JP5585769B2 - Effect promoter for lactic acid bacteria with intestinal immunity activation ability - Google Patents
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Description
本発明は、高い免疫賦活効果（ＩｇＡ抗体産生向上）をもたらす免疫賦活効果促進剤、ならびにそれを含有する免疫賦活に有用な健康食品又は機能性食品に関する。 The present invention relates to an immunostimulatory effect promoter that provides a high immunostimulatory effect (IgA antibody production improvement), and a health food or functional food useful for immunostimulation containing the same.
人体において、腸管は体外から取り込む異物に対しての免疫（腸管免疫又は粘膜免疫と呼ばれる）を担う中心的役割を果たしている。腸管は日常的な食事を通して、日々多くの物質が取り込まれている。腸管での免疫応答機構は、取り込まれる多くの物質を人体に有用な物質と有害な物質（毒性物質、異物や病原性微生物など）に選別し、有害な物質のみを特異的に除去することが求められている。この腸管免疫系においては、抗原特異的な抗体反応による免疫が特に重要なものとなっている。 In the human body, the intestinal tract plays a central role in immunizing foreign bodies taken from outside the body (called intestinal tract immunity or mucosal immunity). Many substances are taken into the intestine every day through daily meals. The immune response mechanism in the intestinal tract can sort out many substances to be taken into useful substances and harmful substances (toxic substances, foreign substances, pathogenic microorganisms, etc.) and remove only harmful substances specifically. It has been demanded. In the intestinal tract immune system, immunity by antigen-specific antibody reaction is particularly important.
腸管での免疫応答機構において最も重要な組織は、小腸に多く存在するパイエル板と呼ばれる組織である。パイエル板には腸管免疫を誘導、制御するために必要なすべての免疫担当細胞群が存在しており、腸管免疫の司令塔としての役割を担っている（非特許文献１）。 The most important tissue in the immune response mechanism in the intestinal tract is a tissue called Peyer's patch, which is abundant in the small intestine. The Peyer's patch has all the immunocompetent cell groups necessary for inducing and controlling intestinal immunity and plays a role as a control tower for intestinal immunity (Non-patent Document 1).
また、腸管免疫系において細菌毒素やウイルスの凝集・中和、組織への細菌付着の抑制などの機能を持ち、免疫機構の主役として機能するものは免疫グロブリンＡ（以下ＩｇＡ抗体という）である。前述したようにパイエル板は、腸管での免疫応答において最も重要な組織であり、このパイエル板細胞からのＩｇＡ抗体産生を効率的に誘導することが腸管免疫の賦活において重要である。 In addition, immunoglobulin A (hereinafter referred to as IgA antibody) has functions such as aggregation / neutralization of bacterial toxins and viruses and suppression of bacterial adhesion to tissues in the intestinal tract immune system, and functions as the main part of the immune mechanism. As described above, Peyer's patch is the most important tissue in the immune response in the intestinal tract, and efficiently inducing IgA antibody production from Peyer's patch cells is important in stimulating intestinal immunity.
免疫系には、大別して自然免疫と呼ばれるものと獲得免疫と呼ばれるものがある。自然免疫は、皮膚や粘膜といった上皮細胞などによる外来異物に対する物理的障壁（バリアー）や食細胞の貪食による防御機構など、人にあらかじめ備わった非特異的な防御機構である。一方、獲得免疫とはリンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞）の免疫応答によって獲得される特異的防御機構である。 The immune system is roughly divided into what is called innate immunity and what is called acquired immunity. Innate immunity is a non-specific defense mechanism provided in advance to humans, such as a physical barrier against foreign foreign substances such as epithelial cells such as skin and mucous membranes, and a defense mechanism by phagocytosis of phagocytes. On the other hand, acquired immunity is a specific defense mechanism acquired by the immune response of lymphocytes (B cells, T cells).
獲得免疫は、さらに細胞性免疫と液性免疫という２種類の免疫系に大別される。細胞性免疫とは、Ｔ細胞が直接的に働き、ウイルスに感染した細胞や細胞内で増殖する病原体を細胞ごと殺傷する免疫系である。一方、液性免疫は、抗体や補体が中心となり、主に細胞外で増殖する病原体を排除する免疫系である。細胞性免疫は、Ｔｈ１細胞（Ｔｈ１型のヘルパーＴ細胞）によって誘導され、液性免疫は、Ｔｈ２細胞（Ｔｈ２型のヘルパーＴ細胞）によって誘導される。 Acquired immunity is further divided into two types of immune systems, cellular immunity and humoral immunity. Cellular immunity is an immune system in which T cells act directly to kill cells infected by viruses and pathogens that grow in the cells. On the other hand, humoral immunity is an immune system that eliminates pathogens mainly growing outside cells, mainly antibodies and complements. Cellular immunity is induced by Th1 cells (Th1-type helper T cells), and humoral immunity is induced by Th2 cells (Th2-type helper T cells).
パイエル板細胞から産生されるＩｇＡ抗体による免疫機構は、抗原特異的免疫反応（獲得免疫）によるものであり、液性免疫に分類される。 The immune mechanism by IgA antibodies produced from Peyer's patch cells is based on an antigen-specific immune reaction (acquired immunity) and is classified as humoral immunity.
乳酸菌体またはその処理物（菌体由来成分）が、パイエル板細胞に対するＩｇＡ抗体産生向上作用を有していることが知られている（特許文献１）。特許文献１には、感染症予防、腫瘍抑制、アレルギー抑制及び整腸作用などの効果が期待され、免疫賦活剤や整腸剤などに利用できることが記載されている。
It is known that lactic acid bacterial cells or processed products thereof (cell-derived components) have an IgA antibody production improving effect on Peyer's patch cells (Patent Document 1).
しかしながら、一般的に、乳酸菌体またはその処理物（菌体由来成分）がもたらす免疫賦活活性及び免疫調節機能は、菌種が同一であっても菌株が違えばその効果も大きく異なることが知られている。そのため免疫賦活剤として用いる際には、用いる菌株の選定が非常に重要となる。そこで多くの研究機関において、より免疫賦活活性及び免疫調節機能の高い乳酸菌株の単離が行なわれている。 However, it is generally known that the immunostimulatory activity and the immunoregulatory function brought about by lactic acid bacterial cells or processed products thereof (cell-derived components) have greatly different effects even if the bacterial strain is the same. ing. Therefore, when using as an immunostimulator, selection of the strain to be used is very important. Therefore, in many research institutes, isolation of lactic acid strains having higher immunostimulatory activity and immunoregulatory functions has been performed.
また、新規乳酸菌株の探索のみでなく、免疫賦活活性及び免疫調整機能を有する既存菌株の培養法を改良することによって、従来の培養方法で得られる菌体よりも高い免疫賦活活性を有する菌体を得る手法の開発も行なわれている。
例えば、アスパラガス処理物を含有する培地で乳酸菌を培養することで、通常の培地で培養する場合よりも高い免疫調節作用（ＩＮＦ-γ産生促進効果）が得られること（特許文献２）が知られている。しかしながら、上記文献に記載の方法では、天然由来成分を培地として用いており、産地や季節によって含有成分にバラツキが生じやすく、培地成分としての安定性に欠ける。また、培養に用いるために、粉砕や抽出などの工程を必要とし、製造工程や製造コストにおいて、実用的とは言えない。
In addition to searching for new lactic acid bacterial strains, cells that have higher immunostimulatory activity than those obtained by conventional culture methods by improving the culture method of existing strains that have immunostimulatory activity and immune regulation function Development of techniques to obtain
For example, it is known that by culturing lactic acid bacteria in a medium containing an asparagus-treated product, a higher immunoregulatory effect (INF-γ production promoting effect) can be obtained than when cultivating in a normal medium (Patent Document 2). It has been. However, in the method described in the above document, a naturally-derived component is used as a medium, and the contained component tends to vary depending on the production area and season, and lacks stability as a medium component. Moreover, in order to use for culture | cultivation, processes, such as a grinding | pulverization and extraction, are required, and it cannot be said that it is practical in a manufacturing process and manufacturing cost.
一方、β-グルカン（β-１,３-Ｄ-グルカン、あるいはβ-１,６-Ｄ-グルカン、あるいはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンなど）が、自然界に生息する担子菌の子実体、又は培養菌糸体に含まれていることがあきらかになりつつある。また、不完全菌であるオーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物もβ-グルカンを菌体外に生産することが知られている（非特許文献２）。オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物が産生するβ-グルカンを含有する培養液は、各種アレルギーの低減効果、免疫異常疾患の改善効果、がん抑制効果があることを記載している。（特許文献３）しかしながら、オーレオバシジウム属の培養液は、菌体外生産されたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むことから粘度が高く、その培養液から菌体を除去し、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを回収、精製することは非常に困難であった。（非特許文献３） On the other hand, β-glucan (β-1,3-D-glucan, or β-1,6-D-glucan, or β-1,3-1,6-D-glucan, etc.) inhabit the natural world It is becoming clear that it is contained in the fruit body of a fungus or a cultured mycelium. In addition, microorganisms belonging to the genus Aureobasidium sp., Which is an incomplete bacterium, are also known to produce β-glucan outside the microbial cells (Non-patent Document 2). It describes that a culture solution containing β-glucan produced by a microorganism belonging to the genus Aureobasidium sp. Has various allergy reducing effects, immune abnormal disease improving effects, and cancer suppressing effects. . However, the culture solution of the genus Aureobasidium has a high viscosity because it contains β-1,3-1,6-D-glucan produced outside the cell, and the cell is removed from the culture. It was very difficult to remove and recover and purify β-1,3-1,6-D-glucan. (Non Patent Literature 3)
しかしながら、本願発明者らは、オーレオバシジウム属の培養液より、精製β-Ｄ−グルカンを製造する方法として、オーレオバシジウム属の培養液をアルカリ処理により低粘度化後微生物を除去し、中和処理を行い、エタノールを添加し得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを噴霧乾燥し、粉末化する製法（特許文献４）を報告している。また、上記記載の方法によって得られた精製β-グルカンには、便通改善作用、メタボリックシンドローム改善作用などの効果があることを報告している（特許文献５、６）。しかしながら、精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと他の素材の組合せによる免疫賦活効果に関する知見は得られていない。 However, as a method for producing purified β-D-glucan from a culture medium of Aureobasidium, the present inventors removed microorganisms after reducing the viscosity of the culture medium of Aureobasidium by alkali treatment, A production method (Patent Document 4) in which β-1,3-1,6-D-glucan obtained by performing a sum treatment and adding ethanol is spray-dried and powdered is reported. Moreover, it has been reported that the purified β-glucan obtained by the above-described method has effects such as a bowel movement improving action and a metabolic syndrome improving action (Patent Documents 5 and 6). However, the knowledge regarding the immunostimulatory effect by the combination of purified β-1,3-1,6-D-glucan and other materials has not been obtained.
乳酸菌とその他の素材の組合せによる免疫活性に関する既存技術として、オーツ麦などのイネ科穀粒及びその加工物とラクトバチルス・カゼイなどの乳酸菌とを組合わせることによって、マクロファージが活性化され、ＩＬ-１２とＩＦＮ-γの産生量が増大する（特許文献７）ことが知られている。ＩＬ-１２及びＩＦＮ-γは、ともにＴｈ１型サイトカインであり、細胞性免疫を活性化する。しかし、腸管免疫系の賦活に重要なＩｇＡ抗体産生向上効果（液性免疫活性）についてはなんら言及されておらず、効果も定かではない。 As an existing technology related to immune activity by combining lactic acid bacteria with other materials, macrophages are activated by combining cereal grains such as oats and processed products thereof with lactic acid bacteria such as Lactobacillus casei, and IL- 12 and IFN-γ production are known to increase (Patent Document 7). IL-12 and IFN-γ are both Th1-type cytokines and activate cellular immunity. However, no mention is made of the IgA antibody production improving effect (humoral immune activity) important for the activation of the intestinal tract immune system, and the effect is not clear.
また、乳酸菌体とβ-グルカンを含む培養物とを組合せることにより、それらを単独で用いた場合と比べて、病原菌による感染を抑制できること（特許文献８）が知られている。しかし、この発明においては、マクロファージ、ＮＫ細胞及びＴ細胞を中心とした細胞性免疫機構の活性効果を目的としたものであり、腸管免疫の賦活に対する効果（ＩｇＡ抗体産生向上）は定かではない。 Further, it is known that by combining lactic acid bacteria and a culture containing β-glucan, infection by pathogenic bacteria can be suppressed as compared with the case where they are used alone (Patent Document 8). However, in this invention, it aims at the activation effect of the cellular immune mechanism centering on macrophages, NK cells, and T cells, and the effect on the activation of intestinal immunity (IgA antibody production improvement) is not clear.
また、乳酸菌体とオーレオバシジウム属の培養液とを組合せることにより、病原菌感染の抑制やＩＦＮ-γ産生促進（細胞性免疫向上）において、相乗的効果をもたらすことも知られている（特許文献９）が、やはり細胞性免疫の活性化を目的としたものであり、腸管免疫の賦活に対する効果（ＩｇＡ抗体産生向上）は定かではない。また、いずれの先行技術も、アガリクス抽出エキス、またはオーレオバシジウム培養液などの未精製β-グルカン混合物を用いたものである。培養に用いる培地成分などのβ-グルカン以外の物質の機能については、未解明の部分も多く、場合によって、それらの成分がβ-グルカンや乳酸菌が持つ免疫賦活作用を阻害し、期待する効果が得られないことや健康を害する副作用をもたらす可能性が考えられる。また、経口投与を目的とした医薬品や飲食用素材として用いるためには、飲食に適した風味の確保も重要である。培養液の培地成分などβ-グルカン以外の成分が多ければ、香味に大きく影響し、異味・異臭の原因となるため問題である。 It is also known that a combination of lactic acid bacteria and a culture medium of Aureobasidium produces a synergistic effect in suppressing infection with pathogenic bacteria and promoting IFN-γ production (improving cellular immunity) (patents) Reference 9) is also aimed at activating cellular immunity, and the effect on the activation of intestinal immunity (improvement of IgA antibody production) is not clear. Each of the prior arts uses an agaricus extract or an unpurified β-glucan mixture such as an aureobasidium culture solution. Regarding the functions of substances other than β-glucan such as medium components used for culture, there are many unexplained parts, and in some cases, these components inhibit the immunostimulatory action of β-glucan and lactic acid bacteria and have the expected effect. It can be impossible to obtain and may cause side effects that are harmful to health. Moreover, in order to use it as a pharmaceutical for oral administration or a material for eating and drinking, it is also important to ensure a flavor suitable for eating and drinking. If there are many components other than β-glucan, such as medium components in the culture solution, this greatly affects the flavor and causes a taste and odor.
