JP5882234B2 - 核酸ライブラリーの作製方法 - Google Patents
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Description
１ 関連出願
本出願は、以下の出願に関連し、それらの出願日の優先権を主張する：２０１０年２月２５日に出願された題名「Automated Library Construction for Next-Generation Sequencing」の米国特許仮出願第61/307,950号；２０１０年４月２０日に出願された題名「Automated Library Construction for Next-Generation Sequencing」の米国特許仮出願第61/326,000号；２０１０年７月２６日に出願された題名「Automated Library Construction for Next-Generation Sequencing」の米国特許仮出願第61/367,513号；および２０１０年１１月５日に出願された題名「Automated Library Construction for Next-Generation Sequencing」の米国特許仮出願第61/410,646号。上述した出願の開示は、本明細書で引用される全ての他の文献と共に、全体を参照して本明細書に具体的に援用される。
本出願は、以下の出願に関連し、それらの出願日の優先権を主張する：２０１０年２月２５日に出願された題名「Automated Library Construction for Next-Generation Sequencing」の米国特許仮出願第61/307,950号；２０１０年４月２０日に出願された題名「Automated Library Construction for Next-Generation Sequencing」の米国特許仮出願第61/326,000号；２０１０年７月２６日に出願された題名「Automated Library Construction for Next-Generation Sequencing」の米国特許仮出願第61/367,513号；および２０１０年１１月５日に出願された題名「Automated Library Construction for Next-Generation Sequencing」の米国特許仮出願第61/410,646号。上述した出願の開示は、本明細書で引用される全ての他の文献と共に、全体を参照して本明細書に具体的に援用される。
２ 発明の分野
本発明は、概して、オイル中での核酸ライブラリーの構築ケミストリーを実施する新しい液滴系の方法に関する。
本発明は、概して、オイル中での核酸ライブラリーの構築ケミストリーを実施する新しい液滴系の方法に関する。
３ 発明の背景
液滴アクチュエーターは、通常、液滴操作を行うための表面または間隙を形成するように構成された１つ以上の基板を含む。基板は、液滴操作を行うために配置された電極を含んでいてもよい。基板または基板間の間隙は、液滴を形成する液体と混和しない液体で被覆および／または充填されていてもよい。液滴アクチュエーターは、核酸の増幅（例えば、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ））および核酸配列決定等の様々な分子手順を行うために使用されている。最近、核酸配列決定技術のあらゆる側面（例えば、コスト、スピード、処理能力、ワークフロー、精度およびデータアセンブリ）で改良がなされてきた。これらの改良された技術に基づく、いわゆる「次世代」配列決定プラットフォームは、しばしば、１０００ゲノム計画、およびヒト体内微生物ゲノム計画等の大規模な配列決定計画に用いられている。これらの技術の他の用途は、トランスクリプトーム配列決定（ＲＮＡ配列）、タンパク質−クロマチン相互作用解析（ＣｈＩＰ配列）、全エキソーム配列決定、メタゲノム解析およびコピー数多型解析を含む。次世代配列決定プラットフォームの配列決定手順は、核酸フラグメントライブラリーを利用する。次世代配列決定プラットフォームの全潜在能力は、フラグメントライブラリーを構築する方法を最適化（例えば、コスト削減、収率向上、および処理能力向上）することにより認識される。ライブラリーの構築は、通常、物理処理、酵素反応および精製を含む、多くの労力と時間集約的な工程を伴う。シークエンスデータの質（例えば、シークエンス範囲の深度、配列決定バイアス）は、フラグメントライブラリーの構築の質に依存する。
液滴アクチュエーターは、通常、液滴操作を行うための表面または間隙を形成するように構成された１つ以上の基板を含む。基板は、液滴操作を行うために配置された電極を含んでいてもよい。基板または基板間の間隙は、液滴を形成する液体と混和しない液体で被覆および／または充填されていてもよい。液滴アクチュエーターは、核酸の増幅（例えば、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ））および核酸配列決定等の様々な分子手順を行うために使用されている。最近、核酸配列決定技術のあらゆる側面（例えば、コスト、スピード、処理能力、ワークフロー、精度およびデータアセンブリ）で改良がなされてきた。これらの改良された技術に基づく、いわゆる「次世代」配列決定プラットフォームは、しばしば、１０００ゲノム計画、およびヒト体内微生物ゲノム計画等の大規模な配列決定計画に用いられている。これらの技術の他の用途は、トランスクリプトーム配列決定（ＲＮＡ配列）、タンパク質−クロマチン相互作用解析（ＣｈＩＰ配列）、全エキソーム配列決定、メタゲノム解析およびコピー数多型解析を含む。次世代配列決定プラットフォームの配列決定手順は、核酸フラグメントライブラリーを利用する。次世代配列決定プラットフォームの全潜在能力は、フラグメントライブラリーを構築する方法を最適化（例えば、コスト削減、収率向上、および処理能力向上）することにより認識される。ライブラリーの構築は、通常、物理処理、酵素反応および精製を含む、多くの労力と時間集約的な工程を伴う。シークエンスデータの質（例えば、シークエンス範囲の深度、配列決定バイアス）は、フラグメントライブラリーの構築の質に依存する。
一般的なライブラリー構築手順では、配列決定される核酸サンプルは、はじめに、流体力学的せん断もしくは機械的な力のいずれかによりランダムに細分化される、または、酵素消化法もしくは化学消化法によりランダムに細分化される。生成する核酸フラグメントは、次いで追加修飾にかけられ、その結果、いわゆる「アダプター」シークエンスが、フラグメントの一端または両端に取り付けられる。この方法は、フラグメントがはじめに末端修復または平滑末端化され、その後任意に、サンプルフラグメントへのアダプターシークエンスの結合前にＡ−ｔａｌｉｎｇ工程が行われる。調製された核酸ライブラリーは、定量化され、そして続く配列決定プロセスの準備がされる。より高度な手順では、長い環状化工程と、末端修復およびアダプター結合の第２ラウンドとがあってもよい。マルチプレックスアイデンティファイアーまたはバーコードの短いシークエンスは、フラグメントに結合されてもよく、または結合されたアダプターシークエンス内に含めてシークエンスアセンブリを補助してもよい。
核酸捕捉、洗浄、および様々な酵素反応間における溶離を含む一般的なライブラリーの構築手順において要求される複数の精製工程は、通常、著しく核酸を損失させる。市販のロボットのリキッドハンドラーを伴う自動化は、さらに材料の損失の影響を受けやすく、それ故、非常に低い収率となる。がんゲノム解析、メタゲノム解析および古生ゲノム解析等の所定の用途では、しばしば、開始時のライブラリー構築のために処理される核酸の量が微量で、配列決定前の核酸サンプルを多量に失うことが許されないことがある。ライブラリー構築に対し、高収率、試薬消費の削減、およびユーザーが多重操作の範囲で操作することができる、柔軟で、自動化されたプラットフォームのニーズがある。
４ 発明の簡単な説明
本発明は、オイルと接触した液滴内での核酸ライブラリーの作製方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：オイル中の液滴内で核酸フラグメントを平滑末端化し、平滑末端化された核酸フラグメントを生成する工程；オイル中の液滴内で平滑末端化された核酸フラグメントをリン酸化し、リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程；オイル中の液滴内でＡ−ｔａｉｌをリン酸化された核酸フラグメントに結合させ、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを生成する工程；およびオイル中の液滴内で核酸アダプターをＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントに結合させ、アダプター結合核酸フラグメントの核酸ライブラリーを生成する工程。
本発明は、オイルと接触した液滴内での核酸ライブラリーの作製方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：オイル中の液滴内で核酸フラグメントを平滑末端化し、平滑末端化された核酸フラグメントを生成する工程；オイル中の液滴内で平滑末端化された核酸フラグメントをリン酸化し、リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程；オイル中の液滴内でＡ−ｔａｉｌをリン酸化された核酸フラグメントに結合させ、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを生成する工程；およびオイル中の液滴内で核酸アダプターをＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントに結合させ、アダプター結合核酸フラグメントの核酸ライブラリーを生成する工程。
いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも１０％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも１５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも２０％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも５０％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも７５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも９０％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも９５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも９９％である。
本発明の方法は、平滑末端化された核酸フラグメントを１以上の工程の前または後で精製する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、開始工程１（ｂ）の前に平滑末端化された核酸フラグメントを精製する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、開始工程１（ｃ）の前にリン酸化された核酸フラグメントを精製する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、開始工程１（ｄ）の前にＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを精製する工程を含んでいてもよい。精製工程は、例えば、オイル中の液滴内でビーズに核酸フラグメントを捕捉する工程およびオイル中でビーズを洗浄する工程を含んでいてもよい。ビーズは、例えば、電荷スイッチビーズまたは固相可逆固定ビーズを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、精製工程は、以下の工程を含む：洗浄液滴を、ビーズを含む液滴と混合し、混合された液滴を生成する工程；およびビーズを拘束している間に混合された液滴を分割し、ビーズを含む娘液滴と、実質的にビーズを含まない娘液滴とを生成する工程。理想的には、分割プロセスの間のいかなるビーズ損失も核酸ライブラリーをその意図された目的に不適当とするのに十分なものではない。
ライブラリー構築に用いられる核酸フラグメントは、時には、５’−突出および／または３’−突出を含んでいてもよい。斯かるフラグメントの平滑末端化工程は、核酸フラグメントを含む液滴と、平滑末端化試薬を含む液滴とをオイル中で混合する工程を含んでいてもよい。リン酸化工程は、核酸フラグメントを含む液滴と、リン酸化試薬を含む液滴とをオイル中で混合する工程を含んでいてもよい。Ａ−ｔａｉｌを結合させる工程は、核酸フラグメントを含む液滴と、Ａ−ｔａｉｌ化試薬を含む液滴とをオイル中で混合する工程を含んでいてもよい。核酸アダプターを結合させる工程は、核酸フラグメントを含む液滴と、アダプター結合試薬を含む液滴とをオイル中で混合する工程を含んでいてもよい。
本発明は、オイルと接触した液滴内で核酸ライブラリーの構築を実行する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：オイル中の液滴内で核酸フラグメントを平滑末端化し、かつ、リン酸化し、平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程；結合バッファー中の固相可逆固定ビーズを用いて、オイル中の液滴内で平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを捕捉する工程；水性バッファーを用いて、オイル中の液滴内で固相可逆固定ビーズを洗浄する工程；オイル中の液滴内で固相可逆固定ビーズから平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを溶離する工程；オイル中の液滴内でリン酸化された核酸フラグメントの両端にＡ−ｔａｉｌを結合させ、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを生成する工程；結合バッファー中の固相可逆固定ビーズを用いて、オイル中の液滴内でＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを捕捉する工程；水性バッファーを用いて、オイル中の液滴内で固相可逆固定ビーズを洗浄する工程；オイル中の液滴内で固相可逆固定ビーズからＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを溶離する工程；オイル中の液滴内でＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントに核酸アダプターを結合させ、アダプター結合核酸フラグメントを生成する工程；結合バッファー中の固相可逆固定ビーズを用いて、オイル中の液滴内でアダプター結合核酸フラグメントを捕捉する工程；水性バッファーを用いて、オイル中の液滴内で固相可逆固定ビーズを洗浄する工程；オイル中の液滴内で固相可逆固定ビーズからアダプター結合核酸フラグメントを溶離する工程；およびオイル中の液滴内で固相可逆固定ビーズからアダプター結合核酸フラグメントを分離する工程。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも１０％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも１５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも２０％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも５０％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも７５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも９０％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも９５％である。いくつかの場合では、アダプター結合核酸フラグメントの修復は、核酸フラグメントのモル基準で少なくとも９９％である。
