JP5943993B2 - 転写のシグナル伝達及び活性化因子3(stat3)発現の調節 - Google Patents
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Description
本出願は、電子形式の配列表を伴って出願される。配列表は、2012年3月29日に作成された672KbのサイズのBIOL0142WOSEQ.txtの表題のファイルとして提供される。電子形式の配列表中の情報は、その全てが参照により本明細書中に組込まれる。
ある態様において、提供されるものは、動物におけるSTAT3のmRNA及びタンパク質の発現を阻害するための方法、化合物、及び組成物である。このような方法、化合物、及び組成物は、過剰増殖性疾病を、治療、予防、又は改善するために有用である。
具体的な定義が提供されない限り、本明細書中に記載される分析化学、合成有機化学、並びに医薬及び製薬化学に関連して使用される命名法、並びにその方法及び技術は、当技術において公知であり、そして普通に使用されるものである。標準的技術を、化学合成及び化学分析のために使用することができる。可能な場合、全ての特許、出願、公開された出願及び他の刊行物、国立バイオデータ情報センター(NCBI)のようなデータベースにより得られるGENBANK寄託番号及び付属する配列情報、並びに本明細書中に開示されるものの中で言及される他のデータは、本明細書中で考察される文書の一部、並びにその全てが参考文献として援用される。
“2’−デオキシヌクレオシド”は、デオキシリボヌクレオシド(DNA)中に天然に存在するような2’−Hフラノシル糖部分を含んでなるヌクレオシドを意味する。ある態様において、2’−デオキシヌクレオシドは、修飾核酸塩基を含んでなることができるか、又はRNA核酸塩基(例えばウラシル)を含んでなることができる。
ある態様において、提供されるものは、STAT3のmRNA又はタンパク質発現を阻害するための方法、化合物、及び組成物である。
修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが:
1ないし5個の結合したヌクレオシドからなる5’−ウイング;
1ないし5個の結合したヌクレオシドからなる3’−ウイング;
8ないし12個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップ;
を含んでなり;そしてここで、5’−ウイング及び3’−ウイングの少なくとも一方が、少なくとも一つの二環式ヌクレオシド又は2’−置換ヌクレオシドを含んでなる;
12ないし22個の結合したヌクレオシドからなる修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる化合物であり;
ここで、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号:1の核酸塩基配列の核酸塩基250−286;250−285;264−285;264−282;728−745;729−745;729−744;787−803;867−883;955−978;1146−1170;1896−1920;1899−1920;1899−1919;1899−1918;1899−1916;1901−1916;1946−1963;1947−1963;2155−2205;2155−2187;2156−2179;2204−2221;2681−2696;2699−2716;3001−3033;3008−3033、3010−3033、3010−3032、3015−3033、3015−3032、3015−3031、3016−3033、3016−3032、3016−3033;3452−3499;3460−3476;3583−3608;3591−3616;3595−3615;3595−3614;3595−3612;3675−3706;3713−3790;3715−3735;3833−3878;3889−3932;3977−4012;4067−4100;4225−4256;4234−4252;4235−4252;4235−4251;4236−4252;4306−4341;4431−4456;4439−4454;4471−4510;4488−4505;4530−4558;4539−4572;4541−4558;4636−4801;4782−4796;4800−4823;4811−4847;4813−4859;4813−4815;4813−4831;4827−4859;4827−4844;4842−4859のいずれかの等しい長さの部分と相補的である。
修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが:
1ないし5個の結合したヌクレオシドからなる5’−ウイング;
1ないし5個の結合したヌクレオシドからなる3’−ウイング;
8ないし12個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップ;
を含んでなり;そしてここで、5’−ウイング及び3’−ウイングの少なくとも一方が、少なくとも一つの二環式ヌクレオシド又は2’−置換ヌクレオシドを含んでなる;
12ないし22個の結合したヌクレオシドからなる修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含んでなる化合物であり;
ここで、修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号:2の核酸塩基配列の核酸塩基2668−2688;2703−2720;5000−5021;5001−5017;5697−5722;5699−5716;6475−6490;6475−6491;6476−6491;7682−7705;8078−8097;8079−8095;9862−9811;9870−9897;9875−9893;9875−9891;9877−9893;11699−11719;12342−12366;12345−12364;12346−12364;12347−12364;12353−12380;12357−12376;12358−12376;12358−12373;12360−12376;14128−14148;16863−16883;46091−46111;50692−50709;50693−50709;50693−50708;61325−61349;66133−66157;66136−66157;66136−66155;66136−66153;66138−66153;66184−66200;67067−67083;4171−74220;74199−74220;74202−74220;74171−74219;74199−74219;74202−74219;74171−74218;74199−74218;74202−74218;74723−74768;74764−74803;74782−74802;74782−74801;74782−74800;74782−74799;74783−74802;74783−74801;74783−74800;74783−74799;74862−74893;74900−74977;74902−74922;74902−74920;75070−75119;75164−75199;75254−75287;75412−75443;75421−75439;75422−75439;75422−75438;75423−75439;75423−75438;75493−75528;75616−75643; 75626−75641;75658−75699;75676−75692;75717−75745;75726−75759;75726−75745;75727−75745;75728−75745;75831−75988;75852−75969;75969−75984;75987−76056;76000−76046;76000−76032;76000−76018;76014−76046;76014−76032;76029−76046;及び76031−76046のいずれかの等しい長さの部分と相補的である。
1ないし5個の結合されたヌクレオシドからなる5’−ウイング;
1ないし5個の結合されたヌクレオシドからなる3’−ウイング;
8ないし12個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップを含んでなり;そして
ここで、5’−ウイング及び3’−ウイングの少なくとも一方は、少なくとも一つの二環式ヌクレオシド又は一つの2’−置換ヌクレオシドを含んでなる。
1ないし5個の結合されたヌクレオシドからなる5’−ウイング;
1ないし5個の結合されたヌクレオシドからなる3’−ウイング;
8ないし12個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップを含んでなり;そして
ここで、5’−ウイング及び3’−ウイングの少なくとも一方は、少なくとも一つの二環式ヌクレオシド及び少なくとも一つの2’−置換ヌクレオシドを含んでなる。
3個の結合されたヌクレオシドからなる5’−ウイング;
3個の結合されたヌクレオシドからなる3’−ウイング;
10個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップを含んでなり;
ここで、それぞれの5’−ウイング及び3’−ウイングのそれぞれのヌクレオシドは、拘束エチルヌクレオシドを含んでなり;
ここで、それぞれのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり;そして
ここで、それぞれのシトシンは、5’−メチルシトシンである。
1ないし5個の結合されたヌクレオシドからなる5’−ウイング;
1ないし5個の結合されたヌクレオシドからなる3’−ウイング;
8ないし12個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップを含んでなり;そして
ここで、5’−ウイング及び3’−ウイングの少なくとも一方は、少なくとも一つの二環式ヌクレオシド又は2’−置換ヌクレオシドを含んでなる。
1ないし5個の結合されたヌクレオシドからなる5’−ウイング;
1ないし5個の結合されたヌクレオシドからなる3’−ウイング;
8ないし12個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップを含んでなり;そして
ここで、5’−ウイング及び3’−ウイングの少なくとも一方は、少なくとも一つの二環式ヌクレオシド及び少なくとも一つの2’−置換ヌクレオシドを含んでなる。
3個の結合されたヌクレオシドからなる5’−ウイング;
3個の結合されたヌクレオシドからなる3’−ウイング;
10個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップを含んでなり;
ここで、それぞれの5’−ウイング及び3’−ウイングのそれぞれのヌクレオシドは、拘束エチルヌクレオシドを含んでなり;
ここで、それぞれのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合であり;そして
ここで、それぞれのシトシンは、5’−メチルシトシンである。
修飾オリゴヌクレオチドが:
1ないし5個の結合されたヌクレオシドからなる5’−ウイング;
1ないし5個の結合されたヌクレオシドからなる3’−ウイング;
8ないし12個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップ;
を含んでなる12ないし22個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチド;
を含んでなる化合物を提供し;
ここで、5’−ウイング及び3’−ウイングの少なくとも一方は、少なくとも一つの二環式ヌクレオシド又は2’−置換ヌクレオシドを含んでなり;
ここで、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号:1の核酸塩基配列の核酸塩基3016から3031の等しい長さの部分と相補的であり;そして
ここで、この化合物は、STAT3のmRNA発現の発現を阻害する。
修飾オリゴヌクレオチドが:
1ないし5個の結合されたヌクレオシドからなる5’−ウイング;
1ないし5個の結合されたヌクレオシドからなる3’−ウイング;
8ないし12個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップ;
を含んでなる12ないし22個の結合されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物を提供し;
ここで、5’−ウイング及び3’−ウイングの少なくとも一方は、少なくとも一つの二環式ヌクレオシド又は2’−置換ヌクレオシドを含んでなり;
ここで、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号:2の核酸塩基配列の核酸塩基6476から6491の等しい長さの部分と相補的であり;そして
ここで、この化合物は、STAT3のmRNA発現の発現を阻害する。
(J)m−(B)n−(J)p−(B)r−(A)t−(D)g−(A)v−(B)w−(J)x−(B)y−(J)z
によって記載される糖モチーフを有し、
式中:
それぞれのAは、独立に2’−置換ヌクレオシドであり;
それぞれのBは、独立に二環式ヌクレオシドであり;
それぞれのJは、独立に2’−置換ヌクレオシド又は2’−デオキシヌクレオシドのいずれかであり;
それぞれのDは、2’−デオキシヌクレオシドであり;
mは、0−4であり;nは、0−2であり;pは、0−2であり;rは、0−2であり;tは、0−2であり;vは、0−2であり;wは、0−4であり;xは、0−2であり;yは、0−2であり;zは、0−4であり;gは、6−14であり;
但し:
m、n、及びrの少なくとも一つは、0以外であり;
w及びyの少なくとも一つは、0以外であり;
m、n、p、r、及びtの合計は、2から5までであり;そして
v、w、x、y、及びzの合計は、2から5までである;
ことを条件とする。
k−d(10)−k
e−d(10)−k
k−d(10)−e
k−k−d(10)−k−k
k−k−d(10)−e−e
e−e−d(10)−k−k
k−k−k−d(10)−k−k−k
e−e−e−d(10)−k−k−k
k−k−k−d(10)−e−e−e
k−k−k−d(10)−k−k−k
e−k−k−d(10)−k−k−e
e−e−k−d(10)−k−k−e
e−d−k−d(10)−k−k−e
e−k−d(10)−k−e−k−e
k−d(10)−k−e−k−e−e
e−e−k−d(10)−k−e−k−e
e−d−d−k−d(9)−k−k−e
e−e−e−e−d(9)−k−k−e
からなる群のいずれかの糖モチーフを有し、
ここで、kは、拘束エチルヌクレオシドであり、eは、2’−MOEで置換されたヌクレオシドであり、そしてdは、2’−デオキシヌクレオシドである。
オリゴマー化合物は、制約されるものではないが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣物、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNAを含む。オリゴマー化合物は、これが水素結合により標的核酸とのハイブリダイゼーションを受けることが可能なことを意味する標的核酸に対して“アンチセンス”であることができる。
ある態様において、STAT3核酸を標的とするアンチセンス化合物は、阻害活性の向上、標的核酸に対する結合親和性の増加、又はin vivoのヌクレアーゼによる分解に対する耐性のようなアンチセンス化合物特性を与えるパターン又はモチーフに配列された化学的に修飾されたサブユニットを有する。
k−d(10)−k
e−d(10)−k
k−d(10)−e
k−k−d(10)−k−k
k−k−d(10)−e−e
e−e−d(10)−k−k
k−k−k−d(10)−k−k−k
e−e−e−d(10)−k−k−k
k−k−k−d(10)−e−e−e
k−k−k−d(10)−k−k−k
e−k−k−d(10)−k−k−e
e−e−k−d(10)−k−k−e
e−d−k−d(10)−k−k−e
e−k−d(10)−k−e−k−e
k−d(10)−k−e−k−e−e
e−e−k−d(10)−k−e−k−e
e−d−d−k−d(9)−k−k−e
e−e−e−e−d(9)−k−k−e
のいずれかを有し、
ここで、kは、拘束エチルヌクレオシドであり、eは、2’−MOE置換ヌクレオシドであり、そしてdは、2’−デオキシヌクレオシドである。
(J)m−(B)n−(J)p−(B)r−(A)t−(D)g−(A)v−(B)w−(J)x−(B)y−(J)z
によって記載される糖モチーフを有し、
式中:
