JP5952331B2 - シヌクレイノパチーおよびアミロイド形成疾患(amyloidogenicdisease)の予防および処置 - Google Patents
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Description
本願は、2007年2月23日に出願された11/710,248の一部継続出願である、2007年4月6日に出願された11/697646の一部継続出願、および2007年11月1日に出願された60/984,721の非仮出願である。前述の出願の各々は、全ての目的のためにその全部が引用することにより本明細書に組み込まれる。
disease(AD))および多系統萎縮症が包含される。レビー小体型認知症(DLB)は、LBDの専門用語における違いを調整するために作られた用語である。
許文献11;非特許文献12;非特許文献13)。NACの正確な機能は不明であるが、それはシナプス事象、例えば発生中の神経可塑性、および学習ならびにLBD、ADおよび他の疾患における病的状態下での神経終末の変性において重要な役割を果たし得る(非特許文献14;非特許文献9)。
(非特許文献14)または主に罹患する細胞であるドーパミン作動性ニューロンの再生および/もしくは生存を促進する成長因子を試験することに向けられている(非特許文献15;非特許文献16)。Aβ1〜42に対する抗体は脳からのアミロイドの除去を促進しそして刺激し、AD様病変を改善し、そして認識能力の改善をもたらすことがADのトランスジェニックマウスモデルにおける最近の研究により示されている(非特許文献17;非特許文献18;非特許文献19)。アルツハイマー患者の脳において見出される細胞外アミロイド斑と対照的に、レビー小体は細胞内であり、そして抗体は典型的に細胞に入らない。
regimes)に対する長年にわたる必要性を満たす。
1つの態様において、本発明は脳におけるレビー小体もしくはアルファ−SN凝集を特徴とする疾患を予防するかもしくは処置する方法を提供する。そのような方法は、アルファ−SNに対する免疫反応を誘導することを伴う。そのような誘導は、免疫原の能動的投与によりまたはシヌクレインに対する抗体もしくは抗体の誘導体の受動的投与により成し遂げることができる。ある方法において、患者は無症状である。ある方法において、患者は疾患にかかっておりそして無症状である。ある方法において、患者は疾患の危険因子を有しそして無症状である。ある方法において、疾患はパーキンソン病である。ある方法において、疾患はパーキンソン病であり、そして薬剤を投与することは患者の運動特性を改善する。ある方法において、疾患はパーキンソン病であり、薬剤を投与することは患者の運動特性の悪化を防ぐ。ある方法において、患者はアルツハイマー病にかかっていない。
N130〜140を含んでなり、そしてアルファシヌクレインの合計で40個以下もしくは30個以下の連続する残基を含有する(残基は配列番号:1に従って番号が付けられている)。場合により、免疫原性フラグメントはSN83〜140を含んでなる(残基は配列番号:1に従って番号が付けられている)。
合により、ポリペプチドは担体に融合している免疫原性フラグメントを含んでなる。場合により、免疫原性フラグメントはアルファ−シヌクレインフラグメントのC末端で担体分子に連結される。場合により、フラグメントの多数のコピーが担体の多数のコピーと相互連結される。場合により、免疫原性フラグメントはアジュバントと共に投与される。場合により、投与する段階はレビー小体の少なくとも部分的なクリアランスをもたらす。場合により、投与する段階はレビー小体を解離させる。場合により、投与する段階はシナプスにおけるアルファシヌクレインオリゴマーのレベルを減少させる。場合により、投与する段階はリソソーム経路の活性化によりシヌクレインを除去する。
患の予防をもたらすかもしくはそれを処置する方法を提供し、該方法はヒトアルファ−シヌクレインの残基110〜130内のエピトープに特異的に結合する抗体の有効な処方計画を疾患にかかっているかもしくはその危険性がある患者に施すことを含んでなる(残基は配列番号:1に従って番号が付けられている)。場合により、抗体はヒトアルファ−シヌクレインの残基118〜126内のエピトープに結合する。場合により、疾患はパーキンソン病である。場合により、抗体はモノクローナル抗体である。場合により、抗体はキメラ抗体、ヒト抗体もしくはヒト化抗体である。場合により、抗体はヒトアルファ−シヌクレインへの結合に関してマウスモノクローナル抗体9E4(ATCC受託番号PTA−8221)と競合する。場合により、抗体はモノクローナル抗体9E4(ATCC受託番号PTA−8221)またはヒト化もしくはキメラ9E4である。場合により、抗体はヒトIgG1アイソタイプの抗体である。場合により、抗体は製薬学的組成物として製薬学的担体と共に投与される。場合により、抗体は0.0001〜100mg抗体/kg体重の投薬量で投与される。場合により、抗体は少なくとも6カ月にわたって複数回投与において投与される。場合により、抗体は腹腔内に、経口で、皮下に、頭蓋内に、筋肉内に、局所に、鼻腔内にもしくは静脈内に投与される。場合により、抗体は抹消経路により投与される。場合により、抗体は1〜10mg/kgの用量で投与される。
「実質的な同一性」という用語は、2つのペプチド配列が、デフォルトギャップ加重を用いてプログラムGAPもしくはBESTFITによるような、最適に並べられる場合に、少なくとも65パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも80もしくは90パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも95パーセントの配列同一性もしくはそれ以上(例えば、99パーセントの配列同一性もしくはそれ以上)を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は保存的アミノ酸置換によって異なる。
;群V(鎖配向に影響を与える残基):gly、pro;および群VI(芳香族側鎖):trp、tyr、phe。保存的置換は、同じクラスにおけるアミノ酸間の置換に関する。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のもののメンバーと交換することに相当する。
al.,Nature 325,773(1987);Ponte et al.,Nature 331,525(1988);およびKitaguchi et al.,Nature 331,530(1988)を参照。ヒトアミロイド前駆体タンパク質(APP)内のアミノ酸は、APP770アイソフォームの配列に従って番号が付けられる。Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42およびAβ43のような用語は、アミノ酸残基1〜39、1〜40、1〜41、1〜42および1〜43を含有するAβペプチドをさ
す。
al.,J.Immunol.137:3614−3619(1986)を参照);固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988)を参照);I−125標識を用いる固相直接標識RIA(Morel et al.,Molec.Immunol.25(1):7−15(1988)を参照);固相直接ビオチン−アビジンEIA(Cheung et al.,Virology 176:546−552(1990));および直接標識RIA(Moldenhauer et al.,Scand.J.Immunol.32:77−82(1990))。典型的に、そのようなアッセイは固体表面に結合している精製された抗原もしくはこれらのいずれかを保有する細胞、非標識試験免疫グロブリンおよび標識参照免疫グロブリンの使用を伴う。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面もしくは細胞に結合している標識の量を決定することにより測定される。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。競合アッセイ(競合抗体)により同定される抗体には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体および立体障害が起こるように参照抗体が結合するエピトープの十分に近位にある隣接エピトープに結合する抗体が包含される。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それは共通抗原への参照抗体の特異的結合を少なくとも50%もしくは75%阻害する。
I.概要
本発明は、レビー小体の形態の、患者の脳における不溶性の塊に凝集したアルファ−SNペプチドの沈着物の存在を特徴とするいくつかの疾患および症状を予防するかもしくは処置する方法を提供する。そのような疾患はレビー小体病(LBD)とまとめて呼ばれ、そしてパーキンソン病(PD)が包含される。そのような疾患は、β−プリーツシート構造を有しそしてチオフラビン−Sおよびコンゴレッドで染まるアルファ−SNの凝集体を特徴とする(Hasimoto,同書を参照)。本発明は、アルファ−SNに対する免疫原性反応を起こすことができる薬剤を用いてそのような疾患を予防するかもしくは処置する方法を提供する。免疫原性反応は、脳における細胞内のシヌクレイン沈着物の形成を防ぐかもしくはそれを除去するように働く。機序の理解は本発明の実施にとって必須ではないが、免疫原性反応は単独でもしくはアルファシヌクレインと共に細胞内に取り込まれるシヌクレインに対する抗体の結果として除去を誘導することができる。実施例において提示される結果は、末梢に投与したアルファシヌクレインに対する抗体が血液脳関門を越え、そしてアルファシヌクレイン沈着物を含有する細胞内に単独でもしくはアルファシヌクレインと共に取り込まれることを示す。取り込まれた抗体は、リソソーム経路の活性化によってアルファシヌクレインの分解を促進することができる。変性形態のアルファシヌクレインに対する親和性を有する取り込まれた抗体はまた、非凝集形態の分子を安定させることもできる。あるいはまたもしくはさらに、抗体は細胞外側表面上のシヌクレインの凝集を妨げることができる。例えば、アルファ−シヌクレインに対する抗体はニューロン細胞表面における異常構造(abnormally conformed)タンパク質を認識しそして架橋し得る。ある方法において、除去反応はFc受容体に媒介される食作用により少なくとも部分的にもたらされることができる。シヌクレインでの免疫は、脳におけるシナプスおよびニューロン細胞体でのシヌクレイン蓄積を減少させることができる。機序の理解は本発明の実施にとって必須ではないが、この結果はニューロン細胞により(例えばシナプス小胞により)取り込まれているシヌクレインに対する抗体により説明することができる。
発明はLBDにかかっているがアルツハイマー病を患っていないかもしくは発症する危険性がない個体においてそのような薬剤を単独でもしくはアルファ−SNに対する免疫原性反応を起こす薬剤と組み合わせて使用する。
免疫原性反応は、患者におけるアルファ−SNと反応する抗体を誘導するために免疫原が投与される場合のように能動的であるか、もしくは患者におけるアルファ−SNにそれ自体が結合する抗体が投与される場合のように受動的であることができる。
治療薬は、アルファ−SNペプチド内のあるエピトープに特異的に向けられる免疫原性反応を誘導する。好ましい薬剤は、アルファ−SNペプチド自体およびそのフラグメントである。米国特許公開US20060259986A1およびPCT特許公開WO05/013889(これらの両方とも、全ての目的のために引用することにより本明細書に組み込まれる)は、シヌクレイノパチーおよびアミロイド形成疾患の予防および処置の方法において有用な新規アルファ−シヌクレインフラグメントを開示する。場合により、これらのフラグメントはアジュバントと組み合わせて用いることができる。