本発明の方法は、さらに、核酸ライブラリーを増幅する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、液滴アクチュエーターで核酸ライブラリーを増幅する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、自動化シークエンサーで核酸ライブラリーを配列決定する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、核酸増幅工程の介在なく、自動化シークエンサーで核酸ライブラリーを配列決定する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、核酸増幅工程を行わずに、自動化シークエンサーで核酸ライブラリーを配列決定する工程を含んでいてもよい。
本発明は、オイルと接触した液滴内での平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントの作製方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；核酸フラグメントを含むサンプル液滴と、平滑末端化試薬およびリン酸化試薬を含む１以上の試薬液滴とを混合し、平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを含むプロダクト液滴を生成する工程。本発明の方法は、プロダクト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、捕捉液滴に平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを捕捉する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて固相可逆固定ビーズを洗浄し、平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程を含んでいてもよく、ここで、洗浄バッファー液滴は実質的に水性バッファーからなる。本発明の方法は、洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離された平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、固相可逆固定ビーズから平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを分離し、オイル中の平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程を含んでいてもよい。
本発明は、オイルと接触した液滴内での平滑末端化された核酸フラグメントに核酸を結合する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；平滑末端化された核酸フラグメントを含むサンプル液滴と、核酸および結合試薬を含む１つ以上の試薬液滴とを混合し、結合核酸フラグメントを含むプロダクト液滴を生成する工程。本発明の方法は、プロダクト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、結合核酸フラグメントを捕捉する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて固相可逆固定ビーズを洗浄し、結合核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程を含んでいてもよく、ここで、洗浄バッファー液滴は実質的に水性バッファーからなる。本発明の方法は、洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離された結合核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、固相可逆固定ビーズからＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを分離し、オイル中の結合核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程を含んでいてもよい。
本発明は、オイルと接触した液滴内でのＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを作製する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；核酸フラグメントを含むサンプル液滴と、Ａ−ｔａｉｌ化試薬を含む１以上の試薬液滴とをオイル中で混合し、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを含むプロダクト液滴を生成する工程。本発明の方法は、プロダクト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを捕捉する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて固相可逆固定ビーズを洗浄し、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程を含んでいてもよく、ここで、洗浄バッファー液滴は実質的に水性バッファーからなる。
本発明の方法は、洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離されたＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、固相可逆固定ビーズからＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを分離し、オイル中のＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程を含んでいてもよい。
本発明は、オイルと接触した液滴内でのアダプター結合核酸フラグメントを作製する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；核酸フラグメントを含むサンプル液滴と、Ａ−ｔａｉｌ化試薬を含む１以上の試薬液滴とをオイル中で混合し、アダプター結合核酸フラグメントを含むプロダクト液滴を生成する工程。本発明の方法は、プロダクト液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、アダプター結合核酸フラグメントを捕捉する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて固相可逆固定ビーズを洗浄し、アダプター結合核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程を含んでいてもよく、ここで、洗浄バッファー液滴は実質的に水性バッファーからなる。本発明の方法は、洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離されたアダプター結合核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、固相可逆固定ビーズからアダプター結合核酸フラグメントを分離し、オイル中のアダプター結合核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程を含んでいてもよい。
本発明は、オイルと接触した液滴内での核酸フラグメントの精製方法を提供し、該方法はオイルと接触した以下の工程の実行を含む；核酸フラグメントを含む液滴と、固相可逆固定ビーズを含むビーズ液滴とを混合し、核酸フラグメントを捕捉する工程；洗浄バッファー液滴を用いた液滴系混合および分割洗浄手順を用いて固相可逆固定ビーズを洗浄し、核酸フラグメントを含む洗浄されたビーズを含む液滴を生成する工程；洗浄されたビーズを含む液滴と、溶離バッファー液滴とを混合し、溶離された平滑末端化／リン酸化された核酸フラグメントを含む溶離液滴を生成する工程；および固相可逆固定ビーズから核酸フラグメントを分離し、オイル中の精製された核酸フラグメントを含む液滴を生成する工程。
本明細書に記載のいずれかの方法では、洗浄バッファー液滴は、実質的に水性バッファーからなる液滴を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、水性バッファーは、実質的に結合バッファーからなる。いくつかの実施形態では、水性バッファーは、実質的に有機溶媒を含まない。いくつかの実施形態では、水性バッファーは、約１０％以下の有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、水性バッファーは、実質的にエタノールを含まない。いくつかの実施形態では、水性バッファーは、約１０％以下のエタノールを含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、少なくとも約２５％の有機溶媒を含む液滴を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、少なくとも約５０％の有機溶媒を含む液滴を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、少なくとも約５０％の有機溶媒を含む液滴を含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、アルコールを含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、エタノールを含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、実質的にエタノールからなる。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、塩が混合される。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、ＮａＣｌが混合される。
いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、約０．０１〜約１００ｍＭの量の塩を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、約０．１〜約１０ｍＭの量の塩を含む。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、洗浄バッファーに可溶な正塩が、約０．０１〜約１００ｍＭの量で混合される。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、洗浄バッファーに可溶な正塩が、約０．１〜約１０ｍＭの量で混合される。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、洗浄バッファーに可溶な単塩が、約０．０１〜約１００ｍＭの量で混合される。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、洗浄バッファーに可溶な単塩が、約０．１〜約１０ｍＭの量で混合される。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、ＮａＣｌが、約０．０１〜約１００ｍＭの量で混合される。いくつかの実施形態では、洗浄バッファー液滴は、ＮａＣｌが、約０．１〜約１０ｍＭの量で混合される。いくつかの実施形態では、塩は、塩の存在しない有機溶媒を含む洗浄バッファー液滴に比べて、１以上の電気濡れ（electrowetting）液滴操作の再現性を向上させる。いくつかの実施形態では、１以上の電気濡れ液滴操作は、液滴輸送、液滴分割、および液滴分配からなる群より選択される。
様々な実施形態で、本発明のライブラリー構築手順の一部または全ての工程は、オイル中で実行される。例えば、いくつかの実施形態では、オイルは、シリコーンオイルまたはフルオロシリコーンオイルを含む。ドーピングオイル用の他のオイルおよび界面活性剤が、本明細書で記載される。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに、自動化シークエンサーで核酸ライブラリーを配列決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに、核酸増幅工程の介在なく、自動化シークエンサーで核酸ライブラリーを配列決定する工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに、核酸増幅工程を行わずに、自動化シークエンサーで核酸ライブラリーを配列決定する工程を含む。
いくつかの実施形態では、オイル中の液滴は、本発明の手順を実行するために液滴アクチュエーターにより制御される。液滴アクチュエーターは、液滴操作を用いる工程を制御してもよい。例えば、液滴操作は、電気濡れ媒介液滴操作、光電濡れ媒介液滴操作、誘電泳動媒介液滴操作等の電極媒介液滴操作を含んでいてもよい。液滴操作を実行するための他の技術が、本明細書で記載される。理想的には、工程は、オペレーターの干渉なしに、単一の液滴アクチュエーターで一体的に実行される。
本発明の方法で用いられる液滴の一部または全部は、オイルと接触してもよい。例えば、液滴は、実質的にオイルに囲まれていてもよい。液滴は、オイルに浮いていてもよい。液滴は、オイルに沈んでいてもよい。液滴とオイルが分離した２つの基板の間に挟み込まれて、オイルを含む液滴操作間隙を形成してもよい。オイルと接触した液滴が分離した２つの基板の間に挟み込まれて、オイルで実質的に充填された液滴操作間隙を形成してもよい。
