JP5954789B2 - 機能的分子の可逆的共有結合 - Google Patents
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Description
それぞれが特定の機能的特性を有する2以上の分子を一緒に連結することが望ましい場合があることは周知である。この方法では、コンジュゲートとして知られる新たな分子を生成することが可能となり、このコンジュゲートはそれらの成分を合わせた特徴を有する。この技術は、広く適用可能な制御された様式で、機能的に有用な分子の既存の特性を修飾するため又は全く新たな機能的側面をかかる分子に付加するための魅力的な手段を提供する。
・クロスリンカーとチオール化合物との間の反応が、実質的に化学量論的な量のみのクロスリンカーを使用して、迅速かつ高収率で実施できることが多い。
・クロスリンカーとチオール含有分子との間のチオエーテル結合が、容易に逆転可能であり、特に、当業者によって選択された時間で、制御された様式で切断できる。
・クロスリンカーへのチオール含有機能的部分の連結後に得られる化合物中の二重結合の保持が、さらなる機能的化合物への連結のための反応部位を構成する。したがって、コンジュゲートに余分な機能的部分を付加することが、より容易であり得る。
本発明は、(1)式F1の第一の機能的部分を含む式R1−Hの化合物を式F2の第二の機能的部分に連結するための試薬としての、式(I)の部分を含む化合物の使用を提供する:
X及びX’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式=NQの基を示し、Qは、水素、ヒドロキシル、C1−6アルキル又はフェニルであり;
Yは求電子性脱離基であり;
R1は、式−F1又は−L−F1の基であり、Lはリンカー基であり、かつR1−Hは少なくとも第一のSH基を含み;
第一の機能的部分及び第二の機能的部分は、同じ又は異なって、それぞれ、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、DNA及びRNAから選択され;
基R1は、式(I)の部分の2位において、式R1−Hの化合物中の第一のSH基の求核攻撃によって式(I)の部分に結合され、その結果2位の基Yが基R1によって置換される。
(i)式(I)の部分を含む化合物を式R1−Hの化合物と反応させて、式(II)の部分を含む化合物を産生する工程
を含み、
工程(i)は、式(I)の部分の2位において、式R1−Hの化合物中の第一のSH基の求核攻撃によって基R1を結合させることを含み、その結果2位の基Yは基R1によって置換され、
X、X’、Y、R1、F2、及び式(I)の部分を含む化合物は全て、上記(1)に記載したとおりである。
式(I)及びF2の部分は、それぞれ上記(1)に記載したとおりであり;
R1は、上記(1)に記載したとおりであり;
このプロセスは、式(I)の部分の2位において、式R1−Hの化合物中の第一のSH基の求核攻撃によって基R1を結合させることを含み、その結果2位の基Yが基R1によって置換される。
(i)式(II)の部分を含む化合物を提供する工程;及び
(ii)式(II)の部分の2位において、基R1と炭素原子との間の結合を切断する工程、を含むプロセスを提供し、ここで、
R1は、上記(1)に記載したとおりであり;
式(II)の部分は、上記(2)に記載したとおりである。
以下のいずれかであり:
R3aは、式R3の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し、R3a’は独立して、式R3’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−O−又は−N(R33a’)の基を形成し、R33a’は、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−N(R33a’)−N(R33a’)−の基を形成し、各R33a’は、同じ又は異なって、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;
R2aは、式R2の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し;
mは、0からnまでの値を有する整数であり;
式(IIa)の化合物は、少なくとも1個の式F2の基を含み;
F2は、上記(1)に記載したとおりであり;
X及びX’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式=NQの基を示し、Qは、水素、ヒドロキシル、C1−6アルキル又はフェニルであり;
以下のいずれかであり:
R3及びR3’は、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式E、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;又は
R3及びR3’は一緒になって、式−N(R33’)の基を形成し、R33’は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;
R2は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示し;
式E及びYのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し;
式Nuのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−OH、−SH、−NH2及び−NH(C1−6アルキル)から選択される求核剤を示し;
式Lのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し;
式Zのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項1に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Lの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Lの基に連結され;
nは、1、2又は3であり;
式IGのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基で置換されている、C1−20アルキル基、C2−20アルケニル基又はC2−20アルキニル基である部分を示し、式中、(a)0、1又は2個の炭素原子は、C6−10アリーレン、5〜10員のヘテロアリーレン、C3−7カルボシクリレン(carbocyclylene)及び5〜10員のヘテロシクリレン(heterocyclylene)基から選択される基によって置換されており、かつ(b)0、1又は2個の−CH2−基は、−O−、−S−、−S−S−、−C(O)−及び−N(C1−6アルキル)−基から選択される基によって置換されており、式中、
(i)該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにC1−6アルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオール、−N(C1−6アルキル)(C1−6アルキル)、ニトロ及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基によって置換されており;
(ii)該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の0、1又は2個の炭素原子は、−C(O)−基によって置換されている。
R1は、上記(1)に記載したとおりであり、
X及びX’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式=NQの基を示し、Qは、水素、ヒドロキシル、C1−6アルキル又はフェニルであり;
以下のいずれかであり:
R3及びR3’は、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式E、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;又は
R3及びR3’は一緒になって、式−O−又は−N(R33’)の基を形成し、R33’は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;又は
R3及びR3’は一緒になって、式−N(R33’)−N(R33’)−の基を形成し、各R33’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;
R2は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示し;
式E及びYのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し;
式Nuのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−OH、−SH、−NH2及び−NH(C1−6アルキル)から選択される求核剤を示し;
式Lのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し;
式Zのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項1に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Lの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Lの基に連結され;
nは、1、2又は3であり;
式IGのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基で置換されている、C1−20アルキル基、C2−20アルケニル基又はC2−20アルキニル基である部分を示し、式中、(a)0、1又は2個の炭素原子は、C6−10アリーレン、5〜10員のヘテロアリーレン、C3−7カルボシクリレン及び5〜10員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ(b)0、1又は2個の−CH2−基は、−O−、−S−、−S−S−、−C(O)−及び−N(C1−6アルキル)−基から選択される基によって置換されており、式中、
(i)該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにC1−6アルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオール、−N(C1−6アルキル)(C1−6アルキル)、ニトロ及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基によって置換されており;
(ii)該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の0、1又は2個の炭素原子は、−C(O)−基によって置換されている[但し、R3及びR3’は、一緒になって式−N(R33’)の基を形成しない]。
以下のいずれかであり:
R3aは、式R3の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し、R3a’は独立して、式R3’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−O−又は−N(R33a’)の基を形成し、R33a’は、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−N(R33a’)−N(R33a’)−の基を形成し、各R33a’は、同じ又は異なって、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;
R2aは、式R2の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し;
mは、0からnまでの値を有する整数であり;
R1は、上記(1)に記載したとおりであり;
F2は、上記(1)に記載したとおりであり;
X及びX’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式=NQの基を示し、Qは、水素、ヒドロキシル、C1−6アルキル又はフェニルであり;
以下のいずれかであり:
R3及びR3’は、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式E、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;又は
R3及びR3’は一緒になって、式−O−又は−N(R33’)の基を形成し、R33’は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;又は
R3及びR3’は一緒になって、式−N(R33’)−N(R33’)−の基を形成し、各R33’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;
R2は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示し;
式E及びYのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し;
式Nuのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−OH、−SH、−NH2及び−NH(C1−6アルキル)から選択される求核剤を示し;
式Lのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し;
式Zのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項1に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Lの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Lの基に連結され;
nは、1、2又は3であり;
式IGのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基で置換されている、C1−20アルキル基、C2−20アルケニル基又はC2−20アルキニル基である部分を示し、式中、(a)0、1又は2個の炭素原子は、C6−10アリーレン、5〜10員のヘテロアリーレン、C3−7カルボシクリレン及び5〜10員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ(b)0、1又は2個の−CH2−基は、−O−、−S−、−S−S−、−C(O)−及び−N(C1−6アルキル)−基から選択される基によって置換されており、式中、
(i)該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにC1−6アルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオール、−N(C1−6アルキル)(C1−6アルキル)、ニトロ及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基によって置換されており;
(ii)該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の0、1又は2個の炭素原子は、−C(O)−基によって置換されている。
以下のいずれかであり:
R3aは、式R3の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し、R3a’は独立して、式R3’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−O−又は−N(R33a’)の基を形成し、R33a’は、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−N(R33a’)−N(R33a’)−の基を形成し、各R33a’は、同じ又は異なって、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;
mは、0からnまでの値を有する整数であり;
R1は、上記(1)に記載したとおりであり、かつR1は、少なくとも第一のチオール基及び第二のチオール基を含み、該第一のチオール基は、式の化合物中の2位に結合し、第二のチオール基は、式(IIIa)の化合物中の3位に結合している;
F2は、上記(1)に記載したとおりであり;
X及びX’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式=NQの基を示し、Qは、水素、ヒドロキシル、C1−6アルキル又はフェニルであり;
以下のいずれかであり:
R3及びR3’は、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式E、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;又は
R3及びR3’は一緒になって、式−O−又は−N(R33’)の基を形成し、R33’は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;又は
