JP5928774B2 - Antidiarrheal inhibitor of irritable bowel syndrome containing β-1,3-glucan, abdominal pain improving agent, and hyperalgesic improving agent in the large intestine - Google Patents

Description

本発明は、過敏性腸症候群の下痢抑制、過敏性腸症候群の腹痛改善、及び大腸における痛覚過敏を抑制するための、β-１，３-グルカンの使用に関する。   The present invention relates to the use of β-1,3-glucan for suppressing diarrhea in irritable bowel syndrome, improving abdominal pain in irritable bowel syndrome, and suppressing hyperalgesia in the large intestine.

過敏性腸症候群（irritable bowel syndrome; ＩＢＳ）とは、大腸組織に器質的な病変が認められないにも関わらず、腹痛・腹部不快感をともなう慢性的な排便異常（便秘あるいは下痢）を生じる機能性消化管疾患である。ＩＢＳは、その症状より、下痢型、便秘型、混合型および分類不明型に分類されている。
先進国において、ＩＢＳの有病率は全人口の約１０〜２０％に達するいわれており、極めて高頻度な消化器疾患であると言われている。また、ＩＢＳの症状は、患者の生活の質や労働生産性を著しく低下させるなど大きな社会問題となっている。 Irritable bowel syndrome (IBS) is a function that causes chronic defecation abnormalities (constipation or diarrhea) with abdominal pain and discomfort despite the absence of organic lesions in the colon tissue. It is a sex digestive tract disease. IBS is classified into diarrhea type, constipation type, mixed type and unclassified type according to its symptoms.
In developed countries, the prevalence of IBS is said to reach about 10 to 20% of the total population, and is said to be an extremely frequent gastrointestinal disease. In addition, the symptoms of IBS have become a major social problem, such as significantly reducing the quality of life and labor productivity of patients.

ＩＢＳの薬物療法として、ポリカルボフィルカルシウムなどの高分子重合体、若しくはマレイン酸トリメブチンなどの消化管運動調節薬を処方して、症状が改善されない場合には、その症状に応じて、乳酸菌製剤、下剤・抗コリン薬などが投与する方法が知られている。しかしながら、これらの方法では、症状の改善が不十分であり、有効性も低かった（非特許文献１）。一方、セロトニン受容体拮抗薬として、アロセトロン等の下痢型ＩＢＳ治療薬が上市されており、比較的高い有効性が報告されているが、重篤な便秘や虚血性大腸炎などの副作用をなすことが報告されている（非特許文献２）。従って、安全かつ効果的な過敏性腸症候群の症状の予防又は改善剤が求められている   As a pharmacotherapy for IBS, a high molecular weight polymer such as polycarbophil calcium, or a gastrointestinal motility regulator such as trimebutine maleate is prescribed, and if the symptoms are not improved, a lactic acid bacteria preparation, Methods for administering laxatives and anticholinergic drugs are known. However, with these methods, the improvement of symptoms is insufficient and the effectiveness is low (Non-Patent Document 1). On the other hand, diarrhea type IBS therapeutic drugs such as allosetron have been marketed as serotonin receptor antagonists, and relatively high efficacy has been reported, but they have side effects such as severe constipation and ischemic colitis. Has been reported (Non-Patent Document 2). Accordingly, there is a need for a safe and effective preventive or ameliorating agent for irritable bowel syndrome.

一方、β-グルカンは、きのこやカビが産生する細胞壁の成分として古くから知られており、天然物由来の有用な健康食品として利用されてきた。β-グルカンは、免疫賦活活性から抗癌や抗癌転移効果（非特許文献３）や炎症性反応の低減にも効果があることが知られている（非特許文献４）。
また、特許文献１には、抗がん剤の経口投与と共に、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを経口投与することにより、抗癌剤の副作用である小腸粘膜障害、及び下痢が抑制されたことが記載されている。このようにβ-グルカンは、免疫賦活作用を通した炎症反応の低減により、種々の疾病に対して効果を示すことが報告されている。しかしながら、過敏性腸症候群における下痢や腹痛・腹部不快感の症状を改善するとの報告はされていない。また、大腸における痛覚過敏を改善するとの報告もされていない。 On the other hand, β-glucan has long been known as a component of cell walls produced by mushrooms and molds, and has been used as a useful health food derived from natural products. It is known that β-glucan is also effective in reducing anti-cancer and anti-cancer metastasis effects (Non-patent Document 3) and inflammatory reaction due to its immunostimulatory activity (Non-Patent Document 4).
Patent Document 1 discloses that oral administration of an anticancer agent and oral administration of β-1,3-1,6-D-glucan suppresses small intestinal mucosal damage and diarrhea that are side effects of the anticancer agent. It has been described. Thus, it has been reported that β-glucan has an effect on various diseases by reducing the inflammatory reaction through the immunostimulatory action. However, it has not been reported to improve the symptoms of diarrhea, abdominal pain and abdominal discomfort in irritable bowel syndrome. There is also no report of improving hyperalgesia in the large intestine.

特開２０１０−９００７０号公報JP 2010-90070 A

心療内科,8,21-27,2004Psychosomatic Medicine, 8, 21-27, 2004 Ａｍ J Gastroentero,97(11suppl),S7-S26,2002Am J Gastroentero, 97 (11suppl), S7-S26, 2002 Immunity,19(3),311-315Immunity, 19 (3), 311-315 Shock 27(4),397-401Shock 27 (4), 397-401

本発明は、安全かつ効果的な過敏性腸症候群の下痢抑制剤、及び腹痛改善剤を提供することを課題とする。また、本発明は、安全かつ効果的な大腸における痛覚過敏改善剤を提供することを課題とする。   An object of the present invention is to provide a safe and effective antidiarrheal agent for irritable bowel syndrome and an abdominal pain ameliorating agent. Another object of the present invention is to provide a safe and effective agent for improving hyperalgesia in the large intestine.

本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、β-１,３-グルカンが過敏性腸症候群における排便異常を改善、及び腹痛を改善することを見出した。また、β-１,３-グルカンが、大腸における痛覚過敏を低減することを見出した。多糖がこれらの作用を有することは、これまで知られていない。本発明はこれらの知見に基づき完成されたものであり、以下の過敏性腸症候群の下痢抑制剤、腹痛改善剤、及び大腸における痛覚過敏改善剤を提供する。   The present inventors have repeated researches to solve the above-mentioned problems, and have found that β-1,3-glucan improves defecation abnormality in irritable bowel syndrome and improves abdominal pain. It was also found that β-1,3-glucan reduces hyperalgesia in the large intestine. It has not been known so far that polysaccharides have these actions. The present invention has been completed based on these findings, and provides the following diarrhea inhibitor, abdominal pain improving agent, and hyperalgesia improving agent in the large intestine of the irritable bowel syndrome.

項１. β-１,３-グルカンを含む過敏性腸症候群の下痢抑制剤。
項２. β-１,３-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンである項１に記載の剤。
項３. β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである項１又は２に記載の剤。
項４. β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである項１〜３に記載の剤。
項５. オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である項４に記載の剤。
項６. β-１,３-グルカンを含む過敏性腸症候群の腹痛改善剤。
項７. β-１,３-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンである項６に記載の剤。
項８. β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである項６又は７に記載の剤。
項９. β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである項６〜８に記載の剤。
項１０. オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である項９に記載の剤。
項１１. β-１,３-グルカンを含む大腸における痛覚過敏改善剤。
項１２. β-１,３-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンである項１１に記載の剤。
項１３. β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである項１１又は１２に記載の剤。
項１４. β-１,３-１,６-グルカンが、オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-グルカンである項１１〜１３に記載の剤。
項１５. オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６）である項１４に記載の剤。 Item 1. A diarrhea inhibitor for irritable bowel syndrome comprising β-1,3-glucan.
Item 2. The agent according to Item 1, wherein β-1,3-glucan is β-1,3-1,6-D-glucan.
Item 3. β-1,3-1,6-glucan having a degree of branching of β-1,6 bond with respect to β-1,3 bond is 50 to 100% Item 3. The agent according to Item 1 or 2, wherein
Item 4. The agent according to Items 1 to 3, wherein the β-1,3-1,6-glucan is β-1,3-1,6-glucan produced by an aureobasidium microorganism.
Item 5. The agent according to Item 4, wherein the microorganism of the genus Aureobasidium is Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain (FERM P-19285) or GM-NH-1A2 strain (FERM P-19286). .
Item 6. An abdominal pain ameliorating agent for irritable bowel syndrome comprising β-1,3-glucan.
Item 7. The agent according to Item 6, wherein β-1,3-glucan is β-1,3-1,6-D-glucan.
Item 8. β-1,3-1,6-glucan having a degree of branching of β-1,6 bond with respect to β-1,3 bond is 50 to 100% Item 8. The agent according to Item 6 or 7, wherein
Item 9. The agent according to Items 6 to 8, wherein the β-1,3-1,6-glucan is β-1,3-1,6-glucan produced by a microorganism of the genus Aureobasidium.
Item 10. The agent according to Item 9, wherein the microorganism belonging to the genus Aureobasidium is Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain (FERM P-19285) or GM-NH-1A2 strain (FERM P-19286). .
Item 11. An agent for improving hyperalgesia in the large intestine containing β-1,3-glucan.
Item 12. The agent according to Item 11, wherein β-1,3-glucan is β-1,3-1,6-D-glucan.
Item 13. β-1,3-1,6-glucan having a degree of branching of β-1,6 bond with respect to β-1,3 bond is 50 to 100% Item 13. The agent according to Item 11 or 12, wherein
Item 14. The agent according to Items 11 to 13, wherein the β-1,3-1,6-glucan is β-1,3-1,6-glucan produced by a microorganism belonging to the genus Aureobasidium.
Item 15. The agent according to Item 14, wherein the microorganism belonging to the genus Aureobasidium is Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain (FERM P-19285) or GM-NH-1A2 strain (FERM P-19286). .