本発明は、核酸フラグメントを平滑末端化する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；核酸フラグメントを含む液滴と、平滑末端化試薬を含む液滴とをオイル中で混合し、平滑末端化反応を行って、平滑末端化された核酸フラグメントを生成する工程。本発明は、核酸フラグメントをリン酸化する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；平滑末端化された核酸フラグメントを含む液滴と、リン酸化試薬を含む液滴とをオイル中で混合し、リン酸化反応を行って、リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程。本発明は、核酸フラグメントを改質する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；平滑末端化された核酸フラグメントを含む液滴と、平滑末端化試薬およびリン酸化試薬を含む液滴とをオイル中で混合し、平滑末端化反応およびリン酸化反応を行って、平滑末端化され、リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程。本発明は、核酸フラグメントをＡ−ｔａｉｌ化する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；リン酸化された核酸フラグメントを含む液滴と、Ａ−ｔａｉｌ化試薬を含む液滴とをオイル中で混合し、Ａ−ｔａｉｌ化反応を行って、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを生成する工程。本発明は、核酸フラグメントを結合する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む；第１核酸を含む液滴と、第２核酸および結合試薬を含む１以上の液滴とをオイル中で混合する工程。第１核酸は、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸を含み、そして第２核酸は、アダプターを含む。
本発明は、ライブラリー構築方法の工程を制御するシステムを提供する。本発明は、例えば、（ｉ）液滴アクチュエーターと、（ｉｉ）本発明の方法のいずれかまたは本発明の個々の工程のいずれかを実行するようにプログラムされたコントローラーとを含む、システムを含む。本発明は、本発明の方法のいずれかを実行するようにプログラムされたエンコードソフトウェアを含む記憶媒体を含む。
本発明は、液滴アクチュエーターをも提供し、該液滴アクチュエーターは以下を備える；頂部基板および底部基板、当該２つの基板は、高さｈ１を有する液滴操作間隙を形成するように構成されている；底部基板と頂部基板との一方または両方と結合した電極を含み、かつ、高さｈ１を有する間隙で液滴操作を実行するために構成された電極通路；および頂部基板と底部基板の２つの基板の間に高さｈ２を有する空隙を形成するように構成された頂部基板または底部基板の一方に形成された陥凹エリア、ここでｈ２はｈ１よりも大きい。いくつかの実施形態では、空隙は、液滴が存在するとき電極を非活性化すると液滴が電極から陥凹エリアに流れるように、液滴操作を実行するために構成された電極に、隣接している。いくつかの実施形態では、液滴のよりエネルギー的に安定なコンホメーションへの変形により引き起こされる移動の結果として、液滴が空隙に入る。いくつかの実施形態では、空隙は、電極通路の電極の再活性化時に高さｈ１を有する間隙領域に、液滴が再突入するのを防止するように選択された寸法を有する。
いくつかの実施形態では、陥凹エリアの形状は、ｈ１からｈ２への階段形状を含む。いくつかの実施形態では、陥凹エリアの形状は、ｈ１からｈ２へのスロープを含む。いくつかの実施形態では、陥凹エリアは、頂部基板、底部基板、または両方の基板に形成される。陥凹エリアは、その頂部または底部で開放されていてもよい。
本発明は、液滴アクチュエーターで液滴を電極頂部から移動する方法を提供し、当該方法は、電極を非活性化して、液滴を液滴アクチュエーターの隣接領域に移動させ、液滴が電極頂部でのコンホメーションと比べてよりエネルギー的に安定なコンホメーションをとる工程を含む。本発明は、液滴アクチュエーターの初期位置で液滴を移動する方法を提供し、当該方法は、電極を非活性化して、液滴を液滴アクチュエーターの隣接領域に移動させ、液滴が初期位置でのコンホメーションと比べてよりエネルギー的に安定なコンホメーションをとる工程を含む。いくつかの場合、電極の再活性化で液滴を電極頂部のそれ以前の位置に戻すことができないように、移動は永久的なものである。いくつかの場合、電極の再活性化で液滴が電極頂部のそれ以前の位置に戻るように、移動は一時的なものである。いくつかの場合、第３電極の活性化で液滴が第３電極頂部の位置に移動するように、移動した液滴は第３電極に隣接する位置にある。いくつかの場合、陥凹部の形状は、ｈ１からｈ２への階段形状を含む。いくつかの場合、陥凹エリアの形状は、ｈ１からｈ２へのスロープを含む。いくつかの場合、陥凹エリアは、頂部基板、底部基板、または両方の基板に形成される。いくつかの場合、陥凹エリアは、その頂部で開放されている。
本発明は、液滴を分配する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：リザーバ電極の区分けされた通路の端で液滴源を収集する工程；通路電極と通路側面電極とのセットに沿って液滴源を延伸する工程；通路側面電極を非活性化する工程；１つ以上の通路電極を非活性化し、分配された液滴と、液滴源の残余部分とを生成する工程。いくつかの場合、液滴源は、磁気応答性ビーズを含む。いくつかの場合、開始通路電極は、隣接する側面電極にはめ込まれていてもよい。磁場は、磁気応答性ビーズを通路電極頂部の液滴領域に引き付ける場所に位置してもよい。いくつかの場合、非活性化工程は、液滴源から少なくとも５０％の磁気応答性ビーズを有する分配された液滴を生成する。いくつかの場合、非活性化工程は、液滴源から少なくとも２５％の磁気応答性ビーズを有する分配された液滴を生成する。いくつかの場合、非活性化工程は、液滴源から少なくとも５０％の磁気応答性ビーズを有する分配された液滴を生成する。いくつかの場合、非活性化工程は、液滴源から少なくとも７５％の磁気応答性ビーズを有する分配された液滴を生成する。いくつかの場合、非活性化工程は、液滴源から少なくとも９０％の磁気応答性ビーズを有する分配された液滴を生成する。いくつかの場合、非活性化工程は、液滴源から少なくとも９５％の磁気応答性ビーズを有する分配された液滴を生成する。いくつかの場合、非活性化工程は、液滴源から少なくとも９９％の磁気応答性ビーズを有する分配された液滴を生成する。いくつかの場合、非活性化工程は、液滴源から実質的に全ての磁気応答性ビーズを有する分配された液滴を生成する。本明細書に記載の全てのビーズ含有液滴と同様に、いくつかの場合、液滴源は、数十のビーズ、数百のビーズ、数千のビーズ；数百万のビーズ；またはそれ以上のビーズを含む。本明細書に記載の全てのビーズ含有液滴と同様に、いくつかの場合、液滴源は、数十の磁気応答性ビーズ、数百の磁気応答性ビーズ、数千の磁気応答性ビーズ；数百万の磁気応答性ビーズ；またはそれ以上の磁気応答性ビーズを含む。
本発明は、液滴アクチュエーターアセンブリを提供し、該液滴アクチュエーターアセンブリは以下を備える：１つ以上の基板；１つ以上の基板上の一連の反応レーン、各反応レーンは、電極の通路を有する；１つ以上の基板上の液滴分配電極アセンブリの第１セット、当該第１セットの各アセンブリは、他のいずれの反応レーンも横切ることなく１の反応レーン上にサンプル液滴を分配するように配置されている；１つ以上の基板上の液滴分配電極アセンブリの第２セット、当該第２セットの各アセンブリは、１の反応レーン上に試薬液滴を分配するように配置されている。１つ以上の基板が、液滴操作間隙を形成するために配置されていてもよい。反応レーンは、液滴操作間隙内に位置していてもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、流体通路を含んでいてもよく、当該流体通路は、液滴操作間隙の外側から液滴操作間隙まで延び、かつ、液滴分配電極の第１セットの１つ以上の近接に液体を供給するように配置されている。液滴アクチュエーターアセンブリは、流体通路を含んでいてもよく、当該流体通路は、液滴操作間隙の外側から液滴操作間隙まで延び、かつ、液滴分配電極の第２セットの１つ以上の近接に液体を供給するように配置されている。液滴分配電極アセンブリの第１セットの各々は、サンプル流体を含むリザーバと結合してもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、少なくとも２つの反応レーンを含んでいてもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、少なくとも８つの反応レーンを含んでいてもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、少なくとも１６の反応レーンを含んでいてもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、少なくとも２４の反応レーンを含んでいてもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、少なくとも４８の反応レーンを含んでいてもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、少なくとも９６の反応レーンを含んでいてもよい。いくつかの場合、液滴分配電極アセンブリの第２セットの各々は、ライブラリー構築試薬を含むリザーバに位置している。いくつかの場合、液滴分配電極アセンブリの第２セットは、サブセットに分割されていて、各サブセットは、他のいずれの反応レーンも横切ることなく同一の一の反応レーンにサンプル液滴を分配するように配置されている２以上の液滴分配電極アセンブリを含む。いくつかの場合、液滴分配電極アセンブリの各サブセット、斯かるサブセット内の各アセンブリは、異なるライブラリー構築試薬を含むリザーバに結合している。いくつかの場合、ライブラリー構築試薬は、平滑末端化試薬、リン酸化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、およびアダプター結合試薬から選択される。液滴アクチュエーターアセンブリは、反応レーン周辺の磁場が、反応レーンの１つ以上の領域で液滴中の磁気応答性ビーズを固定するのに十分な強さを有するように、反応レーンに対して配置された磁石配列を含んでいてもよい。液滴アクチュエーターアセンブリは、反応レーン周辺の磁場が、反応レーンの電極により制御された液滴分割反応の間、液滴中の磁気応答性ビーズを拘束するのに十分な強さを有するように、反応レーンに対して配置された磁石配列を含んでいてもよい。磁石配列は、磁場の強化された領域を作り出すために配置された磁石を含んでいてもよく、当該強化された領域は、反応レーンにそろって、反応レーン内の磁気応答性ビーズを固定する。
本発明は、電極媒介液滴操作を用いた液滴系検査を実行する方法を提供し、当該方法は、以下の工程を含む：２以上のサンプル液滴を分配し、いずれのサンプル液滴も他の液滴の反応レーンを横切ることなく、各サンプル液滴を独立した反応レーンに輸送する工程；および試薬液滴の第１セットを分配し、試薬液滴の第１セットのいずれの液滴もサンプル液滴が以前に横切った他の反応レーンのいずれの領域も横切ることなく、試薬液滴の第１セットの各液滴を反応レーンに輸送する工程。本発明の方法は、各サンプル液滴と、試薬液滴の第１セットの１種とを混合する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、各サンプル液滴をその独立した反応レーンに沿って進める工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、試薬液滴の第２セットを分配し、試薬液滴の第２セットのいずれの液滴もサンプル液滴が以前に横切った他の反応レーンのいずれの領域も横切ることなく、試薬液滴の第２セットの各液滴を反応レーンに輸送する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、各サンプル液滴と、試薬液滴の第２セットの１種とを混合する工程を含んでいてもよい。本発明の方法は、各サンプル液滴をその独立した反応レーンに沿って進める工程を含んでいてもよい。
５ 定義
以下の用語は、本明細書では以下に示された意味を有する。
１つ以上の電極に関して「活性化する」とは、１つ以上の電極の電気状態の変化に影響を及ぼすことを意味し、液滴の存在下では、液滴操作をもたらす。電極の活性化は、交流電流または直流電流により達成され得る。適したいずれの電圧を用いてもよい。例えば、約５０Ｖより大きい、または約１００Ｖより大きい、または約１５０Ｖより大きい、または約２００Ｖより大きい、または約２５０Ｖより大きい、または約２７５Ｖ〜約３７５Ｖ、または約３００Ｖの電圧を用いて電極を活性化してもよい。交流電流を用いる場合、いずれの適した周波数を用いてもよい。例えば、約１Ｈｚ〜約１０００Ｈｚ、約１Ｈｚ〜約１００Ｈｚ、または約１０Ｈｚ〜約６０Ｈｚ、または約２０Ｈｚ〜約４０Ｈｚ、または約３０Ｈｚの周波数を有する交流電流を用いて電極を活性化してもよい。
以下の用語は、本明細書では以下に示された意味を有する。
１つ以上の電極に関して「活性化する」とは、１つ以上の電極の電気状態の変化に影響を及ぼすことを意味し、液滴の存在下では、液滴操作をもたらす。電極の活性化は、交流電流または直流電流により達成され得る。適したいずれの電圧を用いてもよい。例えば、約５０Ｖより大きい、または約１００Ｖより大きい、または約１５０Ｖより大きい、または約２００Ｖより大きい、または約２５０Ｖより大きい、または約２７５Ｖ〜約３７５Ｖ、または約３００Ｖの電圧を用いて電極を活性化してもよい。交流電流を用いる場合、いずれの適した周波数を用いてもよい。例えば、約１Ｈｚ〜約１０００Ｈｚ、約１Ｈｚ〜約１００Ｈｚ、または約１０Ｈｚ〜約６０Ｈｚ、または約２０Ｈｚ〜約４０Ｈｚ、または約３０Ｈｚの周波数を有する交流電流を用いて電極を活性化してもよい。