以上のように、人の健康維持のためには、腸管免疫を賦活すること（ＩｇＡ抗体産生向上）が重要である。しかし、従来技術では、腸管免疫賦活効果を持つ乳酸菌株の研究は行われているものの、それらの高免疫賦活乳酸菌株と併用して用いることができ、その能力を安全かつ効果的に高めるための手段について、十分な検討が成されていなかった。また、乳酸菌と別の免疫賦活物質を混合することにより、相乗的な免疫賦活効果を求める試みはなされているものの、細胞性免疫機構の賦活化を目的としたものが主であり、腸管免疫賦活（ＩｇＡ抗体産生向上）について評価したものはほとんどなかった。 As described above, to maintain human health, it is important to activate intestinal immunity (improve IgA antibody production). However, in the prior art, although research on lactic acid strains having intestinal immunity stimulating effect has been conducted, it can be used in combination with these highly immunostimulatory lactic acid strains, and the ability to enhance its ability safely and effectively Sufficient examination was not made about the means. Although attempts have been made to obtain a synergistic immunostimulatory effect by mixing lactic acid bacteria with another immunostimulatory substance, the main purpose is to activate the cellular immune system. Few things were evaluated for (IgA antibody production improvement).
本発明は、パイエル板細胞に対する高いＩｇＡ抗体産生誘導能を有する乳酸菌体またはその処理物（菌体由来成分）と併用して使用することで、乳酸菌体またはその処理物（菌体由来成分）を単独で用いた場合と比べて、高い腸管免疫賦活効果（ＩｇＡ抗体産生向上）をもたらす免疫賦活効果促進剤を提供することを課題とする。 The present invention can be used in combination with a lactic acid bacterium having high IgA antibody production-inducing ability against Peyer's patch cells or a processed product thereof (a component derived from a microbial cell). It is an object of the present invention to provide an immunostimulatory effect promoter that provides a higher intestinal immunity activation effect (improves IgA antibody production) than when used alone.
本発明者らは上記の事情に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）の培養液から、培地由来成分などの不純物を除去した精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが、乳酸菌体またはその処理物（菌体由来成分）が有するＩｇＡ抗体産生誘導能を促進することを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、オーレオバシジウム属微生物培養液の状態（未精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン）では、乳酸菌体またはその処理物（菌体由来成分）が有するＩｇＡ抗体産生誘導能を抑制してしまい、乳酸菌単独で用いたときほど、腸管免疫賦活の効果が得られないことを発見した。本発明によって、精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、Lactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０、Lactobacillus reuteri ＪＣＭ１０８１、またはLactobacillus plantarum ＨＳＫ２０１ＤのＩｇＡ抗体産生誘導能を、乳酸菌単独で用いた場合より有意（統計学的有意水準５%）に促進・増強する。 In view of the above circumstances, the present inventors have conducted extensive research, and as a result, purified β-1,3-1, from which impurities such as medium-derived components have been removed from the culture solution of Aureobasidium sp. It has been found that 6-D-glucan promotes the IgA antibody production inducing ability of lactic acid bacterial cells or processed products thereof (cell-derived components), and the present invention has been completed. Furthermore, in the state of an aureobasidium microorganism culture solution (unpurified β-1,3-1,6-D-glucan), the ability to induce IgA antibody production possessed by lactic acid bacterial cells or processed products thereof (cell-derived components) is reduced. It has been found that the effect of intestinal immunity activation cannot be obtained as much as when lactic acid bacteria are used alone. According to the present invention, purified β-1,3-1,6-D-glucan is significantly more effective than Lactobacillus plantarum IFO3070, Lactobacillus reuteri JCM1081, or Lactobacillus plantarum HSK201D inducing IgA antibody production (statistics). Promote / enhance to a scientific significance level of 5%).
本発明は、上記知見に基づき完成された物であり、以下に高い免疫賦活効果（ＩｇＡ抗体産生向上）をもたらす免疫賦活効果促進剤、ならびにそれを含有する免疫賦活に有用な健康食品又は機能性食品を提供する。
項１. Lactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０、Lactobacillus reuteri ＪＣＭ１０８１、およびLactobacillus plantarum ＨＳＫ２０１Ｄから選択される少なくとも１種の菌体またはその処理物が有する、パイエル板細胞に対するＩｇＡ抗体産生誘導効果を向上させる、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）の培養液より精製した以下の（１）-（２）の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン
（１）１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する；
（２）水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下。
項２. パイエル板細胞に対するＩｇＡ抗体産生能を有するLactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０、Lactobacillus reuteri ＪＣＭ１０８１、およびLactobacillus plantarum ＨＳＫ２０１Ｄから選択される少なくとも１種の菌体またはその処理物と
上記記載の乳酸菌が有するパイエル板細胞に対するＩｇＡ抗体産生誘導効果を向上させるオーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）の培養液より精製した以下の（１）-（２）の性質を有するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン
（１）１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有する；
（２）水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下である、
を含有することを特徴とする腸管免疫賦活効果促進剤。
項３. 項２に記載の免疫賦活効果促進剤を含有する健康食品又は機能性食品。
The present invention has been completed on the basis of the above-mentioned findings, and the following immunostimulatory effect promoter that provides a high immunostimulatory effect (IgA antibody production improvement), and health food or functionality useful for immunostimulation containing the same Provide food.
(2) The viscosity of the aqueous solution at 30 ° C., pH 5.0, and concentration 0.5 (w / v%) is 200 cP (mPa · s) or less.
(2) The viscosity of the aqueous solution at 30 ° C., pH 5.0, concentration 0.5 (w / v%) is 200 cP (mPa · s) or less.
Intestinal immunity activation effect promoter characterized by containing this.
Item 3. A health food or functional food containing the immunostimulatory effect promoter according to
本発明の免疫賦活効果促進剤は、乳酸菌体またはその処理物（菌体由来成分）と併用して用いることで、乳酸菌体またはその処理物を単独で用いる場合と比べて、乳酸菌が有するパイエル板細胞が産生するＩｇＡ抗体の量を増大させ、腸管免疫系の活性化をもたらし、病原性微生物による感染症やそれらが産生する毒素による健康阻害の予防に有用である。また、精製したβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを主成分とするため、培地由来成分に起因する拮抗作用や副作用の可能性を排除することができ、安全かつ風味良好で飲食に適した機能性飲食品素材として用いることができる。 The immunostimulatory effect promoter of the present invention is used in combination with a lactic acid bacterium or a processed product thereof (a component derived from a microbial cell), so that the Peyer's plate possessed by the lactic acid bacterium is larger than when the lactic acid bacterium or the processed product is used alone It increases the amount of IgA antibody produced by the cells, brings about activation of the intestinal tract immune system, and is useful for preventing infections caused by pathogenic microorganisms and health inhibition by toxins produced by them. In addition, since it contains purified β-1,3-1,6-D-glucan as a main component, it can eliminate the antagonistic action and side effects caused by the medium-derived components, and it is safe and good in flavor. It can be used as a functional food / beverage material suitable for food.
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本発明において、以下β-グルカン又はβ-Ｄ-グルカンとある記載は、β-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを意味する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, the following description of β-glucan or β-D-glucan means β-1,3-1,6-D-glucan.
（Ｉ）腸管免疫賦活能を有する乳酸菌について
本発明で用いられる乳酸菌として、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、エンテロコッカス属、ペディオコッカス属、テトラジェノコッカス属、ストレプトコッカス属に属し、パイエル板細胞からのＩｇＡ抗体産生を誘導する作用（腸管免疫賦活能）を有し、ネガティブコントロールにおけるＩｇＡ抗体産生量と比較して、ＩｇＡ抗体産生量を１．５倍以上向上させる乳酸菌を用いることができる。中でも、パイエル板細胞からのＩｇＡ抗体産生を強く誘導する作用（腸管免疫賦活能）を有するLactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０、Lactobacillus reuteri ＪＣＭ１０８１、またはLactobacillus plantarum ＨＳＫ２０１Ｄが好ましく、Lactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０、またはLactobacillus reuteri ＪＣＭ１０８１がより好ましい。上記乳酸菌は、単独で用いてもよく、複数の乳酸菌を組合せても用いてもよい。また、上記乳酸菌を培養により調整してもよく、市販されている乳酸菌を用いることも可能である。
(I) Lactic acid bacteria having intestinal immunity stimulating ability As lactic acid bacteria used in the present invention, belonging to the genus Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus, Tetragenococcus, Streptococcus, Use of a lactic acid bacterium that has the effect of inducing IgA antibody production from Peyer's patch cells (intestinal immunity activation ability) and improves the IgA antibody production amount by 1.5 times or more compared to the IgA antibody production amount in the negative control Can do. Among them, Lactobacillus plantarum IFO3070, Lactobacillus reuteri JCM1081, or Lactobacillus plantarum HSK201D having the action of strongly inducing IgA antibody production from Peyer's patch cells (intestinal immunity stimulating ability) is preferable, and Lactobacillus plantarum IFO3070 or Lactobacillus plantarum IFO3070 is preferable. The lactic acid bacteria may be used alone or in combination of a plurality of lactic acid bacteria. Moreover, the lactic acid bacteria may be prepared by culturing, and commercially available lactic acid bacteria can also be used.
上記乳酸菌を培養によって調整する場合は、天然培地、合成培地、半合成培地などの培地で培養することによって得ることができる。培地としては、窒素源および炭素源を含有するものが用いられる。窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸などが挙げられる。炭素源としては、例えば、グルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、水あめ、麹汁、でんぷん、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリンなどが上げられる。このほか、無機質として、例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン、更に各種ビタミン類その他を添加することができる。具体的には、ＧＹＰ培地、ＧＡＭ培地、ＭＲＳ培地などを例示することができる。 When adjusting the said lactic acid bacteria by culture | cultivation, it can obtain by culturing with culture media, such as a natural culture medium, a synthetic culture medium, and a semi-synthetic culture medium. A medium containing a nitrogen source and a carbon source is used as the medium. Examples of the nitrogen source include meat extract, peptone, gluten, casein, yeast extract, amino acid and the like. Examples of the carbon source include glucose, xylose, fructose, inositol, syrup, starch juice, starch, bacus, bran, molasses, glycerin and the like. In addition, as an inorganic substance, for example, ammonium sulfate, potassium phosphate, magnesium chloride, sodium chloride, iron, manganese, molybdenum, and various vitamins can be added. Specific examples include GYP medium, GAM medium, MRS medium, and the like.
培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２７〜３７℃であり、培養時間は、１２〜１２０時間程度である。培地のｐＨは４〜９、好ましくは６〜７である。ｐＨがこの範囲をはずれると増殖速度が低下する問題があるため、必要に応じて培養中にアルカリを用いて培養液のｐＨを調整してもよい。ｐＨ調整に用いるものは、通常の培養に用いるものであればよく、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア水、炭酸カルシウムなどを例示できる。また、培養は、静置、振盪、攪拌のいずれでもよい。通気は、通常必要ないが培養手法に応じて適宜行えばよい。培養液はそのまま濃縮、または粉末化したものを乳酸菌体含有物として用いてもよく、培養液から遠心分離やろ過等により菌体を回収した後、蒸留水や生理食塩水などで菌体を洗浄してから用いてもよい。 The culture temperature is 20 to 50 ° C., preferably 27 to 37 ° C., and the culture time is about 12 to 120 hours. The pH of the medium is 4-9, preferably 6-7. When the pH is out of this range, there is a problem that the growth rate is lowered. Therefore, if necessary, the pH of the culture solution may be adjusted using an alkali during the culture. What is used for pH adjustment should just be what is used for normal culture, for example, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, ammonia water, calcium carbonate etc. can be illustrated. In addition, the culture may be any of stationary, shaking, and stirring. Aeration is not usually necessary, but may be appropriately performed according to the culture method. The culture solution may be concentrated or powdered as it is, and used as a lactic acid bacterium-containing material. After collecting the microbial cells from the culture solution by centrifugation or filtration, the microbial cells are washed with distilled water or physiological saline. It may be used after that.
本願発明に用いる乳酸菌は、菌体をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、粉末状、水溶液の状態、ペレット状態にすることも可能である。また、粉末状のものを一旦水溶液の状態にし、再度粉末化させたものを用いてもよい。すなわち、乳酸菌の菌体が存在する状態であればよく、乳酸菌の形状は問わない。 As the lactic acid bacteria used in the present invention, the cells may be used as they are, but if necessary, they can be in the form of powder, aqueous solution or pellet. Moreover, you may use the powdery thing once made into the state of aqueous solution, and pulverized again. That is, the shape of the lactic acid bacterium is not limited as long as microbial cells of lactic acid bacterium are present.
また、乳酸菌における腸管免疫賦活効果は、乳酸菌体またはその処理物（即ち、細胞壁成分、細胞外多糖、ＤＮＡ断片等の菌体に由来する成分）が腸管に存在する免疫細胞により異物として認識されることによって生じると考えられているため、乳酸菌自体の生死については影響を受けない。 Moreover, the intestinal immunity activation effect in lactic acid bacteria is recognized as a foreign substance by immune cells existing in the intestinal tract of lactic acid bacteria or processed products thereof (that is, components derived from cells such as cell wall components, extracellular polysaccharides, DNA fragments). Therefore, it is not affected by the life and death of lactic acid bacteria.
乳酸菌体を殺菌する場合、その殺菌方法は、加熱処理、抗生物質などの薬剤処理、電子線、紫外線、放射線等の物理的処理のいずれの殺菌方法を用いてもよいが、工業的には作業の容易さから、加熱処理が好ましい。 When sterilizing lactic acid bacteria, the sterilization method may be any sterilization method such as heat treatment, chemical treatment such as antibiotics, physical treatment such as electron beam, ultraviolet ray, radiation, etc. From the viewpoint of easiness, heat treatment is preferable.
乳酸菌体処理物とは、酵素処理やホモジナイズ、超音波処理等の方法で菌体を破壊した破砕物、または、それらの抽出液であるが、細胞壁成分や細胞外多糖成分、ＤＮＡ成分等の菌体成分を分画したものであってもよい。 The lactic acid bacterial product is a crushed product obtained by destroying the bacterial cell by a method such as enzyme treatment, homogenization, or ultrasonic treatment, or an extract thereof, but it is a cell wall component, extracellular polysaccharide component, DNA component, etc. It may be a fraction of body components.
乳酸菌体またはその処理物を、粉末状、水溶液の状態、ペレット状態などで用いる場合は、適当な担体を添加した後、定法により顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ゲル状、ペースト状、乳状、懸濁状、液状、飲料等の食用に適した形態に成形してもよい。 When using lactic acid bacteria or its treated product in powder, aqueous solution, pellet form, etc., after adding an appropriate carrier, granulate, granule, tablet, capsule, gel, paste, milk, You may shape | mold in the form suitable for edibles, such as suspension form, liquid form, and a drink.