β-１,３-グルカンは、セロトニン及びアセチルコリン等に起因する排便異常の症状を改善する。即ち、過敏性腸症候群の排便異常、及び腹痛を予防又は改善剤として有用である。また、本発明の剤は、大腸のおける痛覚過敏に対して、効果的に症状を改善することから、腹痛・腹部不快感を伴う慢性的な便通異常を生じる機能性消化管疾患の予防又は改善剤などとして有用である。   β-1,3-glucan improves the symptoms of abnormal bowel movement caused by serotonin and acetylcholine. That is, it is useful as an agent for preventing or improving irritable bowel syndrome defecation and abdominal pain. In addition, since the agent of the present invention effectively improves symptoms against hyperalgesia in the large intestine, prevention or improvement of functional gastrointestinal diseases that cause chronic bowel movement abnormalities accompanied by abdominal pain and abdominal discomfort It is useful as an agent.

実験例で得たオーレオバシジウム・プルランス由来のグルカンの^１Ｈ ＮＭＲスペクトルである。It is a ¹ H NMR spectrum of glucan derived from Aureobasidium pullulans obtained in an experimental example. 実験例で得たオーレオバシジウム・プルランス由来のグルカンの超音波照射したときの培養液の粒度分布を示す図である。It is a figure which shows the particle size distribution of a culture solution when ultrasonically irradiating the glucan derived from an aureobasidium pullulans obtained in the experiment example. 図Ａは、低分子β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが、５-ＨＴ（セロトニン）による排便異常を抑制したことを示す図である。図Ｂは、低分子β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが、ベタネコールによる排便異常を抑制したことを示す図である。図Ｃは、低分子β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが、ひまし油による排便異常を抑制したことを示す図である。FIG. A is a diagram showing that low molecular weight β-1,3-1,6-D-glucan suppressed the defecation abnormality caused by 5-HT (serotonin). FIG. B is a diagram showing that the low molecular weight β-1,3-1,6-D-glucan suppressed defecation abnormalities caused by betanecol. FIG. C is a diagram showing that the low molecular weight β-1,3-1,6-D-glucan suppressed the defecation abnormality caused by castor oil. オーレオバシジウム・プルランス由来のβ-グルカンが大腸における異常便排出による痛みを改善、及び低下させたことを示す図である。It is a figure which shows that the β-glucan derived from Aureobasidium pullulans improved and decreased pain due to abnormal stool excretion in the large intestine. オーレオバシジウム・プルランス由来のβ-グルカンが大腸における痛覚過敏を低下させたことを示す図である。It is a figure which shows that the β-glucan derived from Aureobasidium pullulans reduced hyperalgesia in the large intestine.

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の過敏性腸症候群の下痢抑制剤、腹痛改善剤、及び大腸における痛覚過敏改善剤は、β-１,３-グルカンを有効成分として含む。
β-１,３-グルカン
β-１,３-グルカンとしては、β-１,３-Ｄ-グルカン、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン、β-１,３-１,４-Ｄ-グルカンなどが挙げられる。中でも、β-１,３-１，６-Ｄ-グルカンが好ましい。
これらのβ-１,３-グルカンは、酵母、担子菌（キノコ）類、かび類、乳酸菌、その他微生物等の細胞壁に大量に含まれている。また、β-１,３-グルカンを菌体外へ分泌する菌体も知られている。さらに、大麦、カラスムギ等のイネ科植物にも大量に含まれていることも知られている。中でも、オーレオバシジウム属微生物はβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを主に生産するので、オーレオバシジウム属微生物由来のβ-１,３-グルカンが好ましい。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The diarrhea suppressant, abdominal pain improving agent, and hyperalgesia improving agent in the large intestine of the present invention contain β-1,3-glucan as an active ingredient.
β-1,3-glucan β-1,3-glucan includes β-1,3-D-glucan, β-1,3-1,6-D-glucan, β-1,3-1,4 -D-glucan and the like. Of these, β-1,3-1,6-D-glucan is preferable.
These β-1,3-glucans are contained in large amounts in cell walls of yeast, basidiomycetes (mushrooms), fungi, lactic acid bacteria, and other microorganisms. In addition, cells that secrete β-1,3-glucan to the outside of the cells are also known. Furthermore, it is also known that it is contained in large amounts in gramineous plants such as barley and oats. Among them, the Aureobasidium microorganisms mainly produce β-1,3-1,6-D-glucan, and therefore β-1,3-glucans derived from Aureobasidium microorganisms are preferable.

β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンにおいて、主鎖のβ-１,３結合数に対する側鎖のβ-１，６結合数の比率である分岐度は、通常約５０〜１００％、好ましくは約７５〜１００％、より好ましくは約８５〜１００％であればよい。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが上記分岐度を有することは、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンをエキソ型のβ-１，３-グルカナーゼ（キタラーゼ Ｍ、ケイアイ化成製）で加水分解処理した場合に分解生成物としてグルコースとゲンチオビオースが遊離すること、及びＮＭＲの積算比から確認できる（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。 In β-1,3-1,6-D-glucan, the degree of branching, which is the ratio of the number of β-1,6 bonds in the side chain to the number of β-1,3 bonds in the main chain, is usually about 50 to 100%. , Preferably about 75 to 100%, more preferably about 85 to 100%.
β-1,3-1,6-D-glucan has the above-mentioned degree of branching because β-1,3-1,6-D-glucan is converted into exo-type β-1,3-glucanase (kitalase M, It can be confirmed from the release of glucose and gentiobiose as degradation products when hydrolyzed by KAI Kasei Co., Ltd., and the integration ratio of NMR (supervised by Tadayuki Imanaka, development of the use of microorganisms, 1012-1015, NT)・ S (2002).

上記の分岐度を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、好ましくは２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下のものである。上記粘度の下限値は通常１０ｃＰ（ｍＰａ・s）程度であり得る。
本発明において、粘度は、ＢＭ型回転粘度計を用いて測定した値である。 The β-1,3-1,6-D-glucan having the above-mentioned degree of branching preferably has a viscosity of an aqueous solution at 30 ° C., pH 5.0, and concentration 0.5 (w / v%), preferably 200 cP (mPa · m). s) or less, more preferably 100 cP (mPa · s) or less, and still more preferably 50 cP (mPa · s) or less. The lower limit of the viscosity is usually about 10 cP (mPa · s).
In the present invention, the viscosity is a value measured using a BM type rotational viscometer.

(a)オーレオバシジウム属微生物が生産するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物由来のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、菌体外に分泌されるため、キノコ類やパン酵母の細胞壁に含まれるβ-グルカンと比べて、回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のグルカンから分子量が数万程度の低分子のグルカンまでを培養条件に応じて産生することができる。 (a) β-1,3-1,6-D- produced by microorganisms belonging to the genus Aureobasidium sp. produced by microorganisms belonging to the genus Aureobasidium Glucan has two signals in a ¹ H NMR spectrum of a solution using 1N sodium hydroxide heavy aqueous solution as a solvent, about 4.7 ppm and about 4.5 ppm. Since it is well known that NMR measurement values change due to subtle changes in conditions and are accompanied by errors, “about 4.7 ppm” and “about 4.5 ppm” are measured values within the normally expected range. A numerical value including a fluctuation range (for example, ± 0.2).
Since β-1,3-1,6-D-glucan produced by microorganisms of the genus Aureobasidium is secreted outside the fungus body, compared to β-glucan contained in the cell walls of mushrooms and baker's yeast, It is preferable in that it can be easily recovered and is water-soluble. Aureobasidium microorganisms can produce high-molecular-weight glucans having a molecular weight of 1 million or more to low-molecular-weight glucans having a molecular weight of about tens of thousands according to the culture conditions.

中でも、培養液が比較的低粘度であること、及びβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを高生産する点で、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)が生産するものが好ましく、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれＦＥＲＭ
Ｐ-１９２８５及びＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６として寄託済み）が産生するものが好ましい。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）Ｋ-１株の変異株である。オーレオバシジウム属Ｋ-１株は、分子量２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生することが知られている。
また、オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、通常、硫黄含有基を有するところ、Ｋ-１株の産生するβ-グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株が生産するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンもスルホ酢酸基を有すると考えられる。オーレオバシジウム属微生物の中には、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基などを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生する菌種、菌株も存在する。
ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上５０〜２５０万の高分子量のβ-グルカン（微粒子グルカン）とメインピークが見かけ上２〜３０万の低分子量のβ-グルカンの両方を産生する菌株である。この微粒子状グルカンは、一次粒子径が０．０５〜２μｍ程度である。 Among them, those produced by Aureobasidium pullulans are preferable in that the culture solution has a relatively low viscosity and produces high β-1,3-1,6-D-glucan. Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain or GM-NH-1A2 strain (incorporated administrative agency National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
P-19285 and FERM P-19286) have been produced. The GM-NH-1A1 and GM-NH-1A2 strains are mutants of the Aureobasidium sp. K-1 strain. The Aureobasidium genus K-1 strain is known to produce two types of β-1,3-1,6-D-glucan having a molecular weight of 2 million or more and about 1 million.
Moreover, β-1,3-1,6-D-glucan produced by microorganisms belonging to the genus Aureobasidium usually has a sulfur-containing group, whereas β-glucan produced by K-1 strain has a sulfoacetic acid group. (Arg. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983)), science and industry, 64, 131-135 (1990)). It is considered that β-1,3-1,6-D-glucan produced by the GM-NH-1A1 strain and the GM-NH-1A2 strain also has a sulfoacetic acid group. Among microorganisms belonging to the genus Aureobasidium, there are also species and strains that produce β-1,3-1,6-D-glucan containing a phosphorus-containing group such as a phosphate group, a malate group, and the like.
The GM-NH-1A1 and GM-NH-1A2 strains have a high molecular weight β-glucan (particulate glucan) having an apparent main peak of 500 to 2.5 million and an apparent peak of 2 to 2 as shown in the Examples. It is a strain that produces both 300,000 low molecular weight β-glucan. The fine particle glucan has a primary particle diameter of about 0.05 to 2 μm.

