JP5930814B2 - 肝炎予防又は治療剤 - Google Patents
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Description
項1.
セサミノールを含有する肝炎予防又は治療剤。
項2.
前記肝炎が、アルコール性肝炎である、請求項1に記載の肝炎予防又は治療剤。
項3.
経口剤である、請求項1又は2に記載の肝炎予防又は治療剤。
項A−1.
セサミノールを含有する肝細胞傷害抑制剤。
項A−2.
セサミノールを含有する肝細胞生存率向上剤。
項A−3.
セサミノールを含有する肝細胞過酸化脂質蓄積抑制剤。
項A−4.
セサミノールを含有する肝細胞活性酸素産生抑制剤。
項B.
アルコール性肝炎患者を対象とする、請求項A−1〜A−4のいずれかに記載の剤。
項C.
経口剤である、請求項請求項A−1〜Bのいずれかに記載の剤。
が例示される。中でも、アルコール性肝炎が好ましい。
調製例
Paenibacillus sp. KB0549株(寄託番号:FERM P-21057)をゴマ脱脂粕(竹本油脂製)で培養させることにより、ゴマ脱脂粕中に含まれるセサミノール配糖体からセサミノールを製造した。具体的には、次のようにして行った。
HPLC:HITACHI LaChrom
カラム:Wakosil-II 5C18HG(φ4.6*250mm、和光純薬)
展開溶媒:A;10%アセトニトリル+0.1%トリフルオロ酢酸、B;80%アセトニトリル+0.1%トリフルオロ酢酸、Bを10%〜100%の直線勾配(40分間)で展開。
流速:0.8ml/min
分析波長:280nm
セサミノールおよびセサミノール関連化合物の標準試料によって検量線を作成することで、当該高濃縮液中のセサミノールおよびセサミノール関連化合物の同定や含量算出を行った。
なお、さらに溶媒抽出やシリカゲルによるカラム精製、ゲル濾過精製などの手法を用いることで、さらにセサミノール含有割合を高めることもできる。
10〜13週齢のWistar系雄性ラットの肝臓を門脈に留置したカテーテルを用いてコラゲナーゼ液で灌流した後、肝臓を採取して細分することによって細胞浮遊液を得た。その浮遊液を低速遠心することにより、分離した肝細胞を得た。
実施例2.アルコール性肝炎モデルラットのALT活性の検討
<実験動物の調製>
10〜13週齢のWistar系雄性ラットに予備飼育として、コントロール食および水道水を1週間自由摂取させた。
上記のようにして得た各群ラットの血漿を用い、血漿中に含まれるALT活性の測定を行った。当該測定は、キット「トランスアミナーゼ CII‐テストワコー」(和光純薬)を用いて行った。当該キットは、POP・TOOS法に基づいてALT活性を測定するキットである。具体的な測定手順を図2に示す。また、測定結果を図3に示す。
上述の各群のラットの、肝臓中α-SMA量の測定を行った。肝臓中α-SMA量は肝線維化の指標となる。測定にはWestern blotting法を用いた。Western blotting法のためのサンプル調製およびWestern blotting法は、以下に示した通りに行った。
試験管(15×160 mm)に肝小片0.3±0.05 gと9倍量のライシスバッファーを加えた。氷冷しながらホモジナイザー(POLYTRON PT 1600 E)で30秒間ホモジナイズした。ホモジネートを遠心分離し(3000 rpm、4℃、10分間)、細胞残渣と核を沈降させた。液表面の油分を除去した後、上清を超純水で100倍希釈してタンパク定量用サンプルとした。
タンパク質定量用サンプル100 ml、又は標準溶液(1 mg/ml BSA)と、タンパク色素液(セルバブルーG)2.9 mlを混合し、紫外可視分光光度計(SHIMADZU, UVmini-1240)を用いて波長595 nmで吸光度を測定した。
タンパク質量を揃えた各サンプルを、 ライシスバッファーで適当に希釈したホモジネートと×2 サンプルバッファーを1:1で混合した。これをゲルにアプライし、電気泳動してから、セミドライ ブロッティング装置(BIO-RAD, Trans-Blot SD)を用いて18 Vで50分間通電し、メンブレンにタンパク質を転写した。メンブレンを超純水で洗浄した後、ブロッキングバッファーに浸漬させてブロッキングを行った(4℃、一晩)。その後、TBS-Tで洗浄し、一次抗体を反応させた(1時間)。用いた一次抗体は次のとおりである。(βチューブリンはコントロールとして用いるため検出した。)
Mouse Anti-Human Smooth Muscle Actin, Clone 1A4 (DakoCytomation)
