (5)

1. アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
2. 前記アンジオジェニン分解物が、分子量５００以上、８０００以下であることを特徴とする請求項１に記載のヒアルロン酸産生促進剤。
3. 前記アンジオジェニン分解物が、アンジオジェニンをタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸産生促進剤。
4. 前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする請求項３記載のヒアルロン酸産生促進剤。
5. アンジオジェニン及び／又はアンジオジェニン分解物を１日あたり５．０μｇ以上５０μｇ以下の経口投与によるヒアルロン酸産生の促進を介した肌質の改善方法。