JP5885148B2 - 遺伝子組換えコリネ型細菌および含乳酸ポリエステルの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、遺伝子組換えコリネ型細菌および含乳酸ポリエステルの製造方法に関する。より詳細には、含乳酸ポリエステル合成能力を本来有していないコリネ型細菌に、含乳酸ポリエステル合成に関与する酵素をコードする遺伝子群を導入することにより、含乳酸ポリエステル生産能が付与された遺伝子組換えコリネ型細菌およびこれを用いた含乳酸ポリエステルの製造方法に関するものである。

ポリ乳酸に代表される含乳酸ポリエステルは、石油を原料とせず再生可能なバイオマスから合成することができ、優れた透明性と加工性を有することから、すでに多くの分野で使用されているバイオベースプラスチックであり、脱石油と言う観点から高いニーズがある。

従来的に、含乳酸ポリエステルの化学的合成においては、乳酸からラクチドを合成するプロセスと、有害なスズ触媒などを使用して開環重合するプロセスが必要とされ、これらのプロセスはエネルギー消費が高いほか、得られる製品の安全性が問題となっていた。

一方、糖を炭素源としてポリエステルを生産可能な微生物が、これまでに多数報告されている（非特許文献１）。微生物が生産するポリエステルは、自然界で容易に分解される生分解性プラスチックとして、また糖や植物油などの再生可能な炭素資源から合成することができる“グリーン”プラスチックとして、注目されている。

これまでに、乳酸重合酵素（ポルリヒドロキシアルカン酸合成酵素）遺伝子を導入した遺伝子組換え大腸菌を用いて、スズ触媒などを用いることなく、含乳酸ポリエステルを製造可能な事が示されている（非特許文献２）。また、特許文献１には、クロストリジウム プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼをコードする核酸を組み込んだラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、旧名アルカリゲネス ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ））を、培地に乳酸を添加しながら培養して、３−ヒドロキシ酪酸（以下、「３ＨＢ」と記載する場合がある）と乳酸とからなる共重合ポリエステルを製造する方法が開示されている。さらに、特許文献２には、上記の各酵素をコードする核酸とラルストニア・ユートロファ由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の改変体（ＰｈａＣｍ）をコードする核酸を組み込んだ遺伝子組換え大腸菌を、培地に乳酸を添加せずに培養することによって、生産される３ＨＢと乳酸とからなる共重合ポリエステル中の乳酸含有率を高める方法が開示されている。

しかし、上記方法で合成された含乳酸ポリエステルは、３ＨＢと乳酸の共重合体であり、ポリエステル中の乳酸分率は十分に高いものではなかった。さらに、大腸菌は外毒素を含んでいるため、生産されたポリエステルを医療分野などへ応用する際には、外毒素を含む不純物を慎重に除去する必要があった。

また、遺伝子組換えコリネ型細菌を用いてポリ−３−ヒドロキシブタン酸の合成が可能であることが示されている（特許文献３）。当該遺伝子組換えコリネ型細菌を用いた系では、大腸菌を用いたポリ−３−ヒドロキシブタン酸合成とは異なり、外毒素を含まないポリマーの合成が可能であること、また大腸菌と同等程度の生産性を持って、ポリ−３−ヒドロキシブタン酸合成が可能であることが開示されている。

さらに、遺伝子組換えコリネ型細菌を用いて、乳酸を発酵生産することが可能であることが示されている（非特許文献３）。

しかし、現在までコリネ型細菌を用いて含乳酸ポリエステルを生産させた例は報告されていない。

ＷＯ２００６／１２６７９６ ＷＯ２００９／１３１１８６ 特開２００８−２４５６３３号公報

「生分解性プラスチックハンドブック」、生分解性プラスチック研究会編、１９９５年、第１７８−１９７頁、（株）エヌ・ティー・エス発行 Ｓｈｏｚｕｉ ｅｔ ａｌ． Ｐｏｌｙｍ． Ｄｅｇｒａｄ． Ｓｔａｂ． Ｉｎ ｐｒｅｓｓ ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｏｌｙｍｄｅｇｒａｄｓｔａｂ．２０１１．０１．００７（２０１１） Ｏｋｉｎｏ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （２００８） ７８： ４４９−５４