固形状に調整する際には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、着色剤等常法で用いられているものを用いればよく、そのような担体の例としては、賦形剤としては乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット、デキストリン、デンプン、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、プルラン、無水ケイ酸、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム等を、結合剤としては結晶セルロース、白糖、マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、デキストラン、プルラン、水、エタノール等を、崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デキストリン、結晶セルロース等を、滑沢剤としてはステアリン酸およびその金属塩、タルク、ホウ酸、脂肪酸ナトリウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、無水ケイ酸等を、矯味矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。 When adjusting to a solid, what is used in conventional methods such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, and coloring agents may be used, and examples of such carriers As an excipient, lactose, sucrose, glucose, mannitol, sorbit, dextrin, starch, crystalline cellulose, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, dextran, pullulan, anhydrous silicic acid, calcium phosphate, calcium carbonate, calcium sulfate, etc. Binders include crystalline cellulose, sucrose, mannitol, dextrin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, gum arabic, dextran, pullulan, water, ethanol, etc., and disintegrants include starch, carboxymethylcellulose, hydroxypropyl Pyrcellulose, dextrin, crystalline cellulose, etc., as a lubricant, stearic acid and its metal salts, talc, boric acid, fatty acid sodium salt, sodium lauryl sulfate, magnesium lauryl sulfate, silicic acid anhydride, etc. Examples include sucrose, orange peel, citric acid, tartaric acid and the like.
液体状に調整する際には、乳化剤、可溶化剤、分散剤、懸濁化剤、粘調剤、緩衝剤、安定化剤、矯味矯臭剤等常法で用いられているものを用いればよく、乳化剤および可溶化剤としてはレシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム等を、分散剤および懸濁化剤としては、レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン等を、粘調剤としてはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン等を、緩衝剤としてはクエン酸塩、コハク酸塩等を、安定化剤としてはレシチン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロースを、矯味矯臭剤としては上記したものを例示できる。 When adjusting to a liquid state, an emulsifier, a solubilizer, a dispersant, a suspending agent, a thickening agent, a buffering agent, a stabilizer, a flavoring agent, etc. may be used, As the emulsifier and solubilizer, lecithin, sucrose fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, sodium lauryl sulfate and the like, and as the dispersant and suspending agent, lecithin, sucrose fatty acid ester, methylcellulose, gum arabic, gelatin and the like, As a thickener, methylcellulose, carboxymethylcellulose, gum arabic, gelatin, etc., as a buffer, citrate, succinate, etc., as a stabilizer, lecithin, gum arabic, gelatin, methylcellulose, as a flavoring agent What was mentioned above can be illustrated.
また、味質の改善のために、糖類、糖アルコール類、塩類、油脂類、アミノ酸類、有機酸類、果汁、野菜汁、香料、香辛料、アルコール類、グリセリン等を添加することができる。またｐＨ調整のために、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、酪酸、乳酸、コハク酸、リンゴ酸、シュウ酸、クエン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア水等を添加することができる。 In addition, sugars, sugar alcohols, salts, oils and fats, amino acids, organic acids, fruit juices, vegetable juices, fragrances, spices, alcohols, glycerin, and the like can be added to improve the taste. In addition, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, acetic acid, butyric acid, lactic acid, succinic acid, malic acid, oxalic acid, citric acid, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, aqueous ammonia, etc. are added for pH adjustment. be able to.
（II）精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン
本発明における精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物に由来するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むものである。このβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、好ましくは、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有し、かつ水溶液の３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が好ましくは２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下のものである。上記粘度の下限値は通常１０ｃＰ（ｍＰａ・s）程度であり得る。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
(II) Purified β-1,3-1,6-D-glucan The purified β-1,3-1,6-D-glucan in the present invention is derived from a microorganism belonging to the genus Aureobasidium sp. It contains β-1,3-1,6-D-glucan. This β-1,3-1,6-D-glucan preferably has two signals with a 1 H NMR spectrum of about 4.7 ppm and about 4.5 ppm in a solution containing 1N sodium hydroxide heavy aqueous solution as a solvent. And the viscosity of the aqueous solution at 30 ° C., pH 5.0, concentration 0.5 (w / v%) is preferably 200 cP (mPa · s) or less, more preferably 100 cP (mPa · s) or less, and still more preferably 50 cP (mPa · s) or less. The lower limit of the viscosity is usually about 10 cP (mPa · s). Since it is well known that NMR measurement values change due to subtle changes in conditions and are accompanied by errors, “about 4.7 ppm” and “about 4.5 ppm” are measured values within the normally expected range. A numerical value including a fluctuation range (for example, ± 0.2).
オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン
オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、菌体外に分泌されるため、キノコ類やパン酵母の細胞壁に含まれるβ-グルカンと比べて、回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が１００万以上の高分子量のグルカンから分子量が数万程度の低分子のグルカンまでを培養条件に応じて産生することができる。
Β-1,3-1,6-D-glucan produced by Aureobasidium microorganisms β-1,3-1,6-D-glucan produced by Aureobasidium microorganisms is secreted outside the cells. Therefore, compared to β-glucan contained in cell walls of mushrooms and baker's yeast, it is preferable in that it can be easily recovered and is water-soluble. Aureobasidium microorganisms can produce high-molecular-weight glucans having a molecular weight of 1 million or more to low-molecular-weight glucans having a molecular weight of about tens of thousands according to the culture conditions.
中でも、オーレオバシジウム・プルランス(Aureobasidium pullulans)が生産するものが好ましく、オーレオバシジウム・プルランスＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、又はＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株（独立行政法人産業技術研究所特許生物寄託センターにそれぞれＦＥＲＭ
Ｐ-１９２８５及びＦＥＲＭ Ｐ-１９２８６として寄託済み）が産生するものがより好ましい。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、オーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）Ｋ-１株の変異株である。オーレオバシジウム属K-1株は、分子量２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生することが知られている。
Among them, those produced by Aureobasidium pullulans are preferable, and Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain or GM-NH-1A2 strain (incorporated administrative agency National Institute of Industrial Science and Technology patent biological deposit center) FERM respectively
More preferred are those produced by P-19285 and FERM P-19286). The GM-NH-1A1 and GM-NH-1A2 strains are mutants of the Aureobasidium sp. K-1 strain. The Aureobasidium genus K-1 strain is known to produce two types of β-1,3-1,6-D-glucan having a molecular weight of 2 million or more and about 1 million.
また、オーレオバシジウム属細菌が産生するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、通常、硫黄含有基を有するところ、Ｋ-１株の産生するβ−グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株、及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株が生産するβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンもスルホ酢酸基を有すると考えられる。オーレオバシジウム属微生物の中には、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基などを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生する菌種、菌株も存在する。 In addition, β-1,3-1,6-D-glucan produced by bacteria belonging to the genus Aureobasidium usually has a sulfur-containing group, whereas β-glucan produced by the K-1 strain has a sulfoacetic acid group. (Arg. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983)), science and industry, 64, 131-135 (1990)). It is considered that β-1,3-1,6-D-glucan produced by the GM-NH-1A1 strain and the GM-NH-1A2 strain also has a sulfoacetic acid group. Among microorganisms belonging to the genus Aureobasidium, there are also species and strains that produce β-1,3-1,6-D-glucan containing a phosphorus-containing group such as a phosphate group, a malate group, and the like.
ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株及びＧＭ-ＮＨ-１Ａ２株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上５０〜２５０万の高分子量のβ−グルカン（微粒子グルカン）とメインピークが見かけ上２〜３０万の低分子量のβ−グルカンの両方を産生する菌株である。この微粒子状グルカンは、一次粒子径が０．０５〜２μｍ程度である。 The GM-NH-1A1 strain and the GM-NH-1A2 strain have a high molecular weight β-glucan (fine particle glucan) having an apparent main peak of 500 to 2.5 million and an apparent peak of 2 to 2, as will be described later in Examples. It is a strain that produces both 300,000 low molecular weight β-glucan. The fine particle glucan has a primary particle diameter of about 0.05 to 2 μm.
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの溶解度は、ｐＨ及び温度に依存する。このβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、ｐＨ３．５、温度２５℃の条件で２ｍｇ／ｍｌ水溶液を調整しようとすると、その５０重量％以上が一次粒子径０．０５〜２μｍの微粒子を形成し、残部は水に溶解する。本発明において粒子径は、レーザー回折散乱法により測定した値である。 The solubility of β-1,3-1,6-D-glucan depends on pH and temperature. This β-1,3-1,6-D-glucan has a primary particle size of 0.05 to 2 μm when 50% by weight or more of the 2 mg / ml aqueous solution is prepared under the conditions of pH 3.5 and temperature 25 ° C. Fine particles are formed, and the remainder is dissolved in water. In the present invention, the particle diameter is a value measured by a laser diffraction scattering method.
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが水溶液として製剤中に含まれている場合は、レシチンのような乳化剤や、環状デキストリンのような安定化剤を水溶液に添加することにより、微粒子をさらに安定化させることができる。 When β-1,3-1,6-D-glucan is contained in the preparation as an aqueous solution, fine particles can be obtained by adding an emulsifier such as lecithin or a stabilizer such as cyclic dextrin to the aqueous solution. Can be further stabilized.
また、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンがオーレオバシジウム・プルランス由来のものである場合は、β-１，３結合／β-１，６結合の結合比は、１〜１．５程度、特に１．１〜１．４程度である。 When β-1,3-1,6-D-glucan is derived from Aureobasidium pullulans, the binding ratio of β-1,3 bond / β-1,6 bond is 1-1. About 5 and especially about 1.1 to 1.4.
本発明に、特に好適に用いられるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン
本発明に、特に好適に用いられるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、水溶液にしたときの粘度が、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンより低い。この低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、０．５％(w/v)水溶液（ｐＨ５．０）の３０℃における粘度が好ましくは２００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、より好ましくは１００ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、さらに好ましくは５０ｃＰ（ｍＰａ・s）以下であり、よりさらに好ましくは１０ｃＰ以下である。本発明において、粘度はＢＭ型回転粘度計で測定した値である。
Β-1,3-1,6-D-glucan used particularly preferably in the present invention β-1,3-1,6-D-glucan used particularly preferably in the present invention is an aqueous solution. Is lower than that of natural β-1,3-1,6-D-glucan produced by microorganisms belonging to the genus Aureobasidium. This low-viscosity β-1,3-1,6-D-glucan has a viscosity at 30 ° C. of a 0.5% (w / v) aqueous solution (pH 5.0), preferably 200 cP (mPa · s) or less. More preferably, it is 100 cP (mPa * s) or less, More preferably, it is 50 cP (mPa * s) or less, More preferably, it is 10 cP or less. In the present invention, the viscosity is a value measured with a BM type rotational viscometer.
この低粘度グルカンは、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと同様の一次構造を有し得る。具体的には、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の１ＨＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。 This low-viscosity glucan may have the same primary structure as natural β-1,3-1,6-D-glucan produced by an Aureobasidium microorganism. Specifically, the 1 HNMR spectrum of a solution using 1N sodium hydroxide heavy aqueous solution as a solvent has two signals of about 4.7 ppm and about 4.5 ppm. Since it is well known that NMR measurement values change due to subtle changes in conditions and are accompanied by errors, “about 4.7 ppm” and “about 4.5 ppm” are measured values within the normally expected range. A numerical value including a fluctuation range (for example, ± 0.2).
このグルカンがオーレオバシディウム・プルランス（例えばＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株）由来のものである場合、得られるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンをエキソ型のβ−１，３−グルカナーゼ（キタラーゼ Ｍ、ケイアイ化成製）で加水分解処理すると、分解生成物としてグルコースとゲンチオビオースの遊離が確認できる。このこと及びＮＭＲの積算比から、オーレオバシディウム・プルランス由来のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンはβ−１，３結合の主鎖に対し、β−１，６結合でグルコ−スが１分子側鎖に分岐した構造で、１，３−結合主鎖に対する１，６−結合の側鎖分岐度は、５０〜１００％程度、特に５０〜９０％と推測される。 When this glucan is derived from Aureobasidium pullulans (for example, GM-NH-1A1 strain), the obtained β-1,3-1,6-D-glucan is converted into exo-type β-1,3- When hydrolysis is performed with glucanase (Citalase M, manufactured by KAI Kasei Co., Ltd.), release of glucose and gentiobiose can be confirmed as degradation products. From this and the integration ratio of NMR, β-1,3-1,6-D-glucan derived from Aureobasidium pullulans has β-1,6 bonds compared to the main chain of β-1,3 bonds. With a structure in which glucose is branched into one molecular side chain, the degree of side chain branching of 1,6-bonds relative to the 1,3-bond main chain is estimated to be about 50 to 100%, particularly 50 to 90%.
本発明に、特に好適に用いられるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、金属イオン濃度が、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの固形分１ｇ当たり０．４ｇ以下であることが好ましく、０．２ｇ以下であることがより好ましく、０．１ｇ以下であることがさらにより好ましい。製剤中にβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンが水溶液状態で含まれる場合は、金属イオン濃度は、水溶液の１００ｍｌ当たり１２０ｍｇ以下であることが好ましく、５０ｍｇ以下であることがより好ましく、２０ｍｇ以下であることがさらにより好ましい。 The β-1,3-1,6-D-glucan used particularly preferably in the present invention has a metal ion concentration of 0.4 g per gram of solid content of β-1,3-1,6-D-glucan. Or less, more preferably 0.2 g or less, and even more preferably 0.1 g or less. When β-1,3-1,6-D-glucan is contained in an aqueous solution in the preparation, the metal ion concentration is preferably 120 mg or less, more preferably 50 mg or less, per 100 ml of the aqueous solution. More preferably, it is 20 mg or less.
ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第３〜第５族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形製剤においても、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。 The metal ions referred to here include alkali metal ions, alkaline earth metal ions, Group 3 to Group 5 metal ions, transition metal ions, and the like. Include alkali-derived potassium ions, sodium ions and the like used in the production of low viscosity β-1,3-1,6-D-glucan. The metal ion concentration can be adjusted by ultrafiltration or dialysis. When the metal ion concentration is in the above range, β-1,3-1,6-D-glucan gelation, aggregation, and precipitation are unlikely to occur when stored in an aqueous solution or when sterilized by heating in an aqueous solution. . Further, even in a solid preparation, aggregation or the like hardly occurs when redissolved.
オーレオバシジウム属のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの生産方法
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、例えば、これを産生する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することにより沈殿物として得ることができる。
Method for producing β-1,3-1,6-D- glucan belonging to the genus Aureobasidium β-1,3-1,6-D-glucan can be used, for example, in an organic solvent in the culture supernatant of microorganisms that produce it. Can be obtained as a precipitate.
また、オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生させる方法は種々報告されている。使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源等を挙げることができる。 Various methods for producing β-1,3-1,6-D-glucan by culturing microorganisms belonging to the genus Aureobasidium have been reported. Examples of carbon sources that can be used include carbohydrates such as sucrose, glucose and fructose, and organic nutrient sources such as peptone and yeast extract.
窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源等を挙げることができる。場合によってはβ−グルカンの産生量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類等を添加するのも有効な方法である。 Examples of the nitrogen source include inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, sodium nitrate, and potassium nitrate. In some cases, inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, phosphate, magnesium salt, calcium salt, trace metal salts such as iron, copper, manganese and vitamins are used as appropriate in order to increase the production amount of β-glucan. It is also an effective method to add a kind or the like.