tl.Acad.Sci.U.S.A.90(23):11282−11286(1993))。ADアミロイドの非Aβ成分の前駆体(NACP)とも呼ばれるアルファ−SNは、140アミノ酸のペプチドである。アルファ−SNはアミノ酸配列:
MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA(配列番号:1)(Ueda et al
,同書;GenBank受託番号:P37840)
を有する。
5)(配列番号:2)からなるペプチドである。図1を参照。NACは、ベータシート構造を形成する傾向を示す(Iwai,et al.,Biochemistry,34:10139−10145)。Jensen et al.は、NACがアミノ酸配列:
EQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFV(配列番号:2)(Jensen et al.,Biochem.J.310(Pt1):91−94(1995);GenBank受託番号S56746)
を有することを報告している。
KEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGS(配列番号:3)(Ueda et al.,PNAS USA 90:11282−11286(1993)
を有することを報告している。
により認識される領域のもしくはその近く(例えば、アミノ酸70〜119、80〜109、88〜101もしくは91〜99内)のエピトープを含む。ある活性フラグメントにおいて、エピトープのC末端残基はアルファ−SNのC末端残基である。
5の、もしくはシヌクレインのC末端領域におけるエピトープを認識する抗体9E4の投与は、ヒトアルファ−シヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳におけるアルファ−シヌクレイン凝集を減少させた。アルファ−シヌクレイン末端領域のもしくはその近くの配列を含んでなるアルファ−シヌクレインフラグメントでの免疫は、凝集体のそのような除去を同様にもたらしそして/もしくは凝集体の形成を防ぐことが予想される。
DVFMKGLSKA;DVFMKGLSK;DVFMKGLS;DVFMKGL;DVFMKG;DVFMK、VFMKGLSKAKEGVVAAAEKT;VFMKGLSKAKEGVVAAAEK;VFMKGLSKAKEGVVAAAE;VFMKGLSKAKEGVVAAA;VFMKGLSKAKEGVVAA;VFMKGLSKAKEGVVA;VFMKGLSKAKEGVV;VFMKGLSKAKEGV;VFMKGLSKAKEG;VFMKGLSKAK;VFMKGLSKA;VFMKGLSK;VFMKGLS;VFMKGL;およびVFMKG)。以下に説明されるように、上記のフラグメントは担体分子に連結することができる(例えば、コンジュゲートもしくは融合タンパク質、節II(3)を参照)。あるいはまた、以下に説明されるように、上記のフラグメントはフラグメントをコードする核酸を患者にワクチン接種することにより投与することができる(節II(4)を参照)。
オニン、3−メチルヒスチジン、5−ヒドロキシリシン、オメガ−N−メチルアルギニン、ベータ−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、ガンマ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンおよびイソアスパラギン酸である。治療薬にはまた、アルファ−SNフラグメントのアナログも包含される。本発明のある治療薬は全てDのペプチド、例えば、全てDのアルファ−SNもしくは全てDのNAC、および全てDのペプチドアナログのものである。アナログは天然ヒトアルファシヌクレインに対する抗体のポリクローナル集団に特異的に結合する。フラグメントおよびアナログは、下記のように未処置のもしくはプラセボコントロールと比較してトランスジェニック動物モデルにおいて予防もしくは治療効能についてスクリーニングすることができる。
対して免疫反応を起こす(Essential Immunology,Roit ed.,Blackwell Scientific Publications,Palo
Alto,CA 第6版,p.181を参照)。アルファ−SN以外の薬剤は、上記のアルファ−SNの好ましいセグメントの1つもしくはそれ以上に対して免疫原性反応を誘導するはずである(例えばNAC)。好ましくは、そのような薬剤はアルファ−SNの他のセグメントに向けられずにこれらのセグメントの1つに特異的に向けられる免疫原性反応を誘導する。
siao et al.,Science 274,99(1996);Staufenbiel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,13287−13292(1997);Sturchler−Pierrat et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94.13287−13292(1997);Borchelt et al.,Neuron 19,939−945(1997)により記述されるようなAPPの670/671 Swedish突然変異を保有するマウスである。そのようなシヌクレイン/APPトランスジェニック動物の例は、WO01/60794に提供される。PDのさらなる動物モデルには、6−ヒドロキシドーパミン、ロテノンおよび1−メチル−4−フェニル−1,2,3,6−テトラヒドロピリジン(MPTP)動物モデル(M.Flint Beal,Nature Reviews Neuroscience 2:325−334(2001))が包含される。同じスクリーニング方法は、上記のアルファ−SNの他の潜在的アナログおよびアルファ−SNのフラグメントを含むより長いペプチドならびに他のレビー小体成分およびそのアナログもしくはフラグメントに対して用いることができる。
特異的に結合する抗体を含んでなる免疫原性反応を誘導するアルファ−シヌクレインの第一の免疫原性フラグメントおよびヒトアルファ−シヌクレインの残基70〜140(もしくは120〜140)内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んでなる免疫原性反応を誘導する第二の免疫原性フラグメントを投与することよりもたらすことができる。ヒトアルファ−シヌクレインのフラグメントは、上記に説明したとおり、組み合わせて投与することができる(例えば、融合タンパク質もしくはコンジュゲートとして、共処方において、または同じ治療過程において投与すること)。
本発明の治療薬にはまた、アルファ−SNもしくはレビー小体の他の成分に特異的に結合する抗体も包含される。本発明はまた、アミロイド斑のシヌクレイン−NAC成分に特異的に結合する抗体も提供する。アルファ−SNに免疫反応性の抗体は既知である(例えば、Arima,et al.,Brian Res.809:93−100(1998);Crowther et al.,Neuroscience Lett.292:128−130(2000);Spillantini,et al.Nature 388:839−840(1997)を参照)。そのような抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナルであることができる。あるそのような抗体は、可溶性モノマー形態に特異的に結合せずにアルファ−SNの不溶性凝集体に特異的に結合する。あるものは、不溶性凝集形態に結合せずに可溶性モノマー形態に特異的に結合する。あるものは、凝集および可溶性モノマー形態の両方に特異的に結合する。あるそのような抗体は、天然に存在する全長アルファ−SNに結合せずにアルファ−SNの天然に存在する短い形態(例えばNAC)に特異的に結合する。ある抗体は、短い形態に結合せずに長い形態に特異的に結合する。ある抗体は、LBの他の成分に結合せずにアルファ−SNに特異的に結合する。ある抗体は、アミロイド斑の他の成分に特異的に結合せずにアルファ−SNに特異的に結合する。例えば、米国特許公開US20060259986A1およびPCT特許公開WO05/013889を参照、これらは全ての目的のために引用することにより本明細書に組み込まれ、完全なアルファ−シヌクレイン自体に特異的に結合せずにアルファ−シヌク
レインのフラグメントに特異的に結合する末端特異的抗体を提供する。これらの抗体は、シヌクレイノパチーおよびアミロイド形成疾患の予防および処置の方法において有用である。
影響を及ぼすとは限らない。抗体のエピトープ特異性は、例えば、異なるメンバーがアルファ−SNの異なる部分配列を提示するファージディスプレイライブラリーを形成することにより、決定することができる。ファージディスプレイライブラリーは、次に、試験下の抗体に特異的に結合するメンバーについて選択される。配列群が単離される。典型的に、そのような群は共通コア配列、および異なるメンバーにおける様々な長さの隣接配列を含有する。抗体への特異的結合を示す最も短いコア配列は、抗体により結合されるエピトープを定義する。抗体はまた、そのエピトープ特異性がすでに決定されている抗体との競合アッセイにおいてエピトープ特異性について試験することもできる。
、SN130〜139、SN131〜139、SN132〜139、SN133〜139、SN134〜139、SN135〜139、SN136〜139、SN137〜139、SN124〜138、SN124〜138、SN125〜138、SN126〜138、SN127〜138、SN128〜138、SN129〜138、SN130〜138、SN131〜138、SN132〜138、SN133〜138、SN134〜138、SN135〜138、SN136〜138、SN124〜137、SN125〜137、SN126〜137、SN127〜137、SN128〜137、SN129〜137、SN130〜137、SN131〜137、SN132〜137、SN133〜137、SN134〜137、SN135〜137、SN124〜136、SN125〜136、SN126〜136、SN127〜136、SN128〜136、SN129〜136、SN130〜136、SN131〜136、SN132〜136、SN133〜136およびSN134〜136よりなる群から選択されるヒトアルファシヌクレインのセグメント内のエピトープに結合する。
基本抗体構造単位は、サブユニットのテトラマーを含んでなることが既知である。各テトラマーはポリペプチド鎖の2つの同一対からなり、各対は1本の「軽」鎖(約25kDa)および1本の「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約100〜110個もしくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。
キメラおよびヒト化抗体は、キメラもしくはヒト化抗体の構築のための出発材料を提供するマウスもしくは他の非ヒト抗体と同じもしくは同様の結合特異性および親和性を有する。非ヒト抗体は、ヒトフレームワークおよび定常領域上に非ヒトCDRを移植することにより、もしくは全非ヒト可変ドメインを取り込むこと(場合により、露出残基の置換によりそれらをヒト様表面で「覆い隠すこと」、ここで、結果は「ベニヤ」抗体である)によりヒト化することができる。Gonzales et al.,Minimizing