R3及びR3’は一緒になって、式−N(R33’)−N(R33’)−の基を形成し、各R33’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;
R2は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示し;
式E及びYのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し;
式Nuのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−OH、−SH、−NH2及び−NH(C1−6アルキル)から選択される求核剤を示し;
式Lのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し;
式Zのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項1に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Lの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Lの基に連結され;
nは、1、2又は3であり;
式IGのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基で置換されている、C1−20アルキル基、C2−20アルケニル基又はC2−20アルキニル基である部分を示し、式中、(a)0、1又は2個の炭素原子は、C6−10アリーレン、5〜10員のヘテロアリーレン、C3−7カルボシクリレン及び5〜10員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ(b)0、1又は2個の−CH2−基は、−O−、−S−、−S−S−、−C(O)−及び−N(C1−6アルキル)−基から選択される基によって置換されており、式中、
(i)該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにC1−6アルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオール、−N(C1−6アルキル)(C1−6アルキル)、ニトロ及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基によって置換されており;
(ii)該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の0、1又は2個の炭素原子は、−C(O)−基によって置換されている。
R1は、上記(1)に記載したとおりであり;
X及びX’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式=NQの基を示し、Qは、水素、ヒドロキシル、C1−6アルキル又はフェニルであり;
以下のいずれかであり:
R3aは、式R3の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し、R3a’は独立して、式R3’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−O−又は−N(R33a’)の基を形成し、R33a’は、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−N(R33a’)−N(R33a’)−の基を形成し、各R33a’は、同じ又は異なって、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;
R2aは、式R2の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し;
mは、0からnまでの値を有する整数であり;
以下のいずれかであり:
R3及びR3’は、同じ又は異なって、それぞれ水素原子又は式E、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;又は
R3及びR3’は一緒になって、式−O−又は−N(R33’)の基を形成し、R33’は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;又は
R3及びR3’は一緒になって、式−N(R33’)−N(R33’)−の基を形成し、各R33’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;
R2は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示し;
式E及びYのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し;
式Nuのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−OH、−SH、−NH2及び−NH(C1−6アルキル)から選択される求核剤を示し;
式Lのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し;
式Zのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項1に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Lの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Lの基に連結され;
nは、1、2又は3であり;
式IGのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基で置換されている、C1−20アルキル基、C2−20アルケニル基又はC2−20アルキニル基である部分を示し、式中、(a)0、1又は2個の炭素原子は、C6−10アリーレン、5〜10員のヘテロアリーレン、C3−7カルボシクリレン及び5〜10員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ(b)0、1又は2個の−CH2−基は、−O−、−S−、−S−S−、−C(O)−及び−N(C1−6アルキル)−基から選択される基によって置換されており、式中、
(i)該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにC1−6アルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオール、−N(C1−6アルキル)(C1−6アルキル)、ニトロ及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基によって置換されており;
(ii)該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の0、1又は2個の炭素原子は、−C(O)−基によって置換されており;
R4は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、C1−6アルコキシ、チオール、C1−6アルキルチオ若しくはC1−6アルキルカルボニルオキシ基、又は式F2の基であり;
基R2a及びR4の少なくとも一方は、式F2の基を含み;
F2は、上記(1)に記載したとおりである。
(i)式(III)の化合物:
(ii)式(III)の化合物を式R4−Hの化合物と反応させる工程(式中、R4は上記(9)に記載したとおりである)
を含み、式中、
以下のいずれかであり:
R3aは、式R3の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し、R3a’は独立して、式R3’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−O−又は−N(R33a’)の基を形成し、R33a’は、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−N(R33a’)−N(R33a’)−の基を形成し、各R33a’は、同じ又は異なって、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;
R2aは、式R2の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し;
mは、0からnまでの値を有する整数であり;
R1は、上記(1)に記載したとおりであり;
F2は、上記(1)に記載したとおりであり;
X及びX’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式=NQの基を示し、Qは、水素、ヒドロキシル、C1−6アルキル又はフェニルであり;
以下のいずれかであり:
R3及びR3’は、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式E、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;又は
R3及びR3’は一緒になって、式−O−又は−N(R33’)の基を形成し、R33’は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;又は
R3及びR3’は一緒になって、式−N(R33’)−N(R33’)−の基を形成し、各R33’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;
R2は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示し;
式E及びYのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し;
式Nuのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−OH、−SH、−NH2及び−NH(C1−6アルキル)から選択される求核剤を示し;
式Lのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し;
式Zのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項1に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Lの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Lの基に連結され;
nは、1、2又は3であり;
式IGのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基で置換されている、C1−20アルキル基、C2−20アルケニル基又はC2−20アルキニル基である部分を示し、式中、(a)0、1又は2個の炭素原子は、C6−10アリーレン、5〜10員のヘテロアリーレン、C3−7カルボシクリレン及び5〜10員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ(b)0、1又は2個の−CH2−基は、−O−、−S−、−S−S−、−C(O)−及び−N(C1−6アルキル)−基から選択される基によって置換されており、式中、
(i)該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにC1−6アルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオール、−N(C1−6アルキル)(C1−6アルキル)、ニトロ及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基によって置換されており;
(ii)該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の0、1又は2個の炭素原子は、−C(O)−基によって置換されている。
(a)式(I)の部分及び(b)それに連結された式F2の化合物を含む化合物は、上記(3)に記載したとおりであり;
式F2の化合物は、式R1の基によって修飾され得るシグナルを生成し得る検出可能部分である。
上記(7)、(8)及び(9)のいずれか1つに記載の化合物(但し、(8)に記載の化合物は、少なくとも1個の式F2の基を含む)を提供する工程であって、第一の機能的部分及び第二の機能的部分の一方は、検出可能なシグナルを生成し得る機能的部分であり、第一の機能的部分及び第二の機能的部分のもう一方は、該物質と相互作用し得る機能的部分である、工程;
該サンプルを該化合物とインキュベートする工程;及び
検出可能なシグナルを生成し得る機能的部分からの検出可能なシグナルの生成を可能にする条件下で、シグナルをモニタリングする工程、
を含む。
(a)式R1の機能的部分及び(b)該物質により修飾され得るシグナルを生成し得る検出可能部分を含むコンジュゲートを、上記(2)〜(13)のいずれかに記載のプロセスを実行することにより産生する工程;
該コンジュゲートを該物質とインキュベートする工程;
該検出可能部分からのシグナルを得る工程;及び
該シグナルを、該コンジュゲートが該物質と接触していない場合に得られ得るコントロールシグナルと比較し、それによって、該物質が該コンジュゲートと相互作用するか否かを決定する工程、
を含む。
X及びX’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式=NQの基を示し、Qは、水素、ヒドロキシル、C1−6アルキル又はフェニルであり;
該機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、DNA及びRNAから選択される。
シアニン及びメロシアニン;
Invitrogenから入手可能なBODIPY(ホウ素−ジピロメテン)色素系;
ATTO−TEC GmbHが製造するATTO色素系;
フルオレセイン及びその誘導体;
ローダミン及びその誘導体;
ナフタレン誘導体(例えば、そのダンシル誘導体及びプロダン誘導体);
ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール及びベンゾオキサジアゾール誘導体;
クマリン及びその誘導体;
ピレン誘導体;並びに
Invitrogenから入手可能な、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッド、カスケードブルー及びナイルレッド。
X及びX’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式=NQの基を示し、Qは、水素、ヒドロキシル、C1−6アルキル又はフェニルであり;
以下のいずれかであり:
R3及びR3’は、同じ又は異なって、それぞれ、水素原子又は式E、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;又は
R3及びR3’は一緒になって、式−O−又は−N(R33’)の基を形成し、R33’は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;又は
R3及びR3’は一緒になって、式−N(R33’)−N(R33’)−の基を形成し、各R33’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;
R2は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示し;
式E及びYのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し;
式Nuのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−OH、−SH、−NH2及び−NH(C1−6アルキル)から選択される求核剤を示し;
式Lのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し;
式Zのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項1に記載の第二の機能的部分を含む化合物と反応し得る、式Lの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Lの基に連結され;
nは、1、2又は3であり;
式IGのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基で置換されている、C1−20アルキル基、C2−20アルケニル基又はC2−20アルキニル基である部分を示し、式中、(a)0、1又は2個の炭素原子は、C6−10アリーレン、5〜10員のヘテロアリーレン、C3−7カルボシクリレン及び5〜10員のヘテロシクリレン基から選択される基によって置換されており、かつ(b)0、1又は2個の−CH2−基は、−O−、−S−、−S−S−、−C(O)−及び−N(C1−6アルキル)−基から選択される基によって置換されており、式中、
(i)該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにC1−6アルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオール、−N(C1−6アルキル)(C1−6アルキル)、ニトロ及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基によって置換されており;
(ii)該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の0、1又は2個の炭素原子は、−C(O)−基によって置換されている。