液滴アクチュエーターでのビーズに関して「ビーズ」は、液滴アクチュエーター上の液滴または液滴アクチュエーターに近接する液滴に相互作用し得る何らかのビーズまたは粒子を意味する。ビーズは、球、略球、卵形、ディスク形、立方体、不定形および他の３次元形状等の多種多様な形状であってもよい。ビーズは、例えば、液滴アクチュエーター上の液滴内で液滴操作にかけられてもよく、またさもなければ、液滴アクチュエーター上の液滴が液滴アクチュエーター上のおよび／または液滴アクチュエーター外のビーズに接触するように輸送されることができるように、液滴アクチュエーターに対して構成されてもよい。ビーズは、液滴中、液滴操作間隙中、または、液滴操作表面に供給されてもよい。ビーズは、液滴操作間隙の外部のリザーバ内に設けられてもよく、または液滴操作表面から離れた場所に位置するリザーバ内に設けられてもよい。当該リザーバは、ビーズを含む液滴を液滴操作間隙または液滴操作表面に運ぶことができる流体通路および／または電極通路と結合していてもよい。ビーズは、例えば、樹脂、およびポリマーを含む多種多様な材料を用いて製造されてもよい。ビーズは、例えば、マイクロビーズ、マイクロ粒子、ナノビーズおよびナノ粒子を含むいずれの適した大きさであってもよい。いくつかの場合、ビーズは、磁気応答性であり、他の場合ではビーズはそれほど磁気応答性ではなく、または磁気応答性ではない。磁気応答性ビーズでは、磁気応答性材料が実質的にビーズの全てを構成していてもよく、ビーズの一部を構成していてもよく、またはビーズの一部のみを構成していてもよい。ビーズの残りは、他のもの、ポリマー材料、コーティング、および検査試薬を付着させることができる部分を含んでいてもよい。好適なビーズの例は、フローサイトメトリーマイクロビーズ、ポリスチレンマイクロ粒子およびポリスチレンナノ粒子、機能化ポリスチレンマイクロ粒子および機能化ポリスチレンナノ粒子、被覆ポリスチレンマイクロ粒子および被覆ポリスチレンナノ粒子、シリカマイクロビーズ、蛍光マイクロスフェアおよび蛍光ナノスフェア、機能化蛍光マイクロスフェアおよび機能化蛍光ナノスフェア、被覆蛍光マイクロスフェアおよび被覆蛍光ナノスフェア、着色ダイマイクロ粒子および着色ダイナノ粒子、磁気マイクロ粒子および磁気ナノ粒子、超常磁性マイクロ粒子および超常磁性ナノ粒子（例えば、DYNABEADS（登録商標）粒子、CA, CarlsbadのInvitrogen Group社から入手可能）、蛍光マイクロ粒子および蛍光ナノ粒子、被覆磁気マイクロ粒子および被覆磁気ナノ粒子、強磁性マイクロ粒子および強磁性ナノ粒子、被覆強磁性マイクロ粒子および被覆強磁性ナノ粒子、および２００５年１１月２４日に公開された題名「Multiplex flow assays preferably with magnetic particles as solid phase」の米国特許出願公開第20050260686号明細書；２００３年７月１７日に公開された題名「Encapsulation of discrete quanta of fluorescent particles」の米国特許出願公開第20030132538号明細書；２００５年６月２日に公開された題名「Multiplexed Analysis of Clinical Specimens Apparatus and Method」の米国特許出願公開第20050118574号明細書；２００５年１２月１５日に公開された題名「Microparticles with Multiple Fluorescent Signals and Methods of Using Same」の米国特許出願公開第20050277197号明細書；２００６年７月２０日に公開された題名「Magnetic Microspheres for use in Fluorescence-based Applications」の米国特許出願公開第20060159962号明細書に記載のビーズを含み、当該明細書のビーズならびに磁気応答性材料および磁気応答性ビーズに関する教示を参照して、その開示全体が本明細書に援用される。ビーズは、生体分子と、または、生体分子と結合して錯体を形成し得る他の物質と、予備結合してもよい。ビーズは、抗体、タンパク質もしくは抗原、ＤＮＡ／ＲＮＡプローブまたは所望の標的への親和性を有する何らかの他の分子と予備結合してもよい。磁気応答性ビーズおよび／または非磁気応答性ビーズを固定するためのおよび／またはビーズを用いた液滴操作手順を実行するための液滴アクチュエーター技術の例が、以下に記載されており、その開示全体が参照により本明細書に援用される：２００６年１２月１５日に出願された題名「Droplet-Based Particle Sorting」の米国特許出願第11/639,566号；２００８年３月２５日に出願された題名「Multiplexing Bead Detection in a Single Droplet」の米国特許出願第61/039,183号；２００８年４月２５日に出願された題名「Droplet Actuator Devices and Droplet Operations Using Beads」の米国特許出願第61/047,789号；２００８年８月５日に出願された題名「Droplet Actuator Devices and Methods for Manipulating Beads」の米国特許出願第61/086,183号；２００８年２月１１日に出願された題名「Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetically responsive beads」の国際特許出願第PCT/US2008/053545号；２００８年３月２４日に出願された題名「Bead-based Multiplexed Analytical Methods and Instrumentation」の国際特許出願第PCT/US2008/058018号；２００８年３月２３日に出願された題名「Bead Sorting on a Droplet Actuator」の国際特許出願第PCT/US2008/058047号；および２００６年１２月１１日に出願された題名「Droplet-based Biochemistry」の国際特許出願第PCT/US2006/047486号。本発明の複数の態様でビーズ特性を用いてもよい。複数の態様に適した特性を有するビーズの例は、斯かるビーズから放出される信号を検出および解析する方法と同様に、以下の文献に見出すことができ、それらの斯かるビーズの組成ならびに斯かるビーズを用いたＤＮＡ等の物質を捕捉および溶離する条件に関する教示について参照して援用される：２００８年１２月１１日に公開された題名「Systems and Methods for Multiplex Analysis of PCR in Real Time」の米国特許出願公開第20080305481号明細書；２００８年６月２６日に公開された題名「Methods and Systems for Dynamic Range Expansion」の米国特許出願公開第20080151240号明細書；２００７年９月６日に公開された題名「Methods, Products, and Kits for Identifying an Analyte in a Sample」の米国特許出願公開第20070207513号明細書；２００７年３月２２日に公開された題名「Methods and Systems for Image Data Processing」の米国特許出願公開第20070064990号明細書；２００６年７月２０日に公開された題名「Magnetic Microspheres for use in Fluorescence-based Applications」の米国特許出願公開第20060159962号明細書；２００５年１２月１５日に公開された題名「Microparticles with Multiple Fluorescent Signals and Methods of Using Same」の米国特許出願公開第20050277197号明細書；および２００５年６月２日に公開された題名「Multiplexed Analysis of Clinical Specimens Apparatus and Method」の米国特許出願公開第20050118574号明細書；２００５年７月５日に発行された題名「Isolation of nucleic acids」の米国特許第6,914,137号。
「液滴」は、液体の一滴を意味する。通常、液滴は充填流体により少なくとも一部が境界をつけられる。例えば、液滴は充填流体に完全に覆われていてもよいし、または充填流体および液滴アクチュエーターの１つ以上の表面により境界をつけられてもよい。他の例として、液滴は、充填流体、液滴アクチュエーターの１つ以上の表面、および／または大気により境界をつけられてもよい。他の例として、液滴は、充填流体および大気により境界をつけられてもよい。液滴は、例えば、水性もしくは非水性であってもよいし、または水性成分および非水性成分を含む混合物またはエマルションであってもよい。液滴は、多種多様な形状を取ってもよい；液滴の形状の例はこれらに限定されないが、以下の形状を含む：略ディスク形、ガラス玉形、平頭球形、楕円体、球形、一部偏平な球、半球、卵形、円筒形、斯かる形状の組み合わせ、および混合もしくは分割等の液滴操作の間に形成される様々な形状、または斯かる形状が液滴アクチュエーターの１つ以上の表面と接触する結果形成される様々な形状。本発明の方法を用いた液滴操作にかけられてもよい液滴流体の例は、２００６年１２月１１日に出願された題名「Droplet-Based Biochemistry」の国際特許出願第PCT/US06/47486号を参照されたい。様々な実施形態で、液滴は、全血、リンパ液、血清、血漿、汗、涙、唾液、痰、脳脊髄液、羊水、***、膣***物、漿液、滑液、心膜液、腹水、胸膜液、濾出液、滲出液、嚢胞液、胆汁、尿、胃液、腸液、糞試料、単細胞または複数細胞を含む液体、細胞小器官を含む液体、流動組織、流動有機体、多細胞生物を含む液体、生物学的スワブ、生物学的洗浄剤、およびこれらの組み合わせ等の生物学的なサンプルを含んでいてもよい。さらに、液滴は、水、脱イオン水、食塩水、酸性溶液、塩基性溶液、清浄液および／またはバッファー等の試薬を含んでいてもよい。液滴内容物の他の例は、生化学的な手順用の試薬等、核酸増幅手順、親和性に基づく検査手順、酵素分析手順、配列決定手順、および／または生物学的流体の分析手順等の試薬を含む。平滑末端化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、結合試薬、洗浄バッファー、溶離バッファー、結合バッファー、およびビーズ溶液（例えば、SPRI（登録商標）ビーズ）等の本発明の試薬液滴は、通常、界面活性剤を含む。試薬は、例えば、約0.001〜約0.5％ｖ／ｖの水溶性界面活性剤、または約0.01〜約0.25％ｖ／ｖの水溶性界面活性剤、または約0.01〜約0.15％ｖ／ｖの水溶性界面活性剤を含んでいてもよい。試薬は、例えば、約0.001〜約0.5％ｖ／ｖの水溶性ポリソルベート界面活性剤、または約0.01〜約0.25％ｖ／ｖの水溶性ポリソルベート界面活性剤、または約0.01〜約0.15％ｖ／ｖの水溶性ポリソルベート界面活性剤を含んでいてもよい。試薬は、例えば、約0.001〜約0.5％ｖ／ｖの水溶性ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤、または約0.01〜約0.25％ｖ／ｖの水溶性ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤、または約0.01〜約0.15％ｖ／ｖの水溶性ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート界面活性剤を含んでいてもよい。好適なポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの例としては、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートであり、これはPromega社からTWEEN（登録商標）２０として市販されている。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、本発明の１つ以上の液滴アクチュエーターカートリッジを、湿潤状態または乾燥状態でカートリッジに保存されたおよび／またはカートリッジに装填するための別の容器に保存された本発明の１種以上の試薬と共に含む。
「液滴アクチュエーター」は、液滴操作をするための装置を意味する。液滴アクチュエーターの例は、以下を参照されたい：２００５年６月２８日に発行されたPamulaらによる題名「Apparatus for Manipulating Droplets by Electrowetting-Based Techniques」の米国特許第6,911,132号明細書；２００６年１月３０日に出願されたPamulaらによる題名「Apparatuses and Methods for Manipulating Droplets on a Printed Circuit Board」の米国特許出願第11/343,284号明細書；２００６年１２月１１日に出願されたPollackらによる題名「Droplet-Based Biochemistry」の国際特許出願第PCT/US2006/047486号；Shenderovによる２００４年８月１０日に発行された題名「Electrostatic Actuators for Microfluidics and Methods for Using Same」の米国特許第6,773,566号明細書、および２０００年１月２４日に発行された題名「Actuators for Microfluidics Without Moving Parts」の米国特許第6,565,727号明細書；Kimおよび／またはShahらによる２００３年１月２７日に出願された題名「Electrowetting-driven Micropumping」の米国特許出願第10/343,261号明細書、２００６年１月２３日に出願された題名「Method and Apparatus for Promoting the Complete Transfer of Liquid Drops from a Nozzle」の米国特許出願第11/275,668号明細書、２００６年１月２３日に出願された題名「Small Object Moving on Printed Circuit Board」の米国特許出願第11/460,188号明細書、２００９年５月１４日に出願された題名「Method for Using Magnetic Particles in Droplet Microfluidics」の米国特許出願第12/465,935号明細書、および２００９年４月３０日に出願された題名「Method and Apparatus for Real-time Feedback Control of Electrical Manipulation of Droplets on Chip」の米国特許出願第12/513,157号明細書；２００９年６月１６日に発行されたVelevによる題名「Droplet Transportation Devices and Methods Having a Fluid Surface」の米国特許第7,547,380号明細書；２００７年１月１６日に発行されたSterlingらによる題名「Method, Apparatus and Article for Microfluidic Control via Electrowetting, for Chemical, Biochemical and Biological Assays and the