the immunogenicity of antibodies for clinical application,Tumour Biol.26(1):31−43(2005)を参照。キメラ抗体は、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから、典型的には遺伝子工学により、その軽鎖および重鎖遺伝子が構築されている抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変(V)セグメントをIgG1およびIgG4のようなヒト定常(C)セグメントに連結することができる。ヒトアイソタイプIgG1が好ましい。ある方法において、抗体のアイソタイプはヒトIgG1である。IgM抗体もまた、ある方法において用いることができる。従って、典型的なキメラ抗体はマウス抗体からのVもしくは抗原結合ドメインおよびヒト抗体からのCもしくはエフェクタードメインからなるハイブリッドタンパク質である。
(1)直接抗原に非共有結合する、
(2)CDR領域に隣接する、
(3)そうでなければCDR領域と相互作用する(例えば、CDR領域の約6A以内である)、もしくは
(4)VL−VH界面に関与する
ことが合理的に予想されるならばヒトフレームワークアミノ酸はマウス抗体からの同等なフレームワークアミノ酸により通常は置換されるべきである。
4.2と指定される細胞系は、2007年2月26日にAmerican Type Culture Collection(ATCC,P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108)でブダペスト条約の規定に基づいて寄託されているATCC受託番号PTA−8221を有する。
は、上記のとおりヒト化される。
アルファ−SNに対するヒト抗体は、以下に記述する様々な技術により提供される。あるヒト抗体は競合的結合実験により、もしくはそうでなければ、実施例IXおよびXに記述されるマウスモノクローナル抗体の1つのような特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するように選択される。ヒト抗体はまた、免疫原としてアルファ−SNのフラグメントのみを用いることにより、そして/もしくはアルファ−SNの欠失突然変異体の一群に対して抗体をスクリーニングすることにより特定のエピトープ特異性に関してスクリーニングすることもできる。ヒト抗体は、好ましくはアイソタイプ特異性ヒトIgG1を有する。
基本的方法およびこの方法において使用する典型的な細胞融合相手、SPAZ−4は、Oestberg et al.,Hybridoma 2:361−367(1983);Oestberg,米国特許第4,634,664号;およびEngleman et al.,米国特許4,634,666(これらの各々は、全ての目的のためにその全部が引用することにより組み込まれる)により記述されている。この方法により得られる抗体産生細胞系は、2つはヒトそして1つはマウスの3つの細胞に由来するのでトリオーマと呼ばれる。最初に、マウス骨髄腫系をヒトBリンパ球と融合させてOestberg,上記により記述されるSPAZ−4細胞系のような非抗体産生異種ハイブリッド細胞を得る。次に、免疫したヒトBリンパ球と異種細胞を融合させて抗体産生トリオーマ細胞系を得る。トリオーマは、ヒト細胞から作られる通常のハイブリドーマより安定に抗体を産生することが見出されている。
ことにより増加することができる。
アルファ−SNに対するヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくともセグメントをコードする導入遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック哺乳類から製造することもできる。通常、そのようなトランスジェニック哺乳類の内因性免疫グロブリン遺伝子座は機能的に不活性化される。好ましくは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座のセグメントは、重鎖および軽鎖成分の再構成していない配列を含む。内因性免疫グロブリン遺伝子の不活性化および外来免疫グロブリン遺伝子の導入の両方は、標的化相同的組換えにより、もしくはYAC染色体の導入により成し遂げることができる。この方法に由来するトランスジェニック哺乳類は、免疫グロブリン成分配列を機能的に再構成すること、および内因性免疫グロブリン遺伝子を発現せずに、ヒト免疫グロブリン遺伝子によりコードされる様々なアイソタイプの抗体のレパートリーを発現することができる。これらの特性を有する哺乳類の製造および特性は、例えば、Lonberg et al.,WO93/1222、US5,877,397、US5,874,299、US5,814,318、US5,789,650、US5,770,429、US5,661,016、US5,633,425、US5,625,126、US5,569,825、US5,545,806、Nature 148,1547−1553(1994),Nature Biotechnology 14,826(1996),Kucherlapati,WO91/10741(これらの各々は、全ての目的のためにその全部が引用することにより組み込まれる)により詳細に記述される。トランスジェニックマウスは、特に適当である。抗アルファ−SN抗体は、アルファ−SNもしくはそのフラグメントで、LonbergもしくはKucherlapati,上記により記述されるようなトランスジェニック非ヒト哺乳類を免疫することにより得られる。モノクローナル抗体は、例えば、通常のKohler−Milstein技術を用いて適当な骨髄腫細胞系にそのような哺乳類からのB細胞を融合させることにより製造される。ヒトポリクローナル抗体もまた、免疫原性薬剤で免疫したヒトからの血清の形態で提供されることができる。場合により、そのようなポリクローナル抗体は、親和性試薬としてアルファ−SNもしくは他のアミロイドペプチドを用いて親和性精製により濃縮することができる。
ヒト抗アルファ−SN抗体を得るためのさらなる方法は、Huse et al.,Science 246:1275−1281(1989)により概説される一般的なプロトコルに従ってヒトB細胞からのDNAライブラリーをスクリーニングすることである。トリオーマ方法論に記述したように、そのようなB細胞はアルファ−SN、フラグメント、アルファ−SNもしくはフラグメントを含有するより長いポリペプチドまたは抗イディオタイプ抗体で免疫したヒトから得ることができる。場合により、そのようなB細胞は最終的に抗体処置を受ける患者から得られる。アルファ−SNもしくはそのフラグメントに結合する抗体が選択される。次に、そのような抗体(もしくは結合フラグメント)をコードする配列をクローン化し、そして増幅する。Huseにより記述されるプロトコルは、ファージディスプレイ技術と組み合わせてさらに効率よくされる。例えば、Dower et al.,WO91/17271およびMcCafferty et al.,WO92/01047、US5,877,218、US5,871,907、US5,858,657、US5,837,242、US5,733,743およびUS5,565,332(これらの各々は、全ての目的のためにその全部が引用することにより組み込まれる)を参照。これらの方法において、メンバーがそれらの外側表面上に異なる抗体を提示するファージのライブラリーが製造される。抗体は、通常、FvもしくはFabフラグメントとして提示される。所望の特異性を有する抗体を提示するファージは、アルファ−SNペプチドもしくはそのフラグメントに対する親和性濃縮により選択される。
キメラ、ヒト化もしくはヒト抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結することができる。定常領域の選択は、1つには、抗体依存性補体および/もしくは細胞媒介性毒性が所望されるかどうかにより決まる。例えば、アイソタイプIgG1およびIgG3は補体活性を有し、そしてアイソタイプIgG2およびIgG4はそうでない。アイソタイプの選択はまた、脳への抗体の通過に影響を及ぼすこともできる。ヒトアイソタイプIgG1が好ましい。軽鎖定常領域は、ラムダもしくはカッパであることができる。抗体は、2本の軽鎖および2本の重鎖を含有するテトラマーとして、別個の重鎖、軽鎖として、Fab、Fab’F(ab’)2およびFvとして、もしくは重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサーを介して連結される一本鎖抗体として発現することができる。
キメラ、ヒト化およびヒト抗体は、典型的に、組換え発現により製造される。組換えポリヌクレオチド構築物は、典型的に、生来結合しているかもしくは異種のプロモーター領域を包含する、抗体鎖のコーディング配列に操作可能に連結された発現制御配列を含む。好ましくは、発現制御配列は真核生物宿主細胞を形質転換するかもしくはトランスフェクションすることができるベクターにおける真核生物プロモーター系である。いったんベクターが適切な宿主に導入されると、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに交差反応抗体の収集および精製に適当な条件下で維持される。
免疫反応を誘導するためのある薬剤は、LBに対して免疫反応を誘導するための適切なエピトープを含有するが、免疫原性であるには小さすぎる。この場合、ペプチド免疫原を適当な担体分子に連結して免疫反応を引き起こすのを助けるコンジュゲートを形成することができる。適当な担体には血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、またはジフテリア、エシェリキア・コリ、コレラもしくはヘリコバクター・ピロリ(H.pylori)のような他の病原性細菌からのトキソイド、または弱毒化した毒素誘導体が包含される。T細胞エピトープもまた、適当な担体分子である。あるコンジュゲートは、本発明の薬剤を免疫刺激ポリマー分子(例えば、トリパルミトイル−S−グリセリンシステイン(Pam3Cys))、マンナン(マンノースポリマー)もしくはグルカン(ベータ1→2ポリマー)、サイトカイン(例えば、IL−1、IL−1アルファおよびベータペプチド、IL−2、ガンマ−INF、IL−10、GM−CSF)およびケモカイン(例えば、M
IP1アルファおよびベータ、ならびにRANTES)に連結することにより形成することができる。免疫原性薬剤はまた、O’Mahony、WO97/17613およびWO97/17614に記述されるように、組織を越えた輸送を高めるペプチドに連結することもできる。免疫原は、スペーサーアミノ酸(例えば、gly−gly)と共にもしくはそれなしに担体に連結することができる。
インフルエンザ血球凝集素:HA307-319PKYVKQNTLKLAT(配列番号:4)
マラリアCS:T3エピトープEKKIAKMEKASSVFNV(配列番号:5)
B型肝炎表面抗原:HBsAg19-28FFLLTRILTI(配列番号:6)
熱ショックタンパク質65:hsp65153-171DQSIGDLIAEAMDKVGNEG(配列番号:7)
カルメット・ゲラン桿菌 QVHFQPLPPAVVKL(配列番号:8)
破傷風トキソイド:TT830-844QYIKANSKFIGITEL(配列番号:9)
破傷風トキソイド:TT947-967FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(配列番号:10)
HIV gp120T1:KQIINMWQEVGKAMYA(配列番号:11)
が包含される。
)であり、ここで、Xは好ましくはシクロヘキシルアラニン、チロシンもしくはフェニルアラニンであり、シクロヘキシルアラニンが最も好ましい。
でなる。ある融合タンパク質は、タンデムにアルファ−SNの異なるセグメントを含んでなる。