(i)該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにC1−6アルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオール、−N(C1−6アルキル)(C1−6アルキル)、ニトロ及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基によって置換されており;
(ii)該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の0、1又は2個の炭素原子は、−C(O)−基によって置換されている。
(a)式−LG、−C(O)−LG、−C(S)−LG又は−C(NH)−LGの基(式中、LGは求電子性脱離基である);
(b)−OH、−SH、−NH2、−NH(C1−6アルキル)及び−C(O)NHNH2基から選択される求核剤Nu’;
(c)求核剤と開環求電子反応し得る環式部分Cyc;
(d)式−S(O2)(Hal)の基(式中、Halはハロゲン原子である);
(e)式−N=C=O又は−N=C=Sの基;
(f)式−S−S(IG’)の基(式中、IG’は、本明細書中に記載したとおりの式IGの基を示す);
(g)1個以上のハロゲン原子によって置換されたC6−10アリール基である、基AH;
(h)紫外線光への曝露によって活性化され得る光反応性基;
(i)式−C(O)H又は−C(O)(C1−6アルキル)の基;
(j)マレイミド基;
(k)式−C(O)CHCH2の基;
(l)式−C(O)C(N2)H又は−PhN2 +の基(式中、Phはフェニル基を示す);又は
(m)エポキシド基。
(a)式−LG、−C(O)−LG及び−C(S)−LGの基(式中、LGは、ハロゲン原子並びに−O(C1−6アルキル)、−SH、−S(C1−6アルキル)、トリフレート、トシレート、メシレート、N−ヒドロキシスクシンイミジル及びN−ヒドロキシスルホスクシンイミジル基から選択される);
(b)式−OH、−SH及び−NH2の基;
(c)式
(d)マレイミド基。
(a)少なくとも1個の式−N3の基によって置換されており、1個以上のハロゲン原子によって更に置換されていてもよい、C6−10アリール基;
(b)ベンゾフェノン基;
(c)式−C(O)C(N2)CF3の基;及び
(d)式−PhC(N2)CF3の基(式中、Phはフェニル基を示す)。
X及びX’はそれぞれ酸素原子を示し;
R33’は水素原子又はC1−6アルキル基を示し;
Yはハロゲン原子を示し;
R2は水素若しくはハロゲン原子又はC1−6アルキル基を示す。
(a)このプロセスは、式(II)の2位と3位との間の炭素−炭素二重結合へのF2の求電子付加反応によって、式(II)の部分にF2を連結することを含み得る。
(b)式(I)の部分を含む化合物が式(Ia)の化合物であり、R3及びR3’が一緒になって式−N(R33’)の基を形成し、R33’が水素原子又は式Y、Nu若しくは−L(Z)nの基を示す場合、このプロセスは、F2と、(i)式−N(R33’)の部分の窒素原子又は(ii)式Y、Nu若しくは−L(Z)nの基との間の反応によって、式(II)の部分にF2を連結することを含み得る。
(c)式(I)の部分を含む化合物が式(Ia)の化合物であり、R3及びR3’が一緒になって式−N(R33’)の基を形成せず、R3及びR3’の少なくとも一方が式E、Nu又は−L(Z)nの基を示す場合、このプロセスは、F2と式E、Nu若しくは−L(Z)nの基との間の反応によって、式(II)の部分にF2を連結することを含み得る。
(d)式(I)の部分を含む化合物が式(Ia)の化合物であり、R2が式Y、Nu若しくは−L(Z)nの基を示す場合、このプロセスは、F2と式E、Nu若しくは−L(Z)nの基との間の反応によって、式(II)の部分にF2を連結することを含み得る。
以下のいずれかであり:
R3aは、式R3の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し、R3a’は独立して、式R3’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−O−又は−N(R33a’)の基を形成し、R33a’は、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−N(R33a’)−N(R33a’)−の基を形成し、各R33a’は、同じ又は異なって、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;
R2aは、式R2の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し;
mは、0からnまでの値を有する整数であり;
式(IIa)の化合物は、少なくとも1個の式F2の基を含み;
F2、X、X’、R3、R3’、R33’、R2、L、Z及びnは全て、本明細書中に記載したとおりである。
以下のいずれかであり:
R3aは、式R3の基又は式F2の基を示し、R3a’は独立して、式R3’の基又は式F2の基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−N(R33a’)の基を形成し、R33a’は、式R33’の基又は式F2の基を示し;
R2aは、式R2の基又は式F2の基を示す。
以下のいずれかであり:
R3aは、式R3の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し、R3a’は独立して、式R3’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−O−又は−N(R33a’)の基を形成し、R33a’は、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−N(R33a’)−N(R33a’)−の基を形成し、各R33a’は、同じ又は異なって、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;
R2aは、式R2の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し;
mは、0からnまでの値を有する整数であり;
R1、F2、X、X’、R3、R3’、R33’、R2、L、Z及びnは全て、本明細書中に記載したとおりである。
以下のいずれかであり:
R3aは、式R3の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し、R3a’は独立して、式R3’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−O−又は−N(R33a’)の基を形成し、R33a’は、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−N(R33a’)−N(R33a’)−の基を形成し、各R33a’は、同じ又は異なって、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示す;
mは、0からnまでの値を有する整数であり;
R1は、本明細書中で前記したとおりであり、ここでR1は、少なくとも第一のチオール基及び第二のチオール基を含み、この第一のチオール基は、式(IIIa)の化合物中の2位に結合しており、第二のチオール基は、式(IIIa)の化合物中の3位に結合しており;
F2、X、X’、R3、R3’、R33’、L、Z及びnは全て、本明細書中に記載したとおりであり;
工程(ii)はさらに、式(IIIa)の部分の3位において、基R1と炭素原子との間の結合を切断することを含む。
(i)実施形態(2)又は(3)に記載された、コンジュゲートを産生するためのプロセスを実施する工程;及び
(ii)その後、該コンジュゲートから式R1−Hの化合物を再生する工程。
RN1及びRN2は独立して、水素、アミノ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、カルボキシレート、カルボキサミド、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよい炭素環式アリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいメルカプトアルキル、置換されていてもよいモノ−若しくはジ−アルキルアミノ、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよい複素脂環式(heteroalicyclic)、又は置換されていてもよいアミノアルキルから選択され;
RN3は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよい炭素環式アリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいシクロアルキル、又は置換されていてもよい複素脂環式基である。
(a)式R1の機能的部分及び(b)該物質により修飾され得るシグナルを生成し得る検出可能部分を含むコンジュゲートを、実施形態(2)又は(3)のプロセスを実施することにより産生する工程;
該コンジュゲートを該物質とインキュベートする工程;
該検出可能部分からのシグナルを得る工程;及び
該シグナルを、該コンジュゲートが該物質と接触していない場合に得られ得るコントロールシグナルと比較し、それによって、該物質が該コンジュゲートと相互作用するか否かを決定する工程。
X及びX’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式=NQの基を示し、Qは、水素、ヒドロキシル、C1−6アルキル又はフェニルであり;
機能的部分は、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、DNA及びRNAから選択される。
式(I)の部分を含む化合物を、チオール基を有するさらなる機能的部分と反応させることによって、式(II)の部分を含む化合物である中間体生成物を創出すること;及び
この中間体化合物を、アルケン部分を含む機能的部分と反応させて、このアルケン部分と、中間体生成物の2位と3位との間の炭素−炭素二重結合との間の光触媒的[2+2]環化付加反応をもたらすこと。
X及びX’は、同じ又は異なって、それぞれ酸素、硫黄又は式=NQの基を示し、Qは、水素、ヒドロキシル、C1−6アルキル又はフェニルであり;
YR1は、式Y又はR1の基であり;
Yは求電子性脱離基であり;
R1は、式−F1又は−S−L−F1の基であり、R1はチオール部分を有し、このチオール部分の硫黄原子を介して式(VIa)の部分の2位に連結されており;
R2a、R3a及びR3a’はそれぞれ、式(IIa)の化合物に関して記載されたとおりであり;
Ralk1、Ralk2、Ralk3及びRalk4のそれぞれは、同じ又は異なって、式R2aの基であり、ただし、Ralk1、Ralk2、Ralk3及びRalk4の少なくとも1つは式F2の基を含み;
F1、及び式F2の任意の基は、同じ又は異なって、それぞれ、検出可能部分、酵素活性部分、アフィニティタグ、ハプテン、免疫原性担体、抗体又は抗体断片、抗原、リガンド、生物活性部分、リポソーム、ポリマー部分、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、細胞、炭水化物、DNA及びRNAから選択される。
1H及び13C NMRスペクトルは、1Hについては500MHz、13Cについては125MHzの周波数で作動するBruker Avance 500機器で、室温で記録した。1H NMRスペクトルは、CDCl3(7.26ppm)シグナルを参照とした。13C NMRスペクトルは、CDCl3(77.67ppm)シグナルを参照とした。
赤外線スペクトルは、センチメートルの逆数(cm−1)で与えられる周波数で、ATRモードで作動するPerkinElmer Spectrum 100 FT−IRスペクトロメータで実行した。
質量スペクトル及び高分解能質量データは、VG70−SE質量分析計(EIモード及びCIモード)で記録した。
融点(m.p.)はGallenkamp加熱ブロックで取得したものであり、未補正である。
旋光度測定は、10cmのセル長さでPerkinElmer 343旋光計を使用して実施した。
Boc Tert−ブチルオキシカルボニル基
Cys システイン
Mal マレイミド
DMF ジメチルホルムアミド
TCEP (トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン)
LC−ESI−MS 液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化質量分析
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 7.67 (br s, 1H, NH), 6.89 (s, 1H, C=CH); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 173.8 (C=O), 170.5 (C=O), 136.9 (-(Br)C=C-), 135.4 (-C=CH-); IR (固体, cm-1): 3235 (s), 1709 (s); MS (CI+) m/z, (%): 178 (81M+, 32), 176 (79M+, 32), 125 (25), 86 (100); C4H3O2N79Brについて計算した質量: 175.93472. 実測値: 175.93493; m.p. 148 - 151℃.
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 6.90 (s, 1H, C=CH), 3.09 (s, 3H, N-CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 168.6 (C=O), 165.4 (C=O), 131.9 (-C=CH-), 131.4 ((Br)C=C-), 24.7 (-N-CH3); IR (固体, cm-1): 3106 (s), 1708 (s); MS (CI) m/z, (%):192 (81M+, 99), 190(79M+, 100); C5H5O2N79Brについて計算した質量: 189.95037. 実測値: 189.95052; m.p: 77-79℃
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ =7.63 (s, 1H, NH), 6.27 (s, 1H, C=CH), 5.40 (d, 1H, J = 6.8, NH), 4.67 (ddd, 1H, J = 6.8, 5.4及び5.1, -HN-CH-C(O)-), 3.80 (s, 3H, O-CH3), 3.48 (dd, 1H, J = 13.8及び5.1, -S-CHH-), 3.62 (dd, 1H, J = 14.1及び5.4, -S-CHH-) 1.45 (s, 9H, 3 x CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 170.2 (C=O), 168.9 (C=O), 167.6 (C=O), 155.2 (C=O), 155.9 (-C=CH-), 119.7 (-C=CH-), 81.1 ((CH3)CO-), 53.3 (O-CH3), 52.7 (CH), 34.0 (CH2), 28.3 (3 x CH3); IR (固体, cm-1) 3236 (w), 1715 (s); MS (CI+) m/z, (%): 331 (M+H, 5), 275 (20), 231 (100); [C13H18O6N2S]+Hについて計算した質量: 331.09638. 実測値: 331.09684; 20αD: -41.9o (c = 1.0, メタノール); m.p. 145-147℃.
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ = 6.26 (s, 1H, C=CH), 5.36 (d, 1H, J = 6.3, NH), 4.66 (m, 1H, -HN-CH-), 3.79 (s, 3H, O-CH3), 3.46 (dd, 1H, J = 5.2及び5.0, -S-CHH-), 3.35 (dd, 1H, J = 13.7及び5.1, -S-CHH-), 3.00 (s, 3H, -N-CH3), 1.44 (s, 9H, 3 x CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 170.2 (C=O), 169.5 (C=O), 167.9 (C=O), 155.0 (C=O), 149.9(-C=CH-), 118.7 (-C=CH-), 80.9 ((CH3)3CO-), 53.1 (O-CH3), 52.7 (CH), 33.8 (CH2), 28.3 (3 x CH3), 24.1 (-N-CH3); IR (固体, cm-1) 3367.8, 2977.1, 1694.7; MS (ES+) m/z, (%): 367(46), 311 (M, 100); C14H20N2O6NaSについて計算した質量: 367.0940. 実測値: 367.0931; 20αD: -18.55o (c = 1.0, メタノール); m.p. 101-103℃.
