JP5906369B2 - 魚病に対する免疫賦活剤及び飼料 - Google Patents
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Description
[1].ミモザ抽出物を有効成分とする魚病に対する免疫賦活剤。
[2].ミモザ抽出物が、タンニンを50〜90質量%(固形分)含むものである[1]記載の魚病に対する免疫賦活剤。
[3].ミモザ抽出物が、ミモザの樹皮の熱水抽出物である[1]又は[2]記載の魚病に対する免疫賦活剤。
[4].エドワジエラ症の魚病に対するものである[1]、[2]又は[3]記載の魚病に対する免疫賦活剤。
[5].マダイの魚病に対するものである[1]〜[4]のいずれかに記載の魚病に対する免疫賦活剤。
[6].[1]〜[5]のいずれかに記載の魚病に対する免疫賦活剤を含有する魚用飼料。
[7].ミモザ抽出物を含有する、魚病に対する免疫賦活用飼料。
本発明の魚病に対する免疫賦活剤の有効成分であるミモザ抽出物は、マメ科アカシア(Acasia)属に属する植物である。使用部位は、樹皮、根、根茎、葉、茎のいずれの部位でも原料として使用することができるが、樹皮を使用することが好ましい。抽出方法は特に限定されず、溶媒抽出、熱水抽出、水蒸気蒸留、超臨界抽出等の公知の抽出方法を採用することができる。例えば、溶媒抽出の場合、ミモザ樹皮を生のまま、又は乾燥した後に適当な大きさに切断・加工し、抽出溶媒に浸漬、撹拌することによって得ることができる。抽出は必要に応じて加温してもよく、時間は適宜選定され、抽出pHは、極端な酸性又はアルカリ性でなければ特に制限はない。上記抽出方法に用いる溶媒としては、水;メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類;プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類等が挙げられ、これらを1種単独で又は2種以上を適宜組み合わせて用いることができる。抽出後ろ過を行い、適宜公知の精製を行ってもよい。さらに、抽出液は、適宜、濃縮、分離精製、噴霧乾燥等を行うことができる。
カテキン100mgを99容量%エタノール100mLに溶解した溶液0.1mLに、蒸留水8.0mL及びフォーリン・デニス試薬0.5mLを加え、室温で3分間静置した後、10質量%炭酸ナトリウム溶液1.0mLを加え、室温で30分間静置し、760nmにおける吸光度Aoを求める。次にミモザ抽出物100mgを50容量%エタノール100mLに溶解した溶液0.1mLを、同様に処理し吸光度Aを求める。カテキンの含量を100質量%として、その相対値(A/Ao×100)をもってミモザ抽出物のタンニン含量とする。
本発明の魚病に対する免疫賦活剤は、ミモザ抽出物を有効成分とする魚病に対する免疫賦活剤である。魚病に対する免疫賦活剤の対象となる魚病としては、エドワジエラ症:エドワジエラ タルダ(Edwardsiella tarda)、ビブリオ病:ビブリオ ダムセラ(Vibrio damsela)、ビブリオ ハーベイ(Vibrio harveyi)、ビブリオ オーダリー(Vibrio ordalli)、ビブリオ ペスシダ(Vibrio penaeicida)、ビブリオ スプレンディダス(Vibrio splendidus)、ビブリオ バルニフィカス(Vibrio vulnificus)、ビブリオ アンギラルム(Vibrio anguillarum)、細菌性腸管白濁症:ビブリオ イチオエンテリー(Vibrio ichthyoenteri)、潰瘍病:ビブリオ パラヘモリティカス(Vibrio parahaemolyticus)、桿菌性壊死症:ビブリオ トゥビアッシ(Vibrio tubiashii)、カラムナリス病:フラボバクテリウム カラムナレ(Flavobacterium columnare)、冷水病:フレキシバクター サイクロフィラム(Flexibacter psychrophilum)、滑走細菌症:フレキシバクター マリティマス(Flexibacter maritimus)、テナチバキュラム・マリティマム(Tenacibaculum maritimum)、ノカルジア症:ノカルディア アステロイデス(Nocardia asteroides)、ノカルジア・セリオラエ(Nocardia seriolae)、類結節症:フォトバクテリウム ダムセラ(Photobacterium damsela)、乳酸桿菌症:カーノバクテリウム ピシコラ(Carnobacterium piscicola)、ブドウ球菌症:スタフィロコッカス エピデルミデス(Staphylococcus epidermideis)、菌血症:ラクトコッカス ガービア(Lactococcus garvieae)、せっそう病:エロモナス サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)、連鎖球菌症:エンテロコッカス種(Enterococcus sp.)、ストレプトコッカス イニエ(Streptococus iniae)、ストレプトコッカス ディスガラクティエ(Streptococus dysgalactiae)、ストレプトコッカス・パラユベリス(Streptococus parauberis)等が挙げられる。中でも、エドワジエラ症に対して有効である。