本発明は、遺伝子組換えコリネ型細菌を用いて、乳酸分率が高い含乳酸ポリエステルを生産する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、含乳酸ポリエステル合成能力を本来有していないコリネ型細菌に、乳酸脱水素酵素遺伝子、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、β−ケトチオラーゼ遺伝子、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子およびポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を導入した遺伝子組換えコリネ型細菌株が、高い（９９％以上）乳酸分率を有するポリエステルを合成できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 含乳酸ポリエステル合成能力を本来有していないコリネ型細菌に、乳酸脱水素酵素遺伝子、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、β−ケトチオラーゼ遺伝子、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子およびポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を含む含乳酸ポリエステル合成に関与する遺伝子群が導入されており、かつ９９％以上の乳酸分率を有する含乳酸ポリエステル生産能を有する、遺伝子組換えコリネ型細菌。
［２］ 乳酸脱水素酵素遺伝子が大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）に由来する、［１］の遺伝子組換えコリネ型細菌。
［３］ プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子がメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）に由来する、［１］または［２］の遺伝子組換えコリネ型細菌。
［４］ β−ケトチオラーゼ遺伝子およびアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子がラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）に由来する、［１］〜［３］のいずれかの遺伝子組換えコリネ型細菌。
［５］ ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子がシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に由来する、［１］〜［４］のいずれかの遺伝子組換えコリネ型細菌。
［６］ ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子であり、該変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素が配列番号１０のアミノ酸配列において３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、及び４８１番目のＧｌｎがＬｙｓに置換された二重変異を有する、［５］の遺伝子組換えコリネ型細菌。
［７］ 含乳酸ポリエステル合成能力を本来有していないコリネ型細菌が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌である、［１］〜［６］のいずれかの遺伝子組換えコリネ型細菌。
［８］ コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、［７］の遺伝子組換えコリネ型細菌。
［９］ 含乳酸ポリエステル合成に関与する遺伝子群がコリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターの制御下にある、［１］〜［８］のいずれかの遺伝子組換えコリネ型細菌。
［１０］ コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターが以下のいずれかの塩基配列を含む、［９］の遺伝子組換えコリネ型細菌：
（ｉ）配列番号１３に示される塩基配列；
（ｉｉ）配列番号１３に示される塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつ宿主生物中で連結された遺伝子の転写調節活性を有する塩基配列；
（ｉｉｉ）配列番号１３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡの塩基配列であって、かつ宿主生物中で連結された遺伝子の転写調節活性を有する塩基配列；または
（ｉｖ）配列番号１３に示される塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなりかつ宿主生物中で連結された遺伝子の転写調節活性を有する塩基配列。
［１１］ β−ケトチオラーゼ遺伝子、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子およびポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子がオペロンを形成している、［１］〜［１０］のいずれかの遺伝子組換えコリネ型細菌。
［１２］ 乳酸脱水素酵素遺伝子およびプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子がオペロンを形成している、［１］〜［１１］のいずれかの遺伝子組換えコリネ型細菌。
［１３］ ［１］〜［１２］のいずれかの遺伝子組換えコリネ型細菌を、炭素源を含む培地で培養する工程１）、および工程１）の培養物から含乳酸ポリエステルを回収する工程２）を含む、９９％以上の乳酸分率を有する含乳酸ポリエステルの製造方法。

本発明の遺伝子組換えコリネ型細菌は、安価なバイオマスを炭素源として、効率よく含乳酸ポリエステルを生産することができる。本発明の遺伝子組換えコリネ型細菌は、産業的に重要な、高い乳酸分率を有するポリエステルを生産することが可能であり、実用的なプラスチック生産菌として利用することができる。

図１は、実施例１で調製した遺伝子組換えプラスミドｐＶＣ７ＬＤＨＰＣＴ（Ａ）とｐＰＳＣ１ＳＴＱＫＡＢ（Ｂ）の構成を示す概略図である。（Ａ）において、Ｐｃｓｐはコリネ菌（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来プロモーターを、ＰＣＴはＭ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ）由来のプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子を、ＬＤＨはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来する乳酸脱水素酵素遺伝子を、Ｃｍｒはクロラムフェニコール耐性遺伝子を示す。（Ｂ）において、Ｐｃｓｐはコリネ菌（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来プロモーターを、ｐｈａＣ１（ＳＴ／ＱＫ）は変異型乳酸重合酵素遺伝子を、ｐｈａＡはＲ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のβ−ケトチオラーゼ遺伝子を、ｐｈａＢはＲ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子を、Ｋｍｒはカナマイシン耐性遺伝子を示す。 図２は、実施例２で調製したポリマーの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析の結果を示すチャート図である。

本発明は、含乳酸ポリエステル合成能力を本来有していないコリネ型細菌に、乳酸脱水素酵素遺伝子、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、β−ケトチオラーゼ遺伝子、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子およびポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を含む含乳酸ポリエステル合成に関与する遺伝子群を導入することによって、含乳酸ポリエステル生産能が付与された遺伝子組換えコリネ型細菌ならびに当該遺伝子組換えコリネ型細菌を用いた含乳酸ポリエステルの製造方法に関する。

以下、本発明について、詳細に説明する。
（１）乳酸脱水素酵素遺伝子
乳酸脱水素酵素は、ピルビン酸とＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を乳酸とＮＡＤ^＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）にする可逆反応を触媒する活性を有するタンパク質である。以下、本明細書において、乳酸脱水素酵素を「ＬＤＨ」と記載する。好ましくは、本発明においてＬＤＨはＤ−ＬＤＨである。

本発明における好ましいＬＤＨ遺伝子は、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、およびメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）のいずれかに由来するものである。特に好ましくは、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するものであり、その塩基配列を配列番号１に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。

なお、本発明においてＬＤＨ遺伝子には、配列番号１に示される塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつピルビン酸とＮＡＤＨを乳酸とＮＡＤ^＋にする可逆反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。ここで用語「数個」とは、１〜４０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１０個以下をいう。

また、本発明においてＬＤＨ遺伝子には、配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡの塩基配列であって、かつピルビン酸とＮＡＤＨを乳酸とＮＡＤ^＋にする可逆反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。本発明において「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、２〜６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）および０．１〜０．５％ＳＤＳを含有する溶液中４２〜５５℃にてハイブリダイズを行い、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液中６５℃にて洗浄を行う条件をいう。

さらに、本発明においてＬＤＨ遺伝子には、配列番号１に示される塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつピルビン酸とＮＡＤＨを乳酸とＮＡＤ^＋にする可逆反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。