1H NMR (500MHz, CDCl3): δ =9.00 (s, 1H, NH), 8.95 (s, 1H, NH), 5.59 (1H, d, J = 7.6, NH), 5.41 (d, 1H, J = 7.6, NH), 4.65 - 4.56 (m, 2H, 2 x -HN-HC-C(O)-) C=CHH), 3.93 (dd, 1H, J = 9.3及び3.9,CH), 3.86 (dd, 1H, J = 9.2及び4.2, CH), 3.76 (s, 3H, OCH3), 3.76 (s, 3H, OCH3), 3.51 (dd, 1H, J = 13.8及び4.6, -CHH-), 3.36 (dd, 1H, J = 14.1及び6.0, -CHH-), 3.19-3.11 (m, 3H, 3 x -CHH-), 2.96 (dd, 1H, J = 13.1及び7.1, - CHH-), 2.54-2.02 (m, 2H, -CHH-) 1.43 (s, 18H, 9 x CH3); 13C NMR (125MHz, CDCl3): δ = 177.2 (C=O), 177.1 (C=O), 175.1 (C=O), 175.0 (C=O), 172.0 (C=O), 171.5 (C=O), 155.5 (C=O), 155.3 (C=O), 80.6(2 x -OCCH3), 53.6 (CH), 52.91 (OCH3), 52.85 (OCH3), 50.8 (CH), 40.6 (CH), 40.0 (CH), 37.3 (CH2), 37.0 (CH2), 34.6 (CH2), 34.1 (CH2), 28.3 (6 x CH3); IR (油, cm-1) 3233 (w), 2980 (w), 1783 (w), 1709 (s); MS (CI+) m/z, (%): 333 (M+H, 15), 277 (50), 233 (100); C13H20O6N2Sについて計算した質量: 332.10420. 実測値: 332.10475;
N−Boc−Cys−OMe(36mg、0.153mmol)及び酢酸ナトリウム(13mg、0.153mmol)のメタノール(3mL)中撹拌溶液に、メタノール(3mL)中のブロモマレイミド(30mg、0.169mmol)を添加した。10分後、マレイミド(17mg、0.169mmol)を添加した。溶媒を真空中で除去した。1H NMR分析は化合物4及び未反応のマレイミドのみを示した。
N−Boc−Cys−OMe(36mg、0.153mmol)及び酢酸ナトリウム(13mg、0.153mmol)のメタノール(3mL)中撹拌溶液に、ブロモマレイミド(30mg、0.169mmol)及びマレイミド(17mg、0.169mg)のメタノール(3mL)中混合物を添加した。1分後、溶媒を真空中で除去した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル、9:1から7:3の勾配溶出)で精製して、70%の収率で淡黄色粉末4(36mg、0.108mmol)を得、30%の収率で無色油状物6(15mg、0.045mmol)を得た。
N−Boc−Cys−OMe(36mg、0.153mmol)及びプロピルアミン(10μL、0.153mmol)のメタノール(3mL)中撹拌溶液に、メタノール(3mL)中のブロモマレイミド(30mg、0.169mmol)を添加した。1分後、溶媒を真空中で除去した。この物質をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル:酢酸エチル、9:1から7:3の勾配溶出)で精製して、淡黄色粉末(51mg、0.153mmol)を100%で得た。データは、N−Boc−Cys(Mal)−OMe 4について上記で得たものと一致した。
ソマトスタチンは、分子内の2つのシステイン残基がジスルフィド結合で結合した形態で存在することが知られたペプチドホルモンである。
未処理のソマトスタチン:[ES+]1638.04(m/z 1), 819.82 (m/z 2), 546.95 (m/z 3).
マレイミド架橋されたソマトスタチン:[ES+] 1734.14 Da (m/z 1), 867.40 Da (m/z 2), 578.73 (m/z 3).
一般的手順
1H NMR及び13C NMRスペクトルは、1Hについては500MHz、13Cについては125MHzの周波数で作動するBruker Avance 500機器で、室温で記録した。1H NMRスペクトルは、CDCl3(7.26ppm)シグナルを参照とした。13C NMRスペクトルは、CDCl3(77.67ppm)シグナルを参照とした。赤外線スペクトルは、センチメートルの逆数(cm−1)で与えられる周波数で、ATRモードで作動するPerkinElmer Spectrum 100 FT−IRスペクトロメータで実行した。低分子に関する質量スペクトル及び高分解能質量データは、VG70−SE質量分析計(EIモード及びCIモード)で記録した。融点はGallenkamp加熱ブロックで取得したものであり、未補正である。3,4−ジブロモマレイミド、凍結乾燥ソマトスタチン、PEG5000、TCEP及びベンゼンセレノールは、Sigma−Aldrichから購入し、さらなる精製なしに使用した。
タンパク質サンプルに対するLC−MSは、Waters Acquity Single Quad Detector(SQD)に接続したWaters Acquity uPLCを使用して実施した。カラム:Acquity uPLC BEH C18 1.7μm 2.1x50mm。波長:254nm。移動相:95:5 水(0.1%ギ酸):MeCN(0.1%ギ酸)、4分間にわたる勾配(5:95 水(0.1%ギ酸):MeCN(0.1%ギ酸)まで。流速:0.6mL/分。MSモード:ES+。スキャン範囲:m/z=85−2000。スキャン時間:0.25秒。データは連続体モードで得た。MSのエレクトロスプレー供給源は、3.5kVのキャピラリー電圧及び50Vのコーン電圧で操作した。窒素を、総流量600L/hで、ネブライザー及び脱溶媒和ガスとして使用した。総質量スペクトルを、MassLynxソフトウェアにプレインストールされたMaxEnt 1アルゴリズムを使用して、イオンシリーズから再構築した。MALDI−TOF分析は、MALDI micro MX(Micromass)で実施した。データは、337nmのレーザー波長で、12kVのソース電圧及び5kVのリフレクション電圧で、リフレクトロン陽イオンモードで得た。サンプルは以下に概説したように調製し、ペプチドを含むサンプルを、脱イオンH2O中で24時間透析した。ペプチド及びその誘導体(0.1〜0.3mg/ml)を、トリフルオロ酢酸(10mg/ml)を予めスポットした後に、2μlシナピン酸(10mg/ml)中でMALDIプレート上にスポットした。ACTH(10ng/ml)を質量較正に使用した。
δH (500 MHz, CDCl3) 7.67 (br s, 1H, NH), 6.89 (s, 1H, H-3); δC(125 MHz, CDCl3) 173.8 (C=O), 170.5 (C=O), 136.9 (C2), 135.4 (C3); IR (固体, cm-1) 3235 (s), 1709 (s); MS (CI+) m/z, (相対強度): 178 ([81M+H], 32), 176 ([79M+H], 32), 125 (25), 86 (100); [C4H2O2N79Br]+Hについて計算した質量: 175.9347 実測値 175.9349 (CI+); m.p. 148 - 151℃; UV (アセトニトリル) ε242= 13800及びε276 = 1700 cm-1M-1d3.
δH 1H NMR (CDCl3): 8.55(d, J=8.55Hz, 1H, CH),8.46(d, J=8.51Hz, 1H, CH), 8.33(d, J=8.67Hz, 1H, CH), 7.57(m, 2H, 2xCH), 7.26(d, J=7.08Hz, 1H, CH), 3.07(カルテット, J=6.58Hz, 2H, CH2), 2.89(m, 2H, CH2), 2.85(s, 6H, 2xCH3), 1.35(s, 9H, 3xCH3). 13C NMR (CDCl3): 158.01, 153.05, 136.5, 131.49, 131.09, 130.02, 129.54, 124.48, 120.59, 116.41, 80.41, 45.9, 43.81, 41.5, 28.5. MS: [M + H]+: 393.16.
*-HMQCデータにより同じABシステムの一部として示されるシグナル
†-HMQCデータにより同じABシステムの一部として示されるシグナル
δC (125 MHz, CDCl3) 174.32 (2 x C=O), 171.25 (2 x C=O), 155.33 (2 x C=O), 80.61 (2 x C2), 80.58 (2 x C2), 53.51 (2 x C4), 53.18 (2 x C4), 52.91 (2 x C6), 52.90 (2 x C6), 48.45 (2 x C8), 47.89 (2 x C8), 34.66 (2 x C7), 34.59 (2 x C7), 28.37 (6 x C1), 28.36 (6 x C1)いくつかの炭素シグナルは、ジアステレオマーの重複に起因して欠落している; IR (薄膜、ニート) 3348, 2978, 1719 cm-1; MS (EI) m/z (相対強度): 566 ([M+H], 20), 564 ([M-H], 100); [C22H35N3O10S2]-Hについて計算した正確な質量は564.1669を要求、実測値 564.1686.
メタノール(60mL)中のブロモマレイミド(300mg、1.69mmol)及び酢酸ナトリウム(138mg、1.69mmol)に、ヘキサンチオール(356μL、2.50mmol)を添加した。5分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中10%の酢酸エチル)による精製により、2,3 ジヘキサンチオスクシンイミド(13mg、0.04mmol)を鮮黄色のペーストとして2%の収率で得、ヘキシルスルファニルマレイミド(アルケン310mg、1.46mmol)をクリーム色の粉末として86%の収率で得た。
δH (500 MHz, CDCl3) 8.21 (s, 1H, NH), 3.49 (s, 2H, 2 x H-7), 2.89-2.83 (m, 2H, 2 x HH-6), 2.79-2.83 (m, 2H, 2 x HH-6), 1.71-1.57 (m, 4H, 2 x CH2), 1.44-1.37 (m, 4H, 2 x CH2), 1.34-1.26 (m, 8H, 4 x CH2), 0.89 (t, 6H, J = 6.8, 2 x H3-1); δC (125 MHz, CDCl3) 174.60 (2 x C=O), 48.23 (2 x C7), 32.34 (2 x CH2), 31.26 (2 x CH2), 28.99 (2 x CH2) 28.46 (2 x CH2), 22.56 (2 x CH2), 14.27 (2 x C1-); IR (固体, cm-1) 3198 (m), 2928 (m), 1703 (s); 質量イオンは見出されず。
δH (500 MHz, CDCl3) 7.35 (s, 1H, NH), 6.04 (s, 1H, H-8), 2.91 (t, 2H, H2-6), 1.78-1.72 (m, 2H, H2-5), 1.48-1.42 (m, 2H, CH2), 1.33-1.30 (m, 4H, 2 x CH2), 0.90 (t, 3H, J = 6.9, H3-1); δC (125 MHz, CDCl3) 169.06 (C=O), 167.69 (C=O), 152.74 (C7), 118.24 (C8), 32.06 (C6), 31.26 (CH2), 28.58 (CH2), 27.70 (CH2), 22.52 (CH2), 14.03 (C1); IR (固体, cm-1) 3200 (m), 2918 (m), 1703 (s); MS (ES-) m/z (相対強度): 212 ([M-H], 100); [C10H15NO2S]-Hについて計算した正確な質量はm/z 212.0745を要求、実測値 212.0753 (ES-); m.p. 99-101℃; UV (アセトニトリル) ε247 = 12000及びε347 = 9500 cm-1M-1d3.
