JP7383249B2 - β-1,3-1,6-グルカンの測定方法 - Google Patents
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本願は、2019年11月20日に日本国に出願された特願2019-209679号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
[1] 被験試料中のβ-グルカンと、β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と、β-(1→6)結合と特異的に結合する分子とを混合し、前記β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と前記β-(1→6)結合と特異的に結合する分子とを含む複合体を形成する工程と、
前記複合体を検出する工程と、
前記検出の結果に基づいて前記被験試料中のβ-1,3-1,6-グルカンの量を測定する工程と、
を備える、β-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
[2] 前記β-(1→6)結合と特異的に結合する分子が、β-1,6-グルカナーゼの酵素失活変異体及び抗β-1,6-グルカン抗体からなる群から選択される1種以上である、前記[1]のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
[3] 前記β-(1→3)結合と特異的に結合する分子が、カブトガニ由来G因子又はその変異体、デクチン1の糖鎖認識ドメイン含有タンパク質又はその変異体、β-グルカン認識タンパク質又はその変異体、β-1,3-グルカナーゼの酵素失活変異体、及び抗β-1,3-グルカン抗体からなる群から選択される1種以上である、前記[1]又は[2]のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
[4] 前記複合体を検出する工程の前に、前記複合体から、前記β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と前記β-(1→6)結合と特異的に結合する分子の少なくとも一方を除去する、前記[1]~[3]のいずれかのβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
[5] 前記β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と前記β-(1→6)結合と特異的に結合する分子の少なくとも一方が標識物質によって標識されており、前記複合体の検出を、前記標識物質から発するシグナルを検出することにより行う、前記[1]~[4]のいずれかのβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
[6] 前記β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と前記β-(1→6)結合と特異的に結合する分子の一方が前記標識物質によって標識されており、残る他方が固相担体に固定されている、前記[5]のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
[7] 前記固相担体が磁気ビーズである、前記[6]のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
[8] 前記固相担体がビオチン結合分子によって修飾されており、前記β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と前記β-(1→6)結合と特異的に結合する分子のうち、前記固相担体に固定されている分子がビオチン修飾分子である、前記[6]又は[7]のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
[9] 前記標識物質が、発光物質である、前記[5]~[8]のいずれかのβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
[10] 前記標識物質が、蛍光物質である、前記[9]のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
[11] 前記複合体の検出を、走査分子計数法により行う、前記[1]~[10]のいずれかのβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
[12] 被験動物から採取された生体試料を被験試料として、前記[1]~[11]のいずれかのβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法を行い、前記被験試料中のβ-1,3-1,6-グルカンの量を測定する工程と、
前記測定で得られた前記被験試料中のβ-1,3-1,6-グルカンの量に基づいて、前記被験動物が真菌に感染している可能性を評価する工程と、
を備える、真菌の感染可能性の評価方法。
[13] β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と、β-(1→6)結合と特異的に結合する分子とを含む、β-1,3-1,6-グルカン測定用キット。
また、本発明に係るβ-1,3-1,6-グルカン測定用キットを用いることにより、当該β-1,3-1,6-グルカンの測定方法をより簡便に行うことができる。
なお、FCSやFIDA、SSMCは、例えば、MF20(オリンパス社製)等の公知の一分子蛍光分析システム等を用いて、常法により行うことができる。
また、FIDAにより、共焦点光学系における焦点領域に存在している分子の蛍光強度の揺らぎを検出した後、統計解析を行うことによって、測定試料溶液中のβ-1,3グルカン結合分子とβ-1,6グルカン結合分子の両方を含む複合体由来の蛍光物質の分子数を算出することができる。