また、上記ＬＤＨ遺伝子のコドンは、形質転換に用いる宿主生物（下記にて詳述するコリネ型細菌）のコドン使用頻度に合わせて変換されたものであっても良い。

ピルビン酸とＮＡＤＨを乳酸とＮＡＤ^＋にする可逆反応を触媒する活性は、公知の手法に基づいて測定することができる（Ｖａｎｄｅｒｌｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ １５， Ｉｓｓｕｅ １， １３−３１）。

（２）プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子
プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼは、適当なＣｏＡ基質からプロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応を触媒する活性を有するタンパク質である。以下、本明細書において、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼを「ＰＣＴ」と記載する。

表１に、これまでに報告されたＰＣＴの由来（微生物名）の代表例と、それをコードする塩基配列情報を開示した文献情報を示す。しかし、本発明において利用できるＰＣＴ遺伝子はこれらに限定されることなく、これまでに報告されたＰＣＴ遺伝子のいずれも利用することができる。

本発明における好ましいＰＣＴ遺伝子は、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、およびメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）のいずれかに由来するものである。特に好ましくはメガスファエラ・エルスデニ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）に由来するものであり、その塩基配列を配列番号３に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。

なお、本発明においてＰＣＴ遺伝子には、上記表１に示されるＰＣＴ遺伝子の塩基配列および配列番号３に示される塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつプロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。ここで用語「数個」とは、上記定義のとおりである。

また、本発明においてＰＣＴ遺伝子には、上記表１に示されるＰＣＴ遺伝子の塩基配列および配列番号３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡの塩基配列であって、かつプロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、上記定義のとおりである。

さらに、本発明においてＰＣＴ遺伝子には、上記表１に示されるＰＣＴ遺伝子の塩基列および配列番号３に示される塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつプロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。

また、上記ＰＣＴ遺伝子のコドンは、形質転換に用いる宿主生物（下記にて詳述するコリネ型細菌）のコドン使用頻度に合わせて変換されたものであっても良い。

プロピオン酸及び／又は乳酸にＣｏＡが転移される反応の触媒活性は、例えばＡ．Ｅ．Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２０６巻、第５４７−５５２頁）に記載された方法に従って測定することができる。

（３）β−ケトチオラーゼ遺伝子
β−ケトチオラーゼは、２分子のアセチルＣｏＡが縮合してアセトアセチルＣｏＡが形成される反応を触媒するタンパク質である。以下、本明細書において、β−ケトチオラーゼを、「βＫＴ」と記載する。

表２に、これまでに報告されたβＫＴの由来（微生物名）の代表例と、それをコードする塩基配列情報を開示した文献情報を示す。しかし、本発明において利用できるβＫＴ遺伝子はこれらに限定されることなく、これまでに報告されたβＫＴ遺伝子のいずれも利用することができる。

本発明における好ましいβＫＴ遺伝子は、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、およびメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）のいずれかに由来するものである。特に好ましくはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）に由来するものであり、その塩基配列を配列番号５に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号６に示す。

なお、本発明においてβＫＴ遺伝子には、上記表２に示されるβＫＴ遺伝子の塩基配列および配列番号５に示される塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつ２分子のアセチルＣｏＡが縮合してアセトアセチルＣｏＡが形成される反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。ここで用語「数個」とは、上記定義のとおりである。

また、本発明においてβＫＴ遺伝子には、上記表２に示されるβＫＴ遺伝子の塩基配列および配列番号５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡの塩基配列であって、かつ２分子のアセチルＣｏＡが縮合してアセトアセチルＣｏＡが形成される反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、上記定義のとおりである。

さらに、本発明においてβＫＴ遺伝子には、上記表２に示されるＰＣＴ遺伝子の塩基配列および配列番号５に示される塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ２分子のアセチルＣｏＡが縮合してアセトアセチルＣｏＡが形成される反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。

また、上記βＫＴ遺伝子のコドンは、形質転換に用いる宿主生物（下記にて詳述するコリネ型細菌）のコドン使用頻度に合わせて変換されたものであっても良い。

２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡが形成される反応の触媒活性は、例えばＳｌａｔｅｒら（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９８年、第１８０巻、第１９７９−１９８７頁）に記載された方法によって測定することができる。

（４）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子
アセトアセチルＣｏＡレダクターゼは、アセトアセチルＣｏＡのＮＡＤＰ等の補酵素の存在下で生じる還元反応によって、Ｄ（−）−β−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡが形成される反応を触媒するタンパク質である。以下、本明細書において、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼを、「ＡＡＣｏＡ−Ｒ」と記載する。

表３に、これまでに報告されたＡＡＣｏＡ−Ｒの由来（微生物名）の代表例と、それをコードする塩基配列情報を開示した文献情報又はデータベース登録番号を示す。しかし、本発明において利用できるＡＡＣｏＡ−Ｒ遺伝子はこれらに限定されることなく、これまでに報告されたＡＡＣｏＡ−Ｒ遺伝子のいずれも利用することができる。

本発明における好ましいＡＡＣｏＡ−Ｒ遺伝子は、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、およびメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）のいずれかに由来するものである。特に好ましくはラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）に由来するものであり、その塩基配列を配列番号７に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号８に示す。

なお、本発明においてＡＡＣｏＡ−Ｒ遺伝子には、上記表３に示されるＡＡＣｏＡ−Ｒ遺伝子の塩基配列および配列番号７に示される塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつ上記アセトアセチルＣｏＡの還元反応の触媒活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。ここで用語「数個」とは、上記定義のとおりである。