メタノール(100mL)中のブロモマレイミド(300mg、1.69mmol)及び酢酸ナトリウム(138mg、1.69mmol)に、ヘキサンチオール(237μL、1.69mmol)を添加した。5分後、溶媒を真空中で除去し、フラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル中10%の酢酸エチル)による精製により、ヘキシルスルファニルマレイミド(362mg、1.69mmol)をクリーム色の粉末として100%の収率で得た。
還元型ソマトスタチンの調製
還元型ソマトスタチンは記載したとおりに生成した。1.1当量のハロマレイミド又はジブロモマレイミド誘導体(50mMリン酸ナトリウム、pH6.2、40%MeCN、2.5〜15.0%DMF中100xストック)を周囲温度で添加し、生成物の生成をLC−MSで1時間にわたりモニタリングした。結果を図2に示す。
還元型ソマトスタチンは記載したとおりに生成した。種々の量のジチオマレイミド(50mMリン酸ナトリウム、pH6.2、40%MeCN、2.5〜7.5%DMF中100xストック)を周囲温度で添加し、生成物の生成をLC−MSで1時間にわたりモニタリングした。結果を図3に示す。
マレイミド架橋ソマトスタチンは、記載したように調製した。100当量の種々の還元剤(50mMリン酸ナトリウム、pH6.2、40%MeCN、2.5%DMF中1000xストック)を添加し、未修飾ペプチド及び副産物(還元剤と遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド)の生成を、LC−MSによって4℃で2日間モニタリングした。ソマトスタチンとGSHとの混合型ジスルフィドは、MALDI−TOF MSでのみ検出できた。結果を図4に示す。
マレイミド架橋ソマトスタチンは、記載したように調製した。種々の量のDTT又は2−メルカプトエタノール(50mMリン酸ナトリウム、pH6.2、40%MeCN、2.5%DMF中1000xストック)を添加し、未修飾ペプチド及び副産物(還元剤と遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド)の生成を、LC−MSによって4℃で6時間モニタリングした。結果を図5に示す。
マレイミド架橋ソマトスタチンは、記載したように調製した。20当量の2−メルカプトエタノール(50mMリン酸ナトリウム、pH6.2、40%MeCN、2.5%DMF中1000xストック)を添加し、その後、緩衝液又は5当量のヨウ化ナトリウム若しくはベンゼンセレノール(50mMリン酸ナトリウム、pH6.2、40%MeCN、7.5%DMF中100xストック)のいずれかを添加し、未修飾ペプチド及び副産物(2−メルカプトエタノール又はベンゼンセレノールと遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド)の生成を、LC−MSによって周囲温度で20分間モニタリングした。結果を図6に示す。
ソマトスタチンを、記載したとおりに還元し、N−官能化マレイミド誘導体で架橋した。100当量の2−メルカプトエタノール(50mMリン酸ナトリウム、pH6.2、40%MeCN、2.5%DMF中1000xストック)を添加し、未修飾ペプチド及び副産物(2−メルカプトエタノールと遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド)の生成をLC−MSにより4℃で2日間モニタリングした。結果を図7に示す。
還元型ソマトスタチンを、2.1当量のモノブロモマレイミドと反応させて、ジ−付加生成物を得た。次に、100当量の2−メルカプトエタノール(50mMリン酸ナトリウム、pH6.2、40%MeCN、2.5%DMF中1000xストック)を添加し、モノ−付加生成物、未修飾ペプチド及び副産物(2−メルカプトエタノールと遊離ペプチド−システインとの混合型ジスルフィド)の生成を、LC−MSにより周囲温度で2.5時間モニタリングした。結果を図8に示す。
ソマトスタチンに、種々の量のジチオマレイミド(50mMリン酸ナトリウム、pH6.2、40%MeCN、2.5−7.5%DMF中100xストック)を添加し、反応を周囲温度で10分間インキュベートした。次に、種々の量のTCEP又はベンゼンセレノール(100xストック、50mMリン酸ナトリウム、pH6.2、40%MeCN、2.5〜7.5%DMF中で新たに調製した)を添加し、架橋ソマトスタチンの生成を、LC−MSにより周囲温度で1時間にわたりモニタリングした。結果を図9に示す。
ソマトスタチンに、5当量のN−PEG5000−ジチオフェノールマレイミド又は10当量のN−PEG5000−ジチオフェノールマレイミド(50mMリン酸ナトリウム、pH6.2、40%MeCN、2.5%DMF中100xストック)のいずれかを添加し、反応を周囲温度で10分間インキュベートした。次に、3当量のTCEPそれぞれ5当量のベンゼンセレノール(100xストック、50mMリン酸ナトリウム、pH6.2、40%MeCN、2.5−7.5%DMF中に新たに調製)を添加し、PEG化ソマトスタチンの生成を、LC−MSによって周囲温度で2時間にわたってモニタリングした。結果を図10に示す。
得られたソマトスタチンアナログの活性に対して架橋修飾が有害な影響を有するか否かを試験するために、本発明者らは、ジブロモマレイミド架橋アナログ、PEG化ジブロモマレイミド架橋アナログ及びフルオレセインジブロモマレイミド架橋アナログを、パッチクランプアッセイによって試験した。HKIR3.1/3.2チャネル及びヒトソマトスタチンレセプター2を発現するHEK293細胞をこれらの化合物で処理し、ホールセルパッチクランプ電流記録を採取した。3つ全てのアナログが、ソマトスタチン自体と匹敵する振幅で、GIRK電流の強い活性化を誘導した。コントロールとして細胞を百日咳毒素又はGIRK阻害剤Tertiapin Qで処理したとき、電流は大きく阻害された。このデータにより、架橋ソマトスタチンアナログが、ソマトスタチンレセプター2のアゴニズムに関して、ソマトスタチンの生物活性を保持していることが確認される。
細胞培養方法及び安定細胞株の生成は、J Biol Chem 275,921−9(2000)に記載のとおりに実施した。Kir3.1チャネル及びKir3.2Aチャネルを安定に発現するHEK293細胞(ヒト胚性腎細胞株)を、10%胎仔ウシ血清及び727μgのG418(Invitrogen)を補充した最小必須培地中で、加湿雰囲気(95%O2、5%CO2)中37℃で維持した。細胞を、落射蛍光を使用したトランスフェクト細胞の可視化のためのpEGFP−N1(Clontech)と共に、SSTR2 DNA(Missouri S&T cDNA Resource Center)で一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションは、細胞培養培地(血清も抗生物質も含まない)97μl当たり、5μlのFugene HD(Roche)並びに800ngのSSTR2−DNA及び40ngのEGFP−DNAで実施した。
架橋ソマトスタチンは上記のように調製した。ソマトスタチン及びそのアナログを、緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、pH6.2)中で4℃で24時間透析して、有機溶媒を除去した。透析後、濃度を決定し、ペプチドを4℃で保存した。最終濃度20μMのソマトスタチン及びアナログを使用した(希釈は、細胞外パッチクランプ緩衝液中で行った)。
ホールセルパッチクランプ電流記録を、フィラメント化ホウケイ酸ガラスキャピラリー(Harvard Apparatus、1.5mm ODx1.17mm ID)から引き出される3−4MΩの抵抗を有するファイアポリッシュピペットを使用して、Axopatch 200B増幅器(Axon Instruments)で実施した。データを取得し、Digidata 1322Aインターフェイス(Axon Instruments)及びpCLAMPソフトウェア(バージョン8.1、Axon Instruments)で分析した。速い灌流システムを使用して、ソマトスタチン及びアナログをアプライした(Rapid Solution Changer、RSC−160、Bio−Logic France)。細胞を−60mVでクランプした。細胞外溶液は以下であった(mM):NaCl 80、KCl 60、CaCl2 2、MgCl2 1、HEPES 10、NaH2PO4 0.33、グルコース 10、pH7.4;一方、細胞内溶液は以下であった(mM):グルコン酸K 110、KCl 20、NaCl 10、MgCl2 1、MgATP 2、EGTA 2 GTP 0.3、pH7.4。アゴニストの適用後、電流は、遅延「ラグ」とその後のピーク振幅への迅速な上昇「ピークまでの時間」で活性化した。アゴニストの除去後、電流は、減衰してベースラインに戻った。各細胞について、薬物適用の圧力から生じたフローアーチファクト(flow artifact)が存在するか否かを評価した。これは、記録の開始時に、排水管の1つからの浴溶液を適用することによって行った。GIRK電流の阻害剤Tertiapin(Alomone)を、最終濃度100nMで使用した。細胞を、Gi/oタンパク質の阻害剤である百日咳毒素(Sigma、100ng/ml)と共に一晩インキュベートした。薬物は濃ストック溶液として調製し、−20℃で維持した。
δH (600 MHz, CDCl3) 7.34-7.24 (m, 5H, 5 x Ar-H), 6.15 (d, 1H, J = 1.5, H-5), 4.11 (t, 1H, J = 7.7, H-1), 3.01 (ddd, 1H, J = 1.5, 7.8及び15.8, HH-7), 2.96 (dd, 1H, J = 7.8及び15.6, HH-7), 2.36-2.26 (m, 2H, H2-13), 1.50-1.41 (m, 2H, H2-12), 1.35-1.33 (m, 6H, H2-9, H2-10及びH2-11), 0.85 (t, 3H, J = 7.0, H3-8); δC (150 MHz, CDCl3) 170.96 (C=O), 169.95 (C=O), 147.26 (C4), 141.10 (C14), 129.41 (C5), 128.89 (2 x Ar-H), 127.86 (C17), 127.71 (2 x Ar-H), 47.24 (C1), 32.47 (C13), 31.43 (CH2), 29.19 (CH2), 28.61 (CH2), 22.60 (CH2), 14.10 (C8); IR (油, cm-1) 3288 (w), 2928 (w), 1775 (w), 1717 (s); MS (FAB+) m/z (相対強度): 340 ([M+Na], 20), 329 (35), 207 (20), 176 (100); [C16H23NO2S]+Naについて計算した正確な質量はm/z 340.1347を要求、実測値340.1351 (FAB+).