それぞれのAは、独立に2’−置換ヌクレオシドであり;
それぞれのBは、独立に二環式ヌクレオシドであり;
それぞれのJは、独立に2’−置換ヌクレオシド又は2’−デオキシヌクレオシドのいずれかであり;
それぞれのDは、2’−デオキシヌクレオシドであり;
mは、0−4であり;nは、0−2であり;pは、0−2であり;rは、0−2であり;tは、0−2であり;vは、0−2であり;wは、0−4であり;xは、0−2であり;yは、0−2であり;zは、0−4であり;gは、6−14であり;
但し:
m、n、及びrの少なくとも一つは、0以外であり;
w及びyの少なくとも一つは、0以外であり;
m、n、p、r、及びtの合計は、2から5までであり;そして
v、w、x、y、及びzの合計は、2から5までである;
ことを条件とする。
STAT3をコードするヌクレオチド配列は、制約されるものではないが、次:GENBANK寄託番号NM_139276.2(配列番号:1として本明細書中に援用される)及びヌクレオチド4185000ないし4264000から切断されたGENBANK寄託番号NT_010755.14の相補物(配列番号:2として本明細書中に援用される)を含む。
幾つかの態様において、ハイブリダイゼーションは、本明細書中に開示されるアンチセンス化合物及びSTAT3核酸間に起こる。ハイブリダイゼーションの最も普通の機構は、核酸分子の相補的核酸塩基間の水素結合に関係する(例えば、Watson−Crick,Hoogsteen or reversed Hoogsteen hydrogen bonding)。
アンチセンス化合物及び標的核酸は、アンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が、所望の効果(例えば、STAT3核酸のような標的核酸のアンチセンス阻害)を起こすものであるように、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができる場合、互いに相補的である。
本明細書中に提供されるアンチセンス化合物は、更に特定のヌクレオチド配列、配列番号、又は具体的なIsis番号によって表される化合物、又はこれらの部分に対する規定された同一性のパーセントを有することができる。本明細書中で使用する場合、アンチセンス化合物は、これが同一の核酸塩基の対形成の能力を有する場合、本明細書中に開示される配列と同一である。例えば、開示されたDNA配列中のチミジンの代わりにウラシルを含有するRNAは、ウラシル及びチミジンの両方が、アデニンと対形成するため、DNA配列と同一であると考えられるものである。本明細書中に記載されるアンチセンス化合物の短縮及び延長された変種、並びに本明細書中に提供されるアンチセンス化合物に対して非同一性塩基を有する化合物も、更に意図されている。非同一性塩基は、互いに隣接するか、又はアンチセンス化合物中に分散されることができる。アンチセンス化合物の同一性のパーセントは、これが比較される配列に対して同一の塩基対形成を有する塩基の数によって計算される。
ヌクレオシドは、塩基−糖の組合せである。ヌクレオシドの核酸塩基(更に塩基としても知られる)部分は、通常複素環塩基部分である。ヌクレオチドは、更にヌクレオシドの糖部分に共有的に結合したリン酸基を含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドにおいて、リン酸基は、糖の2’、3’又は5’ヒドロキシル部分に結合することができる。オリゴヌクレオチドは、隣接するヌクレオシドのお互いの共有結合によって形成されて、直線のポリマーのオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成するとして一般的に言及される。
RNA及びDNAの天然に存在するヌクレオシド間結合は、3’から5’へのホスホジエステル結合である。一つ又はそれより多い修飾された、即ち天然に存在しないヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物は、例えば細胞取込みの向上、標的核酸に対する親和性の向上、及びヌクレアーゼの存在中の安定性の増加のような好ましい特性のために、しばしば天然に存在するヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物を超えて選択される。
本明細書中に提供されるアンチセンス化合物は、糖基が修飾された一つ又はそれより多いヌクレオシドを所望により含有することができる。このような糖を修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の向上、結合親和性の増加、又は幾つかの他の有利な生物学的特性をアンチセンス化合物に与えることができる。ある態様において、ヌクレオシドは、化学的に修飾されたリボフラノース環部分を含んでなる。化学的に修飾されたリボフラノース環の例は、制約されるものではないが、置換基の付加(5’及び2’置換基を含む);二環式核酸(BNA)を形成するための非ジェミナルな環原子の架橋;S、N(R)、又はC(R1)(R)2(R=H、C1−C12アルキル又は保護基)によるリボシル環の酸素原子の置換;及びこれらの組合せを含む。化学的に修飾された糖の例は、2’−F−5’−メチル置換されたヌクレオシド(他の開示された5’,2’−ビス置換されたヌクレオシドに対して、8/21/08に公開されたPCT国際特許出願WO2008/101157を参照されたい)、2’−位における更なる置換を伴うSによるリボシル環の酸素原子の置換(2005年6月16日に公開された、公開された米国特許出願US2005/0130923を参照されたい)、又は、別の方法として、BNAの5’−置換(LNAが、例えば5’−メチル又は5’−ビニル基で置換された、11/22/07に公開されたPCT国際特許出願WO2007/134181を参照されたい)を含む。
ここで:
xは、0、1、又は2であり;
nは、1、2、3、又は4であり;
それぞれのRa及びRbは、独立に、H、保護基、ヒドロキシル、C1−C12アルキル、置換されたC1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換されたC2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換されたC2−C12アルキニル、C5−C20アリール、置換されたC5−C20アリール、複素環ラジカル、置換された複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、C5−C7脂環式ラジカル、置換されたC5−C7脂環式ラジカル、ハロゲン、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、アシル(C(=O)−H)、置換されたアシル、CN、スルホニル(S(=O)2−J1)、又はスルホキシル(S(=O)−J1)であり;そして
それぞれのJ1及びJ2は、独立に、H、C1−C12アルキル、置換されたC1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換されたC1−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換されたC2−C12アルキニル、C5−C20アリール、置換されたC5−C20アリール、アシル(C(=O)−H)、置換されたアシル、複素環ラジカル、置換された複素環ラジカル、C1−C12アミノアルキル、置換されたC1−C12アミノアルキル、又は保護基である。
Bxは、複素環式塩基部分であり;
−Qa−Qb−Qc−は、−CH2−N(Rc)−CH2−、−C(=O)−N(Rc)−CH2−、−CH2−O−N(Rc)−、−CH2−N(Rc)−O−、又は−N(Rc)−O−CH2であり;
Rcは、C1−C12アルキル又はアミノ保護基であり;そして
Ta及びTbは、それぞれ独立に、H、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合である。
Bxは、複素環式塩基部分であり;
Ta及びTbは、それぞれ独立に、H、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり;
Zaは、C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、置換されたC1−C6アルキル、置換されたC2−C6アルケニル、置換されたC2−C6アルキニル、アシル、置換されたアシル、置換されたアミト゛、チオール、又は置換されたチオである。
Bxは、複素環式塩基部分であり;
Ta及びTbは、それぞれ独立に、H、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり;
Zbは、C1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、置換されたC1−C6アルキル、置換されたC2−C6アルケニル、置換されたC2−C6アルキニル、、又は置換されたアシル(C(=O)−)である。
Bxは、複素環式塩基部分であり;
Ta及びTbは、それぞれ独立に、H、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり;
Rdは、C1−C6アルキル、置換されたC1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換されたC2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、又は置換されたC2−C6アルキニルであり;
それぞれのqa、qb、qc及びqdは、独立に、H、ハロゲン、C1−C6アルキル、置換されたC1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換されたC2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、又は置換されたC2−C6アルキニル、C1−C6アルコキシ、置換されたC1−C6アルコキシ、アシル、置換されたアシル、C1−C6アミノアルキル、或いは置換されたC1−C6アミノアルキルである;
ある態様において、二環式ヌクレオシドは、以下の式V:
Bxは、複素環式塩基部分であり;
Ta及びTbは、それぞれ独立に、H、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり;
qa、qb、qe及びqfは、それぞれ独立に、水素、ハロゲン、C1−C12アルキル、置換されたC1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換されたC2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換されたC2−C12アルキニル、C1−C12アルコキシ、置換されたC1−C12アルコキシ、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O−C(=O)-NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)-NJjJk又はN(H)C(=S)NJjJkであるか;
或いはqe及びqfは、一緒に=C(qg)(qh)であり;
qg及びqhは、それぞれ独立に、H、ハロゲン、C1−C12アルキル、又は置換されたC1−C12アルキルである。
Bxは、複素環式塩基部分であり;
Ta及びTbは、それぞれ独立に、H、ヒドロキシル保護基、複合体基、反応性リン基、リン部分、又は支持媒体への共有結合であり;
それぞれのqi、qj、qk及びqlは、独立に、H、ハロゲン、C1−C12アルキル、置換されたC1−C12アルキル、C2−C12アルケニル、置換されたC2−C12アルケニル、C2−C12アルキニル、置換されたC2−C12アルキニル、C1−C12アルコキシ、置換されたC1−C12アルコキシ、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O−C(=O)-NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)-NJjJk、又はN(H)C(=S)NJjJkであり;そして
qi及びqj 又はql及びqkは、一緒に、=C(qg)(qh)であり、ここで、qg及びqhは、それぞれ独立にH、ハロゲン、C1−C12アルキル、又は置換されたC1−C12アルキルである。
Bxは、複素環式塩基部分であり;
T3及びT4は、それぞれ独立に、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であるか、又はT3及びT4の一方は、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物に結合するヌクレオシド間結合基であり、そしてT3及びT4の他方は、H、ヒドロキシル保護基、結合された複合体基、或いは5’ 又は3’−末端基であり;
q1、q2、q3、q4、q5、q6及びq7は、それぞれ独立に、H、C1−C6アルキル、置換されたC1−C6アルキル、C2−C6アルケニル、置換されたC2−C6アルケニル、C2−C6アルキニル、又は置換されたC2−C6アルキニルであり;そして
R1及びR2の一方は、水素であり、そして他方は、ハロゲン、置換された又は非置換のアルコキシ、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2、及びCNから選択され、ここで、XはO、S、又はNJ1であり、そしてそれぞれのJ1、J2、及びJ3は、独立に、H又はC1−C6アルキルである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物又は製剤の調製のために医薬的に受容可能な活性又は不活性な物質と混合することができる。医薬組成物の処方のための組成及び方法は、制約されるものではないが、投与の経路、疾病の程度、又は投与される投与量を含む多くの基準に依存する。
アンチセンス化合物は、得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取込みを向上する一つ又はそれより多い分子或いは複合体と、共有的に結合することができる。典型的な複合体基は、コレステロール分子及び脂質分子を含む。更なる複合体基は、炭化水素、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料を含む。
STAT3核酸のレベル、活性又は発現に対するアンチセンス化合物の効果は、各種の細胞型でin vitroで試験することができる。このような分析に使用しされる細胞型は、商業的業者(例えば、American Type Culture Collection,Manassus,VA;Zen−Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC;Clonetics Corporation,Walkersville,MD)から入手可能であり、そして業者の説明書により、商業的に入手可能な試薬(例えば、Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)を使用して培養される。例示的な細胞型は、制約されるものではないが、HuVEC細胞、b.END細胞、HepG2細胞、Hep3B細胞、及び初代培養肝細胞を含む。
本明細書中に記載されるものは、アンチセンスヌクレオチドによる細胞の治療のための方法であり、これは、他のアンチセンス化合物による治療のために適当に改変することができる。
ある態様において、癌細胞株中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質移入非依存性活性(即ち、自由取込み)は、効力の基準である。自由取込みは、例えば、SK−BR−3細胞、U251−MG細胞、MDA−MB−231細胞、H460細胞、A431細胞、colo205細胞、SNB−19細胞、SK−OV3細胞、H1993肺癌細胞、H358肺癌細胞、PC−9肺癌細胞、KHM−35肺癌細胞、Capan−1膵臓癌細胞、HPAF−11膵臓癌細胞、及びColo201結腸直腸癌細胞のような癌細胞株において測定することができる。
RNAの分析は、全細胞RNA又はポリ(A)+mRNAに対して行うことができる。RNA単離の方法は、当技術において公知である。RNAは、当技術において公知の方法を使用して、例えばTRIZOL試薬(Invitrogen,Carlsbad,CA)を使用して製造業者の推奨するプロトコルによって調製される。