また、本発明においてＡＡＣｏＡ−Ｒ遺伝子には、上記表３に示されるＡＡＣｏＡ−Ｒ遺伝子の塩基配列および配列番号７に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡの塩基配列であって、かつ上記アセトアセチルＣｏＡの還元反応の触媒活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、上記定義のとおりである。

さらに、本発明においてＡＡＣｏＡ−Ｒ遺伝子には、上記表３に示されるＡＡＣｏＡ−Ｒ遺伝子の塩基配列および配列番号７に示される塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ上記アセトアセチルＣｏＡの還元反応の触媒活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。

また、上記ＡＡＣｏＡ−Ｒ遺伝子のコドンは、形質転換に用いる宿主生物（下記にて詳述するコリネ型細菌）のコドン使用頻度に合わせて変換されたものであっても良い。

上記アセトアセチルＣｏＡの還元反応の触媒活性は、例えばＧ．Ｗ．Ｈａｙｗｏｏｄら（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８８年、第５２巻、第２５９−２６４頁）に記載された方法によって測定することができる。

その他、これまでに知られているβＫＴ遺伝子とＡＡＣｏ−Ｒ遺伝子とそのアクセッション番号を表４に示す。本発明においては、これら遺伝子も利用することができる。

（５）ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素は、ヒドロキシアシルＣｏＡをモノマーとしてポリヒドロキシアルカン酸を合成する反応の触媒活性を有するタンパク質である。また、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素は、ラクチルＣｏＡをモノマーとしてポリ乳酸を合成する反応を触媒する。さらに、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素は、ヒドロキシアシルＣｏＡおよびラクチルＣｏＡをモノマーとして、ヒドロキシアルカン酸−乳酸共重合体を合成する反応を触媒する。なお、本明細書において、「ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素」および「乳酸重合酵素」は相互互換的に使用される。

本発明における好ましいポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子は、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、およびメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）のいずれかに由来するものであり、特に好ましくはシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）６１−３に由来するものであり、その塩基配列を配列番号９に、当該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号１０に示す。

なお、本発明においてポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子には、配列番号９に示される塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつヒドロキシアシルＣｏＡをモノマーとしてポリヒドロキシアルカン酸を合成する反応の触媒活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。ここで用語「数個」とは、上記定義のとおりである。

また、本発明においてポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子には、配列番号９に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡの塩基配列であって、かつヒドロキシアシルＣｏＡをモノマーとしてポリヒドロキシアルカン酸を合成する反応の触媒活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、上記定義のとおりである。

さらに、本発明においてポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子には、配列番号９に示される塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつヒドロキシアシルＣｏＡをモノマーとしてポリヒドロキシアルカン酸を合成する反応の触媒活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。

また、上記ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子のコドンは、形質転換に用いる宿主生物（下記にて詳述するコリネ型細菌）のコドン使用頻度に合わせて変換されたものであっても良い。

ポリヒドロキシアルカン酸を合成する反応の触媒活性は公知の手法によって測定することが可能であり、例えば上記ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子で形質転換された宿主細胞を得、当該宿主細胞のポリヒドロキシアルカン酸の蓄積能によって確認することができる。

また、本発明においてはポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子として、公知の変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素をコードする遺伝子も利用することができる。このような変異型としては、配列番号９に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）の１３０番目、３２５番目、３９２番目、４７７番目及び４８１番目のアミノ酸が、それぞれ単独で置換された単独変異、任意の２つのアミノ酸が置換された二重変異、任意の３つのアミノ酸が置換された三重変異、４つのアミノ酸が置換された四重変異を挙げることができる（ＷＯ２００３／１０００５５）。好ましくは、配列番号１０のアミノ酸配列において３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、及び４８１番目のＧｌｎがＬｙｓに置換された二重変異を有する変異型（配列番号１２）をコードする遺伝子（配列番号１１）、または配列番号１０のアミノ酸配列において３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、３９２番目のＰｈｅがＳｅｒに、及び４８１番目のＧｌｎがＬｙｓに置換された三重変異を有する変異型をコードする遺伝子である。なお、本明細書において、二重変異を有する変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素を、「ＰｈａＣｍ」と記載する場合がある。

（６）遺伝子組換えベクター
上記（１）〜（５）の遺伝子をコードするＤＮＡを宿主生物（下記にて詳述するコリネ型細菌）に導入して、当該宿主生物内でタンパク質に転写翻訳させて使用する。宿主生物に導入されるＤＮＡは、ベクターに組み込まれた形態にあることが好ましい。

前記のベクターは、宿主生物（下記に詳述するコリネ型細菌）中で自立複製可能なものであればよく、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡの形態にあることが好ましい。ＤＮＡをコリネ型細菌に導入するためのベクターとしては、ｐＡＭ３３０、ｐＨＭ１５１９、ｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１、ｐＡＪ１８４４、ｐＣＧ１、ｐＣＧ２、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１、ｐＨＫ、ｐＰＳＰＴＧ１、ｐＶＣ７、ｐＵＣ１９Ｉ等（これらに限定されない）、公知のベクターを用いることができる。