δH (600 MHz, CDCl3) 8.77 (s, 1H, NH), 7.39-7.31 (m, 5H, 5 x Ar-H), 4.05 (t, 1H, J = 8.8, H-5), 3.17 (dd, 1H, J = 3.4及び10.9, H-7), 3.04 (ddd, 1H, J = 8.4, 11.1及び12.7, HH-6), 2.63 (ddd, 1H, J = 3.6, 9.0及び12.8, HH-6), 2.43 (ddd, 1H, J = 6.7, 7.9及び11.3, HH-17), 2.13 (ddd, 1H, J = 6.6, 8.0及び11.3, HH-17), 1.30-1.08 (m, 8H, H2-13, H2-14及びH2-15及びH2-16), 0.83 (t, 3H, J = 7.3, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 178.76 (C=O), 177.62 (C=O), 136.51 (C11), 128.77 (2 x Ar-H), 128.70 (2 x Ar-H), 128.03 (C8), 57.17 (C4), 45.70 (C5), 43.87 (C7), 31.26 (C17), 28.70 (CH2), 28.65 (CH2), 28.52 (CH2), 26.22 (C6), 22.46 (CH2), 14.10 (C12); IR (油, cm-1) 3218 (w), 2926 (w) 1771 (m), 1703 (s); MS (FAB+) m/z (相対強度): 340 ([M+Na], 20), 199 (25), 176 (100); [C16H23NO2S]+Na について計算した正確な質量はm/z 340.1347を要求、実測値 340.1357 (FAB+).
δH (600 MHz, CDCl3) 8.22 (s, 1H, H-16), 8.14 (d, 1H, J = 8.5, Ar-H), 7.68 (t, 1H, J = 7.6, Ar-H), 7.53 (t, 1H, J = 7.8, H-19), 7.20 (s, 1H, NH), 6.29 (s, 1H, H-5), 4.25 (t, 1H, J = 7.9, H-1), 3.03 (dd, 1H, J = 8.4及び15.4, HH-7), 2.98 (dd, 1H, J = 7.4及び15.2, HH-7), 2.37-2.26 (m, 2H, H2-13), 1.30-1.24 (m, 2H, H2-12), 1.21-1.08 (m, 6H, 3 x CH2), 0.81 (t, 3H, J = 7.1, H3-8); δC (150 MHz, CDCl3) 170.70 (C=O), 169.54 (C=O), 148.60 (C16), 146.35 (C4), 143.94 (C14), 133.83 (Ar-H), 129.96 (Ar-H), 129.86 (C5), 122.96 (Ar-H), 122.59 (Ar-H), 46.78 (C1), 32.52 (C7), 31.56 (CH2), 31.37 (C13), 29.03 (CH2), 28.52 (CH2), 22.57 (CH2), 14.11 (C8); IR (油, cm-1) 3282 (w), 2928 (m) 1775 (w), 1717 (s); 質量イオンは見出されず。
δH (600 MHz, CDCl3) 8.59 (s, 1H, NH), 8.22-8.16 (m, 2H, 2 x Ar-H), 7.66 (d, 1H, J = 7.5, Ar-H), 7.56 (t, 1H, J = 8.0, H-11), 4.14 (t, 1H, J = 8.6, H-5), 3.23 (dd, 1H, J = 3.0及び11.6, H-7), 3.05 (ddd, 1H, J = 8.5, 11.1及び13.1, HH-6), 2.73 (ddd, 1H, J = 3.6, 9.0及び12.9, HH-6), 2.45 (ddd, 1H, J = 6.7, 8.1及び11.4, HH-19), 2.13 (ddd, 1H, J = 6.8, 8.0及び11.3, HH-19), 1.30-1.24 (m, 2H, H2-18), 1.21-1.08 (m, 6H, H2-15, H2-16及びH2-17), 0.81 (t, 3H, J = 7.1, H3-14); δC (150 MHz, CDCl3) 177.94 (C=O), 176.84 (C=O), 148.14 (C9), 138.76 (C13), 135.29 (Ar-H), 129.24 (Ar-H), 123.39 (Ar-H), 123.16 (Ar-H), 56.71 (C4), 45.09 (C5), 43.69 (C7), 31.26 (CH2), 28.88 (CH2), 28.84 (C19), 28.51 (C6), 26.33 (CH2), 22.57 (CH2), 14.06 (C14); IR (油, cm-1) 3214 (w), 2928 (w) 1773 (m), 1709 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 363 ([M+H], 10), 214 (15), 84 (100); [C18H22N2O4S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 363.1379を要求、実測値363.1394 (CI+).
δH (600 MHz, CDCl3) 8.69 (s, 1H, H-2), 7.36-7.26 (m, 8H, 8 x Ar-H), 7.18 (d, 2H, J = 7.0, 2 x Ar-H), 6.65 (t, 1H, J = 5.6, H-17), 6.51 (d, 1H, J = 7.4, H-14), 4.33 (d, 2H, J = 6.0, H2-18), 4.30 (td, 1H, J = 1.2及び5.4, H-15), 4.05 (t, 1H, J = 8.9, H-5), 3.16 (dd, 1H, J = 3.1及び11.1, H-7), 3.04 (ddd, 1H, J = 8.9, 11.1及び12.8, HH-23), 2.94 (dd, 1H, J = 6.6及び13.3, HH-6), 2.59 (ddd, 1H, J = 3.4, 8.9及び12.5, HH-23), 2.31 (dd, 1H, J = 5.3及び13.6, HH-6), 1.98 (s, 3H, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 179.07 (C=O), 176.97 (C=O), 171.10 (C=O), 169.67 (C=O), 137.67 (Ar), 136.16 (Ar), 129.02 (2 x Ar-H), 128.80 (2 x Ar-H), 128.55 (2 x Ar-H), 128.35 (Ar-H), 128.78 (2 x Ar-H), 127.66 (Ar-H), 57.44 (C4), 52.61 (C15), 46.09 (C5), 43.68 (C7), 43.66 (C18), 30.58 (C6), 26.15 (C23), 23.17 (C12); IR (油, cm-1) 3437 (w), 1726 (s); MS (FAB+) m/z (相対強度): 695 ([M+H], 10), 439 (10), 286 (100); [C32H34N6O8S2]+H について計算した正確な質量はm/z 695.1958を要求、実測値695.1964 (FAB+).
δH (600 MHz, CDCl3) 7.32-7.30 (m, 3H, 3 x Ar-H), 7.13 (d, 2H, J = 7.9, 2 x H-10), 3.99 (dd, 1H, J = 7.8及び10.2, H-5), 3.20 (dd, 1H, J = 4.8及び10.3, H-7), 3.13-3.07 (m, 1H, HH-6), 2.93 (s, 3H, H3-18), 2.65 (td, 1H, J = 7.5及び11.4, HH-17), 2.58 (td, 1H, J = 7.5及び11.8, HH-17), 2.46 (ddd, 1H, J = 4.9, 7.7及び12.0, HH-6), 1.55-1.25 (m, 8H, H2-13, H2-14, H2-15及びH2-16), 0.87 (t, 3H, J = 7.0, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 177.78 (C=O), 175.17 (C=O), 137.21 (C11), 128.71 (2 x Ar-H), 127.93 (C8), 127.24 (2 x Ar-H), 48.23 (C5), 42.71 (C7), 31.42 (CH2), 30.07 (C17), 29.33 (CH2), 28.69 (CH2), 25.71 (CH2), 25.25 (C18), 22.58 (CH2), 14.12 (C12); IR (油, cm-1) 2927 (w) 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 332 ([M+H], 40), 228 (40), 86 (70), 84 (100); [C19H25NO2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 332.1684を要求、実測値 333.1697 (CI+).
δH (600 MHz, CDCl3) 7.39-7.30 (m, 5H, 5 x Ar-H), 3.90 (t, 1H, J = 8.7, H-5) 3.13-3.11 (m, 4H, H3-18及びH-7), 3.00 (ddd, 1H, J = 8.5, 11.0及び12.8, HH-6), 2.53 (ddd, 1H, J = 3.7, 9.1及び12.8, HH-6), 2.40 (ddd, 1H, J = 6.4, 8.1及び11.3, HH-17), 2.06 (ddd, 1H, J = 6.5, 8.3及び11.3, HH-17), 1.25-1.08 (m, 8H, H2-13, H2-14, H2-15及びH2-16), 0.82 (t, 3H, J = 7.4, H3-12); δC (150 MHz, CDCl3) 178.73 (C=O), 177.70 (C=O), 136.77 (C11), 128.89 (2 x Ar-H), 128.27 (2 x Ar-H), 127.99 (C8), 55.69 (C4), 45.62 (C5), 42.61 (C7), 31.29 (CH2), 28.94 (CH2), 28.68 (CH2), 28.55 (C17), 26.26 (C6), 25.70 (C18), 22.58 (CH2), 14.09 (C12); IR (油, cm-1) 2927 (w) 1703 (s),; MS (CI+) m/z (相対強度): 332 ([M+H], 100); [C19H25NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 332.1684を要求、実測値332.1680 (CI+).
δH (600 MHz, CDCl3) 7.54-7.27 (m, 10H, 10 x Ar-H), 6.32 (s, 1H, H-6), 4.19 (t, 1H, J = 88.0, H-1), 3.14-3.03 (m, 2H, H2-2), 2.39-2.29 (m, 2H, H2-13), 1.61-1.10 (m, 8H, 4 x CH2), 0.89-0.81 (m, 3H, H3-8); δC (150 MHz, CDCl3) 146.31 (C=O), 141.19 (C=O), 130.19 (Ar), 129.41 (Ar), 129.20 (Ar-H), 128.93 (2 x Ar-H), 128.49 (2 x Ar-H), 127.90 (Ar-H), 127.76 (2 x Ar-H), 126.03 (2 x Ar-H), 47.19 (C1), 32.70 (CH2), 31.43 (CH2), 29.83 (CH2), 29.20 (CH2), 28.63 (CH2), 22.61 (CH2), 14.13 (C8); IR (油, cm-1) 2926 (m) 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 394 ([M+H], 40), 278 (100); [C24H27NO2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 394.1841を要求、実測値394.1829 (CI+).
δH (600 MHz, CDCl3) 8.05 (s, 1H, NH), 7.42-7.41 (m, 2H, 2 x Ar-H), 7.35-7.17 (m, 8H, 8 x Ar-H), 4.05 (t, 1H, J = 10.1, H-5), 3.29 (dd, 1H, J = 5.5及び13.0, H-7), 3.01 (dt, 1H, J = 10.3及び13.0, HH-6), 2.56 (ddd, 1H, J = 5.6, 10.1及び13.4, HH-6); δC (150 MHz, CDCl3) 176.69 (C=O), 174.10 (C=O), 136.56 (C11), 136.01 (2 x Ar-H), 130.13 (Ar-H), 129.66 (2 x Ar-H), 129.28 (C15), 128.72 (2 x Ar-H), 128.01 (Ar-H), 127.32 (2 x Ar-H), 60.59 (C4), 46.32 (C5), 43.70 (C7), 25.51 (C6); IR (油, cm-1) 3226 (w), 2925 (w) 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 310 ([M+H], 10), 206 (30), 111 (100); [C18H15NO2S]+Hについて計算した正確な質量はm/z 310.0902を要求、実測値310.0901 (CI+).