STAT3核酸のレベル又は発現の阻害は、当技術において既知の各種の方法で分析することができる。例えば、標的核酸レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、又は定量的リアルタイムPCRによって定量化することができる。RNA分析は、全細胞RNA又はポリ(A)+mRNAに対して行うことができる。RNA単離の方法は、当技術において公知である。ノーザンブロット分析も、更に当技術においてルーチン的である。定量的リアルタイムPCRは、PE−Applied Biosystems,Foster City,CAから入手可能な、商業的に入手可能なABI PRISM 7600、7700、又は7900配列検出装置を使用し、そして製造業者の説明書によって使用して都合よく達成することができる。
標的RNAレベルの定量化は、ABI PRISM 7600、7700、又は7900配列検出装置(PE−Applied Biosystems,Foster City,CA)を、製造業者の説明書によって使用する定量的リアルタイムPCRによって達成することができる。定量的リアルタイムPCRの方法は、当技術において公知である。
STAT3核酸のアンチセンス阻害は、STAT3タンパク質レベルを測定することによって評価することができる。STAT3のタンパク質レベルは、免疫沈降法、ウェスタンブロット分析(免疫ブロッティング)、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、定量的タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ(例えば、カスパーゼ活性アッセイ)、免疫組織化学、免疫細胞化学又は蛍光標示式細胞分取(FACS)のような当技術において公知の各種の方法で評価又は定量化することができる。標的を指向する抗体は、確認され、そして抗体のMSRSカタログ(Aerie Corporation,Birmingham,MI)のような各種の供給源から得ることができるか、又は当技術において公知の慣用的なモノクローナル又はポリクローナル抗体発生法により調製することができる。マウス、ラット、サル、及びヒトSTAT3の検出のために有用な抗体は、商業的に入手可能である。
アンチセンス化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、STAT3の発現を阻害し、そして細胞増殖の減少、癌に伴う徴候の改善、カヘキシアの減少、及び癌マーカーの減少のような表現型の変化を産生するその能力を評価するために動物において試験される。試験は、正常な動物で、又は実験的な疾病モデルで行うことができる。動物への投与のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩水のような医薬的に受容可能な希釈剤中に処方される。投与は、腹腔内、静脈内、皮下、くも膜下腔内、及び脳室内のような、非経口の投与の経路を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量の計算及び投与頻度は、当業者の能力の範囲内であり、そして投与の経路及び動物の体重のような因子に依存する。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療の期間後、RNAを肝臓組織から単離し、そしてSTAT3核酸発現の変化を測定する。STAT3タンパク質レベルの変化も更に測定する。
ある態様において、提供されるものは、本明細書中に提供される一つ又はそれより多い医薬組成物を投与することを含んでなる、個体を治療する方法、化合物、及び組成物である。ある態様において、個体は、過剰増殖性疾病を有する。ある態様において、過剰増殖性疾病は、癌、例えば、細胞腫、肉腫、リンパ腫、及び白血病、並びに付随する悪性腫瘍及び転移である。ある態様において、癌の種類は、非小細胞肺癌(NSCLC)を含む肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、多発性骨髄腫、肝細胞細胞腫(HCC)、神経膠芽腫、卵巣癌、骨肉腫、頭頸部癌、乳癌、類表皮癌、腸管腺腫、前立腺癌、及び胃癌である。ある態様において、個体は、癌、例えば、細胞腫、肉腫、リンパ腫、及び白血病、並びに付随する悪性腫瘍及び転移を含む過剰増殖性疾病の危険性がある。これは、老化;タバコの使用;日光及びイオン化照射に対する暴露;ある種の化学薬品との接触;ある種のウイルス及び細菌による感染;ある種のホルモン療法;遺伝子的素因;アルコールの使用;並びに不良な食事制限、身体活動性の欠如、及び/又は過体重を含むある種の生活習慣の選択を含む過剰増殖性疾病を発症する一つ又はそれより多い危険因子を有する個体を含む。ある態様において、個体は、過剰増殖性疾病に対する治療が必要であると確認されている。ある態様において、個体におけるSTAT3発現を予防的に減少することに対する方法が提供される。ある態様は、治療的に有効な量のSTAT3核酸を標的とするアンチセンス化合物を個体に投与することにより、それを必要とする個体を治療することを含む。
ある態様において、本明細書中に提供される一つ又はそれより多い医薬組成物は、一つ又はそれより多い他の医薬剤と同時投与される。ある態様において、このような一つ又はそれより多い他の医薬剤は、本明細書中に提供される一つ又はそれより多い医薬組成物と同一の疾病、疾患、又は症状を治療するために設計される。ある態様において、このような一つ又はそれより多い他の医薬剤は、本明細書中に提供される一つ又はそれより多い医薬組成物とは異なった疾病、疾患、又は症状を治療するために設計される。ある態様において、このような一つ又はそれより多い他の医薬剤は、本明細書中に提供される一つ又はそれより多い医薬組成物の好ましくない副作用を治療するために設計される。ある態様において、本明細書中に提供される一つ又はそれより多い医薬組成物は、他の医薬剤の好ましくない効果を治療するためにもう一つの医薬剤と共に同時投与される。ある態様において、本明細書中に提供される一つ又はそれより多い医薬組成物は、組合せ効果を産生するためにもう一つの医薬剤と共に同時投与される。ある態様において、本明細書中に提供される一つ又はそれより多い医薬組成物は、相乗効果を産生するためにもう一つの医薬剤と共に同時投与される。
ある態様において、本明細書中に提供される化合物は、最小の副作用を示す。副作用は、動物の炎症性反応のような、典型的にはSTAT3を標的とすることに無関係なアンチセンス化合物の投与に対する反応を含む。ある態様において、化合物は、動物によって十分に許容される。増加した許容性は、制約されるものではないが、アンチセンス化合物のヌクレオチド配列、ヌクレオチドに対する化学的修飾、アンチセンス化合物中の非修飾の又は修飾されたヌクレオチドの特定のモチーフ、又はこれらの組合せを含む多くの因子に依存する。許容性は、多くの因子によって決定することができる。このような因子は、体重、器官重量、肝機能、腎機能、血小板数、白血球数を含む。
本明細書中に記載されるある種の化合物、組成物及び方法は、ある種の態様によって具体的に記載されてきたが、以下の実施例は、本明細書中に記載される化合物を例示するためのみに役立ち、そしてそれを制約する意図はない。本出願中に引用される参考文献のそれぞれは、その全てが参考文献として援用される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトSTAT3核酸を標的として設計し、そしてin vitroのヒトSTAT3のmRNAの発現に対するその効果に対して試験した。表1及び2に提示したキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを、2−10−2cEtギャップマー又は3−10−3cEtギャップマーのいずれかとして設計した。2−10−2cEtギャップマーは、14個のヌクレオチドの長さであり、ここで、中央のギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオシドを含んでなり、そしてそれぞれ二つのヌクレオシドを含んでなるウイングによって両側において(5’及び3’方向で)隣接されていた。3−10−3cEtギャップマーは、16個のヌクレオチドの長さであり、ここで、中央のギャップセグメントは、10個の2’−デオキシヌクレオシドを含んでなり、そしてそれぞれ三つのヌクレオシドを含んでなるウイングによって両側において(5’及び3’方向で)隣接されていた。5’ウイングセグメントのそれぞれのヌクレオシド及び3’ウイングセグメントのそれぞれのヌクレオシドは、cEt糖修飾を有する。それぞれのギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。それぞれのギャップマー中の全てのシトシン残基は、5’−メチルシトシンである。
実施例1に記載した研究において試験されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、更にb.END細胞中のSTAT3のmRNAに対するその効果に対して試験した。ウェル当たり20,000個の細胞密度の培養されたb.END細胞を、電気穿孔を使用して、7,000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に形質移入した。概略24時間の治療期間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。マウスのプライマープローブセットRTS2381(順方向配列GCCACGTTGGTGTTTCATAATCT、本明細書中で配列番号:465と命名;逆方向配列GATAGAGGACATTGGACTCTTGCA、本明細書中で配列番号:466と命名;プローブ配列TTGGGTGAAATTGACCAGCAATATAGCCG、本明細書中で配列番号:467と命名)を、RNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルは、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されるような全RNA含有量によって調節した。
実施例1において評価された452種の化合物中から選択された高いレベルの効力を示す40種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、in vivoの許容性に対して更に試験した。
STAT3の有意なin vitro阻害を示す実施例1及び2からのギャップマーを、HuVEC細胞中で各種の投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり20,000個の細胞の密度でプレートに入れ、そして電気穿孔を使用して、表4に規定したように、31.25nM、62.5nM、125nM、250nM、500nM、及び1,0000nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。概略16時の治療時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRで測定した。ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199(順方向配列ACATGCCACTTTGGTGTTTCATAA、本明細書中で配列番号:6と命名;逆方向配列TCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAAC、本明細書中で配列番号:7と命名;プローブ配列CAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAA、本明細書中で配列番号:8と命名)を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されるような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
実施例4からのギャップマーを、SK−BR−3細胞中で各種の投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり4,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表5に規定したように、0.02μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2.5μM、及び10μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRで測定した。本明細書中で先に記載したヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されるような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
実施例5からのギャップマーを、U251−MG細胞中で各種の投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり4,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表6に規定したように、0.02μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2.5μM、及び10μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRで測定した。本明細書中で先に記載したヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されるような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
先に記載した研究からのISIS481464及びISIS481549を、異なった投与量でU251−MG細胞中で更に試験した。細胞を、ウェル当たり4,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表7に規定したように、0.1μM、1μM、5μM、10μM、及び20μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRで測定した。本明細書中で先に記載したヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されるような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
ISIS481464及びISIS481549を、異なった投与量でMDA−MB−231細胞中で更に試験した。細胞を、ウェル当たり4,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表8に規定したように、0.02μM、0.2μM、1.0μM、5.0μM、及び10.0μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRで測定した。本明細書中で先に記載したヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されるような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
ISIS481464及びISIS481549を、異なった投与量でA431細胞中で更に試験した。細胞を、ウェル当たり4,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表9に規定したように、0.02μM、0.2μM、1.0μM、5.0μM、及び10.0μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRで測定した。本明細書中で先に記載したヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されるような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