また、SSMCにより、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、溶液内において前記光学系の光検出領域の位置を移動させながら、当該光検出領域からの蛍光を検出することにより、測定試料溶液中に遊離しているβ-1,3グルカン結合分子とβ-1,6グルカン結合分子の両方を含む複合体由来の蛍光物質の分子数を算出することができる。
以降の実験に用いたカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)可溶性β-グルカン(CSBG)は、以下の通りに調製した。
カンジダ・アルビカンスIFO 1385アセトン脱脂乾燥菌体(2g)を、0.1MのNaOH溶液に懸濁させ、NaClOを加えて4℃にて一昼夜酸化処理を行った。酸化処理後、遠心処理(12000rpm、15分間)し、沈殿を回収した。回収された沈殿をエタノール及びアセトンで洗浄した後、乾燥させることによって、カンジダ粒子状β-グルカンであるOX-CA(NaClO-oxidized Candida cell wall beta-glucan)を得た。さらに、OX-CAをDMSOに懸濁させ、超音波処理した後、遠心処理することによって得られた上清からCSBGを得た。
以降の実験に用いたアスペルギルス・スピーシーズ(Aspergillus spp.)可溶性β-グルカン(ASBG)は、以下の通りに調製した。
Aspergillus spp.アセトン脱脂乾燥菌糸体(2g)を0.1MのNaOH溶液に懸濁させ、NaClOを加えて4℃にて一昼夜酸化処理を行った。酸化処理後、遠心処理(12000rpm、15分間)し、沈殿を回収した。回収された沈殿をエタノール及びアセトンで洗浄した後、乾燥させることによって、アスペルギルス不溶性グルカン画分であるOX-Asp(NaClO-oxidized Aspergillus cell wall glucan)を得た。さらに、OX-Aspを8Mのウレアに懸濁させ、オートクレーブ処理(121℃、20分間)を行い、遠心処理することによって得られた上清からASBGを得た。
以降の実験に用いたスギ花粉由来の可溶性β-グルカン(Pollen BG)は、以下の通りに調製した。
スギ花粉(Wako社製)5gを、1.0Lの0.1M 炭酸水素ナトリウム水溶液に懸濁させ、次いでスターラーで30分間混和(室温)した後、4℃にて6,500g、5分間遠心処理することによって上清を回収した。回収された上清をさらに遠心処理(8,000g、5分間)し、上清を回収した。回収された上清を、0.20μmのPESメンブランフィルターを用いてろ過し、ろ液を粗抽出物として4℃で保存した。当該粗抽出物を、S-BGRP固定化Hi-Trapカラム(BGRPカラム、1mL gel)(GEヘルスケア社製)に通過させ、吸着後、PBSでBGRPカラムを洗浄した。吸着物を0.03MのNaOH 5mLで溶出し、溶出液に0.1Mのクエン酸緩衝液(pH3)を添加することによって中和した。中和した溶出液を、1.0Lの精製水で4回透析外液を交換しながら透析(透析膜:スペクトラポアRC透析チューブMWCO1000)し、非透析性画分を-80℃で凍結した後、凍結乾燥することによってPollen BGを得た。
β-1,3グルカン結合分子として蛍光修飾したS-BGRPを用い、β-1,6グルカン結合分子としてビオチン修飾したβ-1,6-グルカナーゼの酵素失活変異体を用いて、由来の異なる3種のβ-グルカンの検出を行った。β-1,6-グルカナーゼの酵素失活変異体としては、アカパンカビ由来β-1,6-グルカナーゼの第321番目のグルタミン酸をアラニンに置換した変異体を用いた。
20μ秒<[ピーク幅]<400μ秒
[ピーク強度]>1(フォトン/10μ秒)
[相関係数]>0.90
従来法であるリムルス反応を用いた検査方法により、実施例1で使用した3種のβ-グルカンの検出を行った。検査には、ファンギテック(登録商標)GテストMK II(ニッスイ社製)を用いて行った。各種β-グルカンを1000pg/mLに調製することによって測定を行った時の測定結果(標準物質パキマン相当)を表1に示す。
走査分子計数法による計測に代えて蛍光強度測定を行った以外は実施例1と同様にして、蛍光修飾S-BGRPとビオチン修飾アカパンカビ由来β-1,6-グルカナーゼE321変異体を用いて、3種のβ-グルカンの検出を行った。
実施例1と同様にして、蛍光修飾S-BGRPとビオチン修飾アカパンカビ由来β-1,6-グルカナーゼE321変異体を用いて、各種免疫グロブリン製剤に含まれるβ-グルカンの測定を行った。免疫グロブリン製剤としては、ベニロン(VENI)(帝人ファーマ社製)、ヴェノグロブリン 5%(VENO 5%)(日本血液製剤機構製)、ガンマガード(GAMM)(MEDLEY社製)、グロベニン(GLOV)(日本製薬社製)、及びサングロポール(SANG)(CSLベーリング社製)を用いた。
β-1,3グルカン結合分子としてビオチン修飾したS-BGRPを用い、β-1,6グルカン結合分子として蛍光修飾したβ-1,6-グルカナーゼの酵素失活変異体を用いて、β-グルカンの検出を行った。β-1,6-グルカナーゼの酵素失活変異体としては、アカパンカビ由来β-1,6-グルカナーゼE321変異体を用いた。
ヒト血清にCSBGを添加して、その添加回収率(%)を算出することにより、ヒト血清がβ-1,3-1,6-グルカンの測定に与える影響を確認した。実施例1と同様にして、蛍光修飾S-BGRPとビオチン修飾アカパンカビ由来β-1,6-グルカナーゼE321変異体を用いた。また、ヒト血清(BioIVT社製)は3種類を用いた。
β-1,3グルカン結合分子として蛍光修飾したBmBGRPを用い、β-1,6グルカン結合分子としてビオチン修飾したβ-1,6-グルカナーゼの酵素失活変異体を用いて、CSBGの検出を行った。具体的には、β-グルカンとしてCSBGを用い、Alexa Fluor 647修飾S-BGRPに代えてAlexa Fluor 647修飾BmBGRPを用いた以外は、実施例1と同様にして走査分子計数法による計測を行い、CSBGの検出を行った。