β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの溶解度は、ｐＨ及び温度に依存する。このβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、ｐＨ３．５、温度２５℃の条件で２ｍｇ／ｍｌ水溶液を調製しようとすると、その５０重量％以上が一次粒子径０．０５〜２μｍの微粒子を形成し、残部は水に溶解する。本発明において粒子径は、レーザー回折散乱法により測定した値である。
オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンも、水溶液にしたときの粘度が、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンより低いものが好ましい。この低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が、通常２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらにより好ましくは１０ｃＰ以下である。 The solubility of β-1,3-1,6-D-glucan depends on pH and temperature. This β-1,3-1,6-D-glucan has a primary particle diameter of 0.05 to 2 μm when it is intended to prepare a 2 mg / ml aqueous solution at pH 3.5 and a temperature of 25 ° C. Fine particles are formed, and the remainder is dissolved in water. In the present invention, the particle diameter is a value measured by a laser diffraction scattering method.
Β-1,3-1,6-D-glucan produced by Aureobasidium microorganisms also has a viscosity when made into an aqueous solution, which is a natural β-1,3-1,6 produced by Aureobasidium microorganisms. Those lower than -D-glucan are preferred. This low-viscosity β-1,3-1,6-D-glucan has an aqueous solution with a viscosity of usually 200 cP (mPa · s) or less at 30 ° C., pH 5.0 and a concentration of 0.5 (w / v%). More preferably 100 cP (mPa · s) or less, still more preferably 50 cP (mPa · s) or less, and even more preferably 10 cP or less.

この低粘度グルカンは、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと同様の一次構造を有し得る。具体的には、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の^１ＨＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、金属イオン濃度が、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの固形分１ｇ当たり０．４ｇ以下であることが好ましく、０．２ｇ以下であることがより好ましく、０．１ｇ以下であることがさらにより好ましい。原料β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが水溶液状態のものである場合は、金属イオン濃度は、水溶液の１００ｍｌ当たり１２０ｍｇ以下であることが好ましく、５０ｍｇ以下であることがより好ましく、２０ｍｇ以下であることがさらにより好ましい。 This low-viscosity glucan may have the same primary structure as natural β-1,3-1,6-D-glucan produced by an Aureobasidium microorganism. Specifically, the ¹ HNMR spectrum of a solution using 1N sodium hydroxide heavy aqueous solution as a solvent has two signals of about 4.7 ppm and about 4.5 ppm. Since it is well known that NMR measurement values change due to subtle changes in conditions and are accompanied by errors, “about 4.7 ppm” and “about 4.5 ppm” are measured values within the normally expected range. A numerical value including a fluctuation range (for example, ± 0.2).
β-1,3-1,6-D-glucan preferably has a metal ion concentration of 0.4 g or less per gram of solid content of β-1,3-1,6-D-glucan. It is more preferably 2 g or less, and even more preferably 0.1 g or less. When the raw material β-1,3-1,6-D-glucan is in an aqueous solution state, the metal ion concentration is preferably 120 mg or less per 100 ml of the aqueous solution, more preferably 50 mg or less, Even more preferably, it is 20 mg or less.

ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第３〜第５族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。
金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形で使用する場合は、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。 The metal ions referred to here include alkali metal ions, alkaline earth metal ions, Group 3 to Group 5 metal ions, transition metal ions, and the like. Include alkali-derived potassium ions, sodium ions and the like used in the production of low viscosity β-1,3-1,6-D-glucan. The metal ion concentration can be adjusted by ultrafiltration or dialysis.
When the metal ion concentration is in the above range, β-1,3-1,6-D-glucan gelation, aggregation, and precipitation are unlikely to occur when stored in an aqueous solution or when sterilized by heating in an aqueous solution. . Further, when used in solid form, aggregation or the like hardly occurs when re-dissolving.

(b)オーレオバシジウム属微生物によるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの生産方法
分岐度５０〜１００％のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、例えば、これを産生する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することにより沈殿物として得ることができる。
また、オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生させる方法は種々報告されている。培養培地に使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源等を挙げることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源等を挙げることができる。場合によってはβ-グルカンの産生量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類等を添加するのも有効な方法である。
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生することが報告されている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）；科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを生産するものであればよく、特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。 (b) Production method of β-1,3-1,6-D-glucan by microorganisms belonging to the genus Aureobasidium β-1,3-1,6-D-glucan having a degree of branching of 50 to 100% is, for example, It can be obtained as a precipitate by adding an organic solvent to the culture supernatant of a microorganism that produces sucrose.
Various methods for producing β-1,3-1,6-D-glucan by culturing microorganisms belonging to the genus Aureobasidium have been reported. Examples of the carbon source that can be used in the culture medium include carbohydrates such as sucrose, glucose, and fructose, and organic nutrient sources such as peptone and yeast extract. Examples of the nitrogen source include inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, sodium nitrate, and potassium nitrate. In some cases, inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, phosphate, magnesium salt, calcium salt, trace metal salts such as iron, copper, manganese, and vitamins are used as appropriate to increase the production of β-glucan. It is also an effective method to add a kind or the like.
Aureobasidium microorganisms are reported to produce high concentrations of β-1,3-1,6-D-glucan when cultured in a medium containing ascorbic acid in a Zapec medium containing sucrose as a carbon source (Arg. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983)); Science and Industry, 64, 131-135 (1990); JP-A-7-51082). However, the medium is not particularly limited as long as the microorganism grows and produces β-1,3-1,6-D-glucan. If necessary, organic nutrient sources such as yeast extract and peptone may be added.

オーレオバシジウム属の微生物を上記培地で好気培養するための条件としては、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の温度条件、３〜７程度、好ましくは３．５〜５程度のｐＨ条件等が挙げられる。
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御することも可能である。更に培養液の消泡のために適宜、消泡剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度、好ましくは１〜４日間程度であり、これによりβ-グルカンを産生することが可能である。なお、β-グルカンの産生量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを主成分とするβ−グルカン多糖が０．１％(ｗ/ｖ)〜数％（ｗ/ｖ）含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ([ｍＰａ・s])から数千ｃＰ（[ｍＰａ・s]）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを沈殿物として得ることができる。 Conditions for aerobic culture of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium in the above medium are about 10 to 45 ° C, preferably about 20 to 35 ° C, about 3 to 7, preferably about 3.5 to 5. PH conditions and the like.
In order to effectively control the culture pH, it is also possible to control the pH of the culture solution with an alkali or an acid. Furthermore, you may add an antifoamer suitably for the defoaming of a culture solution. The culture time is usually about 1 to 10 days, preferably about 1 to 4 days, whereby β-glucan can be produced. The culture time may be determined while measuring the production amount of β-glucan.
When microorganisms belonging to the genus Aureobasidium are cultured under aeration and agitation for about 4 to 6 days under the above conditions, β-glucan polysaccharide containing β-1,3-1,6-D-glucan as a main component is 0.1% in the culture solution. % (W / v) to several% (w / v), and the viscosity of the culture solution is several hundred cP ([mPa · s]) at 30 ° C. using a BM type rotational viscometer (manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd.). ) To several thousand cP ([mPa · s]). By adding, for example, an organic solvent to the supernatant obtained by centrifuging this culture, β-1,3-1,6-D-glucan can be obtained as a precipitate.

＜低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造方法＞
上記の高粘度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加してもよい。例えば、水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が好ましくは０．５％(ｗ/ｖ)以上、より好ましくは１．２５％(ｗ/ｖ)以上になるように添加すればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。 <Method for producing low viscosity β-1,3-1,6-D-glucan>
When an alkali is added to the above-described culture solution containing β-1,3-1,6-D-glucan having high viscosity while stirring at room temperature, the viscosity is drastically decreased.
The alkali is not particularly limited as long as it is water-soluble and can be used as a pharmaceutical or food additive. For example, an alkali carbonate aqueous solution such as a calcium carbonate aqueous solution, a sodium carbonate aqueous solution, a potassium carbonate aqueous solution, or an ammonium carbonate aqueous solution; an alkali hydroxide aqueous solution such as a sodium hydroxide aqueous solution, a potassium hydroxide aqueous solution, or a calcium hydroxide aqueous solution; or an ammonia aqueous solution is used. it can. The alkali may be added so that the pH of the culture solution is 12 or more, preferably 13 or more. For example, when using sodium hydroxide to increase the pH of the culture solution, the final concentration of sodium hydroxide is preferably 0.5% (w / v) or more, more preferably 1.25% (w / v) What is necessary is just to add so that it may become above. When alkali is added to the culture solution and stirred well, the viscosity of the culture solution decreases instantaneously.

次いで、アルカリ処理後の培養液から菌体などの不溶性物質を分離する。培養液の粘度が低いため、菌体を自然沈降させて上澄みを回収する方法（デカント法）、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過（ＭＦ膜などの限外ろ過）などの方法で、容易に不溶性物質とグルカンとを分離できる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合は、セライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。工業的にはフィルタープレスによる菌体除去が好ましい。また、不溶性物質除去前のβ-Ｄ-グルカン液は必要に応じて水で希釈しても良い。濃度が高すぎると不溶性物質除去が困難であり、低すぎても効率的でない。β-Ｄ-グルカン濃度は、例えば０.１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ程度、好ましくは０.５ｍｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌ程度、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍｌ〜５ｍｇ/ｍｌ程度が良い。   Next, insoluble substances such as bacterial cells are separated from the culture solution after the alkali treatment. Since the viscosity of the culture solution is low, a method of allowing the cells to settle naturally (decant method), centrifuging, filtering the whole volume using filter paper or filter cloth, filter press, and membrane filtration (limitation of MF membrane, etc.) Insoluble substances and glucan can be easily separated by a method such as external filtration. In the case of total filtration with filter paper or filter cloth, it is one means to use a filter aid such as celite. Industrially, removal of bacterial cells by a filter press is preferred. Further, the β-D-glucan solution before removal of the insoluble substance may be diluted with water as necessary. If the concentration is too high, it is difficult to remove insoluble substances, and if it is too low, it is not efficient. The β-D-glucan concentration is, for example, about 0.1 mg / ml to 20 mg / ml, preferably about 0.5 mg / ml to 10 mg / ml, and more preferably about 1 mg / ml to 5 mg / ml.