Z=アルファ−SN 60〜72(NAC領域)ペプチド=NH2−KEQVTNVCGGAVVT−COOH(配列番号:13)
Z=アルファ−SN 73〜84(NAC領域)ペプチド=NH2−GVTAVAQKTVECG−COOH(配列番号:14)
Z=アルファ−SN 102〜112ペプチド=NH2−C−アミノ−ヘプタン酸−KNEEGAPCQEG−COOH(配列番号:15)
アルファ−SN 128〜140ペプチド
MAP4配置のZ−破傷風トキソイド830〜844:
Z−QYIKANSKFIGITEL(配列番号:16)
MAP4配置のZ−破傷風トキソイド947〜967:
Z−FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(配列番号:17)
MAP4配置のZ−破傷風トキソイド830〜844:
Z−QYIKANSKFIGITEL(配列番号:18)
直線状配置のZ−破傷風トキソイド830〜844+破傷風トキソイド947〜967:
Z−QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(配列番号:19)
AKXVAAWTLKAAA−Z(配列番号:20)
3Z−PADREペプチド:
Z−Z−Z−AKXVAAWTLKAAA(配列番号:21)
が包含される。
AKXVAAWTLKAAA−Z−Z−Z−Z(配列番号:22)
Z−AKXVAAWTLKAAA(配列番号:23)
Z−ISQAVHAAHAEINEAGR(配列番号:24)
PKYVKQNTLKLAT−Z−Z−Z(配列番号:25)
Z−PKYVKQNTLKLAT−Z(配列番号:26)
Z−Z−Z−PKYVKQNTLKLAT(配列番号:27)
Z−Z−PKYVKQNTLKLAT(配列番号:28)
Z−PKYVKQNTLKLAT−EKKIAKMEKASSVFNV−QYIKANSKFIGITEL−FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE−Z−Z−Z−Z−QYIKANSKFIGITEL−FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(配列
番号:29)
Z−QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE−Z−QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE−Z(配列番号:30)
2分枝樹脂上のZ−QYIKANSKFIGITEL(配列番号:31):
(MAP−4配置のシヌクレインフラグメント融合タンパク質)
が包含される。
レビー小体に対する免疫反応はまた、アルファ−SNペプチドのセグメント、およびそのフラグメント、他のペプチド免疫原、もしくは受動免疫に使用する抗体およびそれらの成分鎖をコードする核酸の投与により誘導することもできる。そのような核酸は、DNAもしくはRNAであることができる。免疫原をコードする核酸セグメントは、典型的に、患者の意図される標的細胞におけるDNAセグメントの発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーのような調節要素に連結される。免疫反応の誘導に望ましいように、血液細胞における発現には、軽鎖もしくは重鎖免疫グロブリン遺伝子からのプロモーターおよびエンハンサー要素またはCMV主要中早期プロモーターおよびエンハンサーが発現を導くために適当である。連結される調節要素およびコーディング配列は、ベクターにクローン化されることが多い。二本鎖抗体の投与のために、2本の鎖を同じもしくは別個のベクターにおいてクローン化することができる。本発明の治療薬をコードする核酸はまた、少なくとも1つのT細胞エピトープをコードすることもできる。アジュバントの使用および の使用に関する本明細書における開示は、本発明の治療薬をコードする核酸でのそれらの使用に変更すべきところは変更して適用される。
e et al.,Human Gene Therapy 6,325−333(1995);Woo et al.,WO94/12629およびXiao & Brandsma,Nucleic Acids.Res.24,2630−2622(1996))からのウイルスベクターを包含する多数のウイルスベクター系が利用可能である。
β−アミロイドペプチドもしくはA4ペプチド(US4,666,829;Glenner & Wong,Biochem.Biophys.Res.Commun.120,1131(1984))としても知られているAβは39〜43個のアミノ酸のペプチドであり、それはアルツハイマー病の特徴的な斑の主要成分である。Aβは、βおよびγセクレターゼと呼ばれる2つの酵素によるより大きいタンパク質APPのプロセシングによって生成される(Hardy,TINS 20,154(1997)を参照)。アルツハイマー病と関連するAPPにおける既知の突然変異は、βもしくはγセクレターゼの部位に近接して、もしくはAβ内で起こる。例えば、位置717はAβへのそのプロセシングにおけるAPPのγ−セクレターゼ切断の部位に近接し、そして位置670/671はβ−セクレターゼ切断の部位に近接する。これらの突然変異は、生成されるAβの42/43アミノ酸形態の量を増加するようにAβが形成される切断反応と相互作用することによりADを引き起こすと考えられる。
活性化の10,000増加をもたらす。この機序は、Aβに他の抗原のものを上回る免疫反応を起こさせる。
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAT(配列番号:33)
を有する。
AN90549(MAP4配置のAβ1〜7−破傷風トキソイド830〜844):(配列番号:34)
DAEFRHD−QYIKANSKFIGITEL
AN90550(MAP4配置のAβ1〜7−破傷風トキソイド947〜967):
DAEFRHD−FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(配列番号:35)
AN90542(直線状配置のAβ1〜7−破傷風トキソイド830〜844+947〜967):
DAEFRHD−QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(配列番号:36)
AN90576:(MAP4配置のAβ3〜9−破傷風トキソイド830〜844):
EFRHDSG−QYIKANSKFIGITEL(配列番号:37)
AN90562(PADRE−Aβ1〜7):
AKXVAAWTLAAA−DAEFRHD(配列番号:38)
AN90543(3PADRE−Aβ1〜7):
DAEFRHD−DAEFRHD−DAEFRHD−AKXVAAWTLKAAA(配列番号:39)
が包含される。
AKXVAAWTLKAAA−DAEFRHD−DAEFRHD−DAEFRHD(配列番号:40)
DAEFRHD−AKXVAAWTLKAAA(配列番号:41)
DAEFRHD−ISQAVHAAHAEINEAGR(配列番号:42)
FRHDSGY−ISQAVHAAHAEINEAGR(配列番号:43)
EFRHDSG−ISQAVHAAHAEINEAGR(配列番号:44)
PKYVKQNTLKLAT−DAEFRHD−DAEFRHD−DAEFRHD(配列番号:45)
DAEFRHD−PKYVKQNTLKLAT−DAEFRHD(配列番号:46)
DAEFRHD−DAEFRHD−DAEFRHD−PKYVKQNTLKLAT(配列番号:47)
DAEFRHD−DAEFRHD−PKYVKQNTLKLAT(配列番号:48)
DAEFRHD−PKYVKQNTLKLAT−EKKIAKMEKASSVFNVQYIKANSKFIGITEL−FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE−DAEFRHD(配列番号:49)
DAEFRHD−DAEFRHD−DAEFRHD−QYIKANSKFIGITELNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(配列番号:50)
DAEFRHD−QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(配列番号:51)
DAEFRHD−QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE−DAEFRHD(配列番号:52)
2分枝樹脂上のDAEFRHD−QYIKANSKFIGITEL(配列番号:53)
本発明は、それに対する除去活性が望ましい、レビー小体もしくは任意の他の抗原、または関連する生物学的存在を除去することにおける活性について抗体をスクリーニングする方法を提供する。レビー小体に対する活性についてスクリーニングするために、PDにかかっている患者もしくは特徴的なパーキンソン病変を有する動物モデルの脳からの組織サンプルを小グリア細胞のようなFc受容体を保有する食細胞および試験下の抗体とインビトロで培地において接触させる。食細胞は、BV−2、C8−B4もしくはTHP−1のような、初代培養もしくは細胞系であることができる。ある方法において、これらの成分は顕微鏡モニタリングを容易にするために顕微鏡スライド上で合わせられる。ある方法において、多数の反応はマイクロタイター皿のウェルにおいて並行して行われる。そのような形式において、別個の小型顕微鏡スライドを別個のウェルに載せることができ、もしくはアルファ−SNのELISA検出のような非顕微鏡検出形式を用いることができる。好ましくは、一連の測定は、反応が進行する前のベースライン値から出発する、インビトロ反応混合物におけるレビー小体の量、および反応中の1つもしくはそれ以上の試験値からなる。抗原は、例えば、アルファ−SNもしくはLBの他の成分に対する蛍光標識抗体で染色することにより検出することができる。染色に使用する抗体は、除去活性について試験される抗体と同じであってもなくてもよい。LBの反応中のベースラインに対する減少は、試験下の抗体が除去活性を有することを示す。そのような抗体は、PDおよび他のLBDを予防することもしくは処置することにおいて有用であると思われる。
離された生物学的存在の例には、アルファ−SN、ウイルス抗原もしくはウイルス、プロテオグリカン、他の病原性微生物の抗原、腫瘍抗原、および接着分子が包含される。そのような抗原は、他の手段の中でも、天然源、組換え発現もしくは化学合成から得ることができる。組織サンプルもしくは単離された生物学的存在を単球もしくは小グリア細胞のようなFc受容体を保有する食細胞、および試験する抗体と培地において接触させる。抗体は、試験下の生物学的存在に対してもしくは該存在と関連する抗原に対してであることができる。後者の場合、目的は生物学的存在が抗原と共に代理で貪食されるかどうかを試験することである。通常、必ずではないが、抗体および生物学的存在(関連抗原でのこともある)は、食細胞を加える前にお互いに接触させる。次に、培地に残っている生物学的存在および/もしくは関連抗原(存在する場合)の濃度をモニターする。培地における抗原もしくは関連する生物学的存在の量もしくは濃度の減少は、抗体が食細胞と共に抗原および/もしくは関連する生物学的存在に対する除去反応を有することを示す。
くとも20%、少なくとも40%、少なくとも60%もしくは少なくとも80%の減少が認められる。