β-1,3グルカン結合分子として蛍光修飾したS-BGRPを用い、β-1,6グルカン結合分子としてビオチン修飾した抗β-1,6グルカン抗体を用いて、CSBGの検出を行った。具体的には、β-グルカンとしてCSBGを用い、ビオチン修飾したβ-1,6-グルカナーゼの酵素失活変異体に代えてビオチン修飾した抗β-1,6グルカン抗体を用いたこと、及びリン酸バッファー(1×PBS、1% BSA)に対し前記抗β-1,6グルカン抗体を1μg/mLになるように添加したこと以外は、実施例1と同様にして走査分子計数法による計測を行い、CSBGの検出を行った。
Claims (11)
- 被験試料中のβ-グルカンと、β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と、β-(1→6)結合と特異的に結合する分子とを混合し、前記β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と前記β-(1→6)結合と特異的に結合する分子とを含む複合体を形成する工程と、
前記複合体を、β-(1→3)結合を有するがβ-(1→6)結合は有していない分子及びβ-(1→6)結合を有するがβ-(1→3)結合は有していない分子と区別して検出する工程と、
前記検出の結果に基づいて前記被験試料中のβ-1,3-1,6-グルカンの量を測定する工程と、
を備え、
前記β-(1→3)結合と特異的に結合する分子が、β-(1→3)結合と特異的に結合するカブトガニ由来G因子又はその変異体、β-(1→3)結合と結合可能だが、その他のβ-グルコシド結合とは結合しないβ-グルカン認識タンパク質又はその変異体、β-1,3-グルカナーゼの酵素失活変異体、及び抗β-1,3-グルカン抗体からなる群から選択される1種以上であり、
前記β-(1→6)結合と特異的に結合する分子が、β-(1→6)結合と特異的に結合するβ-1,6-グルカナーゼの酵素失活変異体、及び抗β-1,6-グルカン抗体からなる群から選択される1種以上である、β-1,3-1,6-グルカンの測定方法。 - 前記β-(1→3)結合と結合可能だが、その他のβ-グルコシド結合とは結合しないβ-グルカン認識タンパク質が、S-BGRP又はBmBGRPである、請求項1に記載のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
- 前記β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と前記β-(1→6)結合と特異的に結合する分子の少なくとも一方が標識物質によって標識されており、前記複合体の検出を、前記標識物質から発するシグナルを検出することにより行う、請求項1又は2に記載のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
- 前記β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と前記β-(1→6)結合と特異的に結合する分子の一方が前記標識物質によって標識されており、残る他方が固相担体に固定されている、請求項3に記載のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
- 前記固相担体が磁気ビーズである、請求項4に記載のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
- 前記固相担体がビオチン結合分子によって修飾されており、前記β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と前記β-(1→6)結合と特異的に結合する分子のうち、前記固相担体に固定されている分子がビオチン修飾分子である、請求項4又は5に記載のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
- 前記標識物質が、発光物質である、請求項3~6のいずれか一項に記載のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
- 前記標識物質が、蛍光物質である、請求項7に記載のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
- 前記複合体の検出を、走査分子計数法により行う、請求項1~8のいずれか一項に記載のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法。
- 被験動物(但し、ヒトを除く)から採取された生体試料を被験試料として、請求項1~9のいずれか一項に記載のβ-1,3-1,6-グルカンの測定方法を行い、前記被験試料中のβ-1,3-1,6-グルカンの量を測定する工程と、
前記測定で得られた前記被験試料中のβ-1,3-1,6-グルカンの量に基づいて、前記被験動物が真菌に感染している可能性を評価する工程と、
を備える、真菌の感染可能性の評価方法。 - β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と、β-(1→6)結合と特異的に結合する分子とを含み、
前記β-(1→3)結合と特異的に結合する分子と前記β-(1→6)結合と特異的に結合する分子のうちの何れか一方は固相担体と結合可能であり、他方は検出可能な標識物質と結合されており、
前記β-(1→3)結合と特異的に結合する分子が、β-(1→3)結合と特異的に結合するカブトガニ由来G因子又はその変異体、β-(1→3)結合と結合可能だが、その他のβ-グルコシド結合とは結合しないβ-グルカン認識タンパク質又はその変異体、β-1,3-グルカナーゼの酵素失活変異体、及び抗β-1,3-グルカン抗体からなる群から選択される1種以上であり、
前記β-(1→6)結合と特異的に結合する分子が、β-(1→6)結合と特異的に結合するβ-1,6-グルカナーゼの酵素失活変異体、及び抗β-1,6-グルカン抗体からなる群から選択される1種以上である、β-1,3-1,6-グルカン測定用キット。
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