δH (600 MHz, CDCl3) 8.24 (s, 1H, NH), 7.43-7.30 (m, 6H, 8 x Ar-H), 7.27-7.24 (m, 2H, 2 x Ar-H), 4.13 (t, 1H, J = 9.0, H-5), 3.20-3.13 (m, 2H, HH-6及びH-7), 2.55 (ddd, 1H, J = 5.6, 8.3及び13.4, HH-6); δC (150 MHz, CDCl3) 177.99 (C=O), 177.17 (C=O), 135.80 (C11), 135.80 (2 x Ar-H), 129.64 (Ar-H), 129.54 (2 x Ar-H), 128.95 (C15), 128.51 (2 x Ar-H), 128.45 (2 x Ar-H), 128.22 (Ar-H), 60.72 (C4), 45.80 (C5), 43.39 (C7), 25.20 (C6); IR (油, cm-1) 3211 (w), 1772 (w) 1707 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 310 ([M+H], 50), 206 (100), 104 (40); [C18H15NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 310.0902を要求、実測値310.0905 (CI+).
δH (600 MHz, CDCl3) 7.29 (s, 1H, NH), 6.43 (s, 1H, H-5), 2.91-2.76 (m, 3H, H-1及びH2-17), 2.70 (dd, 1H, J =1.4及び5.8, HH-7), 2.64 (dd, 1H, J = 1.4及び7.9, HH-7), 2.49 (t, 1H, J = 7.4, H2-13), 1.81-1.25 (m, 12H, 6 x CH2), 0.93-0.85 (m, 6H, H3-8及びH3-14); δC (150 MHz, CDCl3) 174.39 (C=O), 171.40 (C=O), 148.19 (C4), 129.28 (C5), 43.90 (C1), 34.97 (CH2), 31.53 (CH2), 30.60 (CH2), 29.70 (CH2), 29.07 (CH2), 28.76 (CH2), 28.51 (CH2), 22.66 (CH2), 22.65 (CH2), 14.16 (CH3), 14.13 (CH3); IR (油, cm-1) 3226 (w), 2927 (m) 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 298 ([M+H], 80), 187 (100); [C16H27NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 298.1841を要求、実測値298.1841 (CI+).
δH (600 MHz, CDCl3) 8.19 (s, 1H, NH), 3.09 (dd, 1H, J = 4.5及び10.2, H-7), 2.70-2.64 (m, 1H, H-5), 2.53-2.45 (m, 2H, H2-17), 2.37-2.28 (m, 2H, H2-6), 1.80-1.73 (m, 1H, HH-11), 1.59-1.50 (m, 2H, HH-11及びHH-10), 1.38-1.20 (m, 11H, HH-10及び5 x CH2), 0.90 (t, 3H, J = 7.1, CH3), 0.87 (t, 3H, J = 7.3, CH3); δC (150 MHz, CDCl3) 178.73 (C=O), 177.81 (C=O), 56.10 (C4), 44.29 (C7), 40.99 (C5), 31.42 (C17), 29.24 (CH2), 28.99 (CH2), 28.90 (CH2), 28.74 (CH2), 28.73 (CH2), 27.92 (CH2), 22.59 (CH2), 22.58 (CH2), 14.12 (CH3), 14.09 (CH3); IR (油, cm-1) 3209 (w), 2927 (m) 1774 (w), 1711 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 298 ([M+H], 100); [C16H27NO2S]+H について計算した正確な質量はm/z 298.1841を要求、実測値298.1845 (CI+).
δH (600 MHz, CDCl3) 7.96 (s, 1H, NH), 7.33 (d, 2H, J = 7.0, 2 x Ar-H), 7.28 (t, 1H, J = 7.0, H-8), 7.21 (d, 2H, J = 7.5, 2 x Ar-H), 4.02 (t, 1H, J = 10.0, H-5), 2.98-2.92 (m, 2H, HH-6及び-S-CHH-), 2.87 (dd, 1H, J = 10.8及び13.6, HH-6), 2.83-2.72 (m, 2H, -S-CHH-及び-S-CHH-), 2.69 (dt, 1H, J = 7.4及び10.8, -S-CHH-) 1.68-1.57 (m, 4H, H2-16及びH2-22), 1.45-1.31 (m, 4H, H2-15及びH2-21), 1.31-1.25 (m, 8H, H2-13, H2-14, H2-19及びH2-20), 0.86 (t, 6H, J = 7.0, H3-12及びH3-18); δC (150 MHz, CDCl3) 176.91 (C=O), 172.96 (C=O), 136.09 (C11), 128.83 (2 x Ar-H), 128.13 (C8), 127.41 (2 x Ar-H), 62.86 (C4), 54.36 (C7), 46.49 (C5), 33.28 (C6), 31.51 (CH2), 31.47 (CH2), 30.65 (SCH2), 30.09 (SCH2), 29.22 (CH2), 28.96 (CH2), 28.80 (CH2), 28.74 (CH2), 22.63 (CH2), 22.60 (CH2), 14.17 (CH3), 14.15 (CH3); IR (油, cm-1) 3194 (w), 2928 (m) 1774 (w), 1722 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 432 ([M-H], 5), 332 (50), 316 (95), 207 (100); [C24H35NO2S2]-Hについて計算した正確な質量はm/z 432.2026を要求、実測値432.2029 (CI+).
δH (600 MHz, CDCl3) 8.10 (s, 1H, NH), 7.41 (d, 2H, J = 6.9, 2 x Ar-H), 7.37 (t, 1H, J = 6.9, H-8), 7.33 (d, 2H, J = 6.9, 2 x Ar-H), 3.92 (t, 1H, J = 8.9, H-5), 2.95 (dd, 1H, J = 8.9及び12.9, HH-6), 2.86 (dt, 1H, J = 6.9及び14.2, -S-CHH-), 2.78-2.66 (m, 2H, HH-6及び-S-CHH-), 2.60 (ddd, 1H, J = 6.3, 8.3及び10.9, -S-CHH-) 2.00 (ddd, 1H, J = 5.6, 8.6及び10.7, -S-CHH-), 1.65-1.60 (m, 2H, HH-16及びHH-22), 1.43-1.06 (m, 14H, HH-16, HH-22, H2-13, H2-14, H2-15, H2-19, H2-20及びH2-21), 0.88 (t, 3H, J = 6.7, CH3), 0.82 (t, 3H, J = 7.1, CH3); δC (150 MHz, CDCl3) 176.59 (C=O), 176.44 (C=O), 136.03 (C11), 129.50 (2 x Ar-H), 128.83 (C8), 128.29 (2 x Ar-H), 62.32 (C4), 54.58 (C7), 45.33 (C5), 34.85 (C6), 31.48 (CH2), 31.33 (CH2), 30.51 (CH2), 29.21 (CH2), 29.06 (CH2), 28.90 (CH2), 28.76 (CH2), 28.53 (CH2), 22.62 (CH2), 22.50 (CH2), 14.16 (CH3), 14.11 (CH3); IR (油, cm-1) 3215 (w), 2926 (m) 1774 (w), 1715 (s); MS (CI+) m/z (相対強度): 432 ([M-H], 5), 329 (60), 207 (100), 161 (60); [C24H35NO2S2]-Hについて計算した正確な質量はm/z 432.2026 を要求、実測値 432.2034 (CI+).