上記（１）〜（５）の遺伝子のベクターへの挿入は、当業者に知られた遺伝子組み換え技術を用いて行うことができる。ベクターに挿入される遺伝子は、宿主生物中で各遺伝子にコードされるタンパク質の転写翻訳を調節することが可能なプロモーターの下流に、連結して挿入される。プロモーターとしては、宿主生物中で遺伝子の転写を調節できるものであればいずれを用いてもよいが、好ましくは、宿主生物に由来するプロモーターを利用する。好適なプロモーターとしては、細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターが挙げられ、宿主生物にコリネ型細菌を用いる場合には、コリネ型細菌由来の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを用いる。特に好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に由来するものであり、その塩基配列を配列番号１３に示す。

なお、本発明において、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来する細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターには、配列番号１３に示される塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつ宿主中で連結された遺伝子の転写調節活性を有する塩基配列も利用可能である。ここで用語「数個」とは、上記定義のとおりである。

また、本発明において、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来する細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターには、配列番号１３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡの塩基配列であって、かつ宿主中で連結された遺伝子の転写調節活性を有する塩基配列も利用可能である。ここで「ストリンジェントな条件」とは、上記定義のとおりである。

さらに、本発明において、コリネバクテリウム・グルタミカムに由来する細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターには、配列番号１３に示される塩基配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなりかつ宿主中で連結された遺伝子の転写調節活性を有する塩基配列も利用可能である。

また、ベクターには、必要に応じて、遺伝子を導入しようとする宿主生物において利用可能なターミネーター配列、エンハンサー配列、スプライシングシグナル配列、ポリＡ付加シグナル配列、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、選択マーカー遺伝子などを連結することができる。選択マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子の他、アミノ酸や核酸等の栄養素の細胞内生合成に関与する遺伝子、あるいはルシフェラーゼ等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子などを挙げることができる。

上記の点から、本発明においては、ｐＶＣ７（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６９，３５８−３６６（２００３））およびｐＰＳＰＴＧ１（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．上掲）を用いることができる。前記プロモーターを含むｐＶＣ７およびｐＰＳＰＴＧ１に、上記（１）〜（５）の遺伝子を前記プロモーターの３’下流に配置されるように連結・挿入して、当該プロモーターによって（１）〜（５）の遺伝子を発現する発現プラスミドベクターｐＶＣ７ＰＣＴＬＤＨとｐＰＳＣ１ＳＴＱＫＡＢを構築することができる（下記実施例にて詳述）。

ベクターには、上記（１）〜（５）より選択されるいずれかの遺伝子を一つ挿入しても良いし、上記（１）〜（５）より選択される複数個の遺伝子を挿入しても良い。ベクターに挿入される遺伝子について用いられる場合「複数個」とは２〜５個、２〜４個、好ましくは２〜３個の遺伝子を挿入することが可能である。ベクターに複数個の遺伝子を挿入する場合において、一つのベクターに含まれる遺伝子の組み合わせは適宜選択することができる。例えば、一のベクターには、ＰＣＴ遺伝子およびＬＤＨ遺伝子を、また別のベクターには、βＫＴ遺伝子、ＡＡＣｏＡ−Ｒ遺伝子およびポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を挿入することができるが、これらに限定されない。また、一つのベクターに複数個の遺伝子が挿入される場合、これらの遺伝子はオペロンを形成することが好ましい。ここで「オペロン」とは、同一のプロモーターの制御下に転写される１またはそれ以上の遺伝子から構成される核酸配列単位である。

上記の遺伝子、好ましくはベクターの形態にある遺伝子は、当業者に知られた方法によって、宿主生物に導入される。宿主生物へのベクターの組み換え方法としては、例えばリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、接合伝達法、カルシウムイオンを用いる方法や等が挙げられる。

（７）コリネ型細菌
本発明における遺伝子組み換えコリネ型細菌は、上記（１）〜（５）の遺伝子の導入によって形質転換されたコリネ型細菌である。本発明において、宿主生物として利用し得るコリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロコッカス（Ａｇｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アグロマイセス（Ａｇｒｏｍｙｃｅｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ラサイバクター（Ｒａｔｈａｙｉｂａｃｔｅｒ）属、テラバクター（Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ）属、ツリセラ（Ｔｕｒｉｃｅｌｌａ）属などに属する細菌が挙げられる。好ましくは、コリネバクテリウム属細菌である。さらに、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌として、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６等の菌株が挙げられ、好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ１３０３２、およびＡＴＣＣ１４０６７である。これらはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国）より入手できる。

（８）含乳酸ポリエステルの製造
本発明において、含乳酸ポリエステルの製造は、上記（１）〜（５）の遺伝子が導入された遺伝子組み換えコリネ型細菌を、炭素源を含む培地で培養し、培養菌体又は培養物中に含乳酸ポリエステルを生成蓄積させ、該培養菌体又は培養物から当該含乳酸ポリエステルを回収することにより行われる。

炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、マルトース等の炭水化物が挙げられる。また、炭素数４以上の油脂関連物質を炭素源とすることもできる。炭素数４以上の油脂関連物質としては、コーン油、大豆油、サフラワー油、サンフラワー油、オリーブ油、ヤシ油、パーム油、ナタネ油、魚油、鯨油、豚油又は牛油などの天然油脂、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノレン酸、リノール酸若しくはミリスチン酸等の脂肪酸又はこれらの脂肪酸のエステル、オクタノール、ラウリルアルコール、オレイルアルコール若しくはパルミチルアルコール等又はこれらアルコールのエステル等が挙げられる。

窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。

培養は、通常振盪培養などの好気的条件下、２５〜３７℃の範囲、好ましくは３０℃、ｐＨ７〜８、好ましくはｐＨ７．５にて、前記（１）〜（５）のタンパク質が転写発現されてから２４時間以上行うことが好ましい。培養は、バッチ式で行っても、連続式で行っても良い。