Like」の米国特許第7,163,612号明細書；BeckerおよびGascoyneらによる２０１０年１月５日に発行された題名「Method and Apparatus for Programmable fluidic Processing」の米国特許第7,641,779号明細書、および２００５年１２月２０日に発行された題名「Method and Apparatus for Programmable fluidic Processing」の米国特許第6,977,033号明細書；Decreらによる２００８年２月１２日に発行された題名「System for Manipulation of a Body of Fluid」の米国特許第7,328,979号明細書；Yamakawaらによる２００６年２月２３日に公開された題名「Chemical Analysis Apparatus」の米国特許出願公開第20060039823号明細書；Wuによる２００８年１２月３１日に公開された題名「Digital Microfluidics Based Apparatus for Heat-exchanging Chemical Processes」の国際特許公開第WO/2009/003184号明細書；Fouilletらによる２００９年７月３０日に公開された題名「Electrode Addressing Method」の米国特許公開第20090192044号明細書；Fouilletらによる２００６年５月３０日に発行された題名「Device for Displacement of Small Liquid Volumes Along a Micro-catenary Line by Electrostatic Forces」の米国特許第7,052,244号明細書；Marchandらによる２００８年５月２９日に公開された題名「Droplet Microreactor」の米国特許出願公開第20080124252号明細書；Adachiらによる２００９年１２月３１日に公開された題名「Liquid Transfer Device」の米国特許出願公開第20090321262号明細書；Rouxらによる２００５年８月１８日に公開された題名「Device for Controlling the Displacement of a Drop Between two or Several Solid Substrates」の米国特許出願公開第20050179746号明細書；Dhindsaらによる題名「Virtual Electrowetting Channels: Electronic Liquid Transport with Continuous Channel Functionality」のLab Chip、10号、第832〜836頁、２０１０年；これらの優先権文献と共に、これらの内容を参照して、その開示全体が本明細書に援用される。所定の液滴アクチュエーターは、基板間に間隙を有するように配置された１つ以上の基板と、１つ以上の基板に結合し（例えば、重ねた、取り付けた、および／または埋め込まれた）、１つ以上の液滴操作を行うよう配置された電極とを含む。例えば、所定の液滴アクチュエーターは、基部（または底部）基板、基板に結合した液滴操作電極、基板および／または電極の頂部の１つ以上の誘電体層、ならびに任意に基板、誘電体層および／または液滴操作表面を形成する電極の頂部の１つ以上の疎水性層を含む。頂部基板は、一般に液滴操作間隙と称される間隙により液滴操作表面から分離されて供給されてもよい。頂部および／または底部基板上に配列された様々な電極が、上記参考特許および出願において説明されており、本明細書の記述では所定の新規な電極配列が説明されている。液滴操作の間、液滴が、アースまたは参照電極と連続的な接触または頻繁な接触を保つことが好適である。アースまたは参照電極は、間隙で、間隙に面した頂部基板、間隙に面した底部基板に結合してもよい。両方の基板上に電極が供給される場合、電極を制御またはモニターするための、液滴アクチュエーター機器に電極を結合するための電気的な接触は、１または両方の基板に結合してもよい。いくつかの場合、一の基板上の電極が、他の基板に電気的に結合し、その結果、一の基板のみが液滴アクチュエーターと接続する。一の実施形態では、導電性材料（例えば、エポキシ、ＮＪ、HackensakのMaster Bond社から入手可能なMASTER BOND（商標）Polymer System EP79等）が、一の基板上の電極と、他の基板上の電気的通路との間の電気的接続を提供する；例えば、頂部基板上のアース電極は、斯かる導電性材料により底部基板上の電気的通路に結合してもよい。複数の基板を用いる場合、スペーサーを基板間に設け、基板間の間隙の高さを決定し、分配リザーバを規定してもよい。スペーサーの高さまたは間隙の高さは、例えば、約５μｍ〜約５ｍｍ、または約５μｍ〜約１ｍｍ、または約５μｍ〜約６００μｍ、または約１００μｍ〜約４００μｍ、または約２００μｍ〜約３５０μｍ、または約２５０μｍ〜約３００μｍ、または約２７５μｍであってもよい。スペーサーは、例えば、頂部基板または底部基板からの突起層、および／または頂部基板または底部基板の間に挿入された材料層として形成してもよい。流体通路を通じて液体が液滴操作間隙に供給され得る流体通路を形成するために、１つ以上の開口部が１つ以上の基板に設けられてもよい。いくつかの場合、１つ以上の開口部を、開口部を通った液体が１つ以上の液滴操作電極と十分近接し、液体操作が液体を用いた液体操作電極により影響されるような配列等、１つ以上の電極との相互作用のために配列してもよい。いくつかの場合、基部（または底部）基板および頂部基板は、１つの一体化した部材として形成されてもよい。１つ以上の参照電極が、基部（または底部）基板上および／または頂部基板上および／または間隙内に設けられてもよい。参照電極配列の例が、上記参考特許および参考特許出願に開示される。様々な実施形態では、液滴アクチュエーターによる液滴の操作は、電気濡れ媒介または誘電泳動媒介またはクーロン力媒介等の電極媒介であってもよい。液滴操作を制御するために、本発明の液滴アクチュエーターで用いてもよい他の技術の例は、機械的原理（例えば、外部シリンジポンプ、空気圧膜ポンプ、振動膜ポンプ、真空装置、遠心力、圧電ポンプ／超音波ポンプおよび音響力）；電気的原理または磁気的原理（例えば、電気浸透流、動電学的ポンプ、強磁性流体プラグ、電気流体力学ポンプ、磁力を利用した引力または斥力、および電磁流体力学ポンプ）；熱力学的原理（例えば、気泡発生／相転移体積膨張）；他の種類の表面湿潤原理（例えば、電気濡れ、および光電濡れと同様に化学的な、熱的な、構造的なおよび放射性の誘起表面張力勾配）；重力；表面張力（例えば、毛細管現象）；静電力（例えば、電気浸透流）；遠心力（コンパクトディスク上に配置され、回転された基板）；磁力（例えば、振動イオンが流れを引き起こす）；電磁流体力学的な力；および真空差または加圧差等に基づき操作するもの等の、流体力学的な流体圧を誘起する装置、の使用を含む。いくつかの実施形態では、上記技術の２種以上を組み合わせたものを用いて、本発明の液滴アクチュエーターで液滴操作を行ってもよい。同様に、上述したものの１つ以上を用いて、例えば、他の装置のリザーバから、または、液滴アクチュエーターの外部リザーバから（例えば、液滴アクチュエーター基板に結合したリザーバおよび当該リザーバから液滴操作間隙への流体通路）、液体を液滴操作間隙内に供給してもよい。本発明の所定の液滴アクチュエーターの液滴操作表面は、疎水性材料でできていてもよく、または、液滴操作表面を疎水性とするために被覆または処理されていてもよい。例えば、いくつかの場合、液滴操作表面の一部または全部が、溶液中のポリ−もしくはパーフルオロ化合物、または、重合性単量体等の化合物を使用した、堆積または自然位合成等により、低界面エネルギー材料または化学的性質により誘導体化されていてもよい。例としては、TEFLON（登録商標）AF（DE、Wilmington、DuPont社から入手可能）、材料のcytopファミリーの一部、疎水性のFLUOROPEL（登録商標）ファミリーにおけるコーティングおよび超疎水性コーティング（MD、Beltsville、Cytonix社から入手可能）、シランコーティング、フルオロシランコーティング、疎水性ホスホン酸誘導体（例えば、Aculon社から販売されている商品）、およびNOVEC（商標）電気コーティング（MN、St. Paul、3M Company社から入手可能）、およびプラズマ化学気相成長法（PECVD）用の他のフッ素化された単量体を含む。いくつかの場合、液滴操作表面は、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの厚さを有する疎水性コーティングを含んでいてもよい。さらに、いくつかの実施形態では、液滴アクチュエーターの頂部基板は、導電性有機ポリマーを含み、頂部基板は、次いで、疎水性コーティングで被覆され、または、液滴操作表面を疎水性にするために他の処理をされる。例えば、プラスチック基板上に堆積される導電性有機ポリマーは、ポリ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）ポリ（スチレンスルホネート）（PEDOT：PSS）であってもよい。導電性有機ポリマー層および代替の導電層の他の例は、Pollackらによる題名「Droplet Actuator Devices and Methods」の国際特許出願第PCT/US2010/040705号明細書に記載されており、その開示全体が参照により本明細書に援用される。１つまたは両方の基板が、基板としてプリント基板（ＰＣＢ）、ガラス、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）被覆ガラス、および／または半導体材料を用いて製造されてもよい。基板がＩＴＯ被覆ガラスの場合、ＩＴＯコーティングは、約２０〜約２００ｎｍの範囲が好ましく、約５０〜約１５０ｎｍの範囲、または約７５〜約１２５ｎｍ、または約１００ｎｍの厚さが好ましい。いくつかの場合、頂部基板および／または底部基板は、ポリイミド誘電体等の誘電体で被覆されたＰＣＢ基板を含み、ＰＣＢ基板は、いくつかの場合、被覆または他の処理がなされて、液滴操作表面を疎水性にしてもよい。
基板がＰＣＢを含む場合、以下の材料が好適な材料の例である：MITSUI（商標）BN-300（CA、San Jose、MITSUI Chemical America社から入手可能）；ARLON（商標）11N（CA、Santa Ana、Arlon社から入手可能）；NELCO（登録商標）N4000-6およびN5000-30/32（NY、Melville、Park Electrochemical社から入手可能）；ISOLA（商標）FR406（AZ、Chandler、Isola Group社から入手可能）、特にIS620；フルオロポリマーファミリー（低バックグラウンド蛍光を有するため蛍光検出に適している）；ポリイミドファミリー；ポリエステル；ポリエチレンナフタレート；ポリカーボネート；ポリエーテルエーテルケトン；液晶ポリマー；シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）；シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）；アラミド；THERMOUNT（登録商標）不織布アラミド補強材（DE、Wilmington、DuPont社から入手可能）；NOMEX（登録商標）ブランド繊維（DE、Wilmington、DuPont社から入手可能）；および紙。種々の材料についても、基板の誘電体部材としての使用に適している。例としては以下のものを含む：PARYLENE（商標）C（特にガラス上）およびPARYLENE（商標）N（TX、Katy、Parylene Coating Services社から入手可能）等の蒸着した誘電体；TEFLON（登録商標）AFコーティング；cytop；TAIYO（商標）PSR4000シリーズ、TAIYO（商標）PSRおよびAUSシリーズのような液体光画像形成可能なソルダーマスク（NV、Carson City、Taiyo America社から入手可能）（熱制御を含む用途に良好な熱特性）、およびPROBIMER（商標）8165（熱制御を含む用途に良好な熱特性）（CA、Los Angels、Huntsman Advanced Materials Americas社から入手可能）等のソルダーマスク；VACREL（登録商標）乾燥フィルムソルダーマスク系（DE、Wilmington、DuPont社から入手可能）等の乾燥フィルムソルダーマスク；ポリイミドフィルム（例えば、KAPTON（登録商標）ポリイミドフィルム、DE、Wilmington、DuPont社から入手可能）等のフィルム誘電体、ポリエチレン、およびフルオロポリマー（例えば、ＦＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン；ポリエステル；ポリエチレンナフタレート；シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）；シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）；上で列挙した他のＰＣＢ基板材料のいずれか；ブラックマトリックス樹脂；およびポリプロピレン。液滴輸送の電圧と周波数は、個別の検査手順で用いられる試薬の性能によって選択してもよい。設計パラメーターは異なっていてもよく、例えば、アクチュエーターのリザーバの数と配置、独立した電極接続の数、異なるリザーバの大きさ（体積）、磁石／ビーズ洗浄ゾーンの配置、電極サイズ、電極間の間隔、および間隙高さ（頂部基板と底部基板の間）は、個別の試薬、手順、液滴体積等の使用のために異なっていてもよい。いくつかの場合、本発明の基板は、溶液中のポリ−もしくはパーフルオロ化合物または重合性単量体等の化合物を使用した、堆積または自然位合成等により、低界面エネルギー材料または化学的性質により誘導体化されていてもよい。例としては、浸漬またはスプレーコーティング用のTEFLON（登録商標）AFコーティングおよびFLUOROPEL（登録商標）コーティング、ならびにプラズマ化学気相成長法（PECVD）用の他のフッ素化された単量体を含む。加えて、いくつかの場合、液滴操作表面の一部または全部は、ＰＣＢ基板からのバックグラウンド蛍光等のバックグラウンドのノイズを低減する物質で被覆されていてもよい。例えば、ノイズ低減コーティングは、日本の東レから入手可能なブラックマトリックス樹脂等のブラックマトリックス樹脂を含む。液滴アクチュエーターの電極は、通常、コントローラーまたはプロセッサーにより制御され、コントローラーまたはプロセッサーは、それ自身、システムの一部として提供され、処理機能と同様に、データおよびソフトウェアストレージならびに入力および出力機能を含んでいてもよい。試薬は、液滴アクチュエーター上であって、液滴操作間隙内、または、液滴操作間隙に流体的に結合したリザーバ内に供給されてもよい。試薬は、液滴等の液体形態でもよく、または試薬は、液滴操作間隙内または液滴操作間隙に流体的に結合したリザーバ内で再構成可能な形態で供給されてもよい。再構成可能な試薬は、通常、再構成のために液体と組み合わされてもよい。本発明での使用に好適な再構成可能な試薬の例は、Meathrelらによる２０１０年６月１日に特許された題名「Disintegratable films for diagnostic devices」の米国特許第7,727,466号明細書に記載されている試薬を含む。