処置に適している患者には、シヌクレイノパチー疾患の危険性があるが症状を示していない個体、ならびに症状を現在示している患者が包含される。処置に適している患者にはまた、LBDの疾患の危険性があるが症状を示していない個体、ならびに症状を現在示している患者も包含される。そのような疾患には、パーキンソン病(特発性パーキンソン病を包含する)、DLB、DLBD、LBVAD、純粋自律神経障害、レビー小体嚥下障害、偶発的LBD、遺伝的LBD(例えば、アルファ−SN遺伝子、PARK3およびPARK4の突然変異)および多系統委縮症(例えば、オリーブ橋小脳委縮症、線条体黒質変性症およびシャイ−ドレーガー症候群)が包含される。従って、本発明の方法は、LBDの既知の遺伝的危険性を有する個体に予防的に投与することができる。そのような固体には、この疾患を経験している血縁者を有するもの、および遺伝子もしくは生化学マーカーの分析により危険性が決定されるものが包含される。PDに対する危険性の遺伝子マーカーには、シヌクレインもしくはParkin、UCHLIおよびCYP2D6遺伝子における突然変異;特にシヌクレイン遺伝子の位置53での突然変異が包含される。パーキンソン病を現在患っている個体は、安静時振せん、筋硬直、運動緩徐および姿勢の不安定を包含するその臨床兆候から認識することができる。
処置に適している患者には、疾患の危険性があるが症状を示していない個体、ならびにアミロイドーシスの症状を現在示している患者が包含される。アルツハイマー病の場合、十分に長く生きる場合には実質的に誰もがアルツハイマー病を患う危険性がある。従って、本発明の方法は、対象患者の危険性の任意の評価の必要性なしに一般集団に予防的に投与することができる。本発明の方法は、アルツハイマー病もしくは他の遺伝性アミロイド疾患のいずれかの既知の遺伝的危険性を有する個体に特に有用である。そのような個体には、この疾患を経験している血縁者を有するもの、および遺伝子もしくは生化学マーカー
の分析によりその危険性が決定されるものが包含される。アルツハイマー病に対する危険性の遺伝子マーカーには、APP遺伝子における突然変異、特にそれぞれHardyおよびSwedish突然変異と呼ばれる位置717ならびに位置670および671での突然変異が包含される(Hardy,TINS,上記を参照)。危険性の他のマーカーは、プレセニリン遺伝子、PS1およびPS2、ならびにApoE4における突然変異、ADの家族歴、高コレステロール血症もしくはアテローム性動脈硬化症である。アルツハイマー病を現在患っている個体は特徴的な認知症、ならびに上記の危険因子の存在から認識することができる。さらに、ADにかかっている個体を同定するために多数の診断試験が利用可能である。これらには、CSFタウおよびAβ42レベルの測定が包含される。上昇したタウおよび減少したAβ42レベルは、ADの存在を示す。アルツハイマー病を患っている個体はまた、実施例の節に説明されるようにMMSEもしくはADRDA基準により診断することもできる。無症状の患者において、処置は任意の年齢(例えば、10、20もしくは30)で開始することができる。しかしながら、通常、患者が40、50,60もしくは70に達するまで処置を開始する必要はない。処置は、典型的に、ある期間にわたる複数回投薬量を伴う。処置は、以下のVIIモニタリングおよび診断の方法の記載に従って、経時的に治療薬(例えばNAC)に対する抗体または活性化T細胞もしくはB細胞反応をアッセイすることによりモニターすることができる。反応が落ちる場合、ブースター投薬量が指示される。
一般に、処置処方計画は、患者にアルファ−SNに対する免疫原性反応を誘導するために有効な薬剤および/もしくはAβに対する免疫原性反応を誘導するために有効な薬剤を投与することを伴う。予防的適用において、製薬学的組成物もしくは薬剤は、危険性を除くかもしくは軽減する、重症度を軽くする、または疾患の生理学的、生化学的、組織学的および/もしくは行動的症状、その合併症ならびに疾患の発症中に見つかる中間病理学的表現型を包含する疾患の発生を遅らせるために十分な組成物もしくは薬剤の投与の量および頻度を含んでなる処方計画においてLBDもしくは別のシヌクレオパチー疾患にかかりやすいかもしくはそうでなければその危険性がある患者に投与される。治療的適用において、組成物もしくは薬剤は、その合併症および疾患の発症中における中間病理学的表現型を包含する疾患の症状(生理学的、生化学的、組織学的および/もしくは行動的)を治すかもしくは少なくとも部分的に阻むために十分な組成物の投与の量および頻度を含んでなる処方計画においてそのような疾患の疑いがあるかもしくはすでに患っている患者に投与される。例えば、ある方法において処置はレビー小体の少なくとも部分的なクリアランス、レビー小体の少なくとも部分的な解離をもたらし、そして/もしくはシナプスにおけるアルファ−シヌクレインオリゴマーのレベルを減少させる。治療的もしくは予防的処置を成し遂げるために適当な量は、治療的にもしくは予防的に有効な用量として定義される。治療的もしくは予防的処置を成し遂げるために適当な量および投薬頻度の組み合わせは、治療的にもしくは予防的に有効な処方計画として定義される。予防的および治療的処方計画の両方において、薬剤は通常は十分な免疫反応が得られるまでいくつかの投薬量において投与される。典型的に、免疫反応はモニターされ、そして免疫反応が減弱し始める場合には反復投薬量が与えられる。
的かもしくは治療的かを包含する多数の異なる因子により変わる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を包含する非ヒト哺乳類もまた処置することができる。処置投薬量は、安全性および効能を最適化するために滴定する必要がある。免疫原の量は、アジュバントもまた投与されるかどうかにより決まり、アジュバントの不在下ではより高い投薬量が必要とされる。投与ための免疫原の量は、ヒト投与には患者当たり1〜500μg、そしてより通常には注射当たり5〜500μgと異なることもある。時折、注射当たり1〜2mgのより高い用量が使用される。典型的には約10、20、50もしくは100μgが各ヒト注射に用いられる。免疫原の質量もまた、全体としての免疫原の質量に対する免疫原内の免疫原性エピトープの質量比により決まる。典型的に、免疫原のマイクログラムに10-3〜10-5マイクロモルの免疫原性エピトープを使用する。注射のタイミングは1日に1回から、1年に1回まで、10年に1回まで有意に異なることができる。免疫原の投薬量が与えられる任意の既定の日に、投薬量はアジュバントもまた投与される場合には1μg/患者より大きくそして通常は10μg/患者より大きく、そしてアジュバントの不在下では10μg/患者より大きくそして通常は100μg/患者より大きい。典型的な処方計画は免疫、続いて6週間隔のような時間間隔でのブースター注射からなる。別の処方計画は免疫、続いて1、2および12か月後のブースター注射からなる。別の処方計画は、生涯にわたって2か月ごとの注射を伴う。あるいはまた、ブースター注射は免疫反応のモニタリングにより指示されるように不定期であることができる。
薬剤は沈着物が蓄積している特定の組織に直接注射される、例えば頭蓋内注射。筋肉内注射もしくは静脈内注射は、抗体の投与のために好ましい。ある方法において、特定の治療抗体は頭蓋に直接注射される。ある方法において、抗体は持続放出組成物もしくは装置、例えばMedipadTM装置として投与される。
Saponaria Molina)の木の樹皮から単離されたトリテルペングリコシドもしくはサポニンである(Kensil et al.,Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach(eds.Powell & Newman,Plenum Press,NY,1995);米国特許第5,057,540号を参照)、(Aquila BioPharmaceuticals,Framingham,MA)。他のアジュバントは、場合によりモノホスホリル脂質A(Stoute et al.,N.Engl.J.Med.336,86−91(1997)を参照)、プルロニックポリマーおよび死菌のような免疫刺激剤と組み合わせた、水中油滴型エマルジョン(スクアレンもしくはピーナッツ油のような)である。別のアジュバントはCpG(WO98/40100)である。あるいはまた、アルファ−SNもしくはAβをアジュバントに連結することができる。しかしながら、そのような連結は、それに対する免疫反応の性質に影響を及ぼすようにアルファ−SNの構造を実質的に変えるべきではない。アジュバントは活性薬剤と共に治療組成物の成分として投与することができ、または治療薬の投与の前に、それと同時にもしくはその後に別個に投与することができる。
a−ジパルミトキシプロピルアミド(DTP−DPP)テラミド(theramide)TM)、もしくは他の細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫刺激剤と共にもしくはそれなしに用いることができる。水中油滴型エマルジョンには、(a)Model 110Yマイクロフルイダイザー(Microfluidics,Newton MA)のようなマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロン粒子に調合される5%のスクアレン、0.5%のTween 80および0.5%のSpan 85を含有する(場合により様々な量のMTP−PEを含有してもよい)MF59(WO90/14837)、(b)サブミクロンエマルジョンに顕微溶液化されるかもしくはより大きい粒径のエマルジョンを生成するようにボルテックスされる、10%のスクアレン、0.4%のTween 80、5%のプルロニック−ブロックポリマーL121およびthr−MDPを含有するSAF、ならびに(c)2%のスクアレン、0.2%のTween 80ならびにモノホスホリル脂質A(MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)および細胞壁骨格(CWS)よりなる群からの1つもしくはそれ以上の細菌細胞壁成分、好ましくはMPL+CWS(DetoxTM)を含有するRibiTMアジュバントシステム(RAS)、(Ribi ImmunoChem,Hamilton,MT)が包含される。
本発明は、LBDを患っているかもしくはそれにかかりやすい患者におけるアルファ−SNペプチドおよび/もしくはAβペプチドに対する免疫反応を検出する方法を提供する。該方法は、患者に投与されている処置の経過をモニターするために特に有用である。該方法はまた、症状を示す患者への治療的処置および無症状患者への予防的処置の両方をモニターするために用いることができる。該方法は、能動免疫(例えば、免疫原の投与に反応して生産される抗体)および受動免疫(例えば、投与した抗体のレベルを測定すること)の両方をモニターするために有用である。
ある方法は、薬剤の投薬量を投与する前に患者における免疫反応のベースライン値を決定すること、そしてこれを処置後の免疫反応の値と比較することを伴う。免疫反応シグナルの値における有意な増加(すなわち、そのような測定の平均からの1標準偏差として表される、同じサンプルの反復測定における実験誤差の典型的な限界より大きい)は、陽性処置結果(すなわち、薬剤の投与が免疫反応を成し遂げるかもしくは増大していること)を示す。免疫反応の値が有意に変化しないか、もしくは減少する場合、陰性処置結果が示される。一般に、免疫原性薬剤での最初の処置過程を受けている患者は、連続投薬量で免疫反応の増加を示すことが予想され、それは最終的にプラトーに達する。薬剤の投与は、免疫反応が増加している間は一般に続けられる。プラトーの達成は、処置の投与を中止するかまたは投薬量もしくは頻度を減らすことができる指標である。
続けられる。前述のように、コントロール値に対するプラトーの達成は、処置の投与を中止するかまたは投薬量もしくは頻度を減らすことができる指標である。
一般に、受動免疫をモニターする方法は上記の能動免疫をモニターするものと同様である。しかしながら、受動免疫後の抗体プロフィールは典型的に抗体濃度の即時のピーク、続いて指数関数的減衰を示す。さらなる投薬量なしに、減衰は投与した抗体の半減期により数日〜数か月の期間内に処置前レベルに近づく。例えば、あるヒト抗体の半減期は20日の次数のものである。