Tubulin beta rabbit polyclonal antibody (Thermo scientific)
一次抗体反応後、TBS-Tで洗浄し、さらに二次抗体を反応させた(1時間)。用いた二次抗体は以下の通りである。
Anti-mouse IgG biotin conjugated(Dako)
そして、二次抗体反応後、TBS-Tで洗浄し、Streptavidin/HRP(Dako)を反応させ(1時間)、TBS-Tで1回洗浄し、さらにTBSで洗浄した後、DAB発色液により発色させた。さらに、当該発色の(α-SMA/β-tubulin)比を求めた。
エラスティカ・ワン・ギーソン(EVG)染色により、上述の各群のラットの肝臓組織を染色した。EVG染色は結合組織を染色する手法であり、細胞質が黄色、弾性線維が黒紫色、膠原線維は赤色、核が紫色に染色される。
実施例1と同様にして、各種肝細胞を培養した。すなわち、培地中のエタノール濃度が100 mMになるようにエタノールを添加して24時間培養(本培養)することによって、アルコール性肝炎モデル肝細胞を作製するとともに、エタノールを加える際、併せてセサミノール(0.01μg/mLまたは0.05μg/mL)を添加して培養した肝細胞も作製し、さらに、エタノールを全く添加しない以外は同様に培養した肝細胞(コントロール)も作製した。
実施例5とほぼ同様にして得た各培養細胞を用いて、活性酸素の産生量を検討した。具体的には、蛍光顕微鏡写真により活性酸素(H2O2)の発現を2’, 7’-Dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA)を用いて検出した。DCFH-DAは細胞内に散在されると、細胞内エステラーゼにより脱アセチル化し非蛍光型 2’, 7’-Dichlorodihydrofluorescin (DCFH) になり、更に活性酸素により素早く酸化され、強く蛍光する 2’, 7’Dichlorodihydrofluorescein (DCF)に変化することから、当該蛍光を測定することで、活性酸素の産生量を解析することができる。
0.001%セサミノール摂食群(1S群)と0.005%セサミノール摂食群(5S群)の代わりに0.00001%セサミノール摂食群(0.01S群:0.00001%セサミノール食+5%エタノール+CCl4)と0.0001%セサミノール摂食群(0.1S群:0.0001%セサミノール食+5%エタノール+CCl4)を設けた以外は、上記表1に示したように群分けして、上記と同様にラットを飼育し、各群の体重増加量(Weight gain)、摂食量(Food intake)、及び摂食効率(Food efficiency)を測定した。体重および摂食量は2日おきに測定した。体重増加量は飼育終了時の体重から飼育開始時の体重を差し引いた量で表した。摂食量は、飼育期間中における1日平均摂食量を体重100gあたりで表した。摂食効率は体重増加量を総摂食量で除した値で表した。
0.001%セサミノール摂食群(1S群)と0.005%セサミノール摂食群(5S群)の代わりに0.00001%セサミノール摂食群(0.01S群:0.00001%セサミノール食+5%エタノール+CCl4)と0.0001%セサミノール摂食群(0.1S群:0.0001%セサミノール食+5%エタノール+CCl4)を設けた以外は、実施例3と同様にして、各群のラットの、肝臓中α-SMA量の測定を行った。結果を図10に示す。なお、図10の縦軸の単位「Density (arbitrary unit)」は、「Density (α-SMA/β-tubulin)」と同義である。
0.001%セサミノール摂食群(1S群)と0.005%セサミノール摂食群(5S群)の代わりに0.00001%セサミノール摂食群(0.01S群:0.00001%セサミノール食+5%エタノール+CCl4)と0.0001%セサミノール摂食群(0.1S群:0.0001%セサミノール食+5%エタノール+CCl4)を設けた以外は、実施例2の<血漿中ALT活性の検討>と同様にして、ALT活性を測定した。さらに、トランスアミナーゼ CII‐テストワコー(和光純薬工業株式会社)を用いて、AST活性も測定した。
Claims (3)
- セサミノールを含有する肝炎予防又は治療剤。
- 前記肝炎が、アルコール性肝炎である、請求項1に記載の肝炎予防又は治療剤。
- 経口剤である、請求項1又は2に記載の肝炎予防又は治療剤。
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JP2011129521 | 2011-06-09 | ||
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