ISIS481464及びISIS481549を、異なった投与量でH460細胞中で更に試験した。細胞を、ウェル当たり4,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表10に規定したように、0.02μM、0.2μM、1.0μM、5.0μM、及び10.0μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRで測定した。本明細書中で先に記載したヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されるような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトSTAT3核酸を標的として設計し、そしてin vitroのヒトSTAT3のmRNAの発現に対するその効果に対して試験した。ウェル当たり20,000個の細胞の密度の培養されたHuVEC細胞を、電気穿孔を使用して1,000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に形質移入した。概略24時間の治療期間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトのプライマープローブセットRTS199(順方向配列ACATGCCACTTTGGTGTTTCATAA、本明細書中で配列番号:6と命名;逆方向配列TCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAAC、本明細書中で配列番号:7と命名;プローブ配列CAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAA、本明細書中で配列番号:8と命名)を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されるような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして提示される。
STAT3の有意なin vitro阻害を示す、上記実施例11に記載された研究からのギャップマーを、HuVEC細胞中で、各種の投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり20,000個の細胞の密度でプレートに入れ、そして電気穿孔を使用して、表12に示すような23.4375nM、93.75nM、375.0nM、及び1,500.0nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に形質移入した。概略16時間の治療期間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRで測定した。本明細書中で先に記載したヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されるような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトSTAT3核酸を標的として設計し、そしてin vitroのヒトSTAT3のmRNA発現に対するその効果を試験した。表13及び14のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各種の化学的修飾を有する16又は17個のヌクレオチドの長さのギャップマーである。それぞれのギャップマーは、9又は10個の2’−デオキシヌクレオシドからなる中央のギャップセグメントを含んでなり、そしてそれぞれ1、2、3、4、又は5個のヌクレオチドを含んでなるウイングによって両側において(5’及び3’方向で)隣接されている。ウイング中のそれぞれのヌクレオチドは、2’−MOE糖修飾又はcEt糖修飾を含んでなる。ギャップマーのモチーフは、3−10−3、4−9−3、2−10−4、1−10−5、及び3−10−4を含む。表13及び14の化学式の欄は、それぞれのギャップマーの糖モチーフを提供し、ここで、‘e’は、2’−MOEヌクレオシドを示し、‘k’は、拘束エチル(cEt)ヌクレオシドを示し、そして‘d’は、2’−デオキシヌクレオシドを示す。それぞれのギャップマー中のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート(P=S)結合である。それぞれのギャップマー中の全てのシトシン残基は、5’−メチルシトシンである。
STAT3の有意なin vitroの阻害を示す実施例13に記載された研究からのギャップマーを、HuVEC細胞中で、各種の投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり20,000個の細胞の密度でプレートに入れ、そして電気穿孔を使用して、表15に示すような39.1nM、156.3nM、625.0nM、及び2,500.0nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に形質移入した。概略16時間の治療期間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRで測定した。本明細書中で先に記載したヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されるような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
更なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、STAT3核酸を標的として設計し、そしてin vitroのSTAT3のmRNAに対するその効果を試験した。ウェル当たり20,000個の細胞密度の培養されたHuVEC細胞を、電気穿孔を使用して、1,000nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に形質移入した。概略24時間の治療期間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。本明細書中で先に記載したヒトプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されるような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
STAT3の有意なin vitro阻害を示す実施例15に記載された研究からのギャップマーを、HuVEC細胞中で、各種の投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり20,000個の細胞の密度でプレートに入れ、そして電気穿孔を使用して、表18に規定すように39.1nM、156.3nM、625.0nM、及び2,500.0nMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に形質移入した。概略16時間の治療期間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRで測定した。本明細書中で先に記載したヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されるような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
ヒト乳癌細胞MDA−MB−231で接種したBALB/cヌードマウスを、ISIS481464及びISIS481549で治療した。ISIS481549は、マウスの配列と交差反応可能である(即ち、マウス配列にハイブリダイズする)。マウスの腫瘍成長及びオリゴヌクレオチドの許容性を評価した。
研究を、Pharmaron Inc(Beijing,P.R.China)で行った。BALB/cヌードマウスを、Beijing HFK Bio−Technology Co.,Ltd.から得た。MDA−MB−231ヒト乳癌細胞を、10%の熱不活化胎児ウシ血清、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、及び2mMのL−グルタミンで補充されたLeibovitz’s L−15培地中で単層培養物としてin vitroで維持した。細胞を、空気中の5%CO2の雰囲気中で37℃で維持した。腫瘍細胞を、トリプシン−EDTA処理を伴って週2回ルーチン的に継代培養した。指数増殖期で増殖中の細胞を回収し、そして腫瘍接種のために計数した。
RNAを、本明細書中に記載したプライマープローブセットRTS199を使用する、ヒトSTAT3のmRNAレベルのリアルタイムPCR分析のために、腫瘍組織から抽出した。マウスのSTAT3のmRNAレベルも、更にプライマープローブセットmSTAT3_LTS00664(順方向配列CGACAGCTTCCCCATGGA、本明細書中で配列番号:1513と命名;逆方向配列ATGCCCAGTCTTGACTCTCAATC、本明細書中で配列番号:1514と命名;プローブ配列CTGCGGCAGTTCCTGGCACCTT、本明細書中で配列番号:1515と命名)を使用して測定した。結果を、PBS対照に対する、シクロフィリンに対して正規化されたSTAT3の阻害のパーセントとして示す。表19に示すように、ISISアンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療は、PBSと比較して、ヒト及びマウスのSTAT3のmRNAの両方の減少をもたらした。
腫瘍の大きさを、週2回、ノギスを使用して二つの寸法で測定した。腫瘍の体積を、式:V=0.536×a×b2を使用して計算し、式中、a及びbは、それぞれ腫瘍の長径及び短径である。腫瘍の大きさは、T−C及びTV/CV値の計算のために使用した。T−Cは、Tを治療群の腫瘍が所定の大きさ(900mm3)に達するために必要な中位時間(日数)とし、そしてCを対照群の腫瘍が同じ大きさに達するための中位時間(日数)として計算した。TV/CV値(パーセントとして表示)は、ISISオリゴヌクレオチドの抗腫瘍有効性の表示であり、ここで、TV及びCVは、所定の日(32日目)における治療及び対照群のそれぞれの平均体積であった。
動物の全体的健康状態に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、体重を、治療期間中定期的に測定した。データを表22に提示し、そしてISIS481464又はISIS481549のいずれかによる治療が有意な体重の増減を起こさないことを示す。
ヒト類表皮癌細胞A431で接種したBALB/cヌードマウスを、ISIS481464及びISIS481549で治療した。ISIS481549は、マウスの配列と交差反応可能である(即ち、マウス配列にハイブリダイズする)。マウスの腫瘍成長及び許容性に対する治療の効果を評価した。
研究を、Pharmaron Inc(Beijing,P.R.China)で行った。BALB/cヌードマウスを、Beijing HFK Bio−Technology Co.,Ltd.から得た。A431ヒト類表皮癌細胞を、10%の熱不活化胎児ウシ血清、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、及び2mMのL−グルタミンで補充されたDMEM培地中で単層培養物としてin vitroで維持した。細胞を、空気中の5%CO2の雰囲気中で37℃で維持した。腫瘍細胞をトリプシン−EDTA処理を伴って週2回ルーチン的に継代培養した。指数増殖期で増殖中の細胞を回収し、そして腫瘍接種のために計数した。
RNAを、本明細書中に記載したプライマープローブセットRTS199を使用するヒトSTAT3のmRNAレベルのリアルタイムPCR分析のために、腫瘍組織から抽出した。マウスのSTAT3のmRNAレベルも、更に本明細書中に記載したプライマープローブセットmSTAT3_LTS00664を使用して測定した。結果を、PBS対照に対する、シクロフィリンに対して正規化されたSTAT3の阻害のパーセントとして示す。表23に示すように、ISISアンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療は、PBSと比較して、ヒト及びマウスのSTAT3のmRNAの両方の減少をもたらした。
タンパク質を、ヒトSTAT3タンパク質レベルのSTAT3モノクローナル抗体(Cell Signaling Technology,Cat #9135)によるウェスタン分析のために腫瘍溶菌液から抽出した。結果を、ハウスキーピングタンパク質、PBS対照に対する、COX−IIに対して正規化されたSTAT3の阻害のパーセントとして示す。表24に示すように、ISISアンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療は、PBSと比較して、STAT3タンパク質レベルの減少をもたらした。
腫瘍の大きさを、週2回、ノギスを使用して二つの寸法で測定し、そして腫瘍の体積を、式:V=0.5×a×b2を使用して計算し、式中、a及びbは、それぞれ腫瘍の長径及び短径である。腫瘍の大きさは、T−C及びTV/CV値の計算のために使用した。T−Cは、Tを治療群の腫瘍が所定の大きさ(800mm3)に達するために必要な中位時間(日数)とし、そしてCを対照群の腫瘍が同じ大きさに達するための中位時間(日数)として計算された。TV/CV値(パーセントとして表示)は、ISISオリゴヌクレオチドの抗腫瘍有効性の表示であり、ここで、TV及びCVは、所定の日(33日目)における治療及び対照群のそれぞれの平均体積であった。
動物の全体的健康状態に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、体重を、治療期間中定期的に測定した。データを表27に提示し、そしてISIS481464又はISIS481549のいずれかによる治療が、マウスの全体的な健康状態に影響しないことを示す。
ヒトNCI−H460ヒトNSCLCで接種したBALB/cヌードマウスを、ヒトSTAT3を標的とするISIS491464、及びヒト及びマウスSTAT3の両方を標的とするISIS481549で治療した。マウスの腫瘍成長の治療の効果及び許容性を評価した。
研究を、Pharmaron Inc(Beijing,P.R.China)で行った。BALB/cヌードマウスを、Beijing HFK Bio−Technology Co.,Ltd.から得た。NCI−H460ヒトNSCLC細胞を、10%の熱不活化胎児ウシ血清、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、及び2mMのL−グルタミンで補充されたRPMI−1640培地中で単層培養物としてin vitroで維持した。細胞を、空気中の5%CO2の雰囲気中で37℃で維持した。腫瘍細胞を、トリプシン−EDTA処理を伴って週2回ルーチン的に継代培養した。指数増殖期で増殖中の細胞を回収し、そして腫瘍接種のために計数した。
RNAを、本明細書中に記載したプライマープローブセットRTS199を使用するヒトSTAT3のmRNAレベルのリアルタイムPCR分析のために、腫瘍組織から抽出した。マウスのSTAT3のmRNAレベルも、更に本明細書中に記載したプライマープローブセットmSTAT3_LTS00664を使用して測定した。結果を、PBS対照に対する、シクロフィリンに対して正規化されたSTAT3の阻害のパーセントとして示す。表28に示すように、ISISアンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療は、PBSと比較して、ヒト及びマウスのSTAT3のmRNAの両方の減少をもたらした。
腫瘍の大きさを、週2回、ノギスを使用して二つの寸法で測定し、そして腫瘍の体積を、式:V=0.5×a×b2を使用して計算し、式中、a及びbは、それぞれ腫瘍の長径及び短径である。腫瘍の大きさは、T−C及びTV/CV値の計算のために使用した。T−Cは、Tを治療群の腫瘍が所定の大きさ(1,500mm3)に達するために必要な中位時間(日数)とし、そしてCを対照群の腫瘍が同じ大きさに達するための中位時間(日数)として計算された。TV/CV値(パーセントとして表示)は、ISISオリゴヌクレオチドの抗腫瘍有効性の表示であり、ここで、TV及びCVは、所定の日(20日目)における治療及び対照群のそれぞれの平均体積であった。
動物の全体的健康状態に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、体重を、治療期間中定期的に測定した。データを表31に提示し、そしてISIS481464又はISIS481549のいずれかによる治療が、マウスの全体的な健康状態に影響しないことを示す。
ヒト神経膠芽腫細胞で同所性移植されたNU/Jマウスを、CAGCAGATCAAGTCCAGGGA(配列番号:1590)の配列を有する5−10−5MOEギャップマーであるISIS455291で治療した。マウスの腫瘍成長の治療及び許容性の影響を評価した。
30匹のNU/Jマウスに、右前頭葉に5×105個のU−87 MG−luc2細胞を定位的に移植した。腫瘍細胞の移植後15日目に、15匹のこれらのマウスに、2μLのPBS中に溶解した100μgのISIS455291を、腫瘍移植の部位にボーラス注射で頭蓋内に投与した。残りの15匹のマウスに、2μLのPBSを、腫瘍移植の部位にボーラス注射で頭蓋内に投与した。第2の群のマウスは、対照群として役立てた。