合、抗体のさらなる投薬量の投与が施される。ある方法において、ピークもしくはその後のバックグラウンドを差し引いた測定レベルは、他の患者における有益な予防的もしくは治療的処置処方計画を構成することが以前に決定された基準レベルと比較される。測定される抗体レベルが基準レベルより有意に少ない(すなわち、処置から恩恵を受ける患者の集団における基準値の平均−1標準偏差より少ない)場合、抗体の追加投薬量の投与が示唆される。
本発明はさらに、上記の診断方法を行うための診断キットを提供する。典型的に、そのようなキットはアルファ−SNに対する抗体に特異的に結合する薬剤を含有する。キットはまた、標識を含むこともできる。アルファ−SNに対する抗体の検出用には、標識は典型的に標識された抗イディオタイプ抗体の形態である。抗体の検出用に、薬剤はマイクロタイター皿のウェルのような固相に事前に結合して供給することができる。キットはまた、キットの用法を提供する表示も典型的に含有する。表示はまた、アルファ−SNに対する抗体のレベルと測定される標識のレベルを相関させる図表もしくは他の対応処方計画(correspondence regime)を含むこともできる。表示という用語は、その製造、輸送、販売もしくは使用中の任意の時点でキットに添付されるかもしくはそうでなければ付随する任意の書かれたもしくは記録された資料をさす。例えば、表示という用語には広告リーフレットおよびパンフレット、包装材料、説明書、オーディオもしくはビデオカセット、コンピューターディスクならびにキット上に直接記された文書が包含される。
本発明は、患者におけるLBをインビボ画像化する方法を提供する。そのような方法は、PDもしくは脳におけるLBの存在と関連する他の疾患、またはそれに対する感受性を診断するかもしくはその診断を裏付けるために有用である。例えば、該方法は認知症の症状を提示する患者に対して用いることができる。患者がLBを有する場合、患者は例えばPDを患っている可能性がある。該方法はまた、無症状の患者に対して用いることもできる。アミロイドの異常な沈着物の存在は、将来の症候性疾患に対する感受性を示唆する。該方法はまた、パーキンソン病と以前に診断されている患者における疾患の進行および/もしくは処置に対する反応をモニターするためにも有用である。
tini et al PNAS,1998)、アルファ−SNのN末端のエピトープに結合する抗体は、C末端のエピトープに結合する抗体ほど強いシグナルを示さない。従って、そのような抗体はあまり好ましくない。
全長組換えヒトアルファ−SNを1Xリン酸緩衝食塩水(PBS)に1mg/mlの濃度で再懸濁した。各注射用に、50μlのアルファ−SNを使用し;注射当たり50μgの最終濃度を与え、それに150μlの1X PBSを加えた。次に、完全フロインドアジュバント(CFA)をアルファ−SNもしくはPBSのみ(コントロール)のいずれかに1:1で加え、ボルテックスし、そして超音波処理してエマルジョンを完全に再懸濁した。最初の注射には、8匹のD系ヒトアルファ−SNトランスジェニック(tg)単一トランスジェニック4〜7か月齢マウス(Masliah,et al.Science 287:1265−1269(2000))にCFA中のヒトアルファ−SNの注射を与え、そしてコントロールとして4匹のD系ヒトアルファ−SN tgマウスにCFA中のPBSの注射を与えた。マウスに合計6回の注射を与えた。3回の注射は2週間隔で、そして次に3回の注射は1か月間隔で行った。実験の開始後5カ月で動物の人道的扱いに関するNIHガイドラインを用いて動物を屠殺した。抗体力価の測定用に血液サンプルを集めた後、脳をPBS中4%のパラホルムアルデヒドにおいて4日間浸漬固定した。ELISAによるヒトアルファ−SNに対する抗体のレベルを表1に示す。処置したマウスを力価により2群に分ける。第一群は、2〜8,000の中等度の力価を生じた。第二群は、12000〜30000の高い力価を生じた。コントロールマウスにおいて力価は見出されなかった。高い力価をもたらすマウスはシヌクレイン封入体のサイズの顕著な減少を有することが神経病理学的解析により示された。中等度の力価をもたらすマウスは、より小さい減少を示した。図2(パネルa〜d)は、(a)非トランスジェニックマウス、(b)CFAのみで処置したトランスジェニックマウス、(c)中等度の力価を生じたアルファシヌクレインおよびCFAで免疫したトランスジェニックマウスならびに(d)より高い力価を生じたアルファシヌクレインおよびCFAで免疫したトランスジェニックマウスにおけるシヌクレイン封入体を示す。抗ヒトアルファ−SN抗体で免疫染色することによりサンプルを視覚化した。図2は、パネル(b)においてシヌクレイン封入体を示すが、パネル(a)ではそうでない。中等度の力価の処置マウスのパネル(c)において、封入体は強度がいくらか減少している。パネル(d)において、封入体は強度が顕著に減少し
ている。パネル(e)〜(h)は、それぞれパネル(a)〜(d)と同じ4匹のマウスの脳における抗IgGのレベルを示す。IgGはパネル(g)にそしてより大きい程度にパネル(h)に存在することが分かる。データは、末梢投与したアルファ−SNに対する抗体が血液脳関門を越えそして脳に到達することを示す。パネル(i)〜(l)は、図の最初の2列と同じ4匹のマウスについて再び、星状膠細胞のマーカー、GAPについての染色を示す。パネル(k)および(l)は、(i)および(j)と比較して適度に増加した染色を示すことが分かる。これらのデータは、シヌクレイン沈着物の除去には軽度の星状膠および小グリア反応が不随して起こることを示す。
GT1−7ニューロン細胞(Hsue et al.Am.J.Pathol.157:401−410(2000))をマウスアルファ−SNを発現するpCR3.1−T発現ベクター(Invitrogen,Carlsbad,CA)でトランスフェクションし、そして発現ベクターのみでトランスフェクションした細胞と比較した(それぞれ、図3、BおよびA)。ベクターのみでトランスフェクションした細胞(A)は線維芽細胞様外観を有し、一方、アルファ−SNでトランスフェクションした細胞は丸く、細胞表面での封入体が光学および共焦点走査型顕微鏡検査の両方によって見える。次に、トランスフェクションした細胞をウサギ免疫前血清(図3C)もしくはマウスアルファ−SN C末端残基131〜140に対する親和性精製したウサギポリクローナル抗体、67−10(Iwai,et al.,Neuron 14:467(1995))(図3D)で処置した。封入体はパネルCにおけるよりもパネルDにおいて弱く(less strongly)染まることが分かり、アルファシヌクレインに対する抗体は封入体を除去することもしくはその発生を防ぐことにおいて有効であったことを示す。図4は、ウサギ免疫前血清および67−10ポリクローナル抗体で処置したGT1−7トランスフェクション細胞の粒子および細胞質画分のゲル分析を示す。細胞質画分におけるシヌクレインレベルは、免疫前血清もしくはアルファ−SNに対する抗体での処置によりほとんど変化していないことが分かる。しかしながら、アルファ−SNバンドは、アルファ−SNに対する抗体で処置したGT1−7細胞の膜画分において消失する。これらのデータは、アルファシヌクレイン抗体活性が細胞膜と結合するシヌクレインのクリアランスをもたらすことを示す。
光学顕微鏡検査によるかもしくは図4におけるようなゲル分析によるいずれかでの検出でシヌクレイン封入体を除去することにおける活性について抗体をスクリーニングするために用いることができる。
i.ヒトアルファ−シヌクレインtgマウスの免疫
本研究のために、ヘテロ接合体ヒトアルファ−SNトランスジェニック(tg)マウス(D系)(Masliah et al.,2000,Science 286:1265−69)および非トランスジェニック(nontg)コントロールを用いる。実験動物を3群に分ける。群Iでは、2か月の年齢で開始して8か月間マウスを免疫することによる早期免疫の予防的効果を試験する。群IIでは、若年成体マウスに6か月の年齢で開始して8か月間ワクチン接種していったん中等度の病変が確立されると免疫が疾患の進行を軽減することができるかどうかを決定する。群IIIでは、より高齢のマウスに12か月の年齢で開始して4か月間免疫していったん強固な病変が確立されると免疫が症状の重症度を軽減することができるかどうかを決定する。全ての群について、マウスを組換えヒトアルファ−SN+CFAもしくはCFAのみで免疫し、そして各実験について20匹のtgおよび10匹のnontgマウスを使用する。それらのうち、10匹のtgマウスにはヒトアルファ−SN+CFAで、そして他の10匹のtgにはCFAのみで免疫する。同様に、5匹のnontgマウスにはヒトアルファ−SN+CFAで、そして他の5匹はCFAのみで免疫する。簡潔に言えば、免疫プロトコルはCFA中の精製された組換えヒトアルファ−SN(2mg/ml)での最初の注射、続いてIFAと組み合わせたヒトアルファ−SNでの1か月後の再注射からなる。次に、マウスに1か月に1回この混合物を再注射する。ヒトアルファ−SN tg(n=3/各々;6か月齢)およびnontg(n=3/各々;6か月齢)マウスの小サブセットにおいて、マウス(m)アルファ−SN、ヒトベータシヌクレインもしくは突然変異体(A53T)ヒトアルファ−SNでの免疫からなる追加の実験を行う。
免疫が減少するかどうかを決定するために、ヒトアルファ−SN凝集切片をヒトアルファ−SNに対するウサギポリクローナル抗体(1:500)で免疫染色する。4℃で一晩のインキュベーション後に、切片をビオチニル化した抗ウサギ二次抗体、続いてアビジンD−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)複合体(1:200、ABC Elite,Vector)とインキュベーションする。切片をまた、ビオチニル化した抗ウサギ、マウスもしくはヒト二次抗体のみでも免疫染色する。抗マウス二次抗体での実験は、ヒトアルファ−SNに対する抗体が脳に入るかどうかを決定する。反応は0.001%のH2O2を有する50mM Tris−HCl(pH7.4)中0.1%の3,3−ジアミノベンジジン4塩酸塩(DAB)で視覚化し、そして次に切片をエンテラン下でスライド上に載せる。Quantimet 570Cを用いて光学デンシトメトリーにより免疫反応性のレベルを半定量的に評価する。これらの切片はまた、アルファ−SN免疫反応性封入体の数を決定するために画像解析によっても調べられ、そしてアルファ−SN凝集のこの信頼できる測定はワクチン接種の抗凝集効果の重要な指標として働く(Masliah,et
al.(2000))。
以前に記述されたように(Masliah,et al.(2000))、自発運動活性についてマウスをロータロッド(San Diego Instruments,San Diego,CA)において2日間分析する。1日目にマウスを5回の試験にわたって:第1のものは10rpmで、第2のものは20rpmで、そして第3〜第5のものは40rpmで訓練する。2日目に、マウスを各々40rpmで7回の試験にわたって試験する。マウスを個々にシリンダー上に置き、そして回転の速度を240秒の期間にわたって0から40rpmまで上げる。マウスがロッド上にとどまる時間の長さ(落下待ち時間)を記録し、そして運動機能の尺度として使用する。
どのエピトープが有効な反応を伝えるかを決定するために10〜13か月の年齢のヒトアルファ−SNトランスジェニックマウスをアルファ−SNの9つの異なる領域で免疫する。9つの異なる免疫原および1つのコントロールを上記のようにi.p.注射する。免疫原には、全てシスチン結合を介してヒツジ抗マウスIgGに連結される、4つのヒトアルファ−SNペプチドコンジュゲートが包含される。アルファ−SNおよびPBSをそれぞれ陽性および陰性コントロールとして用いる。力価を上記のとおりモニターし、そして
