JP5900491B2 - 細胞培養方法及び細胞培養キット - Google Patents
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Description
(1)培養バッグ11の内面に付着性細胞を播種してインキュベートする第1ステップ。
(2)培養バッグ11から培地を排出し、剥離液を培養バッグ11に充填する第2ステップ。
(3)剥離液が充填された培養バッグ11の合成樹脂シートを撓ませて、合成樹脂シートから付着性細胞を剥離させる第3ステップ。
(4)培養バッグ11の合成樹脂シートから剥離された付着性細胞を回収する第4ステップ。
低密度ポリエチレン(LDPE、三菱ファーマケミカル)単層、厚み250μmの樹脂シートを縦100mm×横120mmの長方形に裁断した。裁断した樹脂シートの周縁領域の約10mmをマスキングして大気圧プラズマ処理を行った。大気圧プラズマ処理は、約25℃、アルゴン68容量%、ヘリウム29容量%、窒素3容量%の混合ガス雰囲気下、大気圧で行った。また、高圧電極及び低圧電極は板状(335mm×250mm)とし、電極間距離を3mmに設定した。また、電源として周波数が5kHzの交流電源を用い、高圧電極と低圧電極との間に2.2kVの電圧を与えた。このプラズマ処理を30秒間行うことにより、上記樹脂シートの中央部(縦80mm×横100mm)に細胞付着性官能基を導入した。
0.01%EDTA(金属キレート剤)に代えて、1%L−オルニチンを用いたほかは、実施例1と同様に実施した。
0.01%EDTA(金属キレート剤)に代えて、0.01%EDTA(金属キレート剤)及び1%L−オルニチンを用いたほかは、実施例1と同様に実施した。
培養バッグ11に代えてフラスコを用い、他の条件は実施例1と同様にして付着性細胞を培養した。その後、実施例1と同様に剥離液10mlをフラスコに流入して、常温、10分間放置した。その後、フラスコから剥離液を回収して、剥離液中に懸濁された付着性細胞の数をカウントした。
実施例1と同様にして培養バッグ11に付着性細胞を培養した。その後、0.25%トリプシン(250IU)−0.01%EDTAを含む剥離液10mlを培養バッグ11に流入して、37℃、5分間放置した。その後、培養バッグ11を撓ませた上で培養バッグ11から剥離液を回収して、剥離液中に懸濁された付着性細胞の数をカウントした。
培養バッグ11に代えてフラスコを用い、他の条件は実施例1と同様にして付着性細胞を培養した。その後、0.25%トリプシン(250IU)−0.01%EDTAを含む剥離液2mlをフラスコに流入して、37℃、5分間放置した。その後、フラスコから剥離液を回収して、剥離液中に懸濁された付着性細胞の数をカウントした。
11・・・培養バッグ(第1バッグ)
12・・・剥離液バッグ(第2バッグ)
13・・・送液回路
Claims (4)
- 可撓性、並びに付着性細胞が培養可能な親水性及び透過性を有するシートがバッグ形状に形成されており、培地が充填された第1バッグと、金属キレート剤、又は、オルニチン、N−[アミノ(ヒドロキシイミノ)メチル]−オルニチン又はその構造異性体、N−アセチル−オルニチン、N−アシル−オルニチン、N−(L−カルボキシエチル)−オルニチン、N−サクシニル−オルニチン、N,N−ジベンゾイル−オルニチン、若しくは(ジフルオロメチル)オルニチンン、N−[(ヒドロキシ)(イミノ)メチル]−オルニチンからなる群から選ばれる少なくとも1つを含む剥離液が充填された第2バッグと、上記第1バッグと上記第2バッグとを連結して、上記第2バッグから上記第1バッグへ上記剥離液を送液可能な送液回路と、を具備する細胞培養キットを用いて付着性細胞を培養する細胞培養方法であって、
上記第1バッグのシートの親水性を有する内面に付着性細胞を播種してインキュベートする第1ステップと、
上記第1バッグから培地を排出し、上記送液回路を通じて上記第2バッグから上記剥離液を上記第1バッグへ送る第2ステップと、
上記剥離液が充填された上記第1バッグのシートを撓ませて、当該シートから付着性細胞を剥離させる第3ステップと、
上記第1バッグのシートから剥離された付着性細胞を回収する第4ステップと、を含む細胞培養方法。 - 上記剥離液が、EDTAを含む請求項1に記載の細胞培養方法。
- 上記第3ステップにおいて、上記第1ステップのインキュベートにおける上記第1バッグの環境温度より低い環境温度において、上記第1バッグのシートを撓ませる請求項1又は2に記載の細胞培養方法。
- 上記第1バッグのシートは、少なくとも内面側にポリオレフィン系樹脂層を有するものであって、当該ポリオレフィン系樹脂層がプラズマ処理されることにより親水性を有するものである請求項1から3のいずれかに記載の細胞培養方法。
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