次いで、グルカンを含む溶液に酸を添加して中和する。中和は、不溶物の除去前に行ってもよい。酸は、医薬や食品添加物として使用できるものであればよく、特に限定されない。例えば、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸などを使用できる。酸の使用量は、溶液又は培養液の液性が中性（ｐＨ５〜８程度）になるような量とすればよい。即ち、中和はｐＨ７に合わせることを必ずしも要さない。
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が通常２００ｃＰ以下、場合によっては、１００ｃＰ以下、５０ｃＰ以下、又は１０ｃＰ以下である。粘度は製造方法ないしは精製方法によって変動する。
アルカリ処理された低粘度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。 Next, the solution containing glucan is neutralized by adding an acid. Neutralization may be performed before removal of insoluble matter. The acid is not particularly limited as long as it can be used as a pharmaceutical or food additive. For example, hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, citric acid, malic acid and the like can be used. The amount of acid used may be such that the solution or culture solution becomes neutral (pH 5-8). That is, neutralization does not necessarily need to be adjusted to pH 7.
β-1,3-1,6-D-glucan obtained by neutralization after alkaline treatment at pH 12 or higher has a viscosity of usually 200 cP at 30 ° C., pH 5.0, and concentration 0.5 (w / v%). Hereinafter, depending on the case, it is 100 cP or less, 50 cP or less, or 10 cP or less. The viscosity varies depending on the production method or purification method.
The alkali-treated low viscosity β-1,3-1,6-D-glucan does not increase in viscosity even when neutralized. Furthermore, at room temperature (15 to 35 ° C.), even if the liquid is acidified so that the pH is less than 4, the viscosity does not increase.
In addition, instead of removing the cells after neutralizing and neutralizing the culture supernatant, alkali treatment and neutralization can be performed after removing the cells from the culture supernatant.

得られるグルカン水溶液からグルカンより低分子量の可溶性夾雑物（例えば塩類など）を除去する場合は、例えば限外ろ過を行えばよい。
また、アルカリ処理、除菌した後、中和せずに、アルカリ性条件下で限外ろ過することもでき、これにより透明性、熱安定性、長期保存性に一層優れる精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが得られる。アルカリ性条件は、ｐＨ１０以上、好ましくは１２以上であり、ｐＨの上限は通常１３．５程度である。
このようにして得られる水溶液に含まれるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを析出させることができる。この場合にｐＨをクエン酸などの有機酸によりｐＨを酸性、好ましくはｐＨ４未満、さらに好ましくはｐＨ３-３．７に調製して、エタノールを添加すると高純度のβ-１,３-１,６-グルカンの粉末を得ることができる。 In order to remove soluble contaminants (for example, salts) having a lower molecular weight than glucan from the resulting aqueous solution of glucan, ultrafiltration may be performed, for example.
In addition, after the alkali treatment and sterilization, it is possible to perform ultrafiltration under alkaline conditions without neutralization. As a result, purified β-1,3- is further excellent in transparency, thermal stability and long-term storage. 1,6-D-glucan is obtained. The alkaline condition is pH 10 or more, preferably 12 or more, and the upper limit of pH is usually about 13.5.
The β-1,3-1,6-D-glucan contained in the aqueous solution thus obtained is temporarily removed from the aqueous solution, whether it is dried to form a solid formulation or used as a formulation as an aqueous solution. It can be deposited. The precipitation method of β-1,3-1,6-D-glucan is not particularly limited. For example, an aqueous solution in which the concentration of glucan is increased to 1 w / w% or more by ultrafiltration or the like is added to ethanol. By adding the alcohol to the aqueous solution at a volume ratio equal to or greater than, preferably equal to or greater than twice, β-1,3-1,6-D-glucan can be precipitated. In this case, the pH is adjusted with an organic acid such as citric acid to an acidic pH, preferably less than pH 4, more preferably pH 3-3.7, and ethanol is added to obtain high-purity β-1,3-1,6. -Glucan powder can be obtained.

β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを低粘度化することにより、限外ろ過などによる濃縮を容易に行えることから、アルコール沈殿に使用するアルコール量を少なくすることができる。
固形物として得る場合は、低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等公知の方法で行うことができる。 By reducing the viscosity of β-1,3-1,6-D-glucan, concentration by ultrafiltration and the like can be easily performed, so that the amount of alcohol used for alcohol precipitation can be reduced.
When obtained as a solid, the low-viscosity β-1,3-1,6-D-glucan aqueous solution may be directly dried, or the precipitated β-1,3-1,6-D-glucan is dried. May be. Drying can be performed by a known method such as spray drying or freeze drying.

医薬組成物
本発明の剤は、適当な担体及び添加剤と共に製剤化して医薬組成物とすることができる。医薬組成物の剤型としては、経口投与剤（咽頭用剤を含む）、坐剤などが挙げられる。
＜経口投与剤＞
経口投与剤は、大腸にβ-１,３-グルカンを効果的に送達できる剤型である。
固形経口投与製剤の剤型としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤などが挙げられ、液体経口投与製剤の剤型としては、乳剤、液剤、シロップ剤などが挙げられる。中でも、摂取が容易である点で、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、チュアブル剤、液剤が好ましく、液剤がより好ましい。経口投与剤は咽頭用剤としても使用できる。
固形製剤は、β-１,３-グルカンに薬学的に許容される担体や添加剤を配合して調製される。例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、でんぷん、マンニットのような賦形剤；アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースのような結合剤；カルメロース、デンプンのような崩壊剤；無水クエン酸、ラウリン酸ナトリウム、グリセロールのような安定剤などが配合される。さらに、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなどでコーティングしたり、カプセル化したりしてもよい。
また、液体製剤は、例えば、β-１,３-グルカンを、水、エタノール、グリセリン、単シロップ、又はこれらの混液などに、溶解又は分散させることにより調製される。これらの製剤には、甘味料、防腐剤、粘滑剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤、着色剤のような添加剤が添加されていてもよい。 Pharmaceutical Composition The agent of the present invention can be formulated into a pharmaceutical composition together with appropriate carriers and additives. Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition include oral administration agents (including pharyngeal agents) and suppositories.
<Oral administration agent>
Oral administration is a dosage form that can effectively deliver β-1,3-glucan to the large intestine.
Examples of dosage forms of solid oral administration preparations include powders, granules, tablets, tablets, pills, capsules, chewable preparations, etc., and dosage forms of liquid oral administration preparations include emulsions, liquids, and syrups. Agents and the like. Especially, a tablet, a granule, a capsule, a chewable agent, and a liquid agent are preferable at a point with easy ingestion, and a liquid agent is more preferable. Orally administered agents can also be used as pharyngeal agents.
The solid preparation is prepared by blending pharmaceutically acceptable carriers and additives in β-1,3-glucan. For example, excipients such as sucrose, lactose, glucose, starch, mannitol; binders such as gum arabic, gelatin, crystalline cellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose; disintegrants such as carmellose, starch; anhydrous citric acid Stabilizers such as sodium laurate and glycerol are blended. Further, it may be coated or encapsulated with gelatin, white sugar, gum arabic, carnauba wax or the like.
The liquid preparation is prepared, for example, by dissolving or dispersing β-1,3-glucan in water, ethanol, glycerin, simple syrup, or a mixture thereof. These preparations may contain additives such as sweeteners, preservatives, demulcents, lubricants, diluents, buffers, flavoring agents, and coloring agents.

固形経口投与剤中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜９９重量％が好ましく、約０．１〜５０重量％がより好ましい。また、液体経口投与剤中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜２重量％が好ましく、約０．０５〜０．５重量％がより好ましい。
上記含有量の範囲であれば、無理のない投薬量及び投薬スケジュールで、本発明を効果的に誘導できる。
＜坐剤＞
坐剤は、直腸粘膜にβ-１,３-グルカンを効果的に送達できる剤型である。
坐剤は、β-１,３-グルカンを、カルボポール及びポリカルボフィルのようなアクリル性高分子；ヒドロキシプロピルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース性高分子；アルギン酸ナトリウム及びキトサンのような天然高分子；脂肪酸ワックスなどの基剤に配合することにより調製できる。また、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、パラベンのような防腐剤；塩酸、クエン酸、水酸化ナトリウムのようなｐＨ調節剤；メチオニンのような安定化剤を配合してもよい。
坐剤中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜９９重量％が好ましく、約０．１〜５０重量％がより好ましい。上記範囲であれば、通常の投薬量及び投薬スケジュールで、本発明を効果的に誘導できる。 The content of β-1,3-glucan in the solid oral dosage form is preferably about 0.01 to 99% by weight, preferably about 0.1 to 50% by weight, based on the entire preparation, in terms of dry weight. Is more preferable. Further, the content of β-1,3-glucan in the liquid oral administration agent is preferably about 0.01 to 2% by weight in terms of the dry weight, and preferably about 0.05 to 0% with respect to the whole preparation. More preferred is 5% by weight.
If it is the range of the said content, this invention can be induced | guided | derived effectively with a reasonable dosage and dosing schedule.
<Suppository>
Suppositories are a dosage form that can effectively deliver β-1,3-glucan to the rectal mucosa.
Suppositories include β-1,3-glucan, acrylic polymers such as carbopol and polycarbophil; cellulosic polymers such as hydroxypropylcellulose and hydroxypropylmethylcellulose; natural such as sodium alginate and chitosan Polymer: Can be prepared by blending with a base such as fatty acid wax. Further, a preservative such as sodium benzoate, potassium sorbate and paraben; a pH regulator such as hydrochloric acid, citric acid and sodium hydroxide; and a stabilizer such as methionine may be added.
The content of β-1,3-glucan in the suppository is preferably about 0.01 to 99% by weight, more preferably about 0.1 to 50% by weight, based on the total formulation, in terms of dry weight. preferable. If it is the said range, this invention can be guide | induced effectively by a normal dosage and a dosage schedule.