3〜12か月の注射の最後にマウスを安楽死させる。組織化学、アルファ−SNレベルおよび毒物学的分析を死後に測定する。
連結されたアルファ−SNペプチドの製造:H アルファ−SNペプチドコンジュゲートは、架橋試薬スルホ−EMCSを用いてアルファ−SNペプチドに付加された人工システインを介して連結することにより製造される。アルファ−SNペプチド誘導体は、以下の最終アミノ酸配列で合成される。各場合において、挿入されるシステイン残基の位置を下線で示す。
アルファ−シヌクレイン60〜72(NAC領域)ペプチド:
NH2−KEQVTNVCGGAVVT−COOH(配列番号:54)
アルファ−シヌクレイン73〜84(NAC領域)ペプチド:
NH2−GVTAVAQKTVECG−COOH(配列番号:55)
アルファ−シヌクレイン102〜112ペプチド:
NH2−C−アミノ−ヘプタン酸−KNEEGAPCQEG−COOH(配列番号:56)
アルファ−シヌクレイン128〜140ペプチド:
Ac−NH−PSEEGYQDYEPECA−COOH(配列番号:57)
ヒトアルファ−SNマウスに各々、以下に示されるようなPBS中0.5mgの抗アルファ−SNモノクローナル抗体を注射する。全ての抗体製剤は、低い内毒素レベルを有するように精製される。モノクローナル抗体は、アルファ−SNのフラグメントもしくはより長い形態をマウスに注射し、ハイブリドーマを調製し、そしてアルファ−SNの他の非重複フラグメントに結合せずにアルファ−SNの所望のフラグメントに特異的に結合する
抗体についてハイブリドーマをスクリーニングすることによりフラグメントに対して製造することができる。
本実験は、3つのタイプのトランンスジェニックマウス:アルファシヌクレイン導入遺伝子(SYN)を有するトランスジェニックマウス、APP導入遺伝子を有するAPPマウス(Games et al.)および単一のトランスジェニックを交配することにより作られる二重トランスジェニックSYN/APPマウスへのAβ免疫の効果を比較する。二重トランスジェニックマウスは、Masliah et al.,PNAS USA
98:12245−12250(2001)に記述される。これらのマウスは、アルツハイマー病およびパーキンソン病の両方にかかっている個体のモデルに相当する。表2は異なる群、研究に使用したマウスの年齢、処置方法およびAβに対する抗体の力価を示す。3タイプ全てのマウスにおいて有意な力価を生じたことが分かる。図5は、顕微鏡検査による処置被験体からの脳切片の試験により決定される脳におけるAβのアミロイド斑により被覆される面積%を示す。かなりの沈着物がAPPおよびSYN/APPマウスにおいて蓄積するが、SYNマウスもしくは非トランスジェニックコントロールにおいてはそうでない。沈着物は、SYN/APP二重トランスジェニックマウスにおいていっそう大きい。Aβ1〜42での免疫は、APPおよびSYN/APPマウスの両方において沈着物を減少させる。図6は、共焦点レーザー走査型および光学顕微鏡検査により検出した場合のマウスの様々な群におけるシヌクレイン沈着物を示す。シヌクレイン沈着物は、CFAのみで処置したSYNおよびSYN/APPマウスにおいて蓄積する。しかしながら、Aβ1〜42およびCFAで処置したマウスの同じタイプにおいて、シヌクレイン沈着物のレベルの顕著な減少がある。これらのデータは、Aβでの処置がAβ沈着物を除去することにおいてだけでなく、シヌクレインの沈着物を除去することにおいても有効であることを示す。従って、Aβもしくはそれに対する抗体での処置は、アルツハイマー病だけでなく複合アルツハイマー・パーキンソン病、およびアルツハイマー病のない患者におけるパーキンソン病を処置することにおいても有用である。SYN/APPマウスにおける抗Aβ抗体の力価は、シヌクレイン封入体の減少した形成と相関した(r=−0.71、p<0.01)。
斑クリアランスへの抗体の効果を調べるために、初代小グリア細胞をPDAPPマウスもしくはヒトAD脳のいずれかの非固定クリオスタット切片と培養するエクスビボアッセイを確立した。小グリア細胞は、新生DBA/2Nマウス(1〜3日)の大脳皮質から得られた。皮質を50μg/mlのDNアーゼI(Sigma)を有するHBSS--(ハンクス平衡塩溶液、Sigma)において機械的に解離させた。解離した細胞を100μmの細胞濾過器(Falcon)で濾過し、そして1000rpmで5分間遠心分離した。ペレットを増殖培地(高グルコースDMEM、10%FBS、25ng/ml rmGM−CSF)に再懸濁し、そして細胞をT−75プラスチック培養フラスコ当たり2個の脳の密度で平板培養した。7〜9日後に、フラスコをオービタルシェーカー上で37℃で200rpmで2h回転させた。細胞懸濁液を1000rpmで遠心分離し、そしてアッセイ培地に再懸濁した。
て抽出し、還元トリシンサンプルバッファーにおいて1:1希釈し、そして16%のトリシンゲル(Novex)上に載せた。イモビロン上への移動後に、ブロットを5μg/mlのpabAβ42、続いてHRP結合抗マウス抗体にさらし、そしてECL(Amersham)で現像した。
A.材料および方法
hα−シヌクレインtgマウスのワクチン接種.本研究のために、血小板由来増殖因子−β(PDGFβ)プロモーターの調節制御下でhα−シヌクレインを発現するヘテロ接合体tgマウス(D系)(Masliah,2000,Science 287:1265−69)を用いた。これらの動物は、脳におけるhα−シヌクレイン免疫反応性封入体ならびにLBDのある種の特徴を再現する神経変性および運動障害を発症するので、それらを選択した。実験動物を2群に分けた。第一群では、合計20匹の幼若(3か月齢)tgマウスを組換えhα−シヌクレイン(n=10)もしくはアジュバントのみ(n=10)で8か月間免疫した。第二群では、合計20匹の若年成体(6か月齢)tgマウスを組換えhα−シヌクレイン(n=10)もしくはアジュバントのみ(n=10)で8か月間免疫した。免疫プロトコルは、最初に、完全フロインドアジュバント(CFA)と組換えhα−シヌクレイン(80μg/ml;100μl)での注射からなった。2週後にマウスに不完全FAとhα−シヌクレイン(80μg/ml;100μl)とのもう1回の注射を与え、続いてリン酸緩衝食塩水中のhα−シヌクレイン(80μg/ml;100μl)で1か月に1回(次の7か月にわたって)再注射した。組換えhα−シヌクレインは、Masliah et al.,2005,Neuron 46:857−68に記載のとおり製造しそして精製し、内毒素に関して試験した。
の各々からの希釈した血清とインキュベーションし、ニトロセルロース上にブロッティングし、そして二次ウサギ抗マウス抗体、続いてI125標識プロテインAとインキュベーションした(Alford et al.,J.Histochem.Cytochem
42:283−287(1994))。PhosphorImager(Molecular Dynamics,Piscataway,NJ)でブロットを画像化しそして分析した。ImageQuantソフトウェア(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)を用いて免疫反応性バンドを定量した。第二組の実験では、非免疫hα−シヌクレインtgマウスからの連続ビブラトーム切片を処置マウスの各々からの希釈した血清、続いてビオチニル化ウマ抗マウスIgG(1:100,Vector)、アビジンD−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP、1:200、ABC Elite、Vector)においてインキュベーションし、そして0.001%のH2O2を含有するジアミノベンジジン4塩酸塩(DAB)と反応させた。顕微鏡検査後に、標識される細胞内コンパートメント(ニューロン細胞体、シナプスおよび封入体)および免疫反応性の程度(0=なし;1=非常に軽度、2=軽度、3=中等度、4=強い)に従って切片を評点した。
Invitrogen)上でSDS−PAGEにより分析した。免疫ブロットをhα−シヌクレイン(LB509,1:1000,Transduction Laboratories,San Diego,CA)およびシナプトフィジン(1:20,Chemicon,Temecula,CA)に対する一次抗体ならびにHRPで標識した二次ヤギ抗マウスIgG(1:5000,SantaCruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)で調べ、増強した化学発光により視覚化し、そしてVersadoc XL画像化装置(BioRad,Hercules,CA)で分析した。
20:4050−4058(2000))およびhα−シヌクレイン陽性であるシナプトフィジン免疫反応性終末の割合を計算した。一次抗体の特異性を確かめるために、一次抗体を20倍過剰の対応するペプチドでもしくは免疫前血清で48hr事前に吸着させて、一次抗体(削除された)の不在下で切片を一晩インキュベーションするコントロール実験を行った。
の関係を確かめるために線形回帰分析を行った。多重比較を説明するためにボンフェローニ補正を適用した。
抗体力価、親和性およびエピトープマッピングの特性化
抗体力価は、両方の実験群において3つの時間点(ワクチン接種後2週、6か月および9か月)で分析した。抗体力価はマウス間でかなり異なり、群Iに属する動物において、hα−シヌクレインで免疫したマウス間の抗体力価は200〜20,000の間であった(表3)。
hα−シヌクレイン蓄積への免疫療法の効果を決定するために、hα−シヌクレインに対する抗体で切片を標識し、そして明視野顕微鏡検査によりもしくはLSCMにより分析した。tgマウスにおいて、豊富なhα−シヌクレイン免疫反応性が神経網においてならびにニューロン内封入体において認められた。CFAのみで処置したtgマウスと比較して、免疫した群の両方からのマウスは側頭皮質における封入体の数の同程度の減少(約25%)を示した(図9A)。さらに、免疫は神経網におけるhα−シヌクレイン免疫反応性の減少をもたらした。CFAのみで処置したtgマウスと比較した場合、この効果は群Iからのマウスにおけるよりも群IIからのマウスにおいて大きかった(図9A)。免疫効果が実際にニューロンのhα−シヌクレイン蓄積を減少させる抗体の能力にもしくはマスキング効果に関連するかどうかを決定するために、CFAのみおよびhα−シヌクレインワクチン接種tgマウス間でβシヌクレイン免疫反応性のレベルを比較することにより
コントロール実験を行った。α−シヌクレインに近いホモログ、βシヌクレインの既知の分布と一致して(Iwai et al.,Neuron 14:467−475(1994))、豊富なβ−シヌクレイン免疫反応性がシナプス前終末と関連する神経網において認められ、そして軽度の免疫標識化がニューロン細胞体において検出されたが、封入体においてはそうでなかった。CFAのみで処置したtgマウスと比較して、hα−シヌクレインで免疫したマウスにおいてβ−シヌクレインのパターンおよびレベルの違いは見出されなかった。hα−シヌクレイン抗体の効果の特異性をさらに調べるために、マウス(m)αシヌクレイン免疫反応性のレベルをCFAのみおよびhα−シヌクレインワクチン接種tgマウス間で比較した。hαシヌクレインと同様に、mαシヌクレイン免疫反応性は神経終末と関連する神経網において豊富であったが、ニューロン細胞体にはそして封入体にはなかった。CFAおよびhα−シヌクレイン免疫マウスの両方において、mαシヌクレインのパターンおよびレベルは同等であった。総合すると、これらの研究は、ワクチン接種がhα−シヌクレインに特異的に影響を及ぼすが、他の関連するシナプス分子にはそうでないことを示唆する。