腫瘍移植の18日後に、それぞれの群からの5匹のマウスを、CO2吸入によって安楽死させ、そして脳の試料をRNA分析のために収集した。RNAを、本明細書中に先に記載したプライマープローブセットRTS199を使用するヒトSTAT3のmRNAレベルのリアルタイムPCR分析のために腫瘍組織から抽出した。ISIS455291による治療は、PBS対照と比較して、腫瘍組織中のヒトSTAT3のmRNAの27%の減少をもたらした。
APC/Min+マウスモデルの、STAT3のmRNAレベル及び腸管腺腫の数に対するISIS481549による治療の効果を評価した。APC/Min+マウス系統を、若年齢で全腸管中の自然な腺腫形成に罹らせた(Moser A.R.et al.,Science 1990.247:322−324)。
4匹のオスの生後9週間のAPC/Min+マウスの二つの群に、4週間、毎週5回投与される5mg/kg又は25mg/kgのISIS481549(それぞれ25mg/kg及び125mg/kgの合計週当たり投与量)を皮下注射した。4匹のオスの生後9週間のAPC/Min+マウスの一つの群に、4週間、毎週5回投与される50mg/kgの対照オリゴヌクレオチド、ISIS141923(250mg/kgの合計週当たり投与量)を皮下注射した。4匹のオスの生後9週間のAPC/Min+マウスの対照群に、4週間、週5回投与されるPBSを皮下注射した。最後の注射後の48時間目にマウスをイソフルラン(isoflurance)で安楽死させ、続いて頸椎脱臼させた。
RNAを、PureLinkTM全RNA精製キット(Invitrogen;#12173−011A)を使用して、製造業者のプロトコルによって組織から単離した。RT−PCRを、StepOnePlus装置(Applied Biosystems)を使用して、製造業者のプロトコルによって行った。マウスのプライマープローブセットmSTAT3_LTS00664(順方向配列CGACAGCTTCCCCATGGA、本明細書中で配列番号:1513と命名;逆方向配列ATGCCCAGTCTTGACTCTCAATC、本明細書中で配列番号:1514と命名;プローブ配列CTGCGGCAGTTCCTGGCACCTT、本明細書中で配列番号:1515と命名)を、STAT3のmRNAレベルを測定するために使用した。ハウスキーピング遺伝子、シクロフィリンのmRNAレベルを、プライマープローブセットmcyclo_24(順方向配列TCGCCGCTTGCTGCA、本明細書中で配列番号:1516と命名;逆方向配列ATCGGCCGTGATGTCGA、本明細書中で配列番号:1517と命名;プローブ配列CCATGGTCAACCCCACCGTGTTC、本明細書中で配列番号:1518と命名)で測定し、そしてSTAT3のmRNAレベルを正規化するために使用した。
小腸の組織学的解析を、腺腫の数を顕微鏡的に評価するために行った。125mg/kg/週のISIS481549による治療は、PBS対照と比較して、統計的に有意な腫瘍の数の減少をもたらした(表33)。治療及び対照群間の有意な差は、スチューデント両側t検定を使用して決定した(p<0.05)。
ヒト非小細胞肺癌細胞株、PC−9を接種されたBALB/cヌードマウス(Charles River)を、ISIS481549及びISIS481464で治療した。マウスの腫瘍の成長及びSTAT3標的の減少を評価した。
生後6から8週のメスのBALB/cヌードマウスに、7×106のPC−9ヒトNSCLC細胞を皮下接種した。150−200mm3の平均腫瘍体積を示すマウスを選択し、そして異なった治療群に無作為化した。7匹のマウスの二つの群に、6週間、毎週5回投与される25mg/kgのISIS481549又はISIS481464(125mg/kgの合計週当たり投与)を皮下注射した。7匹のマウスの一つの群に、6週間、毎週5回投与される25mg/kgのISIS347526(本明細書中で配列番号:1519と命名されるマウス又はヒト標的が未知のTCTTATGTTTCCGAACCGTT)(125mg/kgの合計週当たり投与)を皮下注射した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの最後の投与は、マウスが安楽死させられる24時間前に与えられた。
腫瘍を回収し、そしてRNAを、Qiagen RNAeasy Mini Kit(#74106)を使用して、製造業者のプロトコルによって単離した。STST3のmRNAレベルを、ABI StepOnePlus RT−PCR装置を、ヒトのプライマープローブセットRTS2033(順方向配列GAGGCCCGCCCAACA、本明細書中で配列番号:1520と命名;逆方向配列TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT、本明細書中で配列番号:1521と命名;プローブ配列CTGCCTAGATCGGC、本明細書中で配列番号:1522と命名)と共に使用して測定した。ハウスキーピング遺伝子、GAPDHのmRNAレベルを、ヒトのプライマープローブセット(順方向配列GAAGGTGAAGGTCGGAGTC、本明細書中で配列番号:1523と命名;逆方向配列GAAGATGGTGATGGGATTTC、本明細書中で配列番号:1524と命名;プローブ配列CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC、本明細書中で配列番号:1525と命名)で測定し、そしてRNAレベルを正規化するために使用した。結果を表34に提示し、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチドが、STAT3のmRNAレベルを減少させたことを示す。
腫瘍を、研究期間をとおして定期的に測定した。腫瘍成長の阻害(TGI)を、式:
TGI=[1−(STAT3のASO群(最終)のX))−STAT3のASO群(1日目)のX)/(対照のASO群(最終)のX−対照のASO群(1日目)のX))]×100、式中、X=平均腫瘍体積、を使用して計算した。
体重を、研究期間をとおして定期的に測定した。結果を表36に提示し、そして対照群と比較した治療群の体重の有意な変化がなかったことを示す。
免疫不全であるNOD.Cg−Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJマウス(NSG;JAX #5557)に、ヒト非小細胞肺癌細胞株、LG−476(Jackson Laboratory)を接種し、そしてISIS481464で治療した。マウスの腫瘍成長及びSTAT3標的の減少を評価した。
生後4から6週のメスのNSGマウスに、LG−476ヒトNSCLC細胞を皮下接種し、そして臨床観察、体重及び腫瘍体積のために毎週3回モニターした。腫瘍が1,000mm3に達した時点で、腫瘍を回収し、そして断片化した。3−5mm3の寸法の腫瘍断片を、30匹のNSGマウスの右後側腹部に皮下に移植した。マウスを、毎週3回モニターした。個々の腫瘍が200−250mm3に達した時点で、マウスを二つの群に無作為に割当て、そして3週間、毎週5回投与される25mg/kgのISIS481464又はPBS(125mg/kgの合計週当たり投与)を注射した。腫瘍を最後の投与後24時間に回収した。
腫瘍からの溶菌液を、ABIのStepOnePlus RT−PCR装置を、ヒト特異的プライマープローブセットRTS2033と共に使用して調製した。ハウスキーピング遺伝子、シクロフィリンのmRNAレベルを、ヒト特異的プライマープローブセット(順方向配列GACGGCGAGCCCTTGG、本明細書中で配列番号:1526と命名;逆方向配列TGCTGTCTTTGGGACCTTGTC、本明細書中で配列番号:1527と命名;プローブ配列CCGCGTCTCCTTTGAGCTGTTTGC、本明細書中で配列番号:1528と命名)で測定した。治療及び対照群の間の有意な差は、スチューデント両側t検定を使用して決定した(p<0.05)。
全細胞の溶菌液を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する氷冷の放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)緩衝液中で腫瘍をホモジナイズすることによって調製した。溶菌液を、STAT3抗体(Abcam Antibodies,#ab32500)を使用するウェスタンブロッティングによって分析した。ハウスキーピングタンパク質、シトクロムオキシダーゼII(COXII;#ab79393)及びサバイビン(#ab76424)も更に探査した。STAT3レベルを、COXIIタンパク質又はサバイビンタンパク質のいずれかに対して正規化し、そしてImageJソフトウェアを使用して定量化した。
腫瘍を、研究期間をとおして定期的に測定した。ISIS481464による治療は、PBS対照と比較して、概略39%の腫瘍体積の減少をもたらした。
先に記載した研究からのISIS481464を、更に非小細胞肺癌細胞株のPC9細胞中で異なった投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり3,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表37に規定したように0.02μM、0.1μM、0.5μM、2.5μM、及び10.0μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTST3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS2033(順方向配列GAGGCCCGCCCAACA、本明細書中で配列番号:1520と命名;逆方向配列TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT、本明細書中で配列番号:1521と命名;プローブ配列CTGCCTAGATCGGC、本明細書中で配列番号:1522と命名)をmRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、ヒトのプライマープローブセットHTS5002(順方向配列CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA、本明細書中で配列番号:1529と命名;逆方向配列GCCATGCCAATCTCATCTTGT、本明細書中で配列番号:1530と命名;プローブ配列CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA、本明細書中で配列番号:1531と命名)によって測定されるようなハウスキーピング遺伝子のベータアクチンの含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
先に記載した研究からのISIS481464を、更に前立腺癌細胞株のC42B細胞中で異なった投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり3,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表38に規定したように0.02μM、0.1μM、0.5μM、2.5μM、及び10.0μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTST3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS2033(順方向配列GAGGCCCGCCCAACA、本明細書中で配列番号:1520と命名;逆方向配列TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT、本明細書中で配列番号:1521と命名;プローブ配列CTGCCTAGATCGGC、本明細書中で配列番号:1522と命名)を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、ヒトのプライマープローブセットHTS5002(順方向配列CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA、本明細書中で配列番号:1529と命名;逆方向配列GCCATGCCAATCTCATCTTGT、本明細書中で配列番号:1530と命名;プローブ配列CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA、本明細書中で配列番号:1531と命名)によって測定されるようなハウスキーピング遺伝子のベータアクチンの含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
先に記載した研究からのISIS481464を、更に大腸直腸癌細胞株のColo201細胞中で異なった投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり3,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表39に規定したように0.02μM、0.1μM、0.5μM、2.5μM、及び10.0μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTST3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS2033(順方向配列GAGGCCCGCCCAACA、本明細書中で配列番号:1520と命名;逆方向配列TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT、本明細書中で配列番号:1521と命名;プローブ配列CTGCCTAGATCGGC、本明細書中で配列番号:1522と命名)を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、ヒトのプライマープローブセットHTS5002(順方向配列CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA、本明細書中で配列番号:1529と命名;逆方向配列GCCATGCCAATCTCATCTTGT、本明細書中で配列番号:1530と命名;プローブ配列CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA、本明細書中で配列番号:1531と命名)によって測定されるようなハウスキーピング遺伝子のベータアクチンの含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
先に記載した研究からのISIS481464を、更に乳癌細胞株のBT474M1細胞中で異なった投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり3,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表40に規定したように0.02μM、0.1μM、0.5μM、2.5μM、及び10.0μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTST3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS2033(順方向配列GAGGCCCGCCCAACA、本明細書中で配列番号:1520と命名;逆方向配列TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT、本明細書中で配列番号:1521と命名;プローブ配列CTGCCTAGATCGGC、本明細書中で配列番号:1522と命名)を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、ヒトのプライマープローブセットHTS5002(順方向配列CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA、本明細書中で配列番号:1529と命名;逆方向配列GCCATGCCAATCTCATCTTGT、本明細書中で配列番号:1530と命名;プローブ配列CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA、本明細書中で配列番号:1531と命名)によって測定されるようなハウスキーピング遺伝子のベータアクチンの含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