食品組成物
本発明の剤は食品組成物とすることもできる。この食品組成物は、健康食品、栄養補助食品（バランス栄養食、サプリメントなどを含む）、保健機能食品（特定保健用食品（疾病リスク低減表示、規格基準型を含む）、条件付き特定保健用食品、栄養機能食品を含む）に好適である。
食品組成物は、食品に通常用いられる賦形剤または添加剤を配合して、錠剤、タブレット剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉剤、カプセル剤、水和剤、乳剤、液剤等の剤型に調製することができる。中でも、摂取が容易である点で、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、チュアブル剤、液剤が好ましく、液剤がより好ましい。
食品に通常用いられる賦形剤としては、シロップ、アラビアゴム、ショ糖、乳糖、粉末還元麦芽糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン類、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドンのような結合剤；ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコールのような潤沢剤；ジャガイモ澱粉のような崩壊剤；ラウリル硫酸ナトリウムのような湿潤剤等が挙げられる。添加剤としては、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。 Food composition The agent of the present invention may be a food composition. This food composition consists of health foods, dietary supplements (including balanced nutritional supplements, supplements, etc.), health functional foods (specific health foods (including disease risk reduction labeling, standard type), and conditional special health foods. , Including nutritional functional foods).
The food composition contains excipients or additives commonly used in foods, and is in the form of tablets, tablets, pills, granules, powders, powders, capsules, wettable powders, emulsions, liquids, etc. Can be prepared. Especially, a tablet, a granule, a capsule, a chewable agent, and a liquid agent are preferable at a point with easy ingestion, and a liquid agent is more preferable.
Common excipients used in food include syrup, gum arabic, sucrose, lactose, powdered reduced maltose, cellulose sugar, mannitol, maltitol, dextran, starches, gelatin, sorbit, tragacanth, polyvinylpyrrolidone Agents; sucrose fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, magnesium stearate, calcium stearate, talc, polyethylene glycol, etc .; disintegrants such as potato starch; wetting agents such as sodium lauryl sulfate. Examples of additives include fragrances, buffers, thickeners, colorants, stabilizers, emulsifiers, dispersants, suspending agents, preservatives, and the like.

固形食品製剤中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜９９重量％が好ましく、約０．１〜５０重量％がより好ましい。また、液体食品製剤中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜２重量％が好ましく、約０．０５〜０．５重量％がより好ましい。
上記範囲であれば、無理のない摂取量及び摂取スケジュールで、本発明を効果的に誘導できる。 The content of β-1,3-glucan in the solid food preparation is preferably about 0.01 to 99% by weight, preferably about 0.1 to 50% by weight, based on the whole preparation, in terms of dry weight. More preferred. In addition, the content of β-1,3-glucan in the liquid food preparation is preferably about 0.01 to 2% by weight, and preferably about 0.05 to 0. 5% by weight is more preferred.
If it is the said range, this invention can be induced | guided | derived effectively with a reasonable intake and an intake schedule.

また、この食品組成物は、飲料（スポーツ飲料、ドリンク剤、乳飲料、乳酸菌飲料、果汁飲料、炭酸飲料、野菜飲料、茶飲料等）、菓子類（クッキー等の焼き菓子、ゼリー、ガム、グミ、飴等）のような一般の飲食品を含むものであってもよい。中でも、摂取が容易である点で、飲料が好ましい。
固形又は半固形の食品組成物中のβ-１,３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、製剤全体に対して、約０．０１〜９９重量％が好ましく、約０．１〜５０重量％がより好ましい。また、液体状又は流動状の食品組成物中のβ-１，３-グルカンの含有量は、乾燥重量に換算して、組成物全体に対して、約０．０１〜１０重量％が好ましく、約０．１〜５重量％がより好ましい。
上記範囲であれば、無理なく摂取できる飲食品中に、本発明を効果的に誘導できるだけのβ-１,３-グルカンが含まれることになる。
食品添加剤
本発明の剤は、一つの実施態様として、β-１,３-グルカンを含む食品添加剤であり得る。当業者は、本発明が提供する食品添加剤を食品に配合させることにより、下記で説明する用途、機能または作用を食品に付加することができ、食品の質を改変することができる。 In addition, this food composition includes beverages (sports drinks, drinks, milk drinks, lactic acid bacteria drinks, fruit juice drinks, carbonated drinks, vegetable drinks, tea drinks, etc.), confectionery (baked confectionery such as cookies, jelly, gum, gummi , Etc.) and may contain general food and drinks. Especially, a drink is preferable at the point which ingestion is easy.
The content of β-1,3-glucan in the solid or semi-solid food composition is preferably about 0.01 to 99% by weight in terms of the dry weight, and preferably about 0.1 More preferred is ˜50% by weight. Further, the content of β-1,3-glucan in the liquid or fluid food composition is preferably about 0.01 to 10% by weight in terms of the dry weight, based on the whole composition, About 0.1 to 5% by weight is more preferred.
If it is the said range, (beta) -1,3-glucan which can induce this invention effectively will be contained in the food / beverage products which can be ingested reasonably.
Food additive The agent of the present invention may be a food additive containing β-1,3-glucan as one embodiment. A person skilled in the art can add the use, function or action described below to food by adding the food additive provided by the present invention to the food, and can modify the quality of the food.

使用方法
本発明の剤が経口投与医薬製剤、食品組成物、又は食品添加剤である場合のβ-１,３-グルカンの１日投与量は約０．１〜１０００ｍｇが好ましく、約１〜６００ｍｇがより好ましく、約５〜２００ｍｇがさらに好ましい。
また、本発明の剤が医薬組成物の坐剤である場合のβ-１,３-グルカンの１日投与量は、０．１〜１０００ｍｇが好ましく、約１〜６００ｍｇがより好ましい。 Method of Use When the agent of the present invention is an orally administered pharmaceutical preparation, food composition, or food additive, the daily dose of β-1,3-glucan is preferably about 0.1 to 1000 mg, preferably about 1 to 600 mg. Is more preferable, and about 5-200 mg is more preferable.
In addition, when the agent of the present invention is a suppository of a pharmaceutical composition, the daily dose of β-1,3-glucan is preferably 0.1 to 1000 mg, more preferably about 1 to 600 mg.

用途
本発明の剤は、後述する実施例に示す通り、過敏性腸症候群の排便異常（例えば、下痢、排便亢進など）及び腹痛を改善する。従って、過敏性腸症候群の疾患の予防又は治療剤として有用である。
また、本発明の剤は、大腸痛覚伝達を抑制し、大腸痛覚閾値低下を抑制し得、大腸のおける痛覚過敏に対して、効果的に、症状を改善することから、腹痛・腹部不快感を伴う慢性的な便通異常を生じる機能性消化管疾患の予防又は治療剤などとして有用である。
過敏性腸症候群（irritable bowel syndrome; ＩＢＳ）とは、例えば、診断基準Rome II基準またはRome III基準により定義された疾患である。Rome III基準によれば、過敏性腸症候群は、「最近３ヶ月の内の１ヶ月において、少なくとも３日以上腹痛あるいは腹部不快感が生じ、その腹部症状が１」排便によって改善する、２」排便頻度の変化で始まる、３」便性状の変化で始まる、の３項目中２項目以上にあてはまるもの」と定義されており、排便回数や便性状などの違いから、過敏性腸症候群は下痢型、便秘型、混合型および分類不能型に分類されている（日薬理誌133, 281-291 (2009)）。 Uses The agent of the present invention improves defecation abnormalities (for example, diarrhea, increased defecation) and abdominal pain of irritable bowel syndrome, as shown in the Examples described later. Therefore, it is useful as a preventive or therapeutic agent for diseases of irritable bowel syndrome.
In addition, the agent of the present invention can suppress the transmission of large bowel pain, suppress the decrease in the threshold of pain in the large intestine, and effectively improve symptoms against hyperalgesia in the large intestine. It is useful as a preventive or therapeutic agent for functional gastrointestinal tract diseases that cause chronic bowel movement abnormalities.
Irritable bowel syndrome (IBS) is, for example, a disease defined by diagnostic criteria Rome II criteria or Rome III criteria. According to the Rome III criteria, irritable bowel syndrome is: "Abdominal pain or abdominal discomfort occurs in at least 3 days in the last 3 months, and its abdominal symptoms are improved by 1" defecation, 2 "defecation It is defined as “starting with a change in frequency, 3” starting with a change in stool properties, which applies to 2 or more of the three items, and due to differences in the number of defecation and stool properties, irritable bowel syndrome is diarrhea type, It is classified into constipation type, mixed type and non-classifiable type (Japanese Pharmacology 133, 281-291 (2009)).