本発明の好ましい態様は、Ｅ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来のＬＤＨ遺伝子（配列番号１）、Ｍ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ）由来のＰＣＴ遺伝子（配列番号３）、Ｒ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のβＫＴ遺伝子（配列番号５）、Ｒ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のＡＡＣｏＡ−Ｒ遺伝子（配列番号７）及びＰ．・スピーシーズ（Ｐ．ｓｐ．）６１−３に由来する変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子（配列番号１１）を導入した遺伝子組み換えコリネバクテリウム・グルタミカムを培養し、高い乳酸分率（９９％以上）を有する、ヒドロキシ酪酸と乳酸とからなる共重合ポリエステルを製造する方法である。特に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ１３０３２、およびＡＴＣＣ１４０６７を宿主として使用する。

遺伝子組み換えコリネ型細菌から生産されたポリエステルの回収は、微生物から共重合ポリエステルを回収するための、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、培養液から遠心分離によって集菌、洗浄した後、乾燥させ、クロロホルムに乾燥菌体を懸濁し、加熱することによって、目的とする共重合ポリエステルをクロロホルム画分に抽出し、さらにこのクロロホルム溶液にメタノールを加えてポリエステルを沈殿させ、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去した後、乾燥することで、精製された共重合ポリエステルを得ることができる。

回収されたポリエステルの組成の確認は、通常の方法、例えばガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行えばよい。

本発明の方法おいて製造される含乳酸ポリエステルは、ヒドロキシ酪酸と乳酸とからなる共重合ポリエステルである。本発明において製造される含乳酸ポリエステルは、高い乳酸分率を有し、得られるポリエステルにおいて乳酸分率は、９９％以上、９９．５％以上、９９．９％以上またはそれ以上である。従来、遺伝子組換え微生物（大腸菌）を用いて含乳酸ポリエステルを製造する方法が明らかとなっていた（Ｓｈｏｚｕｉ ｅｔ ａｌ．上掲）。当該遺伝子組換え大腸菌によって製造される含乳酸ポリエステルは、９６％程度の乳酸分率しか得られなかった。当該含乳酸ポリエステルには乳酸の他に、３−ヒドロキシ酪酸（１％）および３−ヒドロキシ吉草酸（３％）の混入が検出される。一方、本発明の方法において得られる含乳酸ポリエステルは９９％以上の乳酸分率を有し、３−ヒドロキシ吉草酸は含まれないか、または検出限界以下である。また、本発明の方法において得られる含乳酸ポリエステルは高い乳酸分率を有するために、優れた耐熱性および時間安定性（時間ともに劣化しない性質）を有することができる。

また、本発明において製造される含乳酸ポリエステルは、約２万〜３万の重量平均分子量、および約１万の数平均分子量を有する。

さらに本発明において製造される含乳酸ポリエステルは、乳酸（詳細にはＤ−乳酸）の光学純度が非常に高く、光学純度９８％ｅｅ以上、９９％ｅｅ以上、９９．５ｅｅ％以上またはそれ以上（ほぼ１００％ｅｅ）である。

また本発明の方法においては、培地に乳酸やヒドロキシ酪酸などの、目的とするポリマーを構成するモノマー成分を添加しなくても、安価な廃糖蜜から、ヒドロキシ酪酸と乳酸とからなる共重合ポリエステルを製造することができ、製造コストの点で有利である。

さらに本発明の方法においては、内毒素を内在していないコリネ型細菌を利用しているために、生産された含乳酸ポリエステルの回収に際して、微生物の内毒素が混入することを回避することができ、生体医療材料や食品接触容器といった用途に利用可能な安全な含乳酸ポリエステルを提供することができる。

以下、非限定的な実施例を示して本発明をさらに詳細に説明する。なお、実施例における各実験操作は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ． １９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．）を初めとする各種の実験操作を紹介したマニュアル、又は各種試薬及びキットに添付された指示書の各記載に従い、行った。

＜実施例１＞ 遺伝子組換え微生物の作製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）からＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出後、乳酸脱水素酵素をコードする核酸（配列番号１）をＰＣＲで増幅するために、ＢａｍＨＩ認識配列を含むフォワードプライマー：５’−ＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣＴＣＧＣＣＧＴＴＴＡＴＡＧ−３’（配列番号１４）と、ＳａｃＩ認識配列を含むリバースプライマー：５’−ＧＡＧＣＴＣＡＡＧＡＴＴＡＡＡＣＣＡＧＴＴＣＧＴＴＣＧ−３’（配列番号１５）のプライマーＤＮＡを合成した。前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用い、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）、ＰＣＲバッファー、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、各プライマー１５ｐｍｏｌ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（全て東洋紡社）を含む反応液中、９４℃２分を１サイクル、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとするＰＣＲ反応を３０サイクル行った後、約１ｋｂｐの増幅断片を回収し、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化して、ＬＤＨをコードするＤＮＡフラグメントを得た。

プラスミドｐＶＣ７（味の素株式会社）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化した後、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ認識配列を含むＤＮＡフラグメントを加えてライゲーションし、上記制限酵素認識配列を有するｐＶＣ７’を調整した。ｐＶＣ７’をＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化した後、前記ＬＤＨをコードする核酸を含むＤＮＡフラグメントを加えてライゲーションし、約７．７ｋｂｐの遺伝子組換えプラスミドｐＶＣＬＤＨを調整した。