先に記載した研究からのISIS481464を、更に多発性骨髄腫細胞株のH929細胞中で異なった投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり10,000−12,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表41に規定したように0.01μM、0.5μM、2.5μM、及び10.0μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略72時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTST3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS2033(順方向配列GAGGCCCGCCCAACA、本明細書中で配列番号:1520と命名;逆方向配列TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT、本明細書中で配列番号:1521と命名;プローブ配列CTGCCTAGATCGGC、本明細書中で配列番号:1522と命名)を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、ヒトのプライマープローブセットHTS5002(順方向配列CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA、本明細書中で配列番号:1529と命名;逆方向配列GCCATGCCAATCTCATCTTGT、本明細書中で配列番号:1530と命名;プローブ配列CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA、本明細書中で配列番号:1531と命名)によって測定されるようなハウスキーピング遺伝子のベータアクチンの含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
先に記載した研究からのISIS481464を、更に多発性骨髄腫細胞株のMM1R細胞中で異なった投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり10,000−12,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表42に規定したように0.01μM、0.5μM、2.5μM、及び10.0μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略72時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTST3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS2033(順方向配列GAGGCCCGCCCAACA、本明細書中で配列番号:1520と命名;逆方向配列TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT、本明細書中で配列番号:1521と命名;プローブ配列CTGCCTAGATCGGC、本明細書中で配列番号:1522と命名)を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、ヒトのプライマープローブセットHTS5002(順方向配列CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA、本明細書中で配列番号:1529と命名;逆方向配列GCCATGCCAATCTCATCTTGT、本明細書中で配列番号:1530と命名;プローブ配列CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA、本明細書中で配列番号:1531と命名)によって測定されるようなハウスキーピング遺伝子のベータアクチンの含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
BALB/cヌードマウスに、ヒト卵巣癌細胞株、SK−OV3を接種し、そしてISIS481464又はISIS481549で治療した。ISIS481549は、マウスの配列と交差反応可能である(即ち、マウス配列にハイブリダイズする)。
ヒト卵巣癌SK−OV3細胞(概略100mm3)を、ヌードマウスに腹腔内注射した。10日後、マウスに、11週間、毎週2回投与される25mg/kgのISIS481464又はISIS481549を、皮下接種した。マウスを、最後の投与の24時間後安楽死させた。
溶菌液を、ヒトのプライマープローブセット(RTS2033)及びマウスのプライマリープローブセット(mSTAT3−LTS0664)を使用するSTAT3のmRNAレベルのRT−PCR分析においてRNA抽出キット(Invitrogen)を使用することによって調製した。結果を表43に示す。結果をPBS対照に対する、STAT3の阻害のパーセントとして示す。データは、ISISアンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療が、PBS対照と比較して、ヒト及びマウスのSTAT3のmRNAの両方の減少をもたらすことを示す。
リン酸化されたSTST3に対する抗体(Cell Signaling)を使用するSTAT3タンパク質レベルのウェスタンブロット分析のために、溶菌液を、RIPA緩衝液で調製した。結果を、図1に示す。データは、ISIS481549による治療が、PBS対照と比較して、リン酸化されたSTST3タンパク質の減少をもたらすことを示す。
マウスのプライマープローブセットmIL6−LTS00629を使用するIL−6のRT−PCR分析のために、溶菌液をRNA抽出キット(Invitrogen)を使用して調製した。データは、ISIS481549による治療が、PBS対照と比較して、IL−6のmRNAの両方の有意な減少をもたらすことを示す。
腫瘍を回収した。腫瘍の重量を測定し、そして結果を表45に示す。結果は、PBS対照の腫瘍重量のパーセントとして提示される。データは、ISIS481549による治療が、PBS対照と比較して、腫瘍重量の有意な減少をもたらすことを示す。
ヒト卵巣癌SK−OV3細胞(概略100mm3)を、ヌードマウスに皮下接種した。10日後、マウスに、6週間、毎週5回投与される50mg/kgのISIS481464、又は50mg/kgのISIS481464及びISIS481549の組合せのいずれかを、腹腔内接種した。マウスを、最後の投与の24時間後安楽死させた。
腫瘍を、ノギスを使用して定期的に測定し、そして腫瘍体積を、式、腫瘍体積=1/2(長さ×幅2)を使用して計算した。結果を図2に示す。データは、マウスのISIS481464及びISIS481549の組合せによる治療が、腫瘍の成長の有意な阻害をもたらすことを示す。
カニクイザルにおけるISIS481464の効力及び許容性を評価した。
オス及びメスのナイーブなカニクイザルを、五つの治療群に割当てた。それぞれ5匹のサルの三つの群は、研究の最初の週中の二日毎(1、3、5及び7日目)に3mg/kg、10mg/kg又は30mg/kgの負荷投与を、続いてその後毎週一回(14日目に開始)の投与を受けた。対照群の5匹のサルは、研究の最初の週中の二日毎(1、3、5及び7日目)にPBSを負荷投与として、続いてその後毎週一回(14日目に開始)の投与を受けた。これらの投与は、1時間の静脈内(i.v.)注入により投与された。5匹のサルの5番目の群は、研究の最初の週中の二日毎(1、3、5及び7日目)に皮下投与される30mg/kgの負荷投与を、続いてその後毎週一回(14日目に開始)の皮下(s.c.)投与を受けた。
肝臓の組織を、1%の2−メルカプトエタノール(Sigma)で補充された3mLのRLT溶菌緩衝液(Qiagen)中でホモジナイズした。RNAを、得られたホモジネートから、RNA精製のための、Qiagen RNeasyの96ウェルプレートを使用して、製造業者のプロトコルによって精製した。精製後、RNA試料を、Perkin−ElmerのABI Prism 7700配列決定装置及びSTAT3のプライマープローブセットRTS3235(順方向配列AAGTTTATCTGTGTGACACCAACGA、本明細書中で配列番号:1532と命名;逆方向配列CTTCACCATTATTTCCAAACTGCAT、本明細書中で配列番号:1533と命名;プローブ配列TGCCGATGTCCCCCCGCA、本明細書中で配列番号:1534と命名)を使用するRT−PCR分析にかけた。STAT3のmRNAレベルを、プライマープローブセットmk_cycloA_2nd(順方向配列TGCTGGACCCAACACAAATG、本明細書中で配列番号:1535と命名;逆方向配列TGCCATCCAACCACTCAGTC、本明細書中で配列番号:1536と命名;プローブ配列TTCCCAGTTTTTCATCTGCACTGCCAX、本明細書中で配列番号:1537と命名)を使用して定量化されたサルのシクロフィリンAに対して正規化した。
肝臓の組織を、プロテアーゼ及びホスファターゼの両方の阻害剤カクテル(Roche)を含有する1mLの氷冷のRIPA緩衝液(Sigma)中でホモジナイズした。全溶菌液を、Bis−Tris PAGE(Invitrogen)によって分離し、PVDFメンブランに移し、そしてSTAT3(Cell Signaling,#9132)及びGAPDH(Advanced Immunochemicals,#06−1−G4−C5)に対する一次抗体を使用して免疫ブロットした。免疫特異的バンドを、X線フィルムに暴露した後、Enhanced Chemiluminescence Plus検出キット(Amersham Biosciences)で検出した。次いでバンドの強度をスキャンし、そしてImageJソフトウェアを使用して定量化した。治療及び対照群間の有意な差は、スチューデントt検定を使用して決定した(p<0.05)。
肝機能に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、血液試料を全ての研究群から収集した。血液試料を、投与の48時間後の44日目に大腿静脈穿刺により収集した。血液試料(1mL)を、血清分離のために抗凝集剤を伴わずに試験管に収集した。試験管を室温で概略60分間保ち、そして次いで血清を得るために10分間3,000rpmで遠心した。各種の肝機能マーカーのレベルを、Toshiba 200FR NEO化学分析器(Toshiba Co.,Japan)を使用して測定した。ALT及びASTの血漿レベルを測定し、そして結果を、IU/Lで表示して、表48に示す。オス及びメスのサルのデータを別個に示す。結果は、ISIS481464による治療が、肝機能に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して予測した範囲外の影響を持たないことを示す。
腎機能に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、血液試料を全ての研究群から収集した。血液試料を、投与の48時間後の44日目に大腿静脈穿刺により収集した。血液試料(1mL)を、血清分離のために抗凝集剤を伴わずに試験管に収集した。試験管を室温で概略60分間保ち、そして次いで血清を得るために10分間3,000rpmで遠心した。各種の腎機能マーカーのレベルを、Toshiba 200FR NEO化学分析器(Toshiba Co.,Japan)を使用して測定した。結果を、mg/dLで表示して表49に示す。血漿の化学的データは、ISIS481464による治療が、腎機能に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して予測した範囲外のいずれもの影響を持たないことを示す。
ISISオリゴヌクレオチドのサルの全体的健康状態に対する影響を評価するために、体重を測定し、そして表50及び51に示す。結果は、ISIS481464による治療の体重に対する影響が、アンチセンスオリゴヌクレオチドに対して予測した範囲内であったことを示す。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、STAT3核酸を標的として設計し、そしてin vitroにおけるSTAT3のmRNAに対するその効果を試験した。ウェル当たり5,000個の細胞の密度の培養されたHuVEC細胞を、LipofectAMINE 2000(登録商標)試薬を使用して30nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。概略24時間の治療期間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトのプライマープローブセットRTS2033(順方向配列GAGGCCCGCCCAACA、本明細書中で配列番号:5と命名;逆方向配列TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT、本明細書中で配列番号:6と命名;プローブ配列CTGCCTAGATCGGC、本明細書中で配列番号:7と命名)を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されたような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
STAT3の有意なin vitroの阻害を示す実施例32に記載した研究からのギャップマーを、HuVEC細胞中で各種の投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり5,000個の細胞の密度でプレートに入れ、そしてLipofectAMINE2000(登録商標)試薬を使用して、表54に規定するように1.1nM、3.3nM、10.0nM、及び30.0nMの濃度のアンチセンスヌクレオチドで形質移入した。概略16時間の治療期間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199(順方向配列ACATGCCACTTTGGTGTTTCATAA、本明細書中で配列番号:6と命名;逆方向配列TCTTCGTAGATTGTGCTGATAGAGAAC、本明細書中で配列番号:7と命名;プローブ配列CAGTATAGCCGCTTCCTGCAAGAGTCGAA、本明細書中で配列番号:8と命名)を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されたような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
更なるギャップマーを、少なくとも50%の阻害を示す実施例1に提示したギャップマーに基づき設計した。これらのギャップマーを、本来のギャップマーの上流及び下流に僅かに移動した(即ち、“マイクロウォーク(microwalk)”)ギャップマーを作ることによって設計した。これらのギャップマーを、in vitroで試験した。ISIS337332も更に比較物質としてアッセイに含めた。ウェル当たり5,000個の細胞の密度の培養されたHuVEC細胞を、LipofectAMINE 2000(登録商標)試薬を使用して30nMのアンチセンスオリゴヌクレオチドで形質移入した。概略24時間の治療期間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。本明細書中に先に記載したヒトのプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されたような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。結果を表55に示す。
STAT3の有意なin vitroの阻害を示す実施例3に記載した研究からのギャップマーを、HuVEC細胞中で各種の投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり5,000個の細胞の密度でプレートに入れ、そしてLipofectAMINE2000(登録商標)試薬を使用して、表56に規定するように8.8nM、17.5nM、35.0nM、及び70.0nMの濃度のアンチセンスヌクレオチドで形質移入した。概略16時間の治療期間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。本明細書中で先に記載したヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されたような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