基板がＰＣＢを含む場合、以下の材料が好適な材料の例である：MITSUI（商標）BN-300（CA、San Jose、MITSUI Chemical America社から入手可能）；ARLON（商標）11N（CA、Santa Ana、Arlon社から入手可能）；NELCO（登録商標）N4000-6およびN5000-30/32（NY、Melville、Park Electrochemical社から入手可能）；ISOLA（商標）FR406（AZ、Chandler、Isola Group社から入手可能）、特にIS620；フルオロポリマーファミリー（低バックグラウンド蛍光を有するため蛍光検出に適している）；ポリイミドファミリー；ポリエステル；ポリエチレンナフタレート；ポリカーボネート；ポリエーテルエーテルケトン；液晶ポリマー；シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）；シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）；アラミド；THERMOUNT（登録商標）不織布アラミド補強材（DE、Wilmington、DuPont社から入手可能）；NOMEX（登録商標）ブランド繊維（DE、Wilmington、DuPont社から入手可能）；および紙。種々の材料についても、基板の誘電体部材としての使用に適している。例としては以下のものを含む：PARYLENE（商標）C（特にガラス上）およびPARYLENE（商標）N（TX、Katy、Parylene Coating Services社から入手可能）等の蒸着した誘電体；TEFLON（登録商標）AFコーティング；cytop；TAIYO（商標）PSR4000シリーズ、TAIYO（商標）PSRおよびAUSシリーズのような液体光画像形成可能なソルダーマスク（NV、Carson City、Taiyo America社から入手可能）（熱制御を含む用途に良好な熱特性）、およびPROBIMER（商標）8165（熱制御を含む用途に良好な熱特性）（CA、Los Angels、Huntsman Advanced Materials Americas社から入手可能）等のソルダーマスク；VACREL（登録商標）乾燥フィルムソルダーマスク系（DE、Wilmington、DuPont社から入手可能）等の乾燥フィルムソルダーマスク；ポリイミドフィルム（例えば、KAPTON（登録商標）ポリイミドフィルム、DE、Wilmington、DuPont社から入手可能）等のフィルム誘電体、ポリエチレン、およびフルオロポリマー（例えば、ＦＥＰ）、ポリテトラフルオロエチレン；ポリエステル；ポリエチレンナフタレート；シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）；シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）；上で列挙した他のＰＣＢ基板材料のいずれか；ブラックマトリックス樹脂；およびポリプロピレン。液滴輸送の電圧と周波数は、個別の検査手順で用いられる試薬の性能によって選択してもよい。設計パラメーターは異なっていてもよく、例えば、アクチュエーターのリザーバの数と配置、独立した電極接続の数、異なるリザーバの大きさ（体積）、磁石／ビーズ洗浄ゾーンの配置、電極サイズ、電極間の間隔、および間隙高さ（頂部基板と底部基板の間）は、個別の試薬、手順、液滴体積等の使用のために異なっていてもよい。いくつかの場合、本発明の基板は、溶液中のポリ−もしくはパーフルオロ化合物または重合性単量体等の化合物を使用した、堆積または自然位合成等により、低界面エネルギー材料または化学的性質により誘導体化されていてもよい。例としては、浸漬またはスプレーコーティング用のTEFLON（登録商標）AFコーティングおよびFLUOROPEL（登録商標）コーティング、ならびにプラズマ化学気相成長法（PECVD）用の他のフッ素化された単量体を含む。加えて、いくつかの場合、液滴操作表面の一部または全部は、ＰＣＢ基板からのバックグラウンド蛍光等のバックグラウンドのノイズを低減する物質で被覆されていてもよい。例えば、ノイズ低減コーティングは、日本の東レから入手可能なブラックマトリックス樹脂等のブラックマトリックス樹脂を含む。液滴アクチュエーターの電極は、通常、コントローラーまたはプロセッサーにより制御され、コントローラーまたはプロセッサーは、それ自身、システムの一部として提供され、処理機能と同様に、データおよびソフトウェアストレージならびに入力および出力機能を含んでいてもよい。試薬は、液滴アクチュエーター上であって、液滴操作間隙内、または、液滴操作間隙に流体的に結合したリザーバ内に供給されてもよい。試薬は、液滴等の液体形態でもよく、または試薬は、液滴操作間隙内または液滴操作間隙に流体的に結合したリザーバ内で再構成可能な形態で供給されてもよい。再構成可能な試薬は、通常、再構成のために液体と組み合わされてもよい。本発明での使用に好適な再構成可能な試薬の例は、Meathrelらによる２０１０年６月１日に特許された題名「Disintegratable films for diagnostic devices」の米国特許第7,727,466号明細書に記載されている試薬を含む。
「液滴操作」は、液滴アクチュエーター上での液滴の何らかの操作を意味する。液滴操作は、例えば、以下を含む：液滴アクチュエーターへの液滴の装填；液滴源からの１以上の液滴の分配；一の液滴を２以上の液滴とする分割（splitting）、分離（separating）または分割（dividing）；一の位置からいずれかの方向の他の位置への液滴の輸送；２以上の液滴を単一の液滴にする混合（merging）または結合（combining）；液滴の希釈；液滴の混合（mixing）；液滴の撹拌；液滴の変形；適所での液滴の保持；液滴の保温；液滴の加熱；液滴の気化；液滴の冷却；液滴の廃棄；液滴の液滴アクチュエーター外への輸送；本明細書に記載の他の液滴操作；および／または上記の組み合わせ。用語「混合させる」、「混合」、「混合する」、「結合」等は、２以上の液滴から１の液滴を生成することを記載するために用いている。２以上の液滴に関して斯かる用語を使用するときは、２以上の液滴の結合により１の液滴とするのに十分な何らかの液滴操作の組み合わせを用いてもよいことが理解される。例えば、「液滴Ａと液滴Ｂとの混合」は、液滴Ａを動かない液滴Ｂと接触するように輸送すること、液滴Ｂを動かない液滴Ａと接触するように輸送すること、または液滴ＡおよびＢを互いに接触するように輸送することにより達成される。用語「分割」、「分離」および「分割」は、生成する液滴の体積（すなわち、生成する液滴の体積が同一または異なり得る）または生成する液滴の数（生成する液滴の数が２，３，４，５またはそれ以上であってもよい）に関して何ら特定の結果を意味することを意図したものではない。用語「混合（mixing）」は、液滴中で１つ以上の構成要素をより均一に分布させる液滴操作をいう。液滴操作の「装填」の例は、微小透析装填、圧力補助装填、ロボット装填、受動装填（例えば、重力補助装填）、およびピペット装填を含む。用語「保温（incubating）」または「保温（incubation）」は、一定時間、液滴が特定の温度または温度プロフィールに保たれることをいう；液滴は、保温の間、静止位置に保たれてもよいし、または常に移動していてもよい、または、分割−混合−分割−混合、もしくは、前後への輸送、もしくは、ループ等の周期的な液滴操作にかけられてもよい。アクチュエーターで液滴操作を行ってもよいということは、液滴アクチュエーターの液滴操作表面で、または液滴アクチュエーターの液滴操作間隙内で、液滴操作が行われることを意味し、いずれの場合でも、液滴は、充填流体によって液滴アクチュエーターの１つ以上の表面から分離していてもよい。液滴操作は、電極媒介されてもよい。いくつかの場合、液滴操作は、表面上の親水性領域および／または疎水性領域の使用により、および／または物理的障害により、および／または異なる間隙高さ等の液滴アクチュエーターの形状により、さらに促進される。液滴操作の例については、「液滴アクチュエーター」という定義の下で、上記特許および特許出願文献を参照されたい。いくつかの場合、液滴操作は、液滴アクチュエーターの間隙高さの差異、または寸法の差異によって媒介されてもよい。また、これに伴い、エネルギー的により安定なコンホメーションに液滴が移動するにつれ、液滴変形を生ずる。インピーダンスまたは静電容量感知または画像化技術または目視観測を、時々、液滴操作の結果を決定または確認するために用いてもよい。斯かる技術の例は、Sturmerらによる２００８年８月２１日に公開された題名「Capacitance Detection in a Droplet Actuator」の国際特許公開第WO/2008/101194号明細書に記載されており、その開示全体が参照により本明細書に援用される。一般的に言えば、感知または画像化技術は、特定の電極に液滴が存在するか否かを確認するのに用いてもよい。例えば、ある液滴分配操作後の目的電極における分配された液滴の存在により、その液滴分配操作が効果的だったことが確認される。同様に、検査手順の適当な工程の検出場所で液滴が存在することにより、前の一連の液滴操作が検出用液滴を良好に生成したことを確認してもよい。液滴輸送時間は、かなり早くともよい。例えば、様々な実施形態で、一の電極から隣の電極までの液滴の輸送は、約１秒、または約０．１秒、または約０．０１秒、または約０．００１秒を超えてもよい。一の実施形態では、電極は直流モードで操作されるが、画像化するために交流モードに切り替えられる。電気濡れ領域に類似した液滴の専有領域について液滴操作を行うことが有用である；換言すると、１倍、２倍、３倍の液滴が、それぞれ、１、２、および３個の電極を用いて効果的に制御されて操作される。もし、液滴の専有領域が所定時間に液滴操作を行うために利用可能な電極の数よりも大きい場合、液滴の大きさと電極の数との差は、通常１より大きくなく、換言すると、２倍の液滴が１個の電極を用いて効果的に制御され、３倍の液滴が２個の電極を用いて効果的に制御される。液滴がビーズを含む場合、液滴の大きさは、液滴を輸送する等の液滴を制御する電極の数と等しいことが有利である。しかしながら、注目すべきことに、界面張力、輸送スピード等を変えることにより、液滴の専有領域よりはるかに小さな専有領域を有する電極または電極のセットを用いて非常に大きな液滴を輸送できる；したがって、上述の文は、有用な目安を記載しており、本発明を限定するものとして解釈すべきではない。
「充填流体」は、液滴と混合しないまたは実質的に混合しない流体を意味する。いくつかの実施形態では、充填流体は、液滴アクチュエーターの液滴操作基板と関連しており、ここで流体は十分に液滴相と非混和性であり、液滴相を電極媒介の液滴操作に供する。例えば、液滴アクチュエーターの間隙は、通常、充填流体で充填される。充填流体は、例えば、シリコーンオイルまたはヘキサデカン充填流体等の低粘性オイルであってもよい。充填流体は、液滴アクチュエーターの間隙全体を充填していてもよいし、または液滴アクチュエーターの１つ以上の表面を被覆していてもよい。充填流体は、導電性または非導電性であってもよい。充填流体は、例えば、界面活性剤または他の添加剤が添加されていてもよい。例えば、添加剤を選択して、液滴操作を改良してもよいし、および／または、液滴からの試薬もしくは目標物質の損失、微小液滴の形成、液滴間の相互汚染、液滴アクチュエーター表面の汚染、液滴アクチュエーター材料の分解等を低減してもよい。界面活性剤の添加を含む充填流体の組成は、個別の検査手順で用いられる試薬の性能、および、液滴アクチュエーターの材料との効果的な相互作用または非相互作用、により選択してもよい。本発明での使用に適した充填流体および充填流体の配合の例は、Srinivasanらによる２０１０年３月１１日に公開された題名「Droplet Actuators, Modified Fluids and Methods」の国際特許公開第WO/2010/027894号明細書および２００９年２月１２日に公開された題名「Use of Additives for Enhancing Droplet Operations」の国際特許公開第WO/2009/021173号明細書；Sistaらによる２００８年８月１４日に公開された題名Droplet Actuator Devices and Methods Employing Magnetically responsive beads」の国際特許公開第WO/2008/098236号明細書；およびMonroeらによる２００７年５月１７日に出願された題名「Electrowetting Devices」の米国特許出願公開第20080283414号明細書に記載されており、本明細書で引用された他の特許および特許出願文献と同様に、その開示全体が参照により本明細書に援用される。注目すべきことに、本明細書に記載の任意のライブラリー作製方法を、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙を実質的に満たしている充填流体等の充填流体中で行ってもよい。一の実施形態では、充填流体は、約１〜約６．５ｃＳＴ、または約１．５〜約５．５ｃＳＴ、または約２〜約５ｃＳＴの動的粘度を有するシリコーンオイルを含む。当該シリコーンオイルに界面活性剤を添加してもよい。一の実施形態では、ライブラリー構築を実行するための充填流体は、約０．０００１〜約１％ｖ／ｖのオイル可溶性の界面活性剤、または約０．００１〜約０．１％ｖ／ｖのオイル可溶性の界面活性剤、または約０．００１〜約０．０１％ｖ／ｖのオイル可溶性の界面活性剤、または約０．００５〜約０．０１％ｖ／ｖのオイル可溶性の界面活性剤と共に、約２ｃＳＴ〜約７ｃＳＴのシリコーンオイルを含む。したがって、一の実施形態では、本発明は、本発明の液滴アクチュエーターカートリッジと斯かる特徴を有する充填流体とを含むキットを提供する。他の実施形態では、ライブラリー構築を実行するための充填流体は、約０．０００１〜約１％ｖ／ｖのソルビタンの脂肪酸エステル、または約０．００１〜約０．１％ｖ／ｖのソルビタンの脂肪酸エステル、または約０．００１〜約０．０１％ｖ／ｖのソルビタンの脂肪酸エステル、または約０．００５〜約０．０１％ｖ／ｖのソルビタンの脂肪酸エステルと共に、約２ｃＳＴ〜約７ｃＳＴのシリコーンオイルを含む。したがって、一の実施形態では、本発明は、本発明の液滴アクチュエーターカートリッジと斯かる特徴を有する充填流体とを含むキットを提供する。他の実施形態では、ライブラリー構築を実行するための充填流体は、約０．０００１〜約１％ｖ／ｖのシリコーンオイル可溶性のソルビタンエステル、または約０．