ミモザ(樹皮)1000gを粉砕し、ミモザ(樹皮)の10倍量で熱水抽出した。固体と液体とを分離して抽出液を得た。得られた抽出液を濃縮し、濃縮液(固形45質量%)を得て、これを噴霧乾燥し、ミモザ抽出物150g(タンニン含量65質量%)を得た。
得られたミモザ抽出物について、下記評価を行った。
ミモザ抽出物含有寒天培地(ミモザ抽出物濃度:0.002〜1.000%(w/v)、2倍希釈系列)に種々の菌液を滴下し(5μL/滴)、2〜4日間、25℃で培養した。目視でコロニーの発育が確認できなかったミモザ抽出物最小濃度を、最小発育阻止濃度(MIC)とした。寒天培地には、ミモザ抽出物を溶解した培地24mLを直径9cmのシャーレに注いだものを使用した。また、発育陽性培地として、ミモザ抽出物不含寒天培地も同様に作成し、細菌の発育と滴下菌量を確認した。結果を表1に示す。下記9種類(15株)の魚病原因菌(細菌)に対し、発育阻止効果が認められた。
エドワジエラ症の原因細菌であるEdwardsiella tardaは宿主食細胞内で抵抗性を示すため、本症の予防には、食細胞のポテンシャルキリング活性(PK)の向上が有効と考えられている。ミモザ抽出物がPKに及ぼす影響を確認した。
100L水槽4槽に平均体重66.7gのマダイを5尾ずつ収容した。水温25℃に馴致した後、各水槽のマダイに、実施例1で得られたミモザ抽出物を表2の割合で添加したモイストペレット(MP)を給餌率4質量%/日で4週間毎日投与した。最終投与日の翌日、下記方法により血液のポテンシャルキリング活性を測定した。結果を表2に併記する。
マイクロチューブにNBT溶液(コントロール)及びZymosan加NBT溶液を15μLずつ分注し、魚より採血した血液100μLを毛細管(長さ75mm、φ2mm、ミナトメディカル製)に充填し1000G、4℃で5分間遠心分離を行った。遠心分離機より毛細管を取り出し、白血球層と赤血球層の境界面及び白血球層の上方2cmで毛細管を切断し、白血球を含む部分を、50μLRPMI1640溶液を用いて新しいマイクロチューブに移動させた。得られた白血球溶液をピペッティングにて白血球細胞を分散し、NBT溶液及びZymosan加NBT溶液を15μLずつ加え、25℃でインキュベート行った。その後、15質量%NaCl溶液を30μL加えた。次に、DMF400μLを各マイクロチューブに加えてピペットを用いて混和し、1500G,4℃、15分間遠心分離を行った。上清250μLを石英マイクロプレートに移し、540nmの吸光値(OD)を測定し、下記式を用いて評価を行った。
ポテンシャルキリング活性(PK)
=Zymosan加NBT溶液のOD−NBT溶液のOD
マダイのエドワジエラ症の感染予防に、ミモザ抽出物の投与が有効かどうか確認した。
100L水槽6槽に平均体重55.0gのマダイを10尾ずつ収容した。水温25℃に馴致した後、各水槽のマダイに、実施例1のミモザ抽出物を表3の割合で添加したモイストペレット(MP)を、給餌率4質量%/日で4週間毎日投与した。4週間投与した翌日、ミモザ抽出物を投与して1.5時間後にE.tarda(MEE0309株)の菌液(107CFU/mL)でマダイを1.5時間浸漬攻撃した。その後水槽に再収用し、攻撃後24時間目の血液と腎臓における菌量を測定した。
マダイのエドワジエラ症の発生予防に、ミモザ抽出物の投与が有効かどうかを確認した。500L水槽2槽に平均体重79.1gのマダイを18尾ずつ収容した。水温25℃に馴致した後、各水槽のマダイに、実施例1のミモザ抽出物を表4の割合で添加したモイストペレット(MP)を給餌率4質量%/日で毎日投与した。4週間投与した翌日、ミモザ抽出物を投与して1.5時間後にE.tarda(MEE0309株)の菌液(107CFU/mL)でマダイを1.5時間浸漬攻撃した。その後水槽に再収用し、攻撃後28日間、マダイの累積死亡率を観察した。攻撃後も観察終了まで表4のミモザ抽出物を投与した。
下記表5に示す組成の魚用飼料を作製した。
Claims (7)
- ミモザ抽出物を有効成分とする魚病に対する免疫賦活剤。
- ミモザ抽出物が、タンニンを50〜90質量%(固形分)含むものである請求項1記載の魚病に対する免疫賦活剤。
- ミモザ抽出物が、ミモザの樹皮の熱水抽出物である請求項1又は2記載の魚病に対する免疫賦活剤。
- エドワジエラ症の魚病に対するものである請求項1、2又は3記載の魚病に対する免疫賦活剤。
- マダイの魚病に対するものである請求項1〜4のいずれか1項記載の魚病に対する免疫賦活剤。
- 請求項1〜5のいずれか1項記載の魚病に対する免疫賦活剤を含有する魚用飼料。
- ミモザ抽出物を含有する、魚病に対する免疫賦活用飼料。
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