実施例3に記載した研究からのギャップマーを、HuVEC細胞中で各種の投与量で更に試験した。細胞を、ウェル当たり20,000個の細胞の密度でプレートに入れ、そして電気穿孔を使用して、表57に規定するように、187.5nM、375.0nM、750.0nM、1,500.0nM、3,000.0nM、及び6,000.0nMの濃度のアンチセンスヌクレオチドで形質移入した。概略16時間の治療期間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。本明細書中で先に記載した、ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されたような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
高いレベルの効力を示す39種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、in vivoの許容性に対して更に試験した。
CD1マウスを、記載されたISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで治療し、そして肝臓中のオリゴヌクレオチドの半減期を評価した。
それぞれ12匹のCD1マウスの複数の群に、50mg/kgのISIS455265、ISIS455269、ISIS455271、ISIS455272、ISIS455291、ISIS455371、ISIS455393、ISIS455553、ISIS455582、ISIS455703、ISIS455394、ISIS455429、ISIS455438、ISIS455471、ISIS455527、ISIS455530、ISIS455536、ISIS455540、ISIS455548、ISIS455611、ISIS455429、ISIS455463、ISIS455464、ISIS455471、ISIS455527、ISIS455611、ISIS465236、ISIS465237、ISIS465239、ISIS465588、ISIS465740、ISIS465742、ISIS465751、ISIS465752、ISIS465754、ISIS465830、ISIS466670、ISIS466718、及びISIS466720を、2週間、毎週2回皮下注射した。それぞれの群からの4匹のマウスを、3日目、28日目、及び56日目に、最後の投与後、犠牲にした。肝臓を分析のために回収した。
全長のオリゴヌクレオチドの濃度、並びに全てのオリゴヌクレオチド濃度(分解された形態を含む)を測定した。使用された方法は、以前に刊行された方法(Leeds et al.,1996;Geary et al.,1999)の改良であり、これは、フェノール−クロロホルム(液−液)抽出、それに続く固相抽出を含む。内部標準(ISIS355868、本明細書中で配列番号:2758と命名された27塩基長の2’−O−メトキシエチルで修飾されたホスホロチオエートオリゴヌクレオリド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT)を、抽出に先立ち加えた。組織試料の濃度を、概略1.14μg/gの定量化下限(LLOQ)の較正曲線を使用して計算した。次いで半減期を、WinNonlinソフトウェア(PHARSIGHT)を使用して計算した。
高いレベルの効力を示す23種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、in vivoの許容性に対して更に試験した。
Sprague−Dawleyラットを、ISISアンチセンスオリゴヌクレオチドで治療し、そしてオリゴヌクレオチドの半減期、並びにオリゴヌクレオチド分解並びに肝臓及び腎臓からの排除のための経過時間を評価した。
それぞれ4匹のSprague−Dawleyラットの複数の群に、20mg/kgのISIS455265、ISIS455269、ISIS455271、ISIS455272、ISIS455291、ISIS455371、ISIS455394、ISIS455703、ISIS455429、ISIS455471、ISIS455527、ISIS455530、ISIS455536、ISIS455548、ISIS455611、ISIS465236、ISIS465237、ISIS465588、ISIS465740、ISIS465754、ISIS465830、ISIS466670、及びISIS466720を2週間、毎週2回皮下注射した。最後の投与の3日後、ラットを犠牲にし、そして肝臓及び腎臓を分析のために収集した。
全長のオリゴヌクレオチドの濃度、並びに全てのオリゴヌクレオチド濃度(分解された形態を含む)を測定した。使用された方法は、以前に刊行された方法(Leeds et al.,1996;Geary et al.,1999)の改良であり、これは、フェノール−クロロホルム(液−液)抽出、それに続く固相抽出を含む。内部標準(ISIS355868、本明細書中で配列番号:2758と命名された27塩基長の2’−O−メトキシエチルで修飾されたホスホロチオエートオリゴヌクレオリド、GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT)を、抽出に先立ち加えた。組織試料の濃度を、概略1.14μg/gの定量化下限(LLOQ)の較正曲線を使用して計算した。全長のオリゴヌクレオチド濃度の腎臓と肝臓の比、並びに全てのオリゴヌクレオチド濃度のそれを計算した。結果を表59に示す。
実施例6−9に記載した齧歯類の許容性研究からのギャップマーを、SK−BR−3細胞中で異なった投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり4,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、いずれもの形質移入試薬を使用せずに、表60に規定するように、0.02μM、0.10μM、0.50μM、1.00μM、2.50μM、及び10.00μMの濃度のアンチセンスヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間の後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。本明細書中で先に記載した、ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されたような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
実施例6−10に記載した研究から選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度を、40cPより大きい粘度を有する選別されたアンチセンスヌクレオチドの援助により測定した。40cPより大きい粘度を有するオリゴヌクレオチドは、いずれもの対象に投与するために高すぎる粘度であるものである。
高いレベルの効力を示す9種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、カニクイザルにおいて更に試験した。肝臓及び腎臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの許容性及び薬物動態学的特性を評価した。
実施例12に記載した研究からのISISオリゴヌクレオチドを、MDA−MB−231細胞中で異なった投与量で更に試験した。細胞を、ウェル当たり4,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、いずれもの形質移入試薬を使用せずに、表62に規定するように、0.02μM、0.20μM、1.00μM、5.00μM、及び10.00μMの濃度のアンチセンスヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間の後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。本明細書中で先に記載した、ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されたような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。それぞれのオリゴヌクレオチドの最大半量阻害濃度(IC50)も、更に表62に示す。
実施例12に記載した研究からのISISオリゴヌクレオチドを、U251−MG細胞中で異なった投与量で更に試験した。細胞を、ウェル当たり4,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、いずれもの形質移入試薬を使用せずに、表63に規定するように、0.1μM、1.0μM、5.0μM、10.0μM、及び20.0μMの濃度のアンチセンスヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間の後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。本明細書中で先に記載した、ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されたような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。それぞれのオリゴヌクレオチドの最大半量阻害濃度(IC50)も、更に表63に示す。
実施例12に記載した研究からのISISオリゴヌクレオチドを、A431細胞中で異なった投与量で更に試験した。細胞を、ウェル当たり4,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、いずれもの形質移入試薬を使用せずに、表64に規定するように、0.02μM、0.2μM、1.0μM、5.0μM、及び10.0μMの濃度のアンチセンスヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間の後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。本明細書中で先に記載した、ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されたような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
実施例12に記載した研究からのISISオリゴヌクレオチドを、H460細胞中で異なった投与量で更に試験した。細胞を、ウェル当たり4,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、いずれもの形質移入試薬を使用せずに、表65に規定するように、0.02μM、0.20μM、1.00μM、5.00μM、及び10.00μMの濃度のアンチセンスヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間の後、RNAを細胞から単離し、そしてSTAT3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。本明細書中で先に記載した、ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS199を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、RIBOGREEN(登録商標)によって測定されたような全RNA含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
ヒトU251神経膠腫腫瘍細胞を接種されたBALB/cヌードマウスを、実施例12に記載した研究からのISISオリゴヌクレオチドで治療した。マウスにおける腫瘍成長に対する治療の効果を評価する。
BALB/cヌードマウスに、1×106個の腫瘍細胞を、皮下に移植した。移植の4日目、それぞれ4匹のマウスの複数の群に、3週間半、毎週5回腹腔内に注射される50mg/kgのISIS455269、ISIS455291、ISIS455371、ISIS455703、ISIS455429、ISIS465237、ISIS465754、ISIS465830、又はISIS466670を投与した。マウスの一つの群に、3週間半、毎週5回腹腔内に注射される50mg/kgの対照オリゴヌクレオチド、ISIS141923を投与した。マウスの一つの群に、3週間半、毎週5回腹腔内に注射されるPBSを投与した。
腫瘍の大きさを、ノギスを使用して二つの寸法で毎週2回測定し、そして腫瘍体積を、式:V=0.5×a×b2を使用して計算し、式中、a及びbは、それぞれ腫瘍の長径及び短径である。結果を表66に示す。データは、ISISオリゴヌクレオチドによる治療が、腫瘍の成長を有意に妨害することを示す。‘n/a’は、その時点でデータ点が入手不可能であったことを示す。
ヒト乳癌細胞MDA−MB−231を接種されたBALB/cヌードマウスを、ISIS455291で治療した。マウスにおける腫瘍成長に対する治療の効果及び許容性を評価した。
研究を、Pharmaron Inc(Beijing,P.R.China)で行った。BALB/cヌードマウスを、Beijing HFK Bio−Technology Co.,Ltd.から得た。MDA−MB−231ヒト乳癌細胞を、10%の熱不活化胎児ウシ血清、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、及び2mMのL−グルタミンで補充されたLeibovitz’s L−15培地中で単層培養物としてin vitroで維持した。細胞を、空気中の5%CO2の雰囲気中で37℃で維持した。腫瘍細胞を、トリプシン−EDTA処理を伴って週2回ルーチン的に継代培養した。指数増殖期で増殖中の細胞を回収し、そして腫瘍接種のために計数した。
RNAを、本明細書中に記載したプライマープローブセットRTS199を使用する、ヒトSTAT3のmRNAレベルのリアルタイムPCR分析のために、腫瘍組織から抽出した。マウスのSTAT3のmRNAレベルも、更にプライマープローブセットmSTAT3_LTS00664(順方向配列CGACAGCTTCCCCATGGA、本明細書中で配列番号:1513と命名;逆方向配列ATGCCCAGTCTTGACTCTCAATC、本明細書中で配列番号:1514と命名;プローブ配列CTGCGGCAGTTCCTGGCACCTT、本明細書中で配列番号:1515と命名)を使用して測定した。結果を、PBS対照に対する、シクロフィリンに対して正規化されたSTAT3の阻害のパーセントとして示す。表67に示すように、ISIS455291による治療は、PBS対照と比較して、ヒト及びマウスのSTAT3のmRNAの両方の減少をもたらした。
腫瘍の大きさを、週2回、ノギスを使用して二つの寸法で測定し、そして腫瘍の体積を、式:V=0.536×a×b2を使用して計算し、式中、a及びbは、それぞれ腫瘍の長径及び短径である。腫瘍の大きさは、T−C及びTV/CV値の計算のために使用した。T−Cは、Tを治療群の腫瘍が所定の大きさ(900mm3)に達するために必要な中位時間(日数)とし、そしてCを対照群の腫瘍が同じ大きさに達するための中位時間(日数)として計算した。TV/CV値(パーセントとして表示)は、ISISオリゴヌクレオチドの抗腫瘍有効性の表示であり、ここで、TV及びCVは、所定の日(32日目)における治療及び対照群のそれぞれの平均体積であった。
動物の全体的健康状態に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、体重を、治療期間中定期的に測定した。データを表70に提示し、そしてISIS455291による治療が、マウスの全体的体重に影響しないことを示す。
ヒト類表皮癌細胞A431を接種されたBALB/cヌードマウスを、ISIS455291で治療した。マウスにおける腫瘍成長に対する治療の効果及び許容性を評価した。
研究を、Pharmaron Inc(Beijing,P.R.China)で行った。BALB/cヌードマウスを、Beijing HFK Bio−Technology Co.,Ltd.から得た。A431ヒト類表皮癌細胞を、10%の熱不活化胎児ウシ血清、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、及び2mMのL−グルタミンで補充されたDMEM培地中で単層培養物としてin vitroで維持した。細胞を、空気中の5%CO2の雰囲気中で37℃で維持した。腫瘍細胞を、トリプシン−EDTA処理を伴って週2回ルーチン的に継代培養した。指数増殖期で増殖中の細胞を回収し、そして腫瘍接種のために計数した。