００１〜約０．１％ｖ／ｖのシリコーンオイル可溶性のソルビタンエステル、または約０．００１〜約０．０１％ｖ／ｖのシリコーンオイル可溶性のソルビタンエステル、または約０．００５〜約０．０１％ｖ／ｖのシリコーンオイル可溶性のソルビタンエステルと共に、約２ｃＳＴ〜約７ｃＳＴのシリコーンオイルを含む。したがって、一の実施形態では、本発明は、本発明の液滴アクチュエーターカートリッジと斯かる特徴を有する充填流体とを含むキットを提供する。他の実施形態では、ライブラリー構築を実行するための充填流体は、約０．０００１〜約１％ｖ／ｖのソルビタントリオレアート、または約０．００１〜約０．１％ｖ／ｖのソルビタントリオレアートのエステル、または約０．００１〜約０．０１％ｖ／ｖのソルビタントリオレアート、または約０．００５〜約０．０１％ｖ／ｖのソルビタントリオレアートのエステルと共に、約２ｃＳＴ〜約７ｃＳＴのシリコーンオイルを含む。ソルビタントリオレアートは、Sigma Aldrich社から界面活性剤配合SPAN（登録商標）85として入手可能である。したがって、一の実施形態では、本発明は、本発明の液滴アクチュエーターカートリッジと斯かる特徴を有する充填流体とを含むキットを提供する。一の実施形態では、ライブラリー構築を実行するための充填流体は、約０．０１〜約２％ｖ／ｖのオイル可溶性の界面活性剤、または約０．１〜約１％ｖ／ｖのオイル可溶性の界面活性剤、または約０．１〜約０．５％ｖ／ｖのオイル可溶性の界面活性剤と共に、２ｃＳＴのシリコーンオイルを含む。したがって、一の実施形態では、本発明は、本発明の液滴アクチュエーターカートリッジと斯かる特徴を有する充填流体とを含むキットを提供する。他の実施形態では、ライブラリー構築を実行するための充填流体は、約０．０１〜約２％ｖ／ｖのオイル可溶性のオクチルフェノールエトキシレート界面活性剤、または約０．１〜約１％ｖ／ｖのオイル可溶性のオクチルフェノールエトキシレート界面活性剤、または約０．１〜約０．５％ｖ／ｖのオイル可溶性のオクチルフェノールエトキシレート界面活性剤と共に、２ｃＳＴのシリコーンオイルを含む。例えば、好適なオクチルフェノールエトキシレート界面活性剤は、TRITON（登録商標）X-15であり、当該TRITON（登録商標）X-15は１５のエチレンオキシド単位を有するオクチルフェノールエトキシレートである。したがって、一の実施形態では、本発明は、本発明の液滴アクチュエーターカートリッジと斯かる特徴を有する充填流体とを含むキットを提供する。他の実施形態では、界面活性剤は、ブロック共重合体を含む。例えば、ブロック共重合体は、ポリ（テトラフルオロエチレン）ブロックおよびポリ（ジメチルシロキサン）を含んでいてもよい。一の実施形態では、ポリ（テトラフルオロエチレン）ブロックは、約５〜約５０の繰り返し単位を含んでいてもよい。一の実施形態では、ポリ（ジメチルシロキサン）は、約４００〜約１０，０００ＭＷのＭＷを有していてもよい。他の実施形態では、界面活性剤は、親水性シリコーンまたは親水性シロキサンを含む。例えば、界面活性剤は、ジメチルシロキサン主鎖を含んでいてもよく、当該ジメチルシロキサン主鎖ではメチル基のいくつかが、ポリアルキレンオキシ基またはピロリドン基により、スペーサーとしてのプロピル基に置換されている。好適な界面活性剤のさらなる例は、ポリアルキレンオキシドシリコーン、ヒドロキシシリコーンおよびカチオン性シリコーン、ポリ（アルキレンオキシ）官能化金属有機物およびポリ（アルキレンオキシ）官能化金属シラン、ならびにトリシロキサンを含む。さらなる例は、DBE−712（ジメチルシロキサン−エチレンオキシドブロック共重合体）、DBP−732（ジメチルシロキサン−（６０％プロピレンオキシド−４０％エチレンオキシド）ブロック共重合体）、DBE−224（ジメチルシロキサン−エチレンオキシドブロック共重合体）、QMS−435（３５〜４５％（トリメチルフェネチル）メチルシロキサン−５５〜６５％ジメチルシロキサン共重合体、塩化物塩）、CMS−222（（カルビノール官能化）メチルシロキサン−ジメチルシロキサン共重合体）、AKT841（Ｏ−アリルオキシ（ポリエチレンオキシ）トリイソプロポキシチタネート）、SIT8192.0（Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミド）、SIM6492.7（２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン）、SIH6185.0（（ヒドロキシポリエチレンオキシプロピル）ヘプタメチルトリシロキサン）、SIM6492.6（（メトキシポリエチレンオキシプロピル）ヘプタメチルトリシロキサン）、およびSIA0075.0（（アセトキシポリエチレンオキシプロピル）ヘプタメチルトリシロキサン）を含み、全てPA、Morrsiville、Gelest社から入手可能である。
磁気応答性ビーズに関して「固定する」は、ビーズが液滴アクチュエーター上の液滴中または充填流体中の位置に実質的に拘束されていることを意味する。例えば、一の実施形態では、固定されたビーズは、液滴中で位置に実質的に拘束され、液滴分割操作の実行が可能となり、実質的に全てのビーズを有する１の液滴と、実質的にビーズを欠く１の液滴とを生ずる。
「磁気応答性」は、磁場に対する応答性を意味する。「磁気応答性ビーズ」は、磁気応答性材料を含むかまたは磁気応答性材料から構成される。磁気応答性材料の例は、常磁性材料、強磁性材料、フェリ磁性材料、およびメタ磁性材料を含む。好適な常磁性材料の例は、鉄、ニッケル、およびコバルトと同様に、Ｆｅ３Ｏ４、ＢａＦｅ１２Ｏ１９、ＣｏＯ、ＮｉＯ、Ｍｎ２Ｏ３、Ｃｒ２Ｏ３、およびＣｏＭｎＰ等の金属酸化物を含む。
液滴および／または液滴中の磁気応答性ビーズに関して、本明細書で用いられる「磁石の磁場への輸送」、「磁石への輸送」等は、液滴中の磁気応答性ビーズを実質的に引き付けることができる磁場領域への輸送についての言及を意図している。同様に、液滴および／または液滴中の磁気応答性ビーズに関して、本明細書で用いられる「磁石または磁場から離れる輸送」、「磁石の磁場外への輸送」等は、液滴または磁気応答性ビーズが磁場から完全に除去されるか否かに関わらず、液滴中の磁気応答性ビーズを実質的に引き付けることができる磁場領域から離れる輸送についての言及を意図している。本明細書に記載の斯かる場合のいずれでも、液滴は磁場の所望の領域へ向けてまたは領域外へ輸送されてもよく、および／または磁場の所望の領域が液滴へ向けてまたは遠ざけて移動されてもよいことが理解される。磁場「内に（within）」または磁場「内に（in）」ある電極、液滴、または磁気応答性ビーズ等への言及は、以下の状況の記載を意図している：（ｉ）電極が、液滴を磁場の所望の領域へまたは領域外へ輸送できる態様で電極が設けられている状況、または（ｉｉ）液滴または磁気応答性ビーズが、磁場の所望の領域に位置している状況；各場合に所望の領域内の磁場は、液滴中のいずれかの磁気応答性ビーズを実質的に引き付けることができる。同様に、磁場「外に（outside of）」または磁場「から離れて（away from）」ある電極、液滴、または磁気応答性ビーズ等への言及は、以下の状況の記載を意図している：（ｉ）電極が、液滴を磁場の特定の領域から離れて輸送できる態様で電極が設けられている状況、または（ｉｉ）液滴または磁気応答性ビーズが、磁場の特定の領域から離れて位置している状況；各場合に斯かる領域の磁場は、液滴中のいずれの磁気応答性ビーズも実質的に引き付けることができないか、または、斯かる領域におけるいずれの残余の引力も、当該領域で行われる液滴操作の有効性を低減しない。本発明の様々な態様では、システム、液滴アクチュエーター、またはシステムの他の構成要素は、１つ以上の永久磁石（例えば、単一の円筒状もしくは棒磁石またはHalbach配列等の斯かる磁石の配列）、または、電磁石もしくは電磁石の配列等の磁石を含み、磁気応答性ビーズまたは液滴アクチュエーターの他の構成要素と相互作用する磁場を形成してもよい。斯かる相互作用は、例えば、保存中、または、液滴操作もしくは液滴外への磁気応答性ビーズの引っ張りの間の液滴中の、磁気応答性ビーズの動きまたは流れを実質的に固定することまたは拘束することを含む。
ビーズの洗浄に関して「洗浄」は、ビーズに接触している液滴から、ビーズに接触しているまたはさらされている１つ以上の物質の量および／または濃度を低減することを意味する。物質の量および／または濃度の低減は、部分的、実質的に完全、または、完全でもよい。物質は広範な種類の物質のいずれでもよい；例としては、（ｉ）さらなる分析のための目的物質、および、（ｉｉ）サンプルの成分、汚染物質、および／または過剰な試薬等の不要な物質を含む。いくつかの実施形態では、洗浄操作は、磁気応答性ビーズに接触した開始液滴から始まり、ここで当該液滴は、初期量および初期濃度の物質を含む。洗浄操作は、様々な液滴操作を用いて進めてもよい。洗浄操作は、磁気応答性ビーズを含む液滴を生成してもよく、ここで、当該液滴は、物質の初期量および／または初期濃度よりも少ない物質の合計量および／または濃度を有する。好適な洗浄技術の例は、Pamulaらによる２００８年１０月２１日に発行された題名「Droplet-Based Surface Modification and Washing」の米国特許第7,439,014号に記載されており、その開示全体が参照により本明細書に援用される。
用語「頂部（top）」、「底部（bottom）」、「上（over）」、「下（under）」および「上（on）」は、液滴アクチュエーターの頂部基板および底部基板の相対的位置等の液滴アクチュエーターの構成要素の相対的位置に関する説明で用いられている。液滴アクチュエーターは、空間での液滴アクチュエーターの配向に関わらず機能してもよいことが理解される。
いずれの形態（例えば、動いているまたは静止している液滴もしくは連続体）でも液体が、電極、配列、マトリックスまたは表面「上（on）」、「に（at）」、または「上（over）」にあるとして記載される場合、斯かる液体は、電極／配列／マトリックス／表面に直接接触するか、または、液体と電極／配列／マトリックス／表面との間に挿置される１つ以上の層もしくはフィルムに接触するかのいずれでもよい。
液滴が液滴アクチュエーター「上に（on）」、または「に装填されて（loaded on）」または「内に装填されて（loaded into）」にあるとして記載されるとき、（ｉ）液滴アクチュエーターを用いて、液滴への１つ以上の液滴操作を容易にする態様で、液滴が液滴アクチュエーター上に配置されている、（ｉｉ）液滴の特性または液滴からの信号を感知するのを容易にする態様で、液滴が液滴アクチュエーター上に配置されている、および／または、（ｉｉｉ）液滴が液滴アクチュエーターで液滴操作にかけられたことが、理解される。
化学反応が記載された場合においては、当該化学反応は、記述された結果を達成するいずれの温度および時間で、行ってもよいと推定される。
６ 図面の簡単な説明
６ 図面の簡単な説明
７ 発明の詳細な説明
本発明は、核酸ライブラリーを構築する方法を提供する。本発明の方法は、通常、オイル等の非混和性の流体中でサンプル液滴および試薬液滴を使用する。一の実施態様では、本発明の方法は、入力サンプルとしてフラグメント化された核酸を使用し、核酸配列決定方法の次の工程のためのアダプター結合核酸ライブラリーにより終了し、核酸配列決定方法は、F. Hoffmann-La Roche社、Life Technology社、Illumina社、Helicos BioSciences社およびPacific Biosciences of California社等から入手可能または開発されているプラットフォーム等の次世代配列決定プラットフォームを使用する。本発明の方法の開始及び終了のいずれにおいても、サイズ分画、核酸フラグメンテーション、逆転写、核酸増幅、二本鎖ヌクレアーゼ処理、ターゲット濃縮、ターゲット配列捕捉、サイズ選択、および核酸出力の定量化（例えば、ゲル電気泳動、qPCR、または他の方法による）等の追加の工程が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の化学的な手法は、液滴アクチュエーター装置を用いて実行されてもよい。方法全体における収率、特定の工程における収率、結果までの時間、試薬消費量、およびバイアス等のライブラリー構築のパラメーターは、当技術分野の現状を超えて非常に向上している。本発明は、核酸ライブラリー構築を超えた用途を有する新規な装置、手法および検査工程も提供する。
本発明は、核酸ライブラリーを構築する方法を提供する。本発明の方法は、通常、オイル等の非混和性の流体中でサンプル液滴および試薬液滴を使用する。一の実施態様では、本発明の方法は、入力サンプルとしてフラグメント化された核酸を使用し、核酸配列決定方法の次の工程のためのアダプター結合核酸ライブラリーにより終了し、核酸配列決定方法は、F. Hoffmann-La Roche社、Life Technology社、Illumina社、Helicos BioSciences社およびPacific Biosciences of California社等から入手可能または開発されているプラットフォーム等の次世代配列決定プラットフォームを使用する。本発明の方法の開始及び終了のいずれにおいても、サイズ分画、核酸フラグメンテーション、逆転写、核酸増幅、二本鎖ヌクレアーゼ処理、ターゲット濃縮、ターゲット配列捕捉、サイズ選択、および核酸出力の定量化（例えば、ゲル電気泳動、qPCR、または他の方法による）等の追加の工程が含まれてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の化学的な手法は、液滴アクチュエーター装置を用いて実行されてもよい。方法全体における収率、特定の工程における収率、結果までの時間、試薬消費量、およびバイアス等のライブラリー構築のパラメーターは、当技術分野の現状を超えて非常に向上している。本発明は、核酸ライブラリー構築を超えた用途を有する新規な装置、手法および検査工程も提供する。
７．１ ライブラリー構築
本発明の典型的なライブラリー構築手順は、いくつかの酵素反応の工程を含む。酵素反応の工程の一部または全部の後に核酸精製を行ってもよい。酵素反応の工程は、１倍、２倍、３倍、４倍サイズの液滴等の単位サイズ化された液滴を用いて行ってもよい。酵素反応の工程は、非混和性または実質的に非混和性の充填流体で、被覆された、部分的に充填された、または実質的に充填された液滴アクチュエーター内の２枚の基板の間で圧迫された液滴のように、液滴が、非混和性または実質的に非混和性の充填流体に浮遊しているまたは沈降している間、あるいは非混和性または実質的に非混和性の充填流体に完全にまたは部分的に囲まれている間に行ってもよい。したがって、本明細書では、液滴操作が記載されるところのいずれでも、液滴が、（ｉ）非混和性または実質的に非混和性の充填流体内に浮遊しているまたは沈降している間、あるいは、（ｉｉ）非混和性または実質的に非混和性の充填流体に完全にまたは部分的に囲まれている間、または、（ｉｉｉ）非混和性または実質的に非混和性の充填流体で、被覆された、部分的に充填された、または実質的に充填された液滴アクチュエーター内の２枚の基板の間で圧迫されている間に、液滴操作を行ってもよいことが理解される。さらに、斯かる充填流体は、本明細書で記載されるようなオイル系充填流体であることが好ましいことが理解される。本発明の方法の液滴操作の一部または全ては、液滴アクチュエーターで行ってもよい。