ーの蓄積を減少させることによりtgマウスの脳におけるニューロン損傷を改善できることを示唆する。
どの因子が免疫療法の効果を予測するかをよりよく理解するために、hα−シヌクレイン蓄積の神経病理学マーカーと抗体力価および親和性との間で線形回帰分析を行った。この分析は、免疫ブロットによる相対的抗体親和性とシナプスにおけるhα−シヌクレイン免疫反応性のレベルとの間の有意な相関関係を示したが、ニューロン封入体の数とはそうでなかった。同様に、ICCによるシナプスを認識する相対的抗体親和性は、シナプスにおけるhα−シヌクレインのレベルと逆相関し、そしてシナプトフィジン標識神経終末により占められる面積パーセントと直接相関するが、ニューロン封入体の数とはそうでなかった。免疫ブロットおよびICCによる抗体反応性のレベルは、ELISAにより決定した場合の抗体力価と強く相関した。抗体力価はまた、抗hαシヌクレイン抗体で標識される神経網の面積パーセントとも相関したが、ニューロンにおける封入体の数とはそうでなかった(表4)。総合すると、これらの結果は、抗ヒトα−シヌクレイン抗体の相対的免疫ブロット反応性およびある程度は抗体のELISA力価がニューロンのヒトα−シヌクレイン蓄積の減少と相関することを示唆する。
tgマウスの脳においてヒトα−シヌクレインが蓄積する特有のニューロン部位を輸送抗体が認識するかどうかを決定するために、単一および二重免疫細胞化学分析をウマ抗マウスIgG抗体で行った。これらの抗体は、免疫した動物において生成される抗ヒトα−シヌクレインを推定上認識するが、CFAコントロールにおいてはそうでない。免疫標識切片の明視野デジタル顕微鏡検査は、hα−シヌクレインで免疫したマウスにおいて、ビオチニル化した抗マウスIgGが神経網におけるニューロン細胞体および神経突起を広範に標識することを示した。CFAのみで処置したtg動物において、血管および小グリアに似ている時折の細胞の軽度の標識化があった。ワクチン接種したマウスにおいて、FITC標識した抗マウスIgGにより標識されるニューロン細胞体はhα−シヌクレイン免疫反応性を示すことが二重免疫染色実験により確かめられた。CFAのみで処置したtgマウスと比較して、hα−シヌクレインワクチン接種マウスにおいて、あるニューロンでは、抗マウスIgGおよびhα−シヌクレイン免疫反応性は細胞体の周辺で共局在化しており、ある領域ではこれら2つの標識は神経突起およびシナプスにおいて検出された。さらに、いくつかのヒトα−シヌクレイン含有ニューロンにおいて2つのマーカーは平均して直径が0.4〜0.8μmのサイズの粒状細胞内構造において検出された。これらの粒状構造はカテプシンD免疫反応性を示すことがさらなる二重標識実験により示され、取り込まれた抗ヒトα−シヌクレイン抗体がリソソーム内でシヌクレインと反応したことを示唆する。この結果と一致して、ヒトα−シヌクレインワクチン接種マウスのニューロンのあるものにおいて、リソソームおよびファゴリソソームを示唆する電子密度の高い積層構造が同定されることが超微細構造解析により示された。総合すると、これらの結果は、ヒトα−シヌクレインでのワクチン接種がリソソーム経路の活性化によってこの分子の分解を促進できることを示唆する。
本実施例は、α−シヌクレイン末端を認識するモノクローナル抗α−シヌクレイン抗体を用いたニューロン内α−シヌクレイン凝集体のクリアランスを示す。ヒトα−シヌクレインを過剰発現しそしてニューロン内α−シヌクレイン凝集体を有するトランスジェニックマウスの新皮質にモノクローナル抗体を注射した。一方はα−シヌクレインのN−末端に対しそしてもう一方はC末端に対する2つの抗体は、関係のないコントロール抗体と比
較してニューロン内α−シヌクレイン凝集体の数を80%まで減少させた(図11)。
群1:11A5、8A5もしくはIgG1コントロールを注射したマウス。
群2:9G5、23E8、6H7もしくはIgG1コントロールを注射したマウス。
群3:4B1、5C12、IgG2aもしくはIgG2bコントロールを注射したマウス。
MAb 8A5は精製されたウシシヌクレイン(αおよびβの混合物)に対してもたらされ、そしてヒトおよびマウスα−シヌクレインのカルボキシ末端のエピトープを認識する。MAb 8A5は、アミノ酸139で終わるトランケーションされたシヌクレインに結合することができる。8A5は、ビオチンに結合したC末端と比較して遊離のC末端を有するシヌクレインに4〜5倍の優先傾向を有することが予備実験により示唆される。また、mAb 6H7およびmAb 8A5は両方ともベータ−シヌクレインも認識する。MAb 4B1はシヌクレインのC末端領域を認識し、そしてウェスタンブロット上でシヌクレインに結合するが、溶液においてシヌクレインを認識しない(すなわち、mAb 4B1はシヌクレインを免疫沈降させない)。図12は、8A5を注射したマウスの反対側(左のパネル;切片内部の丸い褐色の点はα−シヌクレイン凝集体である)および同側(右のパネル)の切片を示す。8A5を注射したマウスとIgG1を注射したコントロールとの間の差は、統計的に有意であった(ノンパラメトリッククラスカル−ウォリス(Kruskall−Wallis)続いてダン多重比較検定によりp<0.05)。これらの結果は、α−シヌクレインC末端および/もしくはN末端を標的とすることがPDおよびDLBのようなシヌクレオパチーにおいて治療的に有益であることを示す。試験した他の抗α−シヌクレイン抗体の投与(表5、図11)は、凝集体の除去をもたらさなかった。
本実施例は、実施例IXに記述されるようなα−シヌクレイン末端を認識するモノクローナル抗α−シヌクレイン抗体(6H7および8A5)を用いたニューロン内α−シヌクレイン凝集体のクリアランスを示す。本実施例はまた、C末端の近くのエピトープを認識するモノクローナル抗α−シヌクレイン抗体(9E4)を用いたニューロン内α−シヌクレイン凝集体のクリアランスも示す。mAb 9E4は、アミノ酸118〜126の領域におけるアルファ−シヌクレインのエピトープを認識する。
体の各々に使用した。
ヒトα−syn tgマウスに9E4−FITCを5mg/kg;100μlの投薬量で静脈内注射した。マウスを1週後に安楽死させて脳およびCSFにおける抗体の存在を決定した。蛍光抗体を直接視覚化し、そして抗体が実際に脳に移動し、そしてニューロン細胞体およびシナプスにおけるαsynを特異的に認識することを見出した。末梢に送達されたコントロールIgGは、tgおよびnontgマウスの両方においてバックグラウンド免疫反応性のみを示した。さらに、処置したマウスからのCSFは未処置のtgマウスの脳におけるαsynに対して免疫反応性であり、そして9E4−FITC抗体での直接免疫標識と同様の染色のパターンを示すことが見出された(図14を参照)。
本研究の目的は、α−syn C末端に対する抗体での受動免疫がCNSに移動し、そしてtgマウスの脳におけるα−syn凝集体を認識しそして除去できることを示すためであった。この目的のためにヒトα−syn tgマウスに9E4を1mg/kgの投薬
量で6か月間腹腔内注射した。6ヵ月の毎週の注射後に9E4で処置した動物を安楽死させた。α−synオリゴマーおよびα−synの不溶性形態の減少したレベルが、注射したtgマウスの脳において見出された(図15を参照)。
FITCで標識したモノクローナル抗体(クローン9E4)をnontgおよびアルファ−syn tgマウスにおいてIV注射した。注射後3日で低レベルの抗体が脳において検出され、一方、高いレベルが血漿において検出された。注射後14および30日で免疫細胞化学およびELISAの両方により明らかなように血漿におけるレベルの減少を伴っていっそう高いレベルが脳において検出された。tgマウスの脳において、9E4−FITC抗体はニューロンにおける粒状α−syn凝集体と関連して検出された。これらの凝集体は、リソソームマーカー(カテプシンD)に対する抗体で共標識された。非免疫IgG−FITCでのコントロール実験は、nontgおよびアルファ−syn tgマウスにおけるバックグラウンド標識のみを示す。さらに、9E4−FITCで処置したマウスのCSFでのアルファ−syn tgマウスからの切片の免疫標識は、未処置のアルファ−syn tgマウスからの切片におけるシナプスおよびニューロンを免疫標識し、対照的に非免疫IgG−FITCで処置したマウスのCSFでは標が認められなかった。
以下のモノクローナル抗体産生細胞系は、示された日付にAmerican Type
Culture Collection(ATCC,P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108)でブダペスト条約の規定に基づいて寄託されている:
アクセプター抗体を選択すること;および
モノクローナル抗体からのCDRおよびアクセプター抗体からの可変領域フレームワークを含んでなるヒト化抗体を製造すること
を含んでなるモノクローナル抗体9E4(ATCC受託番号PTA−8221)をヒト化する方法。
重鎖および軽鎖定常領域を選択すること;
軽鎖定常領域に融合した軽鎖可変領域を含んでなる軽鎖、および重鎖定常領域に融合した重鎖可変領域を含んでなる重鎖を含んでなるキメラ抗体を製造すること
を含んでなるモノクローナル抗体9E4(ATCC受託番号PTA−8221)のキメラ形態を製造する方法。
アクセプター抗体を選択すること;および
モノクローナル抗体からのCDRおよびアクセプター抗体からの可変領域フレームワークを含んでなるヒト化抗体を製造すること
を含んでなるハイブリドーマJH17.1H7.4.24.34(ATCC受託番号PTA−8220)もしくはハイブリドーマJH22.11A5.6.29.70.54.16.14(ATCC受託番号PTA−8222)により生産されるモノクローナル抗体をヒト化する方法。
重鎖および軽鎖定常領域を選択すること;
軽鎖定常領域に融合した軽鎖可変領域を含んでなる軽鎖、および重鎖定常領域に融合した重鎖可変領域を含んでなる重鎖を含んでなるキメラ抗体を製造すること
を含んでなるハイブリドーマJH17.1H7.4.24.34(ATCC受託番号PTA−8220)もしくはハイブリドーマJH22.11A5.6.29.70.54.16.14(ATCC受託番号PTA−8222)により生産されるモノクローナル抗体のキメラ形態を製造する方法。
Claims (9)
- 脳におけるレビー小体もしくはアルファ−シヌクレイン凝集を特徴とする疾患の予防または処置に使用するための、ヒトアルファ−シヌクレインの残基91〜99(残基は配列番号:1に従って番号が付けられている)内のエピトープに特異的に結合する抗体であって、モノクローナル抗体1H7(ATCC受託番号PTA−8220)のCDRを含んで成る、上記抗体、を含んでなる医薬組成物。
- 疾患がパーキンソン病である、請求項1の医薬組成物。
- 抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項1の医薬組成物。
- 抗体がモノクローナル抗体1H7(ATCC受託番号PTA−8220)である、請求項3の医薬組成物。
- 抗体が少なくとも6か月の期間にわたって複数回投与において投与される、請求項1の医薬組成物。
- 抗体が末梢経路により投与される、請求項1〜5のいずれかに記載の医薬組成物。
- 抗シヌクレインモノクローナル抗体が、ハイブリドーマJH17.1H7.4.24.34によって製造される1H7抗体のCDRを含んで成る、請求項1の医薬組成物。
- ヒト化またはキメラ1H7である、請求項7の医薬組成物。
- 抗体が、末梢経路により投与され、リソソーム経路により細胞内レビー小体もしくはアルファシヌクレイン凝集を減少させる、請求項1に記載の医薬組成物。
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