RNAを、本明細書中に記載したプライマープローブセットRTS199を使用する、ヒトSTAT3のmRNAレベルのリアルタイムPCR分析のために、腫瘍組織から抽出した。マウスのSTAT3のmRNAレベルも、更にプライマープローブセットmSTAT3_LTS00664を使用して測定した。結果を、PBS対照に対する、シクロフィリンに対して正規化されたSTAT3の阻害のパーセントとして示す。表71に示すように、ISIS455291による治療は、PBS対照と比較して、ヒト及びマウスのSTAT3のmRNAの両方の減少をもたらした。
腫瘍の大きさを、週2回、ノギスを使用して二つの寸法で測定し、そして腫瘍の体積を、式:V=0.5×a×b2を使用して計算し、式中、a及びbは、それぞれ腫瘍の長径及び短径である。腫瘍の大きさは、T−C及びTV/CV値の計算のために使用した。T−Cは、Tを治療群の腫瘍が所定の大きさ(800mm3)に達するために必要な中位時間(日数)とし、そしてCを対照群の腫瘍が同じ大きさに達するための中位時間(日数)として計算した。TV/CV値(パーセントとして表示)は、ISISオリゴヌクレオチドの抗腫瘍有効性の表示であり、ここで、TV及びCVは、所定の日(33日目)における治療及び対照群のそれぞれの平均体積であった。
動物の全体的健康状態に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、体重を、治療期間中定期的に測定した。データを表74に提示し、そしてISIS455291による治療が、マウスの全体的体重に影響しないことを示す。
ヒトNCI−460ヒトNSCLCを接種されたBALB/cヌードマウスを、ISIS455291で治療した。マウスにおける腫瘍成長に対する治療の効果及び許容性を評価した。
研究を、Pharmaron Inc(Beijing,P.R.China)で行った。BALB/cヌードマウスを、Beijing HFK Bio−Technology Co.,Ltd.から得た。NCI−H464ヒトNSCLC細胞を、10%の熱不活化胎児ウシ血清、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、及び2mMのL−グルタミンで補充されたRPMI−1640培地中で単層培養物としてin vitroで維持した。細胞を、空気中の5%CO2の雰囲気中で37℃で維持した。腫瘍細胞を、トリプシン−EDTA処理を伴って週2回ルーチン的に継代培養した。指数増殖期で増殖中の細胞を回収し、そして腫瘍接種のために計数した。
腫瘍の大きさを、週2回、ノギスを使用して二つの寸法で測定し、そして腫瘍の体積を、式:V=0.5×a×b2を使用して計算し、式中、a及びbは、それぞれ腫瘍の長径及び短径である。腫瘍の大きさは、T−C及びTV/CV値の計算のために使用した。T−Cは、Tを治療群の腫瘍が所定の大きさ(1,500mm3)に達するために必要な中位時間(日数)とし、そしてCを対照群の腫瘍が同じ大きさに達するための中位時間(日数)として計算した。TV/CV値(パーセントとして表示)は、ISISオリゴヌクレオチドの抗腫瘍有効性の表示であり、ここで、TV及びCVは、所定の日(20日目)における治療及び対照群のそれぞれの平均体積であった。
動物の全体的健康状態に対するISISオリゴヌクレオチドの影響を評価するために、体重を、治療期間中定期的に測定した。データを表77に提示し、そしてISIS455291による治療が、マウスの全体的体重に影響しないことを示す。
ヒト神経膠芽腫細胞で同所性に移植されたNU/Jマウスを、CAGCAGATCAAGTCCAGGGA(配列番号:1590 の配列を有する5−10−5ギャップマーのISIS455291で治療した。マウスにおける腫瘍の成長に対する器量の効果及び許容性を評価した。
30匹のNU/Jマウスに、5×105個のU−87MG−luc2細胞を右前頭葉に定位的に移植した。腫瘍細胞移植後の15日目に、これらの15匹のマウスに、2μLのPBS中に溶解された100μgのISIS455291を腫瘍移植の部位にボーラス注射で頭蓋内投与した。残りの15匹のマウスに、2μLのPBSを腫瘍移植の部位にボーラス注射で頭蓋内投与した。
腫瘍移植後の18日目に、それぞれの群からの5匹のマウスを、CO2吸入によって安楽死させ、そして脳の試料をRNA分析のために収集した。RNAを、本明細書中で先に記載したプライマープローブセットRTS199を使用するヒトSTAT3のmRNAレベルのリアルタイムPCR分析のために、腫瘍組織から抽出した。ISIS455291による治療は、PBS対照と比較して、腫瘍細胞中のヒトSTAT3のmRNAの27%の減少をもたらした。
先に記載した研究からのISIS455703及びISIS455291を、非小細胞肺癌細胞株のPC9細胞中で異なった投与量で更に試験した。細胞を、ウェル当たり3,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表78に規定したように0.02μM、0.1μM、0.5μM、2.5μM、及び10.0μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTST3のmRNAレベルを、定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS2033(順方向配列GAGGCCCGCCCAACA、本明細書中で配列番号:1520と命名;逆方向配列TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT、本明細書中で配列番号:1521と命名;プローブ配列CTGCCTAGATCGGC、本明細書中で配列番号:1522と命名)をmRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、ヒトのプライマープローブセットHTS5002(順方向配列CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA、本明細書中で配列番号:1529と命名;逆方向配列GCCATGCCAATCTCATCTTGT、本明細書中で配列番号:1530と命名;プローブ配列CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA、本明細書中で配列番号:1531と命名)によって測定されるようなハウスキーピング遺伝子のベータアクチンの含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
先に記載した研究からのISIS455291を、更に前立腺癌細胞株のC42B細胞中で異なった投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり3,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表79に規定したように0.02μM、0.1μM、0.5μM、2.5μM、及び10.0μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTST3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS2033(順方向配列GAGGCCCGCCCAACA、本明細書中で配列番号:1520と命名;逆方向配列TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT、本明細書中で配列番号:1521と命名;プローブ配列CTGCCTAGATCGGC、本明細書中で配列番号:1522と命名)を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、ヒトのプライマープローブセットHTS5002(順方向配列CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA、本明細書中で配列番号:1529と命名;逆方向配列GCCATGCCAATCTCATCTTGT、本明細書中で配列番号:1530と命名;プローブ配列CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA、本明細書中で配列番号:1531と命名)によって測定されるようなハウスキーピング遺伝子のベータアクチンの含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
先に記載した研究からのISIS455291を、更に大腸直腸癌細胞株のColo201細胞中で異なった投与量で試験した。細胞を、ウェル当たり3,000個の細胞の密度でプレートに入れた。細胞を、表80に規定したように0.02μM、0.1μM、0.5μM、2.5μM、及び10.0μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。概略24時間後、RNAを細胞から単離し、そしてSTST3のmRNAレベルを定量的リアルタイムPCRによって測定した。ヒトSTAT3のプライマープローブセットRTS2033(順方向配列GAGGCCCGCCCAACA、本明細書中で配列番号:1520と命名;逆方向配列TTCTGCTAATGACGTTATCCAGTTTT、本明細書中で配列番号:1521と命名;プローブ配列CTGCCTAGATCGGC、本明細書中で配列番号:1522と命名)を、mRNAレベルを測定するために使用した。STAT3のmRNAレベルを、ヒトのプライマープローブセットHTS5002(順方向配列CGGACTATGACTTAGTTGCGTTACA、本明細書中で配列番号:1529と命名;逆方向配列GCCATGCCAATCTCATCTTGT、本明細書中で配列番号:1530と命名;プローブ配列CCTTTCTTGACAAAACCTAACTTGCGCAGA、本明細書中で配列番号:1531と命名)によって測定されるようなハウスキーピング遺伝子のベータアクチンの含有量によって調節した。結果を、非治療の対照細胞に対するSTAT3の阻害のパーセントとして示す。
Claims (21)
- 配列番号:245の核酸塩基配列の少なくとも12個の連続する核酸塩基の部分を含んでなる核酸塩基配列を有する、12ないし30個の結合されたヌクレオシドからなる一本鎖修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる一本鎖化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、配列番号:245の配列を含んでなる、請求項1に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が、配列番号:245の配列からなる、請求項1に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 前記オリゴヌクレオチドが、16個の結合されたヌクレオシドからなる、請求項1−3のいずれか1項に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 少なくとも一つのヌクレオシド間結合が、修飾ヌクレオシド間結合である、請求項1−4のいずれか1項に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- それぞれのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項1−5のいずれか1項に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 少なくとも一つのヌクレオシドが、修飾糖を含んでなる、請求項1−6のいずれか1項に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 少なくとも一つの修飾糖が、二環式糖である、請求項7に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 前記二環式糖が、4’−CH2−O−2’架橋又は4’−CH(CH3)−O−2’架橋を含んでなる、請求項8に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 前記修飾糖が、2’−O(CH2)2−OCH3基又は2’−O−CH3基を含んでなる、請求項7に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 少なくとも一つのヌクレオシドが、修飾核酸塩基を含んでなる、請求項1−10のいずれか1項に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 前記修飾核酸塩基が、5’−メチルシトシンである、請求項11に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 前記修飾オリゴヌクレオチドが:
1ないし5個の結合したヌクレオシドからなる5’−ウイング;
1ないし5個の結合したヌクレオシドからなる3’−ウイング;
8ないし12個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップ;
を含んでなり;そして
ここで、5’−ウイング及び3’−ウイングの少なくとも一方が、少なくとも一つの二環式ヌクレオシド又は一つの2’−置換ヌクレオシドを含んでなる;
請求項1−12のいずれか1項に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。 - 前記修飾オリゴヌクレオチドが:
1ないし5個の結合したヌクレオシドからなる5’−ウイング;
1ないし5個の結合したヌクレオシドからなる3’−ウイング;
8ないし12個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップ;
を含んでなり;そして
ここで、5’−ウイング及び3’−ウイングの少なくとも一方が、少なくとも一つの二環式ヌクレオシド及び少なくとも一つの2’−置換ヌクレオシドを含んでなる;
請求項1−12のいずれか1項に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。 - 前記修飾オリゴヌクレオチドが:
3個の結合したヌクレオシドからなる5’−ウイング;
3個の結合したヌクレオシドからなる3’−ウイング;
10個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップ;
を含んでなり;
ここで、5’−ウイング及び3’−ウイングのそれぞれの各ヌクレオシドが、拘束エチルヌクレオシドを含んでなり;
ここで、それぞれのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合であり;そして
ここで、それぞれのシトシンが、5’−メチルシトシンである;
請求項1−12のいずれか1項に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。 - 配列番号:245の核酸塩基配列を有する16個の結合したヌクレオシドからなる一本鎖修飾オリゴヌクレオチドを含んでなる化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは:
3個の結合したヌクレオシドからなる5’−ウイング;
3個の結合したヌクレオシドからなる3’−ウイング;
10個の結合された2’−デオキシヌクレオシドからなる5’−ウイング及び3’−ウイング間のギャップ;
を含んでなり;
ここで、5’−ウイング及び3’−ウイングのそれぞれの各ヌクレオシドが、拘束エチルヌクレオシドを含んでなり;
ここで、それぞれのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合であり;そして
ここで、それぞれのシトシンが、5’−メチルシトシンである;
前記化合物又はその医薬的に受容可能な塩。 - 前記一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる、請求項1−16のいずれか1項に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 動物における過剰増殖性疾病の治療用である、請求項1−17のいずれか1項に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 動物における過剰増殖性疾病の治療用である、請求項1−18のいずれか1項に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 前記過剰増殖性疾病が癌である、請求項18又は19に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩。
- 請求項1−20のいずれか1項に記載の化合物又はその医薬的に受容可能な塩及び医薬的に受容可能な希釈剤又は担体を含んでなる医薬組成物。
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