対象
本発明の剤を投与または摂取する対象は、過敏性腸症候群に罹患しているヒト、その処置または予防が必要なヒト、その疑いがあるヒトであり得る。ここで、過敏性腸症候群は、下痢型、便秘型、混合型または分類不能型であってもよい。また、ヒトは男性であっても女性であってもよい。よって、本発明は、一つの実施態様として、β-１,３-グルカンを含む下痢型過敏性腸症候群の治療薬または予防薬を提供する。
また、過敏性腸症候群は、ストレスをはじめとする種々の病因によって引き起こされ、腸管神経の過緊張に伴う腸の運動機能亢進によって生ずる疾患であり得る。腸（例えば、大腸）などの消化管の運動に関与する神経伝達物質としては、セロトニン、およびアセチルコリンが挙げられる。本発明の剤は、後述する実施例に示すとおり、セロトニン、またはアセチルコリンが惹起する排便異常を改善する。よって、本発明は、一つの実施態様として、セロトニン、またはアセチルコリンが惹起する排便異常の改善剤、または、一つの実施態様として、腸におけるセロトニン、またはアセチルコリンの作用亢進抑制剤を提供する。腸におけるセロトニン、またはアセチルコリンの作用の亢進の例としては、腸の運動亢進（例えば、大腸における排便能、輸送能または水分輸送能が亢進していること）が挙げられる。また、腸におけるセロトニンの作用の亢進の他の例としては、大腸に投射している外来性求心性一次神経の終末に存在する５-ＨＴ_３受容体を活性化することによる大腸で発生した痛覚シグナルの中枢への伝達および痛覚過敏の惹起が挙げられる。このような腸における異常が脳へ伝達されると、さらに、ストレスが発生し便通異常を悪化させるという脳腸相関の異常が惹起される。本発明の剤は、好ましい一つの実施態様として、脳腸相関の異常を改善する。
これまで、下痢型過敏性腸症候群の治療薬として用いられている、５-ＨＴ_３受容体アンタゴニストおよび副交感神経を抑制する抗コリン薬には、便秘、尿が出にくい、口の渇き等の副作用が報告されている。β-１,３-グルカンには、そのような副作用は報告されていないことから、この点において、本発明の剤は安全である。 Subject The subject who administers or ingests the agent of the present invention can be a human suffering from irritable bowel syndrome, a human in need of treatment or prevention thereof, or a suspected human. Here, the irritable bowel syndrome may be diarrhea type, constipation type, mixed type or non-classifiable type. Further, the human may be male or female. Therefore, the present invention provides, as one embodiment, a therapeutic or prophylactic agent for diarrhea-type irritable bowel syndrome containing β-1,3-glucan.
Irritable bowel syndrome can be a disease caused by various etiologies including stress and caused by hypermotility of the intestine accompanying hypertonic intestinal nerves. Examples of neurotransmitters involved in gastrointestinal motility such as the intestine (eg, large intestine) include serotonin and acetylcholine. The agent of the present invention improves defecation abnormalities caused by serotonin or acetylcholine, as shown in Examples described later. Therefore, the present invention provides, as one embodiment, an agent for improving abnormal defecation caused by serotonin or acetylcholine, or as one embodiment, an agent for suppressing the enhancement of serotonin or acetylcholine action in the intestine. Examples of the enhanced action of serotonin or acetylcholine in the intestine include increased intestinal motility (for example, increased defecation capacity, transport capacity or water transport capacity in the large intestine). As another example of the enhancement of the action of serotonin in the intestine, pain sensation generated in the large intestine due to activation of 5-HT ₃ receptor present at the terminal of an exogenous primary afferent projecting to the large intestine. Signal transmission to the center and induction of hyperalgesia. When such an abnormality in the intestine is transmitted to the brain, an abnormality in the cerebral-intestinal correlation that causes stress and worsens the bowel movement abnormality is caused. In one preferred embodiment, the agent of the present invention improves abnormalities of cerebral intestinal correlation.
To date, 5-HT ₃ receptor antagonists and anticholinergic drugs that suppress parasympathetic nerves, which are used as therapeutic agents for diarrhea-type irritable bowel syndrome, have side effects such as constipation, difficulty in urine production, and thirst Has been reported. Since no such side effects have been reported for β-1,3-glucan, the agent of the present invention is safe in this respect.

以下、本発明の実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（Ａ）精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造
（１）低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの調製
（１-１）β-グルカンの培養産生
後掲の表１に示す組成を有する液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の肩付きフラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、１３０ｒｐｍの速度で通気攪拌しつつ、３０℃で２４時間培養することにより種培養液を調製した。
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０L／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ＯＤで、多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、硫黄含量から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。 EXAMPLES Hereinafter, although the Example of this invention is given and demonstrated in detail, this invention is not limited to these.
(A) Production of purified β-1,3-1,6-D-glucan
(1) Preparation of low viscosity β-1,3-1,6-D-glucan
(1-1) beta-glucan a liquid medium 100ml having the composition shown in Table 1 supra after culture production placed on shouldered flask 500ml volume, at 121 ° C., 15 min, after pressurized steam sterilization, Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain (FERM P-19285) was aseptically inoculated from a slant of the same medium composition with 1 platinum ear inoculum and stirred at a rate of 130 rpm at 24 ° C. for 24 hours at 30 ° C. A seed culture solution was prepared by culturing for a period of time.
Next, 200 L of medium having the same composition is placed in a 300 L culture apparatus (manufactured by Maruhishi Bioengineer), autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, and 2 L of the seed culture obtained as described above is aseptic. The cells were inoculated and aerated and stirred at 200 rpm, 27 ° C., 40 L / min. The pH of the medium was controlled within the range of pH 4.2 to 4.5 using sodium hydroxide and hydrochloric acid. The turbidity after 96 hours was 23 OD at OD 660 nm, the polysaccharide concentration was 0.5% (w / v), and the substituted sulfoacetic acid content calculated from the sulfur content was 0.09%.

＜多糖濃度測定＞
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(ｖ/ｖ)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。 <Measurement of polysaccharide concentration>
The polysaccharide concentration was collected by sampling several ml of the culture solution, centrifuging and removing the cells, and then adding ethanol to the supernatant so that the final concentration was 66% (v / v) to precipitate the polysaccharide. Then, it melt | dissolved in ion-exchange water and quantified with the phenol sulfuric acid method.

＜置換スルホ含量測定＞
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β-グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ-グルカンを回収した。このβ-グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。
このβ-グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。 <Measurement of substituted sulfo content>
Similarly, ethanol was added to the culture supernatant from which the bacterial cells had been removed to a final concentration of 66%, and β-glucan was collected by precipitation. Thereafter, the sample was dissolved again in ion-exchanged water, centrifuged again, sodium chloride was added to the supernatant so that the final concentration was 0.9%, and β-glucan was again collected with 66% ethanol. This β-glucan recovery and purification operation was further repeated twice, and the resulting β-glucan aqueous solution was dialyzed against ion-exchanged water and then freeze-dried to obtain β-glucan powder.
This β-glucan powder was subjected to combustion tube combustion absorption and then subjected to composition analysis by ion chromatography. As a result, the S content was 239 mg / kg, and the substituted sulfoacetic acid content calculated from this value was 0.09%.

（１−２）アルカリ処理
上記のようにして得られた培養液の粘度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（(ｍＰａ・ｓ)）であった。測定に用いるロータは粘度にあわせて適当なものを選択した。
この培養液に水酸化ナトリウム最終濃度が２．４％(ｗ/ｖ)となるように２５％(ｗ/ｗ)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度を測定したところ、そのときの粘度（３０℃）は２０ｃＰ([ｍＰａ・s])であった。
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、ほぼ１００％の回収率であった。 (1-2) Alkali treatment When the viscosity of the culture solution obtained as described above was measured at 30 ° C. and 12 rpm using a BM type rotational viscometer (manufactured by Tokyo Keiki), 1500 cP ((mPa · s) )Met. The rotor used for the measurement was selected appropriately according to the viscosity.
When 25% (w / w) sodium hydroxide was added to this culture solution so that the final concentration of sodium hydroxide was 2.4% (w / v) and stirred (pH 13.6), the viscosity decreased instantaneously. did. Subsequently, after neutralizing with a 50% (w / v) aqueous citric acid solution to pH 5.0, the viscosity at a concentration of 0.5 (w / v%) was measured. ) Was 20 cP ([mPa · s]).
Next, 1 wt% of KC Flock (manufactured by Nippon Paper Industries Co., Ltd.) was added to the culture broth as a filter aid, and the cells were removed using a Kamata filter press (manufactured by Kamata Kikai). About 230 L). The polysaccharide concentration was 0.5% (w / v), and the recovery rate was almost 100%.

（１−３）β-グルカン水溶液の脱塩
上記のβ-グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ-グルカン水溶液を得た。この時のβ-グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(ｗ/ｖ)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。 (1-3) Desalination of β-glucan aqueous solution After dilution of the above β-glucan aqueous solution (culture filtrate) to 0.3%, ultrafiltration (UF) membrane (molecular weight cut 50,000, manufactured by Nitto Denko Corporation) Was used, and finally the sodium ion concentration was lowered to 20 mg / 100 ml, and then the pH was adjusted to 3.5 with a 50% (w / v) aqueous citric acid solution.
Subsequently, sterilization was performed by holding at 95 ° C. for 3 minutes using a hot-filling heating unit (manufactured by Nisaka Manufacturing Co., Ltd.) to obtain a final β-glucan aqueous solution. The concentration of β-glucan at this time was 0.22% (w / v) as measured by the phenol sulfuric acid method. The total yield from the culture was about 73%.

＜硫黄含有量の測定＞
また、得られたβ-グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ-グルカン粉末を得た。本β-グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０.１２％であった。 <Measurement of sulfur content>
The obtained β-glucan aqueous solution was dialyzed against ion-exchanged water and then freeze-dried to obtain β-glucan powder. From the compositional analysis result of this β-glucan, the S content was 330 mg / kg, and the substituted sulfoacetic acid content calculated from this was 0.12%.

＜結合状態の確認＞
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ-１,３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67,
527-535 (1978)、今中忠行 監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。
２次元ＮＭＲ（^１３Ｃ−^１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図１に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。
この結果、本β-グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンであることが証明された（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの^１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分比から、β-１,３結合／β-１,６結合の比は１．１５であることが判明した。従って、主鎖のβ-１,３結合に対する側鎖のβ-１,６結合の分岐度は、約８７％である。 <Confirmation of combined state>
In addition, since the desiccated culture filtrate was confirmed to have a wavelength shift from 480 nm to around 525 nm by the Congo Red method, it contained glucan containing β-1,3 bonds. Proven (K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67,
527-535 (1978), supervised by Tadayuki Imanaka, development of the use of microorganisms, 1012-1015, NTS (2002)). The shift difference to the maximum value at that time was Δ0.48 / 500 μg polysaccharide.
15 ml of the culture filtrate was taken out, 30 ml of ethanol was added, and centrifuged at 4 ° C. and 1000 rpm for 10 minutes to collect the precipitated polysaccharide. Wash with 66% ethanol, centrifuge at 4 ° C, 1000 rpm for 10 minutes, add 2 ml of ion-exchanged water and 1 ml of 1N sodium hydroxide aqueous solution to the precipitated polysaccharide, stir, then heat at 60 ° C for 1 hour to precipitate. Dissolved. Next, after freezing at −80 ° C., vacuum lyophilization was performed overnight, and the dried powder was dissolved in 1 ml of 1N sodium hydroxide heavy aqueous solution and subjected to two-dimensional NMR.
FIG. 1 shows a ¹ H NMR spectrum having a correlation with 106 ppm of two-dimensional NMR ( ¹³ C- ¹ H COSY NMR). In this spectrum, two signals of 4.7 ppm and around 4.5 ppm were obtained.
As a result, it was proved that this β-glucan is β-1,3-1,6-D-glucan (supervised by Tadayuki Imanaka, Development of Microbial Utilization, 1012-1015, NTS ( 2002)). From the integration ratio of each ¹ H NMR signal, it was found that the ratio of β-1,3 bond / β-1,6 bond was 1.15. Therefore, the degree of branching of the β-1,6 bond in the side chain relative to the β-1,3 bond in the main chain is about 87%.