Ｔａｇｕｃｈｉら（ＰＮＡＳ、２００８年、第１０５号、４５番、１７３２３−１７３２７）に記載されているｐＴＶ１１８ＮｐｃｔＣ１ＡＢ（ＳＴＱＫ）を鋳型としてＭ．エルスデニ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ、ＡＴＣＣ１７７５３）由来のＰＣＴ（アクセッションＮｏ．Ｊ０４９８７）をコードする核酸（配列番号３）をＰＣＲで増幅するために、ＢｇｌＩＩ認識配列を含むフォワードプライマー：５’−ＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡＴＣＡ−３’（配列番号１６）と、ＰｓｔＩ認識配列を含むリバースプライマー：５’−ＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＣＡＧＴＣ−３’（配列番号１７）のプライマーＤＮＡを合成した。前記プラスミドＤＮＡを鋳型として、ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を用い、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）、ＰＣＲバッファー、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、各プライマー１５ｐｍｏｌ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（全て東洋紡社）を含む反応液中、９４℃２分を１サイクル、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を１サイクルとするＰＣＲ反応を３０サイクル行った後、約１，５００ｂｐの増幅断片を回収し、ＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩで消化して、前記ＰＣＴをコードするＤＮＡフラグメントを得た。

上記ｐＶＣＬＤＨをＢｇｌＩＩ及びＰｓｔＩを用いて消化した後、前記ＰＣＴをコードするＤＮＡフラグメントを加えてライゲーションし、ＰＣＴをコードするＤＮＡを含む、約９．２ｋｂｐの組み換えプラスミドｐＶＣ７ＬＤＨＰＣＴを調製した（図１（Ａ））。

Ｔａｋａｓｅら（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３年、第１３３巻、第１３９−１４５頁）に記載されているｐＧＥＭＣ１ＳＴＱＫＡＢをＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、Ｒ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のβＫＴをコードするＤＮＡ（配列番号５）、Ｒ．ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）由来のＡＡＣｏＡ−ＲをコードするＤＮＡ（配列番号７）、及び変異型乳酸重合酵素（配列番号１１）をコードするＤＮＡを全て含むＤＮＡフラグメントを調整した。

Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（上掲）に記載されているプラスミドｐＰＳＰＴＧ１をＢｓｔＥＩＩとＣｐｏＩで消化した後、ＸｂａＩの認識配列を含むＤＮＡフラグメントを加えてライゲーションし、ＸｂａＩ認識配列を含むｐＰＳＰＴＧ１’を調整した。ｐＰＳＰＴＧ１’をＸｂａＩとＢａｍＨＩで消化した後、前記βＫＴ、ＡＡＣｏＡ−Ｒおよび変異型乳酸重合酵素をコードするＤＮＡフラグメントを加えてライゲーションし、βＫＴ、ＡＡＣｏＡ−Ｒおよび変異型乳酸重合酵素をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＰＳＣ１ＳＴＱＫＡＢを調製した（図１（Ｂ））。

前記ｐＶＣ７ＰＣＴＬＤＨとｐＰＳＣ１ＳＴＱＫＡＢをコリネ菌のコンピテントセル（コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２）に加え、エレクトロポレーションにより、両方のプラスミドが導入された形質転換体を作製した。

＜実施例２＞ ポリマーの生産
実施例１で得られた形質転換体を、カナマイシン１００μｇ／ｍＬ、クロラムフェニコール１００μｇ／ｍＬ、２％グルコースを含むＣＭ２Ｇ培地１．５ｍＬに植菌し、３０℃にて１２時間培養を行った後、１００ｍＬの同培地に植菌し、３０℃にて２４時間培養した。得られた培養液を３，１００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心して菌体を回収し、２％グルコースを含むＭＭＴＧ培地１００ｍＬに植菌し、３０℃にて７２時間培養を行った。得られた培養液を３，１００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心して菌体を回収し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁させてから再度同条件で遠心分離した後、２日間、凍結乾燥した。

ガラス製耐圧反応管に乾燥菌体を移し、クロロホルム３ｍＬを加えて懸濁液としてから、１００℃のヒートブロック中で３時間保った後、室温まで冷却後、０．２μｍＰＴＦＥフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）で濾過して、クロロホルム溶液と菌体を分離した。濾液を遠心用ガラス試験管に移し、６０℃でドライアップしてクロロホルムを留去した。試験管内に残った膜状のポリマーを、ヘキサンを用いて洗浄、乾燥し、再びクロロホルム３ｍＬを加え、ポリマーを含むクロロホルム溶液を得た。０．２μｍＰＴＦＥフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）で濾過し、分取用ＧＰＣ（ＬＣ−９２０１）を用いてポリマー画分を分取した後、クロロホルムを留去して、ポリマー１１ｍｇを回収した。ポリマーの菌体内含有率（培養後の乾燥菌体総重量に対して回収されたポリマー重量割合）は約１％であった。

＜実施例３＞ ポリマーの分析
（ｉ）ＧＰＣ
実施例２で回収されたポリマー約１ｍｇにクロロホルムを１ｍＬ加え、これを０．２μｍＰＴＦＥフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）で濾過した溶液をサンプルとして、下記の条件でＧＰＣ測定を行った。
システム ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ ＧＰＣ ｓｙｓｔｅｍ
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ−Ｓｕｐｅｒ ＴＨＺ−Ｍ（６．０ｍｍ×１５０ｍｍ）
溶離液 ：ＣＨＣｌ３
流量 ：０．８ｍＬ／分
温度 ：４０℃
検出 ：１０Ａ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ
サンプル量：１０μＬ