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを産生することが報告されている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）；科学と工業,64,131-135（1990）；特開平７−５１０８２号公報）。しかし、培地は、微生物が生育し、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを生産するものなら特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。 Aureobasidium microorganisms are reported to produce high concentrations of β-1,3-1,6-D-glucan when cultured in a medium containing ascorbic acid in a Zapec medium containing sucrose as a carbon source (Arg. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983)); Science and Industry, 64, 131-135 (1990); JP-A-7-51082). However, the medium is not particularly limited as long as microorganisms grow and produce β-1,3-1,6-D-glucan. If necessary, organic nutrient sources such as yeast extract and peptone may be added.
オーレオバシジウム属の微生物を上記培地で好気培養するための条件としては、１０〜４５℃程度、好ましくは２０〜３５℃程度の温度条件、３〜７程度、好ましくは３．５〜５程度のｐＨ条件等が挙げられる。 Conditions for aerobic culture of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium in the above medium are about 10 to 45 ° C, preferably about 20 to 35 ° C, about 3 to 7, preferably about 3.5 to 5. PH conditions and the like.
効果的に培養ｐＨを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のｐＨを制御することも可能である。更に培養液の消泡のために適宜、消泡剤を添加してもよい。培養時間は通常１〜１０日間程度、好ましくは１〜４日間程度であり、これによりβ−グルカンを産生することが可能である。なお、β−グルカンの産生を測定しながら培養時間を決めてもよい。 In order to effectively control the culture pH, it is also possible to control the pH of the culture solution with an alkali or an acid. Furthermore, you may add an antifoamer suitably for the defoaming of a culture solution. The culture time is usually about 1 to 10 days, preferably about 1 to 4 days, whereby β-glucan can be produced. The culture time may be determined while measuring the production of β-glucan.
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を４〜６日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを主成分とするβ−グルカン多糖が０．１％から数％(w/v)含有されており、その培養液の粘度はＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）により３０℃では数百ｃＰ([ｍＰａ・s])から数千ｃＰ（[ｍＰａ・s]）という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを沈殿物として得ることができる。 When microorganisms belonging to the genus Aureobasidium are cultured under aeration and agitation for about 4 to 6 days under the above conditions, 0.1-β-glucan polysaccharide containing β-1,3-1,6-D-glucan as a main component is contained in the culture solution. % To several% (w / v), and the viscosity of the culture solution is from several hundred cP ([mPa · s]) to several thousand cP at 30 ° C. by a BM type rotational viscometer (manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd.). It has a very high viscosity ([mPa · s]). By adding, for example, an organic solvent to the supernatant obtained by centrifuging this culture, β-1,3-1,6-D-glucan can be obtained as a precipitate.
低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造方法
上記の高粘度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
Method for producing low-viscosity β-1,3-1,6-D-glucan A culture solution containing the above high-viscosity β-1,3-1,6-D-glucan is added to this while stirring at room temperature. When alkali is added, the viscosity rapidly decreases.
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液；あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のｐＨが１２以上、好ましくは１３以上になるように添加すればよい。例えば水酸化ナトリウムを使用して培養液のｐＨを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が好ましくは０．５％(ｗ/ｖ)以上、より好ましくは１．２５％(ｗ/ｖ)以上になるように添加すればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。 The alkali is not particularly limited as long as it is water-soluble and can be used as a pharmaceutical or food additive. For example, an alkali carbonate aqueous solution such as a calcium carbonate aqueous solution, a sodium carbonate aqueous solution, a potassium carbonate aqueous solution, or an ammonium carbonate aqueous solution; an alkali hydroxide aqueous solution such as a sodium hydroxide aqueous solution, a potassium hydroxide aqueous solution, or a calcium hydroxide aqueous solution; or an ammonia aqueous solution is used. it can. The alkali may be added so that the pH of the culture solution is 12 or more, preferably 13 or more. For example, when using sodium hydroxide to increase the pH of the culture solution, the final concentration of sodium hydroxide is preferably 0.5% (w / v) or higher, more preferably 1.25% (w / v) or higher. Add so that. When alkali is added to the culture solution and stirred well, the viscosity of the culture solution decreases instantaneously.
次いで、アルカリ処理後の培養液から菌体などの不溶性物質を分離する。培養液の粘度が低いため、菌体を自然沈降させて上澄みを回収する方法（デカント法）、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過（ＭＦ膜などの限外ろ過）などの方法で、容易に不溶性物質とグルカンとを分離できる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合は、セライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。工業的にはフィルタープレスによる菌体除去が好ましい。また、不溶性物質除去前のβ−Ｄ−グルカン液は必要に応じて水で希釈しても良い。濃度が高すぎると不溶性物質除去が困難であり、低すぎても効率的でない。β−Ｄ−グルカン濃度は、０.１ｍｇ/ｍｌ〜２０ｍｇ/ｍｌ、好ましくは０.５ｍｇ/ｍｌ〜１０ｍｇ/ｍｌ、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍｌ〜５ｍｇ/ｍｌが良い。 Next, insoluble substances such as bacterial cells are separated from the culture solution after the alkali treatment. Since the viscosity of the culture solution is low, a method of allowing the cells to settle naturally (decant method), centrifuging, filtering the whole volume using filter paper or filter cloth, filter press, and membrane filtration (limitation of MF membrane, etc.) Insoluble substances and glucan can be easily separated by a method such as external filtration. In the case of total filtration with filter paper or filter cloth, it is one means to use a filter aid such as celite. Industrially, removal of bacterial cells by a filter press is preferred. Further, the β-D-glucan solution before removal of the insoluble substance may be diluted with water as necessary. If the concentration is too high, it is difficult to remove insoluble substances, and if it is too low, it is not efficient. The β-D-glucan concentration is 0.1 mg / ml to 20 mg / ml, preferably 0.5 mg / ml to 10 mg / ml, more preferably 1 mg / ml to 5 mg / ml.
次いで、グルカンを含む溶液に酸を添加して中和する。中和は、不溶物の除去前に行ってもよい。酸は、医薬や食品添加物として使用できるものであればよく、特に限定されない。例えば、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸などを使用できる。酸の使用量は、溶液又は培養液の液性が中性（ｐＨ５〜８程度）になるような量とすればよい。即ち、中和はｐＨ７に合わせることを必ずしも要さない。 Next, the solution containing glucan is neutralized by adding an acid. Neutralization may be performed before removal of insoluble matter. The acid is not particularly limited as long as it can be used as a pharmaceutical or food additive. For example, hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, citric acid, malic acid and the like can be used. The amount of acid used may be such that the solution or culture solution becomes neutral (pH 5-8). That is, neutralization does not necessarily need to be adjusted to pH 7.
ｐＨ１２以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、３０℃、ｐＨ５．０、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度が通常２００ｃＰ以下、場合によっては５０ｃＰ以下である。粘度は製造方法ないしは精製方法によって変動する。
β-1,3-1,6-D-glucan obtained by neutralization after alkaline treatment at
アルカリ処理された低粘度のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温（１５〜３５℃）では、液性をｐＨが４を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。 The alkali-treated low viscosity β-1,3-1,6-D-glucan does not increase in viscosity even when neutralized. Furthermore, at room temperature (15 to 35 ° C.), even if the liquid is acidified so that the pH is less than 4, the viscosity does not increase.
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。 In addition, instead of removing the cells after neutralizing and neutralizing the culture supernatant, alkali treatment and neutralization can be performed after removing the cells from the culture supernatant.
得られるグルカン水溶液からグルカンより低分子量の可溶性夾雑物（例えば塩類など）を除去する場合は、例えば限外ろ過を行えばよい。 In order to remove soluble contaminants (for example, salts) having a lower molecular weight than glucan from the resulting aqueous solution of glucan, ultrafiltration may be performed, for example.
また、アルカリ処理、除菌した後、中和せずに、アルカリ性条件下で限外ろ過することもでき、これにより透明性、熱安定性、長期保存性に一層優れる精製β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンが得られる。アルカリ性条件は、ｐＨ１０以上、好ましくは１２以上であり、ｐＨの上限は通常１３．５程度である。
Moreover, after carrying out alkali treatment and sterilization, it is possible to perform ultrafiltration under alkaline conditions without neutralization, and thereby purified β-1,3-excellent in transparency, thermal stability and long-term storage stability. 1,6-D-glucan is obtained. The alkaline condition is
このようにして得られる水溶液に含まれるβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を１ｗ／ｗ％以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは２倍以上添加することにより、β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを析出させることができる。この場合にｐＨをクエン酸などの有機酸によりｐHを酸性、好ましくはｐＨ４未満、さらに好ましくはｐＨ３−３．７に調整して、エタノールを添加すると高純度のβ-１,３-１,６-グルカンの粉末を得ることができる。
The β-1,3-1,6-D-glucan contained in the aqueous solution thus obtained is temporarily removed from the aqueous solution, whether it is dried to form a solid formulation or used as a formulation as an aqueous solution. It can be deposited. The precipitation method of β-1,3-1,6-D-glucan is not particularly limited. For example, an aqueous solution in which the concentration of glucan is increased to 1 w / w% or more by ultrafiltration or the like is added to ethanol. By adding the alcohol to the aqueous solution at a volume ratio equal to or greater than, preferably equal to or greater than twice, β-1,3-1,6-D-glucan can be precipitated. In this case, when the pH is adjusted to an acidic value with an organic acid such as citric acid, preferably less than
β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを低粘度化することにより、限外ろ過などによる濃縮を容易に行えることから、アルコール沈殿に使用するアルコール量を少なくすることができる。 By reducing the viscosity of β-1,3-1,6-D-glucan, concentration by ultrafiltration and the like can be easily performed, so that the amount of alcohol used for alcohol precipitation can be reduced.
固形製剤にする場合は、低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等公知の方法で行うことができる。 When preparing a solid preparation, the low-viscosity β-1,3-1,6-D-glucan aqueous solution may be directly dried, and the precipitated β-1,3-1,6-D-glucan is dried. May be. Drying can be performed by a known method such as spray drying or freeze drying.
（III）本発明における腸管免疫賦活促進剤
本発明の腸管免疫賦活促進剤は、パイエル板細胞に対するＩｇＡ抗体産生能を有するLactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０、Lactobacillus reuteri ＪＣＭ１０８１、およびLactobacillus plantarum ＨＳＫ２０１Ｄから選択される少なくとも１種の菌体またはその処理物（菌体由来成分）と上記記載のオーレオバシジウム属（Aureobasidium）の培養液より、精製したβ-グルカンを含有することを特徴とする。乳酸菌体またはその処理物と精製β-グルカンを併用して使用することで、乳酸菌体またはその処理物（菌体由来成分）を単独で用いるよりも、高い免疫賦活効果（ＩｇＡ抗体産生向上）が得られる。
ここで、「高い免疫賦活効果（ＩｇＡ抗体産生向上）」とは、精製β-グルカンと乳酸菌体またはその処理物（菌体由来成分）を併用して用いることによって、乳酸菌体またはその処理物（菌体由来成分）を単独で用いた時よりも、統計的に有意水準５％でＩｇＡ抗体産生が向上する状態をいう。
(III) Intestinal immunity activation promoter in the present invention The intestinal immunity activation promoter of the present invention is at least one selected from Lactobacillus plantarum IFO3070, Lactobacillus reuteri JCM1081, and Lactobacillus plantarum HSK201D having the ability to produce IgA antibodies against Peyer's patch cells. Or purified product thereof (cell-derived component) and the above-described culture medium of Aureobasidium, containing β-glucan purified. By using lactic acid bacteria or a treated product thereof in combination with purified β-glucan, a higher immunostimulatory effect (IgA antibody production improvement) is obtained than using lactic acid bacteria or a treated product (bacteria-derived component) alone. can get.
Here, the “high immunostimulatory effect (IgA antibody production improvement)” is a combination of purified β-glucan and a lactic acid bacterium or a processed product thereof (component derived from a microbial cell). This refers to a state in which IgA antibody production is improved at a statistically significant level of 5% compared to when the microbial cell-derived component is used alone.
本発明の免疫賦活効果促進剤は、必要に応じて薬学的に許容される担体とともに適当な製剤とすることが出来る。このような担体として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、付湿剤等が挙げられる、また、酸化防止剤のような慣用の添加剤なども含まれていてもよい。 The immunostimulatory effect promoter of the present invention can be made into a suitable preparation together with a pharmaceutically acceptable carrier as necessary. Examples of such carriers include excipients, binders, disintegrants, lubricants, moisturizers, and the like, and conventional additives such as antioxidants may also be included.
製剤の形態は特に限定されず、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等とどのような形態であっても良い。乳酸菌体またはその処理物と精製β-グルカンを使用すると、高濃度の水溶液を調整できることから、シロップ剤にする場合にも、一日に無理なく摂取できる量に、有効量の乳酸菌体またはその処理物と精製β-グルカンを含ませることができる。 The form of the preparation is not particularly limited, and any form such as tablets, pills, capsules, powders, granules, syrups and the like may be used. The use of lactic acid bacteria or treated products and purified β-glucan makes it possible to prepare a high-concentration aqueous solution. Products and purified β-glucan.
賦形剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖等の各種糖類；馬鈴薯デンプン、小麦デンプン、とうもろこしデンプン等の各種デンプン類；結晶セルロース等の各種セルロース類；無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等の各種無機塩酸等が挙げられる。 As the excipient, known ones can be widely used, for example, various saccharides such as lactose, sucrose, and glucose; various starches such as potato starch, wheat starch and corn starch; various celluloses such as crystalline cellulose; anhydrous Examples include various inorganic hydrochloric acids such as calcium hydrogen phosphate and calcium carbonate.
結合剤としては、公知のものを使用でき、例えば、結晶セルロース、プルラン、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、マクゴール等が挙げられる。 As the binder, known ones can be used, and examples thereof include crystalline cellulose, pullulan, gum arabic, sodium alginate, polyvinyl pyrrolidone, and macgol.
崩壊剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、デンプン、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。 As the disintegrant, known ones can be widely used, and examples thereof include carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl starch, starch, sodium alginate and the like.
潤沢剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油等が挙げられる。 As the lubricant, known ones can be widely used, and examples thereof include magnesium stearate, talc, and hardened oil.
付湿剤としては、公知のものを広く使用でき、例えば、ココナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、大豆リン脂質、グリセリン、ソルビトール等が挙げられる。 As the wetting agent, known ones can be widely used, and examples thereof include coconut oil, olive oil, sesame oil, peanut oil, soybean phospholipid, glycerin, sorbitol and the like.
製剤中に含まれるβ-グルカンの含有量は、投与対象又は患者の年齢、体重、投与方法等によって変化し得るが、例えば、体重７０ｋｇの成人男性の場合、一日の摂取量が１〜１０００ｍｇ程度、好ましくは１０〜５００ｍｇ程度、より好ましくは１０〜２００ｍｇ程度、さらに好ましくは、２５〜１００ｍｇ程度になるような量が含まれていればよい。
また、製剤中に含まれる乳酸菌体またはその処理物の含有量は、ＩｇＡ抗体産生を向上しうる量であればいかなる量であってもよく、使用形態、投与対象又は患者の年齢、体重、投与方法等によって変化し得るが、例えば、体重７０ｋｇの成人男性の場合、一日の摂取量が、乳酸菌乾燥重量当り、０．５ｍｇ〜３ｇ程度となるように含有させることが好ましく。より好ましくは６５〜２６０ｍｇ程度になるような量が含まれていればよい。
The content of β-glucan contained in the preparation may vary depending on the age, body weight, administration method, etc. of the subject or patient. For example, in the case of an adult male weighing 70 kg, the daily intake is 1-1000 mg. It is sufficient that the amount is about 10 to 500 mg, more preferably about 10 to 200 mg, and still more preferably about 25 to 100 mg.