本発明の典型的なライブラリー構築手順は、いくつかの酵素反応の工程を含む。酵素反応の工程の一部または全部の後に核酸精製を行ってもよい。酵素反応の工程は、１倍、２倍、３倍、４倍サイズの液滴等の単位サイズ化された液滴を用いて行ってもよい。酵素反応の工程は、非混和性または実質的に非混和性の充填流体で、被覆された、部分的に充填された、または実質的に充填された液滴アクチュエーター内の２枚の基板の間で圧迫された液滴のように、液滴が、非混和性または実質的に非混和性の充填流体に浮遊しているまたは沈降している間、あるいは非混和性または実質的に非混和性の充填流体に完全にまたは部分的に囲まれている間に行ってもよい。したがって、本明細書では、液滴操作が記載されるところのいずれでも、液滴が、（ｉ）非混和性または実質的に非混和性の充填流体内に浮遊しているまたは沈降している間、あるいは、（ｉｉ）非混和性または実質的に非混和性の充填流体に完全にまたは部分的に囲まれている間、または、（ｉｉｉ）非混和性または実質的に非混和性の充填流体で、被覆された、部分的に充填された、または実質的に充填された液滴アクチュエーター内の２枚の基板の間で圧迫されている間に、液滴操作を行ってもよいことが理解される。さらに、斯かる充填流体は、本明細書で記載されるようなオイル系充填流体であることが好ましいことが理解される。本発明の方法の液滴操作の一部または全ては、液滴アクチュエーターで行ってもよい。
本発明のライブラリー作製方法は、フラグメント化された核酸を利用する。フラグメント化された核酸は、物理的せん断方法；超音波処理；制限エンドヌクレアーゼ等の酵素方法；および他の化学的方法と同様に斯かる方法の組み合わせ等のいずれかの核酸フラグメンテーション方法を用いて調製されてもよい。フラグメントサイズは、ランダムまたは非ランダムであってもよい。フラグメントはサイズ分画されていてもよいし、サイズ分画されていなくてもよい。核酸のフラグメンテーションは、液滴アクチュエーターでまたは液滴アクチュエーター外で行われてもよい。液滴アクチュエーターで、非フラグメント化されたサンプルを含む液滴を、フラグメンテーション試薬を含む１つ以上の液滴と共に液滴操作を用いて混合して、フラグメント化された核酸を含む液滴を生成してもよい。フラグメント化された核酸は、次の工程のために液滴アクチュエーターから除去されてもよいし、またはサンプル調製方法の次の工程にかけられてもよいし、もしくは液滴アクチュエーターで次の工程にかけられてもよい。液滴アクチュエーターでの核酸サンプルのフラグメンテーションを促進するために有用な超音波処理の設定の例は、Srinivasanらによる２０１０年７月１５日に出願された題名「Systems for and Methods of Promoting Cell Lysis in Droplet Actuators」の米国特許出願第61/364,645号に記載されており、その開示全体がを参照により本明細書に援用される。
図１は、フラグメント化された核酸を用いて核酸ライブラリーの構築のための例示的な手順１００の工程を示すフローチャートである。手順１００は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。
平滑末端化工程１０５では、５’−および／または３’−突出を有する核酸フラグメントが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性と５’→３’ポリメラーゼ活性の両方を有するＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化される。液滴アクチュエーターで、平滑末端化工程は、サンプル液滴と、平滑末端化試薬を有する液滴とを分配および混合する液滴操作を用いて達成され得る。平滑末端化工程の後に、核酸を精製して（例えば、ビーズ系洗浄手順）、続く工程に干渉し得る、酵素および組み込まれなかったｄＮＴＰｓを除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。平滑末端化工程１０５は、平滑末端化されたフラグメントを調製するフラグメンテーションスキームが用いられる場合は、省略してもよい。
リン酸化工程１１０では、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、リン酸エステルを平滑末端化された核酸の５’−ヒドロキシ末端に結合してもよい。液滴アクチュエーターで、リン酸化工程は、リン酸化試薬を含む液滴を分配し、当該液滴と、工程１０５により調製された平滑末端化された核酸を含む液滴とを混合する液滴操作を用いて達成され得る。平滑末端化工程の後に、核酸を精製して（例えば、ビーズ系洗浄手順）、酵素と、続く工程に干渉し得る過剰な試薬とを除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。平滑末端化工程１０５とリン酸化工程１１０は、容易に組み合され得る。例えば、ILLUMINA（登録商標）対末端 DNA サンプル調製キット、およびNEBNEXT（登録商標）DNA サンプル調製試薬セット１、および他の市販のキット内で、平滑末端化試薬とリン酸化試薬とは一般に組み合わされている。当該組み合わされた工程のための核酸精製は、個々の工程について記載したようにビーズ系混合および分割液滴洗浄手順を用いて達成されてもよい。平滑末端化工程１０５とリン酸化工程１１０とが分けられる場合、当該工程の間に洗浄工程を行う必要はない。平滑末端化試薬を含む液滴は、液滴操作を用いて、サンプル液滴と、分配および混合されてもよく；次いで、リン酸化酵素を含む液滴は分配され、液滴操作を用いて、サンプルおよび平滑末端化試薬を含む液滴に混合されてもよい。この工程により調製された液滴中の核酸は、次いで、本明細書に記載のように、捕捉され、精製されてもよい。
Ａ−ｔａｉｌ化工程１１５では、クレノウ（３’→５’）エキソ−ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、Ａ−ｔａｉｌを、リン酸化され、平滑末端化された核酸フラグメントの両端に付けてもよい。その反応は、好適には約３７℃で起こる。ｄＡＴＰの存在下、クレノウ（３’→５’）エキソ−ＤＮＡポリメラーゼＩは、非テンプレート３’付加に触媒作用を及ぼす。液滴アクチュエーターで、Ａ−ｔａｉｌ化工程は、液滴操作を用いてＡ−ｔａｉｌ化試薬を含む液滴を分配し、当該液滴と、工程１１０により調製されたリン酸化された核酸を含む液滴とを混合することにより達成され得る。液滴アクチュエーターで、この反応は、室温と同程度の低い温度、または、３７℃程度またはいくつかの場合はさらに高い温度で達成され得る。Ａ−ｔａｉｌ化反応後に、クレノウＤＮＡポリメラーゼＩは、反応液滴と、不活性化試薬を含む液滴とを混合する液滴操作を行うことにより不活性化（例えば、化学的不活性化）される、または反応液滴を所望の活性を達成するために選択した温度および時間で保温することにより熱不活性化される等、不活性化されてもよい。温度は、通常、約２０〜６０分間、約３５〜約７５℃等、室温を超えて昇温される。あるいは、核酸は精製され、ビーズ系洗浄手順を用いて酵素除去されてもよく、当該手順で、核酸はビーズ上に捕捉され、当該ビーズは洗浄手順にかけられる。
アダプター結合工程１２０では、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて核酸アダプターをＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントに結合してもよい。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、並列５’−リン酸エステルに存在する付着末端と、二本鎖核酸の３’−ヒドロキシ末端と、の間のリン酸エステル結合の形成に触媒作用を及ぼす。その反応は、所望のアダプター結合を達成するために選択した温度と時間（例えば、約２０℃で約３０分間）で起こり得る。液滴アクチュエーターで、アダプター結合工程は、アダプターと結合試薬とを含む液滴を分配し、当該液滴と、工程１１５により調製されたＡ−ｔａｉｌ化された核酸を含む液滴と、を混合する液滴操作を用いて達成され得る。結合工程の後に、核酸を精製して（例えば、ビーズ系洗浄手順を用いて）、続くＰＣＲ増幅工程に干渉し得る組み込まれなかったアダプターを除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。いくつかの実施形態では、アダプターの核酸に対する比は、約１０：１モルより大きく、または約１５：１モルより大きく、または約２０：１モルより大きく、または約２５：１モルより大きく、または約３０：１モルより大きく、またはより高い。さらに他の実施形態では、アダプターの核酸に対する比は、約１：１〜約１０：１である。放出された核酸は、次いで、いずれかの核酸増幅技術を用いて増幅されてもよい。増幅は、液滴アクチュエーターで、例えば、フロースルー熱サイクル方法を用いて行ってもよく、または核酸は別の装置で増幅のために液滴アクチュエーターから除去されてもよい。しかしながら、本発明の一の実施態様では、本出願人は、本発明の方法が従来のライブラリー構築方法よりもはるかに高い収率をもたらすことを発見した。その結果として、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ライブラリー構築後に増幅工程の介在なく、核酸ライブラリーを配列決定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、２０以下のサイクル、または１５以下のサイクル、または１０以下のサイクル、または５以下のサイクル、またはちょうど１または２サイクル等の、最小限の増幅で、ライブラリー構築後に、核酸ライブラリーを配列決定する方法を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、液滴アクチュエーターからライブラリー液滴を除去する工程と、増幅工程の介在なく、または、最小限の増幅（例えば、２０以下のサイクル、または１５以下のサイクル、または１０以下のサイクル、または５以下のサイクル、またはちょうど１または２サイクル）と共に、当該ライブラリーを配列決定装置上に装填する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ライブラリー構築後に、濃縮増幅工程の介在なく、核酸ライブラリーを配列決定する方法を提供する。
一の実施形態では、アダプター結合工程１２０は、約１５〜約２４℃、または約１７〜約２３℃、または約１９〜約２１℃、または約２０℃等の室温未満の温度で達成され得る。
他の代わりの実施形態では、平滑末端化工程１０５、リン酸化工程１１０、およびＡ−ｔａｉｌ化工程１１５は組み合わされてもよい。液滴アクチュエーターで、当該実施形態は、液滴操作を用いて、平滑末端化試薬、リン酸化試薬、およびＡ−ｔａｉｌ化試薬を含む液滴を分配する工程と、分配された液滴と核酸サンプル液滴とを混合する工程とを含み、サンプル核酸の平滑末端化、リン酸化、およびＡ−ｔａｉｌ化を達成する。核酸は、続くアダプター結合工程で精製された核酸を提供するために、例えば、本明細書の他の箇所に記載のように、ビーズに捕捉され、洗浄されてもよい。
他の実施形態では、核酸精製工程は、アダプター結合工程の後のみ行われる。さらに他の実施形態では、１つ以上の捕捉工程および溶離工程を、ライブラリー構築方法のいずれかの工程の後に行ってもよい。例えば、平滑末端化工程、リン酸化工程、および／またはＡ−ｔａｉｌ化工程の後に、液滴は、核酸捕捉ビーズを含む液滴と組み合わされてもよい。ビーズは、磁石を用いて拘束されてもよく、ビーズを囲む液滴中の過剰の液体は、液滴をビーズから離れて輸送することにより「スナップオフ」してもよい。ビーズは、ビーズを囲む最小量の液体を残して留置される。他の液滴をそのビーズと接触させるように輸送して、この最小量の液体と新しい液滴の液体とを混合し、新しく混合された液滴内にビーズを懸濁させることにより、そのビーズを捕捉してもよい。したがって、例えば、新しい液滴は、ビーズから捕捉された核酸を溶離させるための試薬を含んでいてもよい。ビーズは、磁石を用いて再度拘束されてもよく、ビーズを囲む液滴中の過剰の液体は、液滴をビーズから離れて輸送することにより「スナップオフ」してもよい。この液滴は、溶離した核酸を含み、当該核酸は、次いで、ライブラリー作製方法の次の工程にさらされてもよい。ビーズは、スナップオフプロセスの間、拘束されていてもよく、その後、磁石の移動または電磁石のスイッチを切ることにより、次の液滴内に、放出されて再度懸濁されてもよい。適したスナップオフ技術の例は、本明細書の他の箇所に記載されており、例えば、図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃの記載を参照されたい。
本発明のこの手順および他の手順で要求されるいずれの温度条件も、液滴操作表面、および／または、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙中の充填流体の領域、を加熱もしくは冷却することにより、形成されてもよい。液滴は、液滴操作を用いて、液滴操作表面または液滴操作間隙の加熱領域または冷却領域に輸送され、必要な時間当該領域に保持されてもよい。あるいは、液滴アクチュエーターカートリッジ全体または液滴を含むカートリッジの領域が、必要な保温時間の間、加熱または冷却されてもよい。さらに、液滴操作間隙の外側または液滴操作表面から離れたところを加熱または冷却するために、液滴を液滴操作表面または液滴操作間隙に存在する流体通路に移動すること等により、液滴は液滴アクチュエーターから除去されてもよい。液滴は、その後、次の工程を行うための冷却後に液滴操作間隙または液滴操作表面に戻されてもよい。
対末端ライブラリーの構築のための台上（ｏｎ−ｂｅｎｃｈ）手順の一例を表１に示す。この例では、各酵素工程、すなわち、平滑末端化工程、Ａ−ｔａｉｌ化工程、およびアダプター結合工程のための反応キットを用いた（それぞれ、E1210S、M0212SおよびM2200S、New England Biolabs社）。試薬は、必要に応じて希釈され、検査で使用する最終的な１倍濃度を供給してもよい。平滑末端、Ａ−ｔａｉｌ、およびアダプター結合混合物は、（ｉ）改質されて、（ｉｉ）ポリソルベート界面活性剤（例えば、０．０１〜０．１％Tween-20（ポリソルベート２０としても公知）、または、他の界面活性剤、等）等の界面活性剤を、本明細書に記載の濃度で含んでいてもよい。
核酸フラグメントライブラリー構築手順の他の一例は、インビトロ転位手順にて高密度である。転位手順では、Ｔｎ５トランスポザーゼの活動亢進誘導体