測定された分子量分布曲線を図２に示す。分子量較正曲線は標準ポリスチレンを用いて作成し、標準ポリスチレン分子量の換算値で分子量を表した。その結果、ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は２万〜３万、数平均分子量（Ｍｎ）は約１万、Ｍｗ／Ｍｎは１．８〜２．３であった。

（ｉｉ）ＧＣ／ＭＳ
実施例２で回収されたポリマー約５０μｇを１ｍＬのクロロホルムに溶解した溶液２５０μＬ、エタノール８５０μＬ、塩酸１００μＬをガラス製耐圧反応管で混合し、１００℃のヒートブロック中で３時間、エタノリシス処理を行った。室温まで冷却後、０．６５Ｍリン酸および０．９ＭＮａＣｌを含む溶液１ｍｌと２５０ｍＭリン酸溶液５００μＬを加えて混合し、ｐＨを中性に調整した後、室温、１，２００ｒｐｍで５分間の条件で遠心し、水層とクロロホルム層を分離した。クロロホルム層を採取し、モレキュラーシーブスにより脱水を行って、ＧＣ分析用サンプルとした。

ＧＣ／ＭＳ分析は、下記の条件で行った。
ＧＣシステム ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＧＣ ２０１０
ＭＳシステム ：ＧＣ／ＭＳ−ＱＰ２０１０
カラム ：ＮＥＵＴＲＡ−ＢＯＮＤ−１（０．２５ｍｍ×３０００ｍｍ）
キャリアガス ：Ｈｅ
ガス流量 ：３０．０ｍＬ／分
ディテクター温度 ：３１０℃
インジェクター温度：２５０℃
カラムオーブン温度：１００℃
カラム昇温 ：８℃／ｍｉｎ
サンプル量 ：１μＬ

上記条件での分析結果及び乳酸エチルのＭＳスペクトルを図２に示す。ＧＣ／ＭＳの結果より、実施例２で回収されたポリマーは３ヒドロキシ酪酸と乳酸をモノマー単位として含むことが確認された。

（ｉｉｉ）ＮＭＲ分析
実施例２で回収されたポリマーを重水素化クロロホルムに溶解してサンプルとし、３００ＭＨｚで^１Ｈ−ＮＭＲ（図２）を測定した。その結果、実施例２で回収されたポリマーは３ヒドロキシ酪酸と乳酸をモノマー単位として含むこと、乳酸の比が９９％以上であることが判明した。

Claims (13)

1. 含乳酸ポリエステル合成能力を本来有していないコリネ型細菌に、Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子、プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、β−ケトチオラーゼ遺伝子、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子および乳酸重合酵素遺伝子を含む含乳酸ポリエステル合成に関与する遺伝子群が導入されており、かつ９９％以上の乳酸分率を有する含乳酸ポリエステル生産能を有する、遺伝子組換えコリネ型細菌。
2. 乳酸重合酵素遺伝子が、配列番号９に示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつ、該乳酸重合酵素遺伝子にコードされる乳酸重合酵素が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において３２５番目、４８１番目のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸がそれぞれＴｈｒ、Ｌｙｓであるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の遺伝子組換えコリネ型細菌。
3. 乳酸重合酵素遺伝子にコードされる乳酸重合酵素が、配列番号１０のアミノ酸配列において３２５番目のＳｅｒがＴｈｒに、及び４８１番目のＧｌｎがＬｙｓに置換された二重変異を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の遺伝子組換えコリネ型細菌。
4. Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子が大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組換えコリネ型細菌。
5. プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子がメガスフェラ属（Ｍｅｇａｓｐｈｅｒａ）に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子組換えコリネ型細菌。
6. β−ケトチオラーゼ遺伝子およびアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子がラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子組換えコリネ型細菌。
7. 含乳酸ポリエステル合成能力を本来有していないコリネ型細菌が、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子組換えコリネ型細菌。
8. コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項７に記載の遺伝子組換えコリネ型細菌。
9. 含乳酸ポリエステル合成に関与する遺伝子群がコリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターの制御下にある、請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子組換えコリネ型細菌。
10. コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターが以下のいずれかの塩基配列を含む、請求項９に記載の遺伝子組換えコリネ型細菌：
    （ｉ）配列番号１３に示される塩基配列；
    （ｉｉ）配列番号１３に示される塩基配列において、１から数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつ宿主生物中で連結された遺伝子の転写調節活性を有する塩基配列；
    （ｉｉｉ）配列番号１３に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡの塩基配列であって、かつ宿主生物中で連結された遺伝子の転写調節活性を有する塩基配列；または
    （ｉｖ）配列番号１３に示される塩基配列と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなりかつ宿主生物中で連結された遺伝子の転写調節活性を有する塩基配列。
11. β−ケトチオラーゼ遺伝子、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ遺伝子および乳酸重合酵素遺伝子がオペロンを形成している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子組換えコリネ型細菌。
12. Ｄ−乳酸脱水素酵素遺伝子およびプロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子がオペロンを形成している、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子組換えコリネ型細菌。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子組換えコリネ型細菌を、炭素源を含む培地で培養する工程１）、および工程１）の培養物から含乳酸ポリエステルを回収する工程２）を含む、９９％以上の乳酸分率を有する含乳酸ポリエステルの製造方法。

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