In addition, the content of the lactic acid bacterium or the processed product thereof contained in the preparation may be any amount as long as it can improve IgA antibody production. For example, in the case of an adult male with a body weight of 70 kg, the daily intake is preferably 0.5 mg to 3 g per dry weight of lactic acid bacteria. More preferably, the amount may be about 65 to 260 mg.
また、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤のような固形製剤の場合は、精製β-グルカンを０．１〜９９．９重量％、乳酸菌を乾燥重量当り、０．１〜９９．９重量％含んでいればよい。 In the case of solid preparations such as tablets, pills, capsules, powders and granules, 0.1 to 99.9% by weight of purified β-glucan and 0.1 to 99.99% of lactic acid bacteria per dry weight. It only needs to contain 9% by weight.
また、シロップ剤のような液体又は流動性の製剤の場合は、精製β-グルカンが０．０１〜２重量％程度、乳酸菌を乾燥重量当り、０．２６〜５．２重量％含まれていることが好ましい。また液体又は流動性の製剤中のβ-グルカンは一部が溶解していない場合もある。 In the case of a liquid or fluid preparation such as a syrup, about 0.01 to 2% by weight of purified β-glucan and 0.26 to 5.2% by weight of lactic acid bacteria per dry weight are contained. It is preferable. Further, β-glucan in a liquid or fluid formulation may not be partially dissolved.
上記範囲であれば、摂取しやすい製剤量中に、腸管免疫賦活促進効果が十分に得られるとともに、副作用や毒性が現れない量が含まれていることになる。 If it is the said range, while the intestinal immunity activation promotion effect is fully acquired in the amount of a formulation which is easy to ingest, the quantity which does not show a side effect and toxicity will be contained.
また、本発明の腸管免疫賦活促進剤には、パイエル板細胞からのＩｇＡ抗体産生を誘導する作用（腸管免疫賦活能）を損なわない範囲で、通常含まれる成分や添加剤が含まれていてもよい。 In addition, the intestinal immunity activation promoter of the present invention may contain components and additives that are usually included within a range that does not impair the action of inducing IgA antibody production from Peyer's patch cells (intestinal immunity activation ability). Good.
本発明の腸管免疫賦活促進剤は、乳酸菌またはその処理物と、精製β-グルカンの配合比は、パイエル板細胞に対するＩｇＡ抗体産生能を有する乳酸菌体またはその処理物を１とした場合、精製β-グルカンが１/３〜１/２倍量程度であることが好ましい。 The intestinal immunity activation promoter of the present invention has a ratio of lactic acid bacteria or a processed product thereof to purified β-glucan, and the purified β-glucan has an IgA antibody-producing ability against Peyer's patch cells and the processed product thereof is 1. -It is preferable that the glucan is about 1/3 to 1/2 times the amount.
（ＩＶ）飲食品組成物
本発明の飲食品組成物は、パイエル板細胞に対するＩｇＡ抗体産生能を有するLactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０、Lactobacillus reuteri ＪＣＭ１０８１、およびLactobacillus plantarum ＨＳＫ２０１Ｄから選択される少なくとも１種の菌体またはその処理物（菌体由来成分）と、上記記載したオーレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）の培養液より精製した、精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含有することを特徴とする。
この飲食品組成物は、パイエル板細胞からのＩｇＡ抗体産生を誘導する作用（腸管免疫賦活能）を有するため、健康食品、機能性食品、又は栄養機能食品又は特定保健用食品のような保健機能食品として好適に使用できる。ここで、本発明における健康食品は、一般に「健康によい」として売られている食品全般、又は消費者が健康に良いと積極的な効果を期待して摂取する医薬品以外の食品を含み、健康補助食品を含む。また、本発明における機能性食品は、生体調節機能を充分に効率よく発現するように設計した食品を含む。
(IV) Food / beverage composition The food / beverage composition of the present invention comprises at least one microbial cell selected from Lactobacillus plantarum IFO3070, Lactobacillus reuteri JCM1081, and Lactobacillus plantarum HSK201D, which have the ability to produce IgA antibodies against Peyer's patch cells, or its It contains purified β-1,3-1,6-D-glucan purified from a treated product (bacterial cell-derived component) and a culture solution of the above-mentioned Aureobasidium sp. To do.
Since this food / beverage product composition has an action to induce IgA antibody production from Peyer's patch cells (intestinal tract immune activation ability), health functions such as health foods, functional foods, nutritional functional foods or foods for specified health use It can be suitably used as a food. Here, the health food in the present invention generally includes foods generally sold as “healthy”, or foods other than pharmaceuticals that consumers ingest in anticipation of positive effects as good for health. Includes supplements. Moreover, the functional food in the present invention includes food designed so as to express the biological regulation function sufficiently efficiently.
本発明の飲食品組成物に含まれる飲食品の種類は特に限定されない。乳酸菌体またはその処理物と精製β-グルカンを添加できるものであれば、栄養ドリンク、ジュース、茶、スープのような各種飲料品はもちろんのこと、クッキー、飴、ガム、ゼリー、寒天、プリン、グミ、チョコレート、澱粉加工食品などいかなる飲食品でも用いることができる。パン、うどんのような麺類、ヨーグルトやチーズなどの乳製品、ドレッシングやマヨネーズなどの加工食品、嚥下用補助食品等も好適である。各飲食品の特性や目的に応じ、製造工程の適切な段階で配合すればよい。 The kind of food / beverage products contained in the food / beverage product composition of the present invention is not particularly limited. As long as it can add lactic acid bacteria or processed products and purified β-glucan, it can be used for various drinks such as energy drinks, juices, teas, soups, cookies, strawberries, gums, jelly, agar, pudding, Any food and drink such as gummy, chocolate, and processed starch food can be used. Bread, noodles such as udon, dairy products such as yogurt and cheese, processed foods such as dressing and mayonnaise, swallowing supplements, and the like are also suitable. What is necessary is just to mix | blend in the suitable step of a manufacturing process according to the characteristic and objective of each food / beverage products.
本発明の飲食品組成物中には、１日摂取量が好ましくは１〜１０００ｍｇ程度、好ましくは１０〜５００ｍｇ程度、さらに好ましくは１０〜２００ｍｇ程度、よりさらに好ましくは２５〜１００ｍｇ程度になるようにβ−１，３−１，６−グルカンが含まれていればよい。また、乾燥重量０．５ｍｇ〜３ｇ程度の乳酸菌体またはその処理物が含まれていればよい。 In the food and beverage composition of the present invention, the daily intake is preferably about 1 to 1000 mg, preferably about 10 to 500 mg, more preferably about 10 to 200 mg, and still more preferably about 25 to 100 mg. It is sufficient if β-1,3-1,6-glucan is contained. Moreover, what is necessary is just to contain the lactic acid microbial cell of about 0.5 mg-3 g of dry weight, or its processed material.
乳酸菌体またはその処理物、および精製β-グルカンは、人体に対して無毒性であるから、その添加割合に特に制限はないが、各飲食品の特性、呈味性あるいは経済性等を考慮して、固形、半固形又はゲル状食品の場合、その添加量は、組成物全体量に対して、精製β-グルカンは、通常０．０１％〜２重量％程度であればよい。また、乳酸菌は乾燥重量当り、０．２６〜５．２重量％程度であればよい。ヨーグルトのような半固形状の食品も、食する上で流動性が求められない点で固形状食品に含まれる。上記の範囲であれば、無理なく摂取できる食品量中に、腸管免疫賦活促進に有効な１日摂取量が含まれることになる。 Lactic acid bacteria or processed products thereof and purified β-glucan are non-toxic to the human body, so there are no particular restrictions on the ratio of addition, but considering the characteristics, taste, economy, etc. of each food and drink In the case of a solid, semi-solid or gel food, the amount of the purified β-glucan is usually about 0.01% to 2% by weight with respect to the total amount of the composition. Moreover, the lactic acid bacteria should just be about 0.26-5.2 weight% per dry weight. Semi-solid foods such as yogurt are also included in solid foods in that fluidity is not required for eating. If it is said range, the daily intake effective in intestinal immunity activation promotion will be contained in the food amount which can be ingested reasonably.
また同様の理由で、液体、流動状、又は半流動状の飲料組成物に乳酸菌体またはその処理物、およびβ-グルカンを含ませる場合も、組成物全体量に対して、精製β-グルカンは、通常０．０１％〜２重量％程度であればよい。また、乳酸菌は乾燥重量当り、０．２６〜５．２重量％程度であればよい。上記の範囲であれば、無理なく摂取できる食品量中に腸管免疫賦活促進に有効な１日摂取量が含まれることになる。 For the same reason, when a lactic acid bacterium or a processed product thereof and β-glucan are contained in a liquid, fluid, or semi-fluid beverage composition, the purified β-glucan is contained in the total amount of the composition. Usually, it may be about 0.01% to 2% by weight. Moreover, the lactic acid bacteria should just be about 0.26-5.2 weight% per dry weight. If it is said range, the daily intake effective in intestinal immunity activation promotion will be contained in the food amount which can be ingested reasonably.
本発明の飲食品組成物には、本発明の効果を損なわない範囲で、食品分野で慣用の補助成分が含まれていて良い。このような補助成分として、例えばフラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、大豆オリゴ糖、イソマルトースのようなオリゴ糖；α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンのようなシクロデキストリンや直鎖デキストリンおよび難消化デキストリン；クエン酸、リンゴ酸、ヒアルロン酸のような有機酸；トリプトファン、メチオニン、テアニン、GABA（γ‐アミノ酪酸）などのアミノ酸、β‐カロテン、ルテイン、アスタキサンチン、フコキサンチンなどのβ‐カロチノイド類、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンEのようなビタミン類；亜鉛、鉄、マグネシウム、セレン、クロム、銅、マンガン、モリブデン、ヨウ素のようなミネラル；ウコン、高麗ニンジン、ショウガ、紅花、イチョウ葉またはイチョウ葉エキスのような生薬；ラクトフェリン；ローヤルゼリー；プロポリス；カテキン；ウコン；トレハロース；高麗ニンジン；ショウガ；紅花；イチョウ葉またはイチョウ葉エキス；アロエ；サイリウム；シャンピニオン；黒酢；各種香料などが挙げられる。 The food / beverage composition of the present invention may contain auxiliary components commonly used in the food field within a range not impairing the effects of the present invention. Examples of such auxiliary components include fructooligosaccharides, dairy oligosaccharides, soybean oligosaccharides, oligosaccharides such as isomaltose; cyclodextrins such as α-cyclodextrin, β-cyclodextrin, and γ-cyclodextrin, and linear chains Dextrins and resistant dextrins; organic acids such as citric acid, malic acid, hyaluronic acid; amino acids such as tryptophan, methionine, theanine, GABA (γ-aminobutyric acid), β such as β-carotene, lutein, astaxanthin, fucoxanthin -Vitamins such as carotenoids, vitamin A, vitamin C, vitamin E; minerals such as zinc, iron, magnesium, selenium, chromium, copper, manganese, molybdenum, iodine; turmeric, ginseng, ginger, safflower, ginkgo Of leaf or ginkgo leaf extract Una crude drugs; lactoferrin; royal jelly; propolis; catechin; turmeric; trehalose; ginseng; ginger; safflower; Ginkgo biloba or ginkgo biloba extract; aloe; psyllium; Champignon; like various perfumes; vinegar.
実施例
以下、実施例を示して本発明を説明するが、本発明の技術的範囲はこれによって何ら限定されることはない。
Examples Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
製造例 精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの製造方法
（１）低粘度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの調整
（１-１）β−グルカンの培養産生
後掲の表１に示す組成を有する液体培地１００ｍｌを５００ｍｌ容量の肩付きフラスコに入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）ＧＭ-ＮＨ-１Ａ１株（ＦＥＲＭ Ｐ-１９２８５）を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、１３０ｒｐｍの速度で攪拌しつつ、３０℃で２４時間培養することにより種培養液を調整した。
Production example Production method of purified β-1,3-1,6-D-glucan
(1) Preparation of low viscosity β-1,3-1,6-D-glucan
(1-1) beta-glucan a liquid medium 100ml having the composition shown in Table 1 supra after culture production placed on shouldered flask 500ml volume, at 121 ° C., 15 min, after pressurized steam sterilization, Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain (FERM P-19285) is aseptically inoculated from a slant with the same medium composition and stirred at a speed of 130 rpm for 24 hours at 30 ° C. A seed culture solution was prepared by culturing.
次いで、同じ組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容量の培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃で、１５分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液２Ｌを無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２７℃、４０L／ｍｉｎの通気攪拌培養を行った。なお、培地のｐＨは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてｐＨ４．２〜４．５の範囲内に制御した。９６時間後の菌体濁度はＯＤ６６０ｎｍで２３ＯＤ、多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、硫黄含量から計算される置換スルホ酢酸含量は０．０９％であった。
＜多糖濃度測定＞
多糖濃度は、培養液を数ｍｌサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
＜置換スルホ含量測定＞
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が６６％となるように添加し、β−グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が０．９％になるように食塩を加えた後、再度６６％エタノールでβ−グルカンを回収した。このβ−グルカン回収精製操作を更に２回繰り返し、得られたβ−グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。
Next, 200 L of medium having the same composition is placed in a 300 L culture apparatus (manufactured by Maruhishi Bioengineer), autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, and 2 L of the seed culture obtained as described above is aseptic. The cells were inoculated and aerated and stirred at 200 rpm, 27 ° C., 40 L / min. The pH of the medium was controlled within the range of pH 4.2 to 4.5 using sodium hydroxide and hydrochloric acid. The turbidity after 96 hours was 23 OD at OD 660 nm, the polysaccharide concentration was 0.5% (w / v), and the substituted sulfoacetic acid content calculated from the sulfur content was 0.09%.
<Measurement of polysaccharide concentration>
The polysaccharide concentration was collected by sampling several ml of the culture solution, centrifuging and removing the cells, and then adding ethanol to the supernatant so that the final concentration was 66% (v / v) to precipitate the polysaccharide. Then, it melt | dissolved in ion-exchange water and quantified with the phenol sulfuric acid method.
<Measurement of substituted sulfo content>
Similarly, ethanol was added to the culture supernatant from which the cells had been removed so that the final concentration was 66%, and β-glucan was collected by precipitation. Thereafter, the sample was dissolved again in ion-exchanged water, centrifuged again, sodium chloride was added to the supernatant so that the final concentration was 0.9%, and β-glucan was again collected with 66% ethanol. This β-glucan recovery and purification operation was further repeated twice, and the resulting β-glucan aqueous solution was dialyzed against ion-exchanged water and then freeze-dried to obtain a β-glucan powder.