Claims (18)
- 式F1の第一の機能的部分を含む式R1−Hの化合物を式F2の第二の機能的部分に連結するための試薬としての、式(Ia)の化合物の使用:
X及びX’はそれぞれ酸素を示し;
Yは求電子性脱離基であり;
R3及びR3’は一緒になって、式−N(R33’)−の基を形成し、R33’は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示すか、又は
R3及びR3’は一緒になって、式−N(R33’)−N(R33’)−の基を形成し、各R33’は、同じ又は異なって、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示す;
R2は、水素原子又は式Y、Nu、−L(Z)n若しくはIGの基を示し;
式Yのそれぞれの基は、同じ又は異なって、求電子性脱離基を示し;
式Nuのそれぞれの基は、同じ又は異なって、−OH、−SH、−NH2及び−NH(C1−6アルキル)から選択される求核剤を示し;
式Lのそれぞれの基は、同じ又は異なって、リンカー基を示し;
式Zのそれぞれの基は、同じ又は異なって、請求項1に記載の第二の機能的部分を含む
化合物と反応し得る、式Lの基に結合した反応性基を示し、その結果該第二の機能的部分が該式Lの基に連結され;
nは、1、2又は3であり;
式IGのそれぞれの基は、同じ又は異なって、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基で置換されている、C1−20アルキル基、C2−20アルケニル基又はC2−20アルキニル基である部分を示し、これらの基において、(a)0、1又は2個の炭素原子は、C6−10アリーレン、5〜10員のヘテロアリーレン、C3−7カルボシクリレン及び5〜10員のヘテロシクリレン基から選択される基に置き換わっており、かつ(b)0、1又は2個の−CH2−基は、−O−、−S−、−S−S−、−C(O)−及び−N(C1−6アルキル)−基から選択される基に置き換わっており、これらの基において、
(i)該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにC1−6アルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオ、−N(C1−6アルキル)(C1−6アルキル)、ニトロ及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基によって置換されており;
(ii)該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の0、1又は2個の炭素原子は、−C(O)−基に置き換わっており;
・該第一の機能的部分及び第二の機能的部分のいずれか一方は、抗体又は抗体断片であるタンパク質であり、該第一の機能的部分及び第二の機能的部分のもう一方は薬物であるか;
・該第一の機能的部分及び第二の機能的部分のいずれか一方は、ペプチド、タンパク質、多糖、ポリエーテル、ポリアミノ酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ(メタ)アクリル酸及びその誘導体、ポリウレタン及びポリホスファゼンから選択されるポリマー部分であり、該第一の機能的部分及び第二の機能的部分のもう一方は薬物であるか;又は
・該第一の機能的部分及び第二の機能的部分のいずれか一方は、抗体又は抗体断片であるタンパク質であり、該第一の機能的部分及び第二の機能的部分のもう一方は検出可能部分であり;
基R1は、式(Ia)の化合物の2位において、式R1−Hの化合物中の第一のSH基の求核攻撃によって式(Ia)の化合物に結合され、その結果2位の基Yが基R1に置き換わられる。 - (A):
Yが、ハロゲン原子又はトリフレート、トシレート、メシレート、N−ヒドロキシスクシンイミジル、N−ヒドロキシスルホスクシンイミジル、C1−6アルキルチオ、5〜10員のヘテロシクリルチオ、C6−10アリールチオ、C3−7カルボシクリルチオ、−OC(O)CH3、−OC(O)CF3、フェニルオキシ、−NRxRyRz +若しくは−PRxRyRz +基であり、式中、Rx、Ry及びRzは、同じ又は異なって、水素原子並びにC1−6アルキル及びフェニル基から選択される;及び/又は
(B):
Lが、非置換であるか又はハロゲン原子及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基で置換されている、C1−20アルキレン基、C2−20アルケニレン基又はC2−20アルキニレン基である部分を示し、これらの基において、(a)0、1又は2個の炭素原子は、C6−10アリーレン、5〜10員のヘテロアリーレン、C3−7カルボシクリレン及び5〜10員のヘテロシクリレン基から選択される基に置き換わっており、かつ(b)0、1又は2個の−CH2−基は、−O−、−S−、−S−S−、−C(O)−及び−N(C1−6アルキル)−基から選択される基に置き換わっており、これらの基において、
(i)該アリーレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにC1−6アルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオ、−N(C1−6アルキル)(C1−6アルキル)、ニトロ及びスルホン酸基から選択される1個以上の置換基によって置換されており;
(ii)該カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基中の0、1又は2個の炭素原子は、−C(O)−基に置き換わっている;及び/又は
(C):
Zが、
(a)式−LG、−C(O)−LG、−C(S)−LG又は−C(NH)−LGの基(式中、LGは求電子性脱離基である);
(b)−OH、−SH、−NH2、−NH(C1−6アルキル)及び−C(O)NHNH2基から選択される求核剤Nu’;
(c)求核剤と開環求電子反応し得る環式部分Cyc;
(d)式−S(O2)(Hal)の基(式中、Halはハロゲン原子である);
(e)式−N=C=O又は−N=C=Sの基;
(f)式−S−S(IG’)の基(式中、IG’は、請求項2に記載の式IGの基を示す);
(g)1個以上のハロゲン原子によって置換されたC6−10アリール基である、基AH;
(h)紫外線光への曝露によって活性化され得る光反応性基;
(i)式−C(O)H又は−C(O)(C1−6アルキル)の基;
(j)マレイミド基;
(k)式−C(O)CHCH2の基;
(l)式−C(O)C(N2)H又は−PhN2 +の基(式中、Phはフェニル基を示す);若しくは
(m)エポキシド基、
を示す;及び/又は
(D):
IGが、非置換のC1−6アルキル基、C2−6アルケニル基又はC2−6アルキニル基である部分を示し、これらの基において、(a)0又は1個の炭素原子は、フェニレン、5〜6員のヘテロアリーレン、C5−6カルボシクリレン及び5〜6員のヘテロシクリレン基から選択される基に置き換わっており、該フェニレン、ヘテロアリーレン、カルボシクリレン及びヘテロシクリレン基は、非置換であるか又はハロゲン原子並びにC1−4アルキル及びC1−4アルコキシ基から選択される1又は2個の置換基によって置換されており、かつ(b)0、1又は2個の−CH2−基は、−O−、−S−及び−C(O)−基から選択される基に置き換わっている;及び/又は
(E):
nが1である、
請求項1に記載の使用。 - 式(Ia)の化合物が式(Ib)の化合物
X及びX’はそれぞれ酸素原子を示し;
R33’は水素原子又はC1−6アルキル基を示し;
Yはハロゲン原子を示し;
R2は水素若しくはハロゲン原子又はC1−6アルキル基を示す、
請求項1又は2に記載の使用。 - R1が式−F1の基であり;
F1が、少なくとも第一のシステイン残基を含むペプチド又はタンパク質であり;
基R1が、式(Ia)の化合物の2位において、該第一のシステイン残基のチオール基の求核攻撃によって式(Ia)の化合物に結合され、その結果基Yが基R1中の第一のシステイン残基中のチオール基に由来する式−S−の基に置き換わった請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。 - R2が式Yの基であり;
R1がさらに、少なくとも第二のシステイン残基を含み;かつ
基R1が、式(Ia)の部分の3位において、該第二のシステイン残基のチオール基の求核攻撃によって式(Ia)の化合物にさらに結合され、その結果基R2が基R1中の第二のシステイン残基中のチオール基に由来する式−S−の基に置き換わった、請求項4に記載の使用。 - コンジュゲートを産生するためのプロセスであって、
(i)式(Ia)の化合物を式R1−Hの化合物と反応させて、式(II)の化合物を産生する工程
を含み、
工程(i)は、式(Ia)の化合物の2位において、式R1−Hの化合物中の第一のSH基の求核攻撃によって基R1を結合させることを含み、その結果2位の基Yは基R1によって置き換わられ、
X、X’、Y、R1、R2、R3、R3’、及びF2は全て、請求項1〜5のいずれか1項に記載したとおりである、プロセス。 - 請求項6に記載のプロセスであって、
(A):
該プロセスは、式(II)の2位と3位との間の炭素−炭素二重結合へのF2の求電子付加反応によって、F2を式(II)の化合物に連結する工程を含む;又は
(B):
R3及びR3’が一緒になって式−N(R33’)−の基を形成し、R33’は、水素原子又は式Y、Nu若しくは−L(Z)nの基を示し、該プロセスは、F2と(i)式−N(R33’)−の部分の窒素原子又は(ii)式Y、Nu若しくは−L(Z)nの基との間の反応によって、F2を式(II)の部分に連結する工程を含む;又は
(C):
R2が、式Y、Nu又は−L(Z)nの基を示し、該プロセスは、F2と式Y、Nu又は−L(Z)nの基との間の反応によって、F2を式(II)の化合物に連結する工程を含む。 - コンジュゲートを産生するためのプロセスであって、該プロセスは、
式R1−Hの化合物を、式(IIa)の化合物:
R3a及びR3a’は一緒になって、式−N(R33a’)−の基を形成し、R33a’は、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示すか、又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−N(R33a’)−N(R33a’)−の基を形成し、各R33a’は、同じ又は異なって、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し;
R2aは、式R2の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し;
mは、0からnまでの値を有する整数であり;
式(IIa)の化合物は、少なくとも1個の式F2の基を含み;
F2は、請求項1に記載したとおりであり;
X、X’、Y、R3、R3’、R33’、R2、L、Z及びnは全て、請求項1〜3のいずれか1項に記載したとおりであり;
R1は、請求項1、4又は5に記載したとおりであり;
該プロセスは、式(IIa)の化合物の2位において、式R1−Hの化合物中の第一のSH基の求核攻撃によって基R1を結合させることを含み、その結果2位の基Yが基R1に置き換わられる、プロセス。 - (i)式(III)又は(IIIa)の化合物を、提供する工程;及び
(ii)ホスフィン化合物、亜リン酸塩化合物、チオール、セレノール、アミン及びソフトカーボン求核化合物から選択される試薬と共に、式(III)又は(IIIa)の化合物をインキュベートすることにより、式(III)又は(IIIa)の化合物の2位において、基R1と炭素原子との間の結合を切断する工程、
を含み、
R3a及びR3a’は一緒になって、式−N(R33a’)−の基を形成し、R33a’は、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示すか、又は
R3a及びR3a’は一緒になって、式−N(R33a’)−N(R33a’)−の基を形成し、各R33a’は、同じ又は異なって、式R33’の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し、;
R2aは、式R2の基又は式F2若しくは−L(F2)m(Z)n−mの基を示し;
mは、0からnまでの値を有する整数であり;
R1は、請求項1、4又は5に記載したとおりであり;
F2は、請求項1に記載したとおりであり;
X、X’、R3、R3’、R33’、R2、L、Z及びnは全て、請求項1〜3のいずれか1項に記載したとおりである。]
該プロセスが式(IIIa)の化合物を含む場合、
式(IIIa)の化合物のR1は、少なくとも第一のチオール基及び第二のチオール基を含み、該第一のチオール基は、式(IIIa)の化合物中の2位に結合し、第二のチオール基は、式(IIIa)の化合物中の3位に結合しており;
工程(ii)が、ホスフィン化合物、亜リン酸塩化合物、チオール、セレノール、アミン及びソフトカーボン求核化合物から選択される試薬と共に、式(IIIa)の化合物をインキュベートすることにより、式(IIIa)の部分の3位において、基R1と炭素原子との間の結合を切断することを更に含む、プロセス。 - 請求項8に記載の式(IIa)の化合物(但し、R 2a は、グルコピラノシルチオではない。)。
- 式F 2 の基を少なくとも1個含み、R 2a が水素原子ではない、請求項9に記載の式(III)の化合物。
- 請求項9に記載の、式(IIIa)の化合物。
- 式F2の基を少なくとも1個含む、請求項12に記載の化合物。
- R1が、少なくとも第1のシステイン残基と第2のシステイン残基を含むペプチド又はタンパク質であり、
R1は、該第1のシステイン残基中のチオール基に由来する式−S−の基により式(IIIa)の化合物中の2位に結合し、かつ
R1は、該第2のシステイン残基中のチオール基に由来する式−S−の基により式(IIIa)の化合物中の3位に結合する、請求項12又は13に記載の化合物。 - 式(IVa)又は(IVb)の化合物
R1は、請求項1、4又は5に記載したとおりであり;
X、X’、R2a、R3a及びR3a’は、請求項9に記載したとおりであり;
R4は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、C1−6アルコキシ、チオール、C1−6アルキルチオ若しくはC1−6アルキルカルボニルオキシ基、又は式F2の基であり;
基R2a及びR4の少なくとも一方は、式F2の基を含み;
F2は、請求項1に記載したとおりである]。 - 請求項11、請求項13又は請求項15に記載の化合物を有効成分として含有する医薬組成物。
- コンジュゲートがマレイミド環を含み、該プロセスが該マレイミド環の開環をもたらす工程を更に含む、請求項6〜8のいずれか1項に記載のプロセス。
- 式(IIIa)の化合物において、R 1 の第1のシステイン残基と第2のシステイン残基が該ペプチド又はタンパク質中で形成された内部ジスルフィド結合に由来する、請求項14に記載の化合物。
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