＜粒度測定＞
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図２に示す。
０．３μｍのピークはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
また、二次粒子はマグネチックスターラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。 <Particle size measurement>
Next, when the particle size of the culture solution was measured using a laser diffraction / scattering type particle size distribution measuring apparatus (LA-920 manufactured by HORIBA), the particles were about 0.3 μm and 100 μm in size. I was seen. Subsequently, when particle size measurement was performed while irradiating with ultrasonic waves, the 100 μm peak disappeared as soon as it was seen, the 0.3 μm peak increased, and finally only 0.3 μm. The particle size distribution of the culture solution when irradiated with ultrasonic waves is shown in FIG.
The peak of 0.3 μm is the peak due to the primary particles of β-1,3-1,6-D-glucan, and the peak of 100 to 200 μm is the primary particles of β-1,3-1,6-D-glucan. This is considered to be a peak due to aggregated secondary particles.
Further, it was confirmed that the secondary particles disappeared in the same manner even when stirred with a magnetic stirrer and lightly shaken, and easily broken into primary particles. Therefore, the secondary particles are considered to be very loosely aggregated (slowly aggregated state).

＜分子量測定＞
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンとβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。 <Molecular weight measurement>
Further, using Toyopearl HW65 (column size 75 cm × φ1 cm, excluded molecular weight 2.5 million (dextran)) manufactured by Tosoh Corporation, gel filtration chromatography was performed using a 0.1 M sodium hydroxide aqueous solution as an eluent to dissolve β- When the molecular weight of a solution containing 1,3-1,6-D-glucan and primary particles of β-1,3-1,6-D-glucan was measured, dissolved β-1,3-1,6 Two types of low molecular fractions having peaks of 2 to 300,000 derived from -D-glucan and apparently high molecular fractions of 500 to 2.5 million derived from primary particles were detected. Shodex pullulan was used as a molecular weight marker.
In order to separate the water-soluble β-1,3-1,6-D-glucan and the fine particles, a β-1,3-1,6-D-glucan solution containing the fine particle fraction and the soluble fraction is used. When filtration was performed with a filter (0.2 μm) manufactured by Advantech, 500 to 2.5 million polymer fractions disappeared. From this, it was found that the polymer fraction corresponds to primary particles of β-1,3-1,6-D-glucan and secondary particles in which primary particles are aggregated. Therefore, the molecular weight of water-soluble β-1,3-1,6-D-glucan is considered to be 2 to 300,000.

（２）粉末化β-グルカンの調製
（１−２）において、アルカリ処理および菌体除去処理により調製された微粒子β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(ｖ／ｖ)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。
次いで、得られた乾燥β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
一方、水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。 (2) Preparation of powdered β-glucan In (1-2), β-1,3-1,6-D-glucan containing fine particles β-1,3-1,6-D-glucan prepared by alkali treatment and fungus body removal treatment Ethanol was added to the 1,6-D-glucan aqueous solution so that the final concentration was 66% (v / v) to precipitate polysaccharide glucan, which was collected by centrifugation. Next, ethanol and water were removed by a freeze-drying method to obtain dry β-1,3-1,6-D-glucan. The yield at that time was 95% or more compared to the total sugar concentration before ethanol precipitation.
Subsequently, the obtained dried β-1,3-1,6-D-glucan was dissolved and dispersed in water so that the final concentration was 0.3% (w / v), and then the same as described above. Gel chromatography was performed using Toyopearl HW65 (column size: 75 cm × φ1 cm, excluded molecular weight: 2.5 million (dextran)) manufactured by Toyopearl, and the molecular weight was measured. It was found that the molecular weight was composed of two types, a low molecular fraction having a peak of 2 to 300,000 and a high molecular fraction having an apparent appearance of 500 to 2.5 million. Here, a pullulan manufactured by Shodex was used as a molecular weight marker.
On the other hand, in order to separate water-soluble β-1,3-1,6-D-glucan and fine particles, an aqueous solution of β-1,3-1,6-D-glucan prepared by this method (fine particles and solubilized glucan are mixed). When the product was filtered with a filter (0.2 μm) manufactured by Advantech, 500 to 2.5 million polymer fractions disappeared. Therefore, even if the β-1,3-1,6-D-glucan obtained by this method is dried, it is the same as β-1,3-1,6-D-glucan before drying if it is redissolved. It was demonstrated to reproduce the physical behavior of

（３）高純度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末の製造
（１）においてアルカリ処理を行い低粘度化した培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、濾過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機４０Ｄ-４を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外濾過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、ｐＨを３．０-３．５にクエン酸により調整して、エタノール１８Ｌを加え、グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置Ｒ-３を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
なお、得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末を１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、ＮＭＲスペクトルを測定したところ、１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを得た。また、得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末の濃度０．５（ｗ／ｖ％）の水溶液の粘度は２００ｃＰ以下であった（ｐＨ５．０、３０℃）。
上記記載の方法によって得られた精製β-グルカンを下記の試験に供した。 (3) Production of high-purity β-1,3-1,6-D-glucan powder (1) 90 L of a culture solution (polysaccharide concentration 0.5% (5 mg / ml)) reduced in viscosity by alkali treatment After neutralization with 9 kg of 50% aqueous citric acid solution, the cells were removed through a Kamata filter press 40D-4 precoated with 1.8 kg of filter aid (Powder Cellulose KC Flock manufactured by Nippon Paper Chemicals). The filtrate was concentrated to 9 L with an ultrafiltration spiral element (NTU3150-S4 manufactured by Nitto Denko). While stirring the concentrate, the pH was adjusted to 3.0-3.5 with citric acid, and 18 L of ethanol was added to obtain a glucan / ethanol / water slurry. The viscosity of the slurry was 22 mPa · s (30 ° C.) with a BM viscometer. The mixture was allowed to stand at room temperature for 3 hours, and about 17 L of the supernatant (ethanol / water) was removed. The viscosity of the remaining slurry was 45 mPa · s (30 ° C.). 10 L of this concentrated slurry was spray-dried using a spray dryer R-3 of Sakamoto Giken Co., Ltd. to obtain 360 g of β-1,3-1,6-D-glucan powder (recovery rate 80%). The purity of the obtained β-1,3-1,6-D-glucan was 90% or more as a result of NMR spectrum analysis.
The obtained β-1,3-1,6-D-glucan powder was dissolved in 1N sodium hydroxide heavy aqueous solution and the NMR spectrum was measured. The 1H NMR spectrum was about 4.7 ppm and about 4.5 ppm. Two signals were obtained. Further, the viscosity of the obtained β-1,3-1,6-D-glucan powder aqueous solution having a concentration of 0.5 (w / v%) was 200 cP or less (pH 5.0, 30 ° C.).
The purified β-glucan obtained by the method described above was subjected to the following test.

（Ｂ）ベタネコール（betanecol）、セロトニン（５-ＨＴ）、及びひまし油（castor
oil）のそれぞれの薬剤投与により誘導した便通異常による過剰排便（下痢症状）に対する低分子β-グルカン経口投与の効果
上記実験例において得た高純度β-１，３-１，６-Ｄ-グルカン粉末（以下「低分子β-グルカンという」）。
アセチルコリン作動薬であるベタネコール（bethanechol）、セロトニン(５-ＨＴ)、及び大腸刺激剤であるひまし油(castor oil)による便通異常（下痢）を誘発し、それぞれの刺激剤により誘発された下痢症状（排便異常）の低減に対する低分子β-グルカンの効果をマウスを用いて検討した。野生型（Ｃ５７／ＢＬ６）マウス（６〜８週齢、体重２０-２５ｇ）に低分子β-グルカン（６００ｍｇ/ｋｇ）を経口投与し、その２時間後にベタネコールとセロトニンは皮下注射（３ｍｇ/ｋｇ）を行い、ひまし油（３００μｌ/匹）は経口投与を行った。各刺激剤投与後ベタネコール、セロトニンは１時間後、ひまし油は２時間後の便***量を測定した。なお、比較対照にはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いた。
結果を図３Ａ−Ｃに示す。図３Ａより、低分子β-グルカンが、セロトニンによる大腸の排便異常を低減したことが分る。図３Ｂより、低分子β-グルカンが、ベタネコールによる大腸の排便異常を低減していることが分る。図３Ｃより、低分子β-グルカンが、ひまし油による粘膜刺激による排便異常を低減していることが分る。このことより、低分子β-グルカンの事前投与により便の異常***は有意に低減したことが分かる。即ち、低分子β-グルカンには、セロトニンやアセチルコリンのような排便異常を誘発する物質に起因した症状を改善することが分る。 (B) betanecol, serotonin (5-HT), and castor oil (castor)
effect of oral administration of low molecular weight β-glucan on excessive defecation (diarrhea symptoms) caused by abnormal bowel movement induced by each drug administration of high-purity β-1,3-1,6-D-glucan obtained in the above experimental example Powder (hereinafter referred to as “low molecular β-glucan”).
Induced abnormal bowel movements (diarrhea) by acetylcholine agonist bethanechol, serotonin (5-HT), and colonic castor oil castor oil, and diarrhea symptoms induced by each stimulant (defecation) The effect of low-molecular β-glucan on the reduction of (abnormality) was examined using mice. Low-molecular β-glucan (600 mg / kg) was orally administered to wild-type (C57 / BL6) mice (6-8 weeks old, body weight 20-25 g), and 2 hours later, bethanechol and serotonin were injected subcutaneously (3 mg / kg ) And castor oil (300 μl / animal) was orally administered. After administration of each stimulant, stool excretion was measured after 1 hour for bethanechol and serotonin and 2 hours for castor oil. For comparison, PBS (phosphate buffered saline) was used.
The results are shown in FIGS. 3A-C. From FIG. 3A, it can be seen that low molecular weight β-glucan reduced colonic defecation abnormalities caused by serotonin. From FIG. 3B, it can be seen that the low-molecular β-glucan reduces the bowel defecation abnormality due to betanecol. FIG. 3C shows that low-molecular β-glucan reduces defecation abnormalities caused by mucosal stimulation with castor oil. This shows that abnormal excretion of stool was significantly reduced by prior administration of low-molecular β-glucan. That is, it can be seen that low molecular weight β-glucan improves symptoms caused by substances that induce defecation abnormalities such as serotonin and acetylcholine.