このβ−グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、Ｓ含量は２３９ｍｇ／ｋｇであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は０・０９％であった。 This β-glucan powder was combusted and absorbed by the combustion tube and analyzed by ion chromatography. As a result, the S content was 239 mg / kg, and the substituted sulfoacetic acid content calculated from this value was 0.09%.
（１−２）アルカリ処理
上記のようにして得られた培養液の粘度をＢＭ型回転粘度計（東京計器製）を用いて、３０℃、１２ｒｐｍで測定したところ、１５００ｃＰ（(ｍＰａ・ｓ)）であった。測定に用いるロータは粘度にあわせて適当なものを選択した。
(1-2) Alkali treatment When the viscosity of the culture solution obtained as described above was measured at 30 ° C. and 12 rpm using a BM type rotational viscometer (manufactured by Tokyo Keiki), 1500 cP ((mPa · s) )Met. The rotor used for the measurement was selected appropriately according to the viscosity.
この培養液に水酸化ナトリウム最終濃度が２．４％(ｗ/ｖ)となるように２５％(ｗ/ｗ)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ（ｐＨ１３．６）、瞬時に粘度が低下した。引き続いて５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液でｐＨ５．０となるように中和してから、濃度０．５（ｗ／ｖ％）における粘度を測定したところ、そのときの粘度（３０℃）は２０ｃＰ([ｍＰａ・s])であった。 When 25% (w / w) sodium hydroxide was added to this culture solution so that the final concentration of sodium hydroxide was 2.4% (w / v) and stirred (pH 13.6), the viscosity decreased instantaneously. did. Subsequently, after neutralizing with a 50% (w / v) aqueous citric acid solution to pH 5.0, the viscosity at a concentration of 0.5 (w / v%) was measured. ) Was 20 cP ([mPa · s]).
次いで、この培養液にろ過助剤としてＫＣフロック（日本製紙社製）を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液（約２３０Ｌ）を得た。その多糖濃度は０．５％(ｗ/ｖ)で、ほぼ１００％の回収率であった。 Next, 1 wt% of KC Flock (manufactured by Nippon Paper Industries Co., Ltd.) was added to the culture broth as a filter aid, and the cells were removed using a Kamata filter press (manufactured by Kamata Kikai). About 230 L). The polysaccharide concentration was 0.5% (w / v), and the recovery rate was almost 100%.
（１−３）β−グルカン水溶液の脱塩
上記のβ−グルカン水溶液（培養ろ液）を０．３％に希釈後、限外ろ過（ＵＦ）膜（分子量カット５万、日東電工社製）を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を２０ｍｇ／１００ｍｌに落とした後、５０％(ｗ/ｖ)クエン酸水溶液によりｐＨを３．５に調整した。
(1-3) Desalination of β-glucan aqueous solution After dilution of the above β-glucan aqueous solution (culture filtrate) to 0.3%, ultrafiltration (UF) membrane (molecular weight cut 50,000, manufactured by Nitto Denko Corporation) Was used, and finally the sodium ion concentration was lowered to 20 mg / 100 ml, and then the pH was adjusted to 3.5 with a 50% (w / v) aqueous citric acid solution.
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット（日阪製作所製）を用いて９５℃で、３分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ−グルカン水溶液を得た。この時のβ−グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ０．２２％(ｗ/ｖ)であった。また、培養液からのトータル収率は約７３％であった。
＜硫黄含有量の測定＞
また、得られたβ−グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。本β−グルカンの組成分析結果からＳ含量は３３０ｍｇ／ｋｇであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は０．１２％であった。
＜結合状態の確認＞
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、４８０ｎｍから５２５ｎｍ付近への波長シフトを確認することができたのでβ−１，３結合を含むグルカンを含有していることが証明された（K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978)、今中忠行 監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス（2002））。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μｇ多糖であった。
Subsequently, sterilization was performed by holding at 95 ° C. for 3 minutes using a hot filling heating unit (manufactured by Nisaka Manufacturing Co., Ltd.) to obtain a final β-glucan aqueous solution. The concentration of β-glucan at this time was 0.22% (w / v) as measured by the phenol sulfuric acid method. The total yield from the culture was about 73%.
<Measurement of sulfur content>
Further, the obtained β-glucan aqueous solution was dialyzed with ion-exchanged water and then freeze-dried to obtain β-glucan powder. From the compositional analysis result of this β-glucan, the S content was 330 mg / kg, and the substituted sulfoacetic acid content calculated from this was 0.12%.
<Confirmation of combined state>
Moreover, since the wavelength shift from 480 nm to about 525 nm could be confirmed by the Congo red method, the above-described culture filtrate that had been desalted contained glucan containing β-1,3 bonds. Proven (K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978), supervised by Tadayuki Imanaka, Development of the use of microorganisms, 1012-1015, NTS (2002)). The shift difference to the maximum value at that time was Δ0.48 / 500 μg polysaccharide.
上記培養ろ液１５ｍｌを取り出し、３０ｍｌのエタノールを添加し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎで遠心して、沈殿する多糖を回収した。６６％エタノールで洗浄し、４℃、１０００ｒｐｍ、１０分間遠心して、沈殿する多糖に２ｍｌのイオン交換水と、１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、６０℃、１時間保温して沈殿を溶解させた。次に-８０℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を１ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、２次元ＮＭＲに供した。 15 ml of the culture filtrate was taken out, 30 ml of ethanol was added, and centrifuged at 4 ° C. and 1000 rpm for 10 minutes to collect the precipitated polysaccharide. Wash with 66% ethanol, centrifuge at 4 ° C, 1000 rpm for 10 minutes, add 2 ml of ion-exchanged water and 1 ml of 1N sodium hydroxide aqueous solution to the precipitated polysaccharide, stir, then heat at 60 ° C for 1 hour to precipitate. Dissolved. Next, after freezing at −80 ° C., vacuum lyophilization was performed overnight, and the dried powder was dissolved in 1 ml of 1N sodium hydroxide heavy aqueous solution and subjected to two-dimensional NMR.
２次元ＮＭＲ（１３Ｃ−１Ｈ ＣＯＳＹ ＮＭＲ）１０６ｐｐｍと相関関係を有する１Ｈ ＮＭＲスペクトルを図４に示す。このスペクトルにおいて４．７ｐｐｍと４．５ｐｐｍ付近との２つのシグナルが得られた。 1 H NMR spectra with a correlation between the two-dimensional NMR (13 C- 1 H COSY NMR ) 106ppm shown in FIG. In this spectrum, two signals of 4.7 ppm and around 4.5 ppm were obtained.
この結果、本β−グルカンがβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンであることが証明された（今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス（2002））。それぞれの１Ｈ ＮＭＲシグナルの積分比から、β−１，３結合／β−１，６結合の比は１．１５であることが判明した。
＜粒度測定＞
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(ＨＯＲＩＢＡ製ＬＡ−９２０)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては０．３μｍと１００μｍ程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、１００μｍのピ−クはみるみるうちに消失し、０．３μｍのピ−クが増え、最終的に０．３μｍのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図５に示す。
As a result, it was proved that this β-glucan is β-1,3-1,6-D-glucan (supervised by Tadayuki Imanaka, development of the use of microorganisms, 1012-1015, NTS ( 2002)). From the integration ratio of each 1 H NMR signal, the ratio of β-1,3 bond / β-1,6 bond was found to be 1.15.
<Particle size measurement>
Next, when the particle size of the culture solution was measured using a laser diffraction / scattering type particle size distribution measuring apparatus (LA-920 manufactured by HORIBA), the particles were about 0.3 μm and 100 μm in size. I was seen. Subsequently, when particle size measurement was performed while irradiating with ultrasonic waves, the 100 μm peak disappeared as soon as it was seen, the 0.3 μm peak increased, and finally only 0.3 μm. The particle size distribution of the culture solution when irradiated with ultrasonic waves is shown in FIG.
０．３μｍのピークはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子によるピークであり、１００〜２００μｍのピークはβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。 The peak of 0.3 μm is the peak due to the primary particles of β-1,3-1,6-D-glucan, and the peak of 100 to 200 μm is the primary particles of β-1,3-1,6-D-glucan. This is considered to be a peak due to aggregated secondary particles.
また、二次粒子はマグネチックスタ−ラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。
＜分子量測定＞
また、東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））を用いて、０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンとβ−１，３−１，６−Ｄグルカンの１次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンに由来する２〜３０万のピークの低分子画分と、１次粒子に由来する見かけ上５０〜２５０万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。
Further, it was confirmed that the secondary particles disappeared in the same manner even when stirred with a magnetic stirrer and lightly shaken, and easily broken into primary particles. Therefore, the secondary particles are considered to be very loosely aggregated (slowly aggregated state).
<Molecular weight measurement>
Further, Toyopearl HW65 manufactured by Tosoh Corporation (column size 75 cm × φ1 cm, excluded molecular weight 2.5 million (dextran)) was subjected to gel filtration chromatography using 0.1 M sodium hydroxide aqueous solution as an eluent, and dissolved β- When the molecular weight of a solution containing 1,3-1,6-D-glucan and β-1,3-1,6-D glucan primary particles was measured, the dissolved β-1,3-1,6- Two types of low molecular fractions having peaks of 2 to 300,000 derived from D-glucan and apparently high molecular fractions of 500 to 2.5 million derived from primary particles were detected. Shodex pullulan was used as a molecular weight marker.
水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの分子量は２〜３０万と考えられる。 In order to separate the water-soluble β-1,3-1,6-D-glucan and the fine particles, a β-1,3-1,6-D-glucan solution containing the fine particle fraction and the soluble fraction is used. When filtration was performed with a filter (0.2 μm) manufactured by Advantech, 500 to 2.5 million polymer fractions disappeared. From this, it was found that the polymer fraction corresponds to primary particles of β-1,3-1,6-D-glucan and secondary particles in which primary particles are aggregated. Therefore, the molecular weight of water-soluble β-1,3-1,6-D-glucan is considered to be 2 to 300,000.
（２）粉末化β-グルカンの調整
（１−２）において、アルカリ処理および菌体除去処理により調整された微粒子β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを含むβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液に、最終濃度が６６％(v/v)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して９５％以上であった。
(2) Preparation of powdered β-glucan (1-2) In β-1,3-, containing fine particles β-1,3-1,6-D-glucan prepared by alkali treatment and fungus body removal treatment Ethanol was added to the 1,6-D-glucan aqueous solution so that the final concentration was 66% (v / v) to precipitate the polysaccharide glucan and recovered by centrifugation. Next, ethanol and water were removed by a freeze-drying method to obtain dry β-1,3-1,6-D-glucan. The yield at that time was 95% or more compared to the total sugar concentration before ethanol precipitation.
次いで、得られた乾燥β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを最終濃度が０．３％（ｗ／ｖ）となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールＨＷ６５（カラムサイズ ７５ｃｍ×φ１ｃｍ、排除分子量２５０万（デキストラン））により０．１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は２〜３０万のピークの低分子画分と見かけ上５０〜２５０万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてＳｈｏｄｅｘ社製のプルランを用いた。 Subsequently, the obtained dried β-1,3-1,6-D-glucan was dissolved and dispersed in water so that the final concentration was 0.3% (w / v), and then the same as described above. Gel chromatography was performed using Toyopearl HW65 (column size: 75 cm × φ1 cm, excluded molecular weight: 2.5 million (dextran)) manufactured by Toyopearl, and the molecular weight was measured. It was found that the molecular weight was composed of two types, a low molecular fraction having a peak of 2 to 300,000 and a high molecular fraction having an apparent appearance of 500 to 2.5 million. Here, a pullulan manufactured by Shodex was used as a molecular weight marker.
一方、水溶性β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと微粒子を分離するため、本法で調整したβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン水溶液（微粒子と可溶化グルカンを含むもの）をアドバンテック社製のフィルター（０．２μｍ）でろ過を行ったところ、５０〜２５０万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。 On the other hand, in order to separate water-soluble β-1,3-1,6-D-glucan and fine particles, an aqueous solution of β-1,3-1,6-D-glucan prepared by this method (fine particles and solubilized glucan are mixed). When the product was filtered with a filter (0.2 μm) manufactured by Advantech, 500 to 2.5 million polymer fractions disappeared. Therefore, even if the β-1,3-1,6-D-glucan obtained by this method is dried, it is the same as β-1,3-1,6-D-glucan before drying if it is redissolved. It was demonstrated to reproduce the physical behavior of
（３）高純度β-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末の製造
（１）においてアルカリ処理を行い低粘度化した培養液（多糖濃度０．５％（５ｍｇ／ｍｌ））９０Ｌを５０％クエン酸水溶液９ｋｇで中和後、濾過助剤（日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スＫＣフロック）を１．８ｋｇプレコートした薮田式濾過圧搾機40D-4を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外濾過スパイラルエレメント（日東電工製ＮＴＵ３１５０−Ｓ４）で９Ｌまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、ｐＨを３．０-３．５にクエン酸により調整して、エタノール１８Ｌを加え、グルカン／エタノール／水スラリーを得た。スラリーの粘度はＢＭ型粘度計で２２ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。室温で３時間静置し、上澄み液（エタノール／水）約１７Ｌを取り除いた。残ったスラリーの粘度は４５ｍＰａ・ｓ（３０℃）であった。本濃縮スラリー１０Ｌを坂本技研型の噴霧乾燥装置R-3を用いて噴霧乾燥し、３６０ｇのβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末を得た（回収率８０％）。得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカンの純度はＮＭＲスペクトルの解析の結果、９０％以上であった。
なお、得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末を１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、ＮＭＲスペクトルを測定したところ、１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを得た。また、得られたβ-１,３-１,６-Ｄ-グルカン粉末の濃度０．５（ｗ／ｖ％）の水溶液の粘度は２００ｃＰ以下であった（ｐＨ５．０、３０℃）。上記記載の方法によって得られた精製β-グルカンを下記の実施例に用いた。
(3) Production of high-purity β-1,3-1,6-D-glucan powder (1) 90 L of a culture solution (polysaccharide concentration 0.5% (5 mg / ml)) reduced in viscosity by alkali treatment After neutralization with 9 kg of 50% citric acid aqueous solution, the cells were removed through a Kamata filter press 40D-4 pre-coated with 1.8 kg of filter aid (Nippon Paper Chemicals powder cellulose KC floc). The filtrate was concentrated to 9 L with an ultrafiltration spiral element (NTU3150-S4 manufactured by Nitto Denko). While stirring the concentrate, the pH was adjusted to 3.0-3.5 with citric acid, and 18 L of ethanol was added to obtain a glucan / ethanol / water slurry. The viscosity of the slurry was 22 mPa · s (30 ° C.) with a BM viscometer. The mixture was allowed to stand at room temperature for 3 hours, and about 17 L of the supernatant (ethanol / water) was removed. The viscosity of the remaining slurry was 45 mPa · s (30 ° C.). 10 L of this concentrated slurry was spray-dried using a Sakamoto Giken type spray dryer R-3 to obtain 360 g of β-1,3-1,6-D-glucan powder (recovery rate 80%). The purity of the obtained β-1,3-1,6-D-glucan was 90% or more as a result of NMR spectrum analysis.
The obtained β-1,3-1,6-D-glucan powder was dissolved in 1N sodium hydroxide heavy aqueous solution and the NMR spectrum was measured. The 1H NMR spectrum was about 4.7 ppm and about 4.5 ppm. Two signals were obtained. Further, the viscosity of the obtained β-1,3-1,6-D-glucan powder aqueous solution having a concentration of 0.5 (w / v%) was 200 cP or less (pH 5.0, 30 ° C.). The purified β-glucan obtained by the method described above was used in the following examples.
実施例１および比較例１、２
本発明に係る、精製β-グルカンが及ぼす腸管パイエル板細胞からのＩｇＡ抗体産生促進について説明する。
Example 1 and Comparative Examples 1 and 2
The promotion of IgA antibody production from intestinal Peyer's patch cells exerted by purified β-glucan according to the present invention will be described.
（１）乳酸菌体の調整方法
１）乳酸菌Lactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０の凍結保存液を１０μl、ＭＲＳ培地（ＯＸＯＩＤ）１００mlに添加して３７℃で２４時間静置培養した。ＭＲＳ培地の組成を下記表２に示す。
２）培養液を遠心分離して菌体のみを回収した。
３）０.９%の滅菌生理食塩水に菌体を懸濁した後、再び遠心分離して菌体を回収した。０.９%滅菌生理食塩水への菌体の懸濁と遠心分離処理は合計３回繰り返した。
４）滅菌水で菌体濃度が１×１０１０ cells/ml（乳酸菌乾燥粉末換算で約１０ｍｇ）になるように調整した後、９０℃で３０分間加熱処理して乳酸菌を死滅させた。なお、乳酸菌体の細胞数はバクテリア計算盤を用いて計測した。
５）この乳酸菌液に４倍量のＲＰＭＩ培地を添加した（乳酸菌濃度２×１０９cells/ml；乳酸菌乾燥粉末換算で約２ｍｇ）ものを乳酸菌調整液として下記の試験に供した。ＲＰＭＩ培地の組成を下記表３に示す。調整した乳酸菌調整液は、実施例１および比較例１、２に用いた。
(1) Preparation method of lactic acid bacteria 1) 10 μl of a cryopreservation solution of lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum IFO3070 was added to 100 ml of MRS medium (OXOID), followed by stationary culture at 37 ° C. for 24 hours. The composition of the MRS medium is shown in Table 2 below.
2) The culture broth was centrifuged to recover only the cells.
3) After suspending the cells in 0.9% sterilized physiological saline, the cells were collected by centrifugation again. Suspension of cells in 0.9% sterile physiological saline and centrifugation were repeated a total of 3 times.
4) After adjusting the bacterial cell concentration to 1 × 10 10 cells / ml (about 10 mg in terms of dry powder of lactic acid bacteria) with sterilized water, heat treatment was performed at 90 ° C. for 30 minutes to kill the lactic acid bacteria. The number of cells of lactic acid bacteria was measured using a bacterial calculation board.
5) Four times as much RPMI medium (concentration of lactic acid bacteria: 2 × 10 9 cells / ml; approximately 2 mg in terms of lactic acid bacteria dry powder) was added to this lactic acid bacteria solution and subjected to the following test as a lactic acid bacteria adjustment solution. The composition of the RPMI medium is shown in Table 3 below. The prepared lactic acid bacteria adjustment solution was used in Example 1 and Comparative Examples 1 and 2.
（２）精製β-グルカンの調整方法
１）上記製造例に記載した方法により得られた精製β-グルカン粉末を多糖濃度で４０００μｇ/ｍｌになるように滅菌水に溶解した後、９０℃で３０分間加熱処理した。
２）加熱処理したβ-グルカン水溶液に４倍量のＲＰＭＩ培地を添加した（β-グルカン濃度８００μｇ／ｍｌ）ものを精製β-グルカン調整液として、実施例１に用いた。
(2) Preparation method of purified β-glucan 1) The purified β-glucan powder obtained by the method described in the above production example was dissolved in sterilized water so that the polysaccharide concentration was 4000 μg / ml, and then 30 ° C. at 30 ° C. Heat-treated for minutes.
2) A 4-fold amount of RPMI medium (β-glucan concentration 800 μg / ml) added to a heat-treated β-glucan aqueous solution was used in Example 1 as a purified β-glucan adjustment solution.
（３）未精製β-グルカン調整方法
１）上記製造例に記載した手法により、Aureobasidium pullulans GM-NH-１A１株の培養液を作成した。その後、培養液中の多糖濃度をフェノール硫酸法により多糖濃度を測定し、４０００μｇ／ｍｌになるように滅菌水で調整した。
２）９０℃で３０分間加熱処理した。
３）４倍量のRPMI培地を添加して５倍希釈した。（β-グルカン濃度（多糖換算）８００μｇ／ｍｌ）。これを未精製β-グルカン調整液として、比較例２に用いた。
(3) Unpurified β-glucan preparation method 1) A culture solution of Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain was prepared by the method described in the above production example. Thereafter, the polysaccharide concentration in the culture solution was measured by the phenol-sulfuric acid method, and adjusted with sterilized water so as to be 4000 μg / ml.
2) Heat-treated at 90 ° C. for 30 minutes.
3) 4-fold amount of RPMI medium was added to dilute 5-fold. (Β-glucan concentration (polysaccharide equivalent) 800 μg / ml). This was used in Comparative Example 2 as an unpurified β-glucan adjustment solution.
（４）パイエル板細胞の培養方法
１）ＢＡＬＢ/ｃ 雄マウス（５週齢）を購入後、通常の餌と水を与え１週間飼育した。
２）飼育終了後、当該試験マウスを解剖し、小腸に存在するパイエル板細胞を単離し、１×１０７ｃｅｌｌｓ/ｍｌになるようにＲＰＭＩ培地を用いて調整した。
３）調整したパイエル板細胞液を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１００μｌずつ分注した。
４）パイエル板細胞液を加えたマイクロプレートのｗｅｌｌに、ネガティブコントロール（コントロール１）として滅菌水をＲＰＭＩ培地で５倍希釈したもの（以下、滅菌水調整液と記載）を用い、ポジティブコントロール（コントロール２）として２ｍｇ/ｍｌになるように滅菌水で調整したＬＰＳ（Lipopolysaccharides from Escherichia coli ０１１１:B４（SIGMA ALDRICH）をＲＰＭＩ培地で５倍希釈したもの（以下、ＬＰＳ調整液と記載）を用いた。実施例１は、上述した乳酸菌調整液と精製β-グルカン調整液を５０μｌずつ添加した。比較例１は、乳酸菌調整液５０μｌと滅菌水調整液５０μｌを添加した。比較例２は、乳酸菌調整液と未精製β-グルカン調整液を５０μｌずつ添加した。なお、乳酸菌体５×１０８ｃｅｌｌ/ｍｌは、乳酸菌乾燥粉末換算で約０．５ｍｇに相当する。
５）各被検物質およぼその濃度については表４に示す。また、各被検物質につき３wellずつ試験を行った。
６）マイクロプレートにパイエル板細胞と披検物質の混合液を３７℃、５％ＣＯ２濃度下で４日間培養した。
(4) Peyer's plate cell culture method 1) BALB / c Male mice (5 weeks old) were purchased and then fed with normal food and water for 1 week.
2) After the breeding, the test mouse was dissected, Peyer's patch cells present in the small intestine were isolated, and adjusted using RPMI medium so as to be 1 × 10 7 cells / ml.
3) 100 μl of the prepared Peyer's plate cell solution was dispensed into a 96-well microplate.
4) A positive control (control) using a well of a microplate to which Peyer's plate cell solution was added diluted 5 times with sterilized water with RPMI medium as a negative control (control 1). As 2), LPS (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111: B4 (SIGMA ALDRICH)) adjusted with sterilized water so as to be 2 mg / ml was diluted 5-fold with RPMI medium (hereinafter referred to as LPS adjustment solution). In Example 1, 50 μl each of the lactic acid bacterium preparation solution and the purified β-glucan preparation solution described above were added, Comparative Example 1 was added with 50 μl lactic acid bacteria preparation solution and 50 μl of sterilized water adjustment solution, and Comparative Example 2 was a lactic acid bacteria preparation solution. the crude β- glucan adjusted solution was added in 50μl and. Incidentally, lactic acid bacteria 5 × 10 8 cell / ml, the lactic acid bacteria dried powder terms Equivalent to about 0.5mg.
5) Table 4 shows each test substance and its concentration. In addition, the test was conducted for 3 wells for each test substance.
6) A mixture of Peyer's patch cells and test substance was cultured on a microplate for 4 days at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration.
（５）ＩｇＡ抗体量測定方法
１）パイエル板細胞培養液を遠心分離して、上清を回収した。
２）パイエル板細胞培養液上清のＩｇＡ抗体量をＥＬＩＳＡ法により測定した。なお、１細胞液につき２回ずつ測定した。
(5) IgA antibody amount measuring method 1) The Peyer's patch cell culture solution was centrifuged, and the supernatant was collected.
2) The amount of IgA antibody in Peyer's plate cell culture supernatant was measured by ELISA. In addition, it measured twice per cell liquid.
図１に実施例１および比較例１、２のパイエル板細胞培養液上清中に含まれるＩｇＡ抗体濃度測定値をグラフ化したものを示す。図１に示されるように、精製β-グルカンを乳酸菌体と混合した場合には乳酸菌単体で用いた場合より、パイエル板細胞培養液上清中のＩｇＡ抗体濃度が高かった。実施例１と比較例１について平均値の差の検定を行なった際の生起確率は０.０２６６８であり、有意水準５%で差が生じた。このことは、精製β-グルカンを乳酸菌体と混合することで、乳酸菌単体よりも有意に高くＩｇＡ抗体産生を誘導することを示している。一方、比較例１と比較例２について平均値の差の検定を行なった際の生起確率は０.００６６０であり、有意水準５％で差が生じている。このことは、未精製β-グルカンを乳酸菌体と混合した場合、乳酸菌単体よりもＩｇＡ産生量が有意に低下することを示している。未精製β-グルカンを混合することで、乳酸菌単体で用いた場合よりもパイエル板からのＩｇＡ産生が抑制された理由については不明であるが、未精製β-グルカン中には培養液に由来するβグルカン以外の様々な成分が多く含まれていることから、それらがパイエル板細胞のＩｇＡ産生を阻害した可能性が考えられる。従って、精製処理を行なうことにより未精製β-グルカン中に存在していたＩｇＡ産生阻害物質が除去され、精製β-１,３-１,６-Ｄ-グルカンによって、乳酸菌が有しているパイエル板細胞からのＩｇＡ抗体産生を誘導する作用（腸管免疫賦活能）を効率よく促進したと推測できる。 FIG. 1 is a graph showing measured values of IgA antibody concentration contained in Peyer's plate cell culture supernatants of Example 1 and Comparative Examples 1 and 2. As shown in FIG. 1, when purified β-glucan was mixed with lactic acid bacteria, the concentration of IgA antibody in Peyer's plate cell culture supernatant was higher than when lactic acid bacteria were used alone. The occurrence probability when the difference between the average values of Example 1 and Comparative Example 1 was tested was 0.0668, and a difference occurred at a significance level of 5%. This indicates that mixing purified β-glucan with lactic acid bacteria induces IgA antibody production significantly higher than lactic acid bacteria alone. On the other hand, the probability of occurrence when the difference between the average values is tested for Comparative Example 1 and Comparative Example 2 is 0.000066, and there is a difference at a significance level of 5%. This indicates that when unpurified β-glucan is mixed with lactic acid bacteria, the amount of IgA produced is significantly lower than that of lactic acid bacteria alone. The reason why IgA production from Peyer's patches was suppressed by mixing unpurified β-glucan compared to when using lactic acid bacteria alone was unclear, but in unpurified β-glucan is derived from the culture medium Since various components other than β-glucan are contained in a large amount, it may be possible that they inhibited IgA production of Peyer's patch cells. Accordingly, the purification treatment removes the IgA production inhibitory substance that was present in the unpurified β-glucan, and the purified β-1,3-1,6-D-glucan provides a peanut possessed by lactic acid bacteria. It can be presumed that the action of inducing IgA antibody production from plate cells (intestinal immunity activation ability) was efficiently promoted.
実施例２、３および比較例３〜８
腸管パイエル板細胞からのＩｇＡ抗体産生促進能を有している乳酸菌における精製β-グルカンの効果について説明する。
Examples 2, 3 and Comparative Examples 3-8
The effect of purified β-glucan in lactic acid bacteria having the ability to promote IgA antibody production from intestinal Peyer's patch cells will be described.
（１）乳酸菌体の調整方法
Lactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０、Lactobacillus reuteri ＪＣＭ１０８１、またはＬactobacillus plantarum kefirを用い、実施例１に記載の方法と同様の方法で乳酸菌調整液を調整した。なお、Lactobacillus reuteri ＪＣＭ１０８１の乳酸菌体調整液は、実施例２および比較例３、Lactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０の乳酸菌体調整液は、実施例３および比較例４、Lactobacillus plantarum kefirの乳酸菌体調整液は、比較例５および６に用いた。
(1) Preparation method of lactic acid bacteria
Lactobacillus plantarum IFO3070, Lactobacillus reuteri JCM1081 or Lactobacillus plantarum kefir was used to prepare a lactic acid bacterium preparation solution in the same manner as described in Example 1. The Lactobacillus reuteri JCM1081 Lactobacillus preparation solution is Example 2 and Comparative Example 3, the Lactobacillus plantarum IFO3070 Lactobacillus preparation solution is Example 3 and Comparative Example 4, and the Lactobacillus plantarum kefir Lactobacillus preparation solution is a Comparative Example. Used for 5 and 6.
（２）精製β-グルカンの濃度調整
実施例１および比較例１、２に記載の方法と同様の方法により、精製β-グルカン調整液を調整し、実施例２、３、および比較例６、７、８に用いた。
(2) Concentration adjustment of purified β-glucan A purified β-glucan adjustment solution was prepared by the same method as described in Example 1 and Comparative Examples 1 and 2, and Examples 2, 3 and Comparative Example 6, Used for 7 and 8.
（３）パイエル板細胞の培養方法
実施例１および比較例１、２に記載の方法と同様の方法により行った。実施例２、３および比較例３〜８における披検物質および被検物質濃度について表５に示す。
(3) Peyer's patch cell culture method The same method as described in Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 was used. Table 5 shows test substance and test substance concentrations in Examples 2 and 3 and Comparative Examples 3 to 8.
（４）ＩｇＡ抗体の測定
実施例１および比較例１、２に記載の方法と同様の方法により行った。
(4) Measurement of IgA antibody The IgA antibody was measured by the same method as described in Example 1 and Comparative Examples 1 and 2.
図２に実施例２、３および比較例３〜８のパイエル板細胞培養液上清中に含まれるＩｇＡ抗体濃度測定値をグラフ化したものを示す。抗体産生を促進する物質として公知であるＬＰＳ（グラム陰性菌由来リポ多糖）では、精製β-グルカンとの混合有無によるＩｇＡ抗体産生量への影響は認められなかったが、Lactobacillus reuteri ＪＣＭ１０８１とLactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０においては、精製β-グルカン添加により、乳酸菌単体の場合よりもＩｇＡ抗体の産生量が増加した。実施例２と比較例３について平均値の差の検定を行なった際の生起確率は０.０１４３であり、有意水準５%で差が生じた。また、実施例３と比較例４について平均値の差の検定を行なった際の生起確率は０.０００２であり、有意水準５%で差が生じた。このことから、乳酸菌Lactobacillus reuteri ＪＣＭ１０８１及びLactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０に精製β-グルカンを添加することで、乳酸菌単体で得られるＩｇＡ抗体産生誘導効果よりも有意に高いＩｇＡ抗体産生誘導が生じていることが分かる。乳酸菌Lactobacillus reuteri ＪＣＭ１０８１では精製β-グルカン添加によってＩｇＡ抗体産生量は１９%上昇した。また乳酸菌Lactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０では精製β-グルカン添加によってＩｇＡ抗体産生量は２９％上昇し、特にLactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０と精製β-グルカンを混合した場合にＩｇＡ抗体産生が効果的に促進された。一方、比較例５に示すように、Lactobacillus plantarum kefirはパイエル板細胞からのＩｇＡ抗体産生を誘導する作用（腸管免疫賦活能）を有しているものの、比較例６に示すように精製β-グルカンを添加してもほとんど促進効果が得られなかった。この結果より、パイエル板細胞からのＩｇＡ抗体産生を誘導する作用（腸管免疫賦活能）を有する乳酸菌すべてにおいて、精製β-グルカンによる相乗効果が得られるものではない。 FIG. 2 is a graph showing the measured IgA antibody concentration contained in the Peyer's plate cell culture supernatants of Examples 2 and 3 and Comparative Examples 3 to 8. LPS (a lipopolysaccharide derived from a Gram-negative bacterium), which is known as a substance that promotes antibody production, did not affect the IgA antibody production by the presence or absence of mixing with purified β-glucan, but Lactobacillus reuteri JCM1081 and Lactobacillus plantarum In IFO3070, the production amount of IgA antibody increased by the addition of purified β-glucan compared to the case of lactic acid bacteria alone. The occurrence probability when the difference between the average values of Example 2 and Comparative Example 3 was tested was 0.0143, and a difference occurred at a significance level of 5%. The occurrence probability when the difference between the average values of Example 3 and Comparative Example 4 was tested was 0.0002, and the difference occurred at a significance level of 5%. From this, it can be seen that by adding purified β-glucan to lactic acid bacteria Lactobacillus reuteri JCM1081 and Lactobacillus plantarum IFO3070, IgA antibody production induction significantly higher than the IgA antibody production induction effect obtained with lactic acid bacteria alone occurs. In the lactic acid bacterium Lactobacillus reuteri JCM1081, the amount of IgA antibody produced increased 19% by the addition of purified β-glucan. In addition, in the lactic acid bacterium Lactobacillus plantarum IFO3070, the amount of IgA antibody produced was increased by 29% by adding purified β-glucan. In particular, when Lactobacillus plantarum IFO3070 and purified β-glucan were mixed, IgA antibody production was effectively promoted. On the other hand, as shown in Comparative Example 5, Lactobacillus plantarum kefir has an action of inducing IgA antibody production from Peyer's patch cells (intestinal immunity stimulating ability), but as shown in Comparative Example 6, purified β-glucan Almost no accelerating effect was obtained even when added. From this result, the synergistic effect of purified β-glucan is not obtained in all lactic acid bacteria having an action (intestinal immunity activation ability) that induces IgA antibody production from Peyer's patch cells.
実施例４、５および比較例９〜１５
様々な機能性があり健康に対する効果が期待できるとされている、市販の機能性乳酸菌株における精製β-グルカンの効果について説明する。
Examples 4, 5 and Comparative Examples 9-15
The effect of purified β-glucan on a commercially available functional lactic acid strain that has various functions and is expected to have health effects will be described.
（１）Lactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０の菌体調整方法
１）乳酸菌Lactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０の凍結保存液を１０μl、ＭＲＳ培地（ＯＸＯＩＤ）１００ｍｌに添加して３７℃で２４時間静置培養した。
２）培養液を遠心分離して菌体のみを回収した。
３）０．９％の滅菌生理食塩水に菌体を懸濁した後、再び遠心分離して菌体を回収した。０．９％滅菌生理食塩水への菌体の懸濁と遠心分離処理は合計３回繰り返した。
４）菌体ペレットを凍結乾燥処理して粉末化した。
５）滅菌水で菌体濃度が１０．４ｍｇ／ｍｌになるように調整した。
６）９０℃で３０分間加熱処理した。
７）この乳酸菌液に４倍量のＲＰＭＩ培地を添加した（乳酸菌濃度２．０８mg/ml）ものを乳酸菌調整液として下記の試験に供した。調整した乳酸菌調整液は、実施例４および比較例９に用いた。
(1) Method for preparing cells of Lactobacillus plantarum IFO3070 1) 10 μl of a cryopreserved solution of lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum IFO3070 was added to 100 ml of MRS medium (OXOID), followed by stationary culture at 37 ° C. for 24 hours.
2) The culture broth was centrifuged to recover only the cells.
3) After suspending the cells in 0.9% sterilized physiological saline, the cells were centrifuged again to collect the cells. Suspension of cells in 0.9% sterile physiological saline and centrifugation were repeated a total of 3 times.
4) The bacterial cell pellet was lyophilized and powdered.
5) The microbial cell concentration was adjusted to 10.4 mg / ml with sterilized water.
6) Heat-treated at 90 ° C. for 30 minutes.
7) A solution obtained by adding 4 times the amount of RPMI medium (concentration of lactic acid bacteria: 2.08 mg / ml) to this lactic acid bacteria solution was subjected to the following test as a lactic acid bacteria adjustment solution. The prepared lactic acid bacteria adjustment solution was used in Example 4 and Comparative Example 9.
（２）Lactobacillus plantarum ＨＳＫ２０１Ｄ（日本ハム株式会社）、Enterococcus faecalis ＥＣ-１２（コンビ株式会社）、Lactobacillus casei Ｋ−１(亀田製菓株式会社）の菌体末からの乳酸菌調整液の調整方法
１） 乳酸菌末１ｇを滅菌した０．９％生理食塩水５０ｍｌに懸濁し、遠心分離して菌体を回収した。
２）回収した菌体に滅菌した０．９％生理食塩水５０ｍｌを加えて再懸濁し、遠心分離して菌体を回収した。０．９％滅菌生理食塩水への菌体の懸濁と遠心分離処理は合計３回繰り返した。
３）菌体ペレットを凍結乾燥処理して粉末化した。
４）滅菌水で菌体濃度が１０．４ｍｇ／ｍｌになるように調整した。
５）９０℃で３０分間加熱処理した。
６）この乳酸菌液に４倍量のＲＰＭＩ培地を添加した（乳酸菌濃度２．０８mg/ml）ものを乳酸菌調整液として下記の試験に供した。Lactobacillus plantarum ＨＳＫ２０１Ｄの乳酸菌調整液は実施例５および比較例１０に用いた。Enterococcus faecalis ＥＣ-１２の乳酸菌調整液は比較例１１及び比較例１２に用いた。Lactobacillus casei Ｋ-１の乳酸菌調整液は比較例１３及び比較例１４に用いた。
(2) Lactobacillus plantarum HSK201D (Nippon Ham Co., Ltd.), Enterococcus faecalis EC-12 (Combi Corporation), Lactobacillus casei K-1 (Kameda Seika Co., Ltd.)
2) 50 ml of sterilized 0.9% physiological saline was added to the collected cells, resuspended, and centrifuged to collect the cells. Suspension of cells in 0.9% sterile physiological saline and centrifugation were repeated a total of 3 times.
3) The cell pellet was freeze-dried and powdered.
4) The microbial cell concentration was adjusted to 10.4 mg / ml with sterilized water.
5) Heat-treated at 90 ° C. for 30 minutes.
6) A solution obtained by adding 4 times the amount of RPMI medium (lactic acid bacteria concentration 2.08 mg / ml) to this lactic acid bacteria solution was subjected to the following test as a lactic acid bacteria preparation solution. Lactobacillus plantarum HSK201D lactic acid bacterium preparation solution was used in Example 5 and Comparative Example 10. Enterococcus faecalis EC-12 lactic acid bacteria adjustment solution was used in Comparative Example 11 and Comparative Example 12. Lactobacillus casei K-1 lactic acid bacteria preparation solution was used in Comparative Examples 13 and 14.
（３）精製β‐グルカンの濃度調整
実施例１および比較例１、２に記載の方法と同様の方法により、精製β-グルカン調整液を調整し、実施例４、実施例５、比較例１１、比較例１３および比較例１５に用いた。
(3) Concentration adjustment of purified β-glucan A purified β-glucan adjusting solution was prepared by the same method as described in Example 1 and Comparative Examples 1 and 2, and Example 4, Example 5, and Comparative Example 11 were prepared. Used in Comparative Example 13 and Comparative Example 15.
（４）パイエル板細胞の培養方法
実施例１および比較例１、２に記載の方法と同様の方法により行なった。実施例４、５および比較例９〜１５における披検物質および披検物質濃度について表６に示す。
(4) Peyer's plate cell culture method The same method as described in Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 was used. Table 6 shows test substances and test substance concentrations in Examples 4 and 5 and Comparative Examples 9 to 15.
（５）ＩｇＡ抗体の測定
実施例１および比較例１、２に記載の方法と同様の方法により行なった。
(5) Measurement of IgA antibody The IgA antibody was measured by the same method as described in Example 1 and Comparative Examples 1 and 2.
図３に実施例４、５および比較例９〜１５のパイエル板細胞培養液上清中に含まれるＩｇＡ抗体濃度測定値をグラフ化したものを示す。Lactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０とLactobacillus plantarum ＨＳＫ２０１Ｄにおいては、精製β-グルカンの添加により、乳酸菌単体の場合よりもＩｇＡ抗体の産生量が増加した。実施例４と比較例９、また実施例５と比較例１０について平均値の差の検定を行なった結果、有意水準５％で差が生じた。このことから、Lactobacillus plantarum ＩＦＯ３０７０およびLactobacillus plantarum ＨＳＫ２０１Ｄに精製β-グルカンを添加することで、乳酸菌単体で得られるＩｇＡ抗体産生誘導効果よりも有意に高いＩｇＡ抗体産生誘導が生じていることが分かる。一方、比較例１１と比較例１２、また比較例１３と比較例１４について平均値の差の検定を行なった結果、有意水準５％で差があるとはいえず、Enterococcus aecalis ＥＣ-１２とLactobacillus casei Ｋ-１に精製βグルカンを添加してもＩｇＡ抗体産生誘導における相乗効果は認められなかった。 FIG. 3 is a graph showing measured IgA antibody concentrations contained in the supernatants of Peyer's plate cell culture fluids of Examples 4 and 5 and Comparative Examples 9 to 15. In Lactobacillus plantarum IFO3070 and Lactobacillus plantarum HSK201D, the production amount of IgA antibody increased by the addition of purified β-glucan as compared with the case of lactic acid bacteria alone. As a result of testing the difference between the average values of Example 4 and Comparative Example 9, and Example 5 and Comparative Example 10, a difference occurred at a significance level of 5%. From this, it can be seen that by adding purified β-glucan to Lactobacillus plantarum IFO3070 and Lactobacillus plantarum HSK201D, IgA antibody production induction significantly higher than the IgA antibody production induction effect obtained with lactic acid bacteria alone occurs. On the other hand, as a result of the test of the difference between the average values for Comparative Example 11 and Comparative Example 12 and Comparative Example 13 and Comparative Example 14, it cannot be said that there is a difference at a significance level of 5%. Enterococcus aecalis EC-12 and Lactobacillus Even when purified β-glucan was added to casei K-1, a synergistic effect in inducing IgA antibody production was not observed.
飲食品組成物の処方例
処方例１（クッキー）
粉末β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン 1重量％
殺菌乳酸菌末 0.2重量％
カテキン 1重量％
クッキー生地 残量
処方例２（サプリメント）
粉末β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン 10重量％
コラーゲンペプチド 42重量％
ヒアルロン酸 0.06重量％
殺菌乳酸菌末 １重量％
ビタミンC 10重量％
ビタミンB2 0.03重量％
ビタミンB6 0.03重量％
賦形剤（デンプンなど）
残量
処方例３（ドリンク剤）
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液
（0.2重量％β‐グルカン水溶液） 61.5重量％
殺菌乳酸菌末 0.03重量％
ミルクオリゴ糖 0.8重量％
ラクトフェリン 0.09重量％
甘味料（スクラロース） 0.03重量％
クエン酸 0.22重量％
香料 0.37重量％
水 残部
処方例４（ドリンク剤）
β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン水溶液
（0.2重量％β‐グルカン水溶液） 61.5重量％
殺菌乳酸菌末 0.03重量％
テアニン 0.8重量％
GABA 0.09重量％
甘味料（スクラロース） 0.03重量％
クエン酸 0.22重量％
香料 0.37重量％
水 残部
Formulation example for food and beverage composition Formulation example 1 (cookie)
Powder β-1,3-1,6-D-
Bactericidal lactic acid bacteria powder 0.2% by weight
Cookie dough
Formulation Example 2 (Supplement)
Powder β-1,3-1,6-D-
Collagen peptide 42% by weight
Hyaluronic acid 0.06% by weight
Bactericidal lactic
Vitamin B2 0.03% by weight
Vitamin B6 0.03% by weight
Excipient (such as starch)
Remaining amount
Formulation Example 3 (Drink)
β-1,3-1,6-D-glucan aqueous solution (0.2 wt% β-glucan aqueous solution) 61.5 wt%
Bactericidal lactic acid bacteria powder 0.03% by weight
Milk oligosaccharide 0.8% by weight
Lactoferrin 0.09% by weight
Sweetener (sucralose) 0.03% by weight
Citric acid 0.22% by weight
Fragrance 0.37% by weight
Water balance
Formulation Example 4 (Drink)
β-1,3-1,6-D-glucan aqueous solution (0.2 wt% β-glucan aqueous solution) 61.5 wt%
Bactericidal lactic acid bacteria powder 0.03% by weight
Theanine 0.8% by weight
GABA 0.09 wt%
Sweetener (sucralose) 0.03% by weight
Citric acid 0.22% by weight
Fragrance 0.37% by weight
Water balance
腸管免疫賦活効果が高い免疫賦活剤を提供する。
An immunostimulant having a high intestinal tract immunostimulatory effect is provided.
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