（Ｃ）大腸伸展運動により起こる痛覚刺激と低分子β-グルカン経口投与の効果
ウィスター系ラット（雌、３-４週齢）の肛門からポリエチレン製のバック（２ｃｍの長さ）を大腸（直腸）に挿入した。バックが肛門から１ｃｍの部位まで挿入した。そして、そのバックに空気を入れて一定の圧力になるまで膨らませて(大腸伸展運動 Colorectal distention (ＣＲＤ))、その際に生じる痛みを筋肉の収縮が起こる電位を内臓知覚（visceromotor response (ＶＭＲ））として測定した。ＣＲＤ刺激は８０ｍｍＨｇの圧力で３０秒間維持し、５分間隔で１２回の繰り返しＣＲＤ刺激を行い、その際のＶＭＲの数値推移を測定した。なお、ＣＲＤ刺激は、低分子β-グルカンを１日あたり１００ｍｇ/ｋｇ、および６００ｍｇ/ｋｇの量でラットに７日間継続経口投与し、７日目の投与終了後１２時間後に、繰り返しＣＲＤテストを行った。また、比較対照にはＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いた。
結果を図４に示す。この結果より、低分子β-グルカン投与ラット群では、ＣＲＤ刺激における痛覚レベルが明らかに低下した。また、１２回後の繰り返しＣＲＤ刺激終了時点において、低分子β-グルカン６００ｍｇ/ｋｇ投与ラットでは、痛覚レベルの改善傾向が認められた。このことから、低分子β-グルカン投与により、大腸における異常便排出による痛みは低減されたことが分かる。即ち、大腸における腹痛の症状を改善していることが分る。また、低分子β-グルカンは、大腸における痛覚過敏を改善することが分る。 (C) Effect of painful stimulation caused by large intestine stretching exercise and oral administration of low-molecular β-glucan From the anus of Wistar rats (female, 3-4 weeks old), a polyethylene back (2 cm long) is taken from the large intestine (rectum) Inserted into. The back was inserted 1 cm from the anus. Then, the back is inflated until a certain pressure is reached (Colorectal distention (CRD)), and the pain that occurs at that time causes the muscles to contract and the visceral perception (visceromotor response (VMR)) As measured. CRD stimulation was maintained at a pressure of 80 mmHg for 30 seconds, and repeated CRD stimulation was performed 12 times at 5-minute intervals, and the numerical transition of VMR at that time was measured. For CRD stimulation, low-molecular β-glucan was orally administered to rats at a dose of 100 mg / kg and 600 mg / kg for 7 days, and repeated CRD tests were conducted 12 hours after the completion of the 7th day. went. Further, PBS (phosphate buffered saline) was used as a comparative control.
The results are shown in FIG. From this result, in the low-molecular β-glucan-administered rat group, the pain sensation level upon CRD stimulation was clearly reduced. In addition, at the end of repeated CRD stimulation 12 times later, in the low-molecular β-glucan 600 mg / kg-administered rats, a tendency to improve pain level was observed. From this, it can be seen that administration of low molecular weight β-glucan reduced pain due to abnormal stool excretion in the large intestine. That is, it can be seen that the symptoms of abdominal pain in the large intestine are improved. It can also be seen that low molecular weight β-glucan improves hyperalgesia in the large intestine.

（Ｄ）酪酸浣腸により誘導した擬似大腸過敏症における大腸伸展運動により起こる痛覚刺激と低分子β-グルカン経口投与の効果
ウィスター系ラット（雌、３-４週齢）を酪酸（Ｂｕｔｙｒａｔｅ）（１１０ｍｇ/ｍｌ、１ｍｌ）による浣腸（肛門から７ｃｍの大腸部へ1日に２回、３日間）を行うことにより、擬似大腸過敏症を誘導した。擬似大腸過敏症の状態下でＣＲＤ刺激を行うことにより、大腸における痛覚刺激への低分子β-グルカン経口投与の効果を検討した。なお、比較対照として、生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を用いた。
低分子β-グルカン経口投与群は、1日あたり１回６００ｍｇ/ｋｇで７日間与え、その後に酪酸浣腸を行った。酪酸浣腸により擬似大腸過敏症を誘導した上記ラットに、１０-８０ｍｍＨｇで段階的にＣＲＤ刺激レベルを大きくし、それぞれ２０秒間のＣＲＤ刺激を１５０秒間隔で与えて、その際の痛覚レベルをＶＭＲで測定した。
結果を図５に示す。酪酸浣腸のみの場合と低分子β-グルカンを併用した場合では、低分子β-グルカンを与えたラットの方が、大腸伸展運動（ＣＲＤ）刺激に対する痛覚レベルの低減がなされ、痛覚過敏が改善されたことが分かる。 (D) Effect of painful stimulation caused by large intestine stretching exercise and oral administration of low molecular β-glucan in pseudocolon hypersensitivity induced by butyrate enema. Wistar rats (female, 3-4 weeks old) were treated with butyrate (110 mg / pseudo-colon hypersensitivity was induced by enema (ml, 1 ml) (from the anus to 7 cm of the large intestine twice a day for 3 days). The effect of oral administration of low molecular weight β-glucan on painful stimulation in the large intestine was examined by performing CRD stimulation under the condition of pseudocolon hypersensitivity. In addition, physiological saline (Saline) was used as a comparison control.
The low-molecular β-glucan oral administration group was given 600 mg / kg once a day for 7 days, followed by butyrate enema. The CRD stimulation level was increased stepwise at 10-80 mmHg to the rats induced pseudo-colon hypersensitivity by butyrate enema, and each CRD stimulation for 20 seconds was given at intervals of 150 seconds, and the pain level at that time was measured by VMR. It was measured.
The results are shown in FIG. In the case of butyrate enema alone and in combination with low molecular weight β-glucan, rats given low molecular weight β-glucan have a reduced level of pain perception of colonic motility (CRD) stimulation and improved hyperalgesia. I understand that.

本発明の過敏性腸症候群の下痢抑制剤、腹痛改善剤、及び大腸のおける痛覚過敏改善剤は過敏性腸症候群の症状改善剤として有用であり、腹痛・腹部不快感を伴う慢性的な便通異常（便秘あるいは下痢）を生じる機能性消化管疾患などの疾患の予防又は治療剤として好適に使用できる。
The diarrhea suppressant, abdominal pain ameliorating agent, and the hyperalgesia improving agent in the large intestine of the present invention are useful as a symptom improving agent for irritable bowel syndrome and chronic bowel movement abnormalities accompanied by abdominal pain / abdominal discomfort It can be suitably used as a preventive or therapeutic agent for diseases such as functional gastrointestinal diseases that cause constipation or diarrhea.

Claims (9)

オーレオバシジウム属に属する微生物由来のβ-１,３-１,６-グルカンを含む過敏性腸症候群の下痢抑制経口投与剤、または座剤。 An orally administered agent for suppressing diarrhea or suppository containing irritable bowel syndrome, comprising β-1,3-1,6-glucan derived from a microorganism belonging to the genus Aureobasidium. β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである請求項１に記載の剤。   β-1,3-1,6-glucan is β-1,3-1,6-glucan having a degree of branching of β-1,6 bond with respect to β-1,3 bond of 50 to 100%. Item 3. The agent according to Item 1. オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ
Ｐ-１９２８６）である請求項１または２に記載の剤。 The microorganism belonging to the genus Aureobasidium is Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain (FERM P-19285) or GM-NH-1A2 strain (FERM).
The agent according to claim 1 or 2, which is P-19286). オーレオバシジウム属に属する微生物由来のβ-１,３-１,６-グルカンを含む過敏性腸症候群の腹痛改善経口投与剤、または座剤。 An orally administered or suppository for improving abdominal pain in irritable bowel syndrome, comprising β-1,3-1,6-glucan derived from a microorganism belonging to the genus Aureobasidium. β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである請求項４に記載の剤。   β-1,3-1,6-glucan is β-1,3-1,6-glucan having a degree of branching of β-1,6 bond with respect to β-1,3 bond of 50 to 100%. Item 5. The agent according to Item 4. オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ
Ｐ-１９２８６）である請求項４または５に記載の剤。 The microorganism belonging to the genus Aureobasidium is Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain (FERM P-19285) or GM-NH-1A2 strain (FERM).
The agent according to claim 4 or 5, which is P-19286). オーレオバシジウム属に属する微生物由来のβ-１,３-１,６-グルカンを含む大腸における痛覚過敏改善経口投与剤、または座剤。 An oral administration agent or suppository for improving hyperalgesia in the large intestine, which contains β-1,3-1,6-glucan derived from a microorganism belonging to the genus Aureobasidium. β-１,３-１,６-グルカンが、β-１,３結合に対するβ-１,６結合の分岐度が５０〜１００％であるβ-１,３-１,６-グルカンである請求項７に記載の剤。   β-1,3-1,6-glucan is β-1,3-1,6-glucan having a degree of branching of β-1,6 bond with respect to β-1,3 bond of 50 to 100%. Item 8. The agent according to Item 7. オーレオバシジウム属の微生物が、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（ＦＥＲＭ
Ｐ-１９２８６）である請求項７または８に記載の剤。 The microorganism belonging to the genus Aureobasidium is Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain (FERM P-19285) or GM-NH-1A2 strain (FERM).
The agent according to claim 7 or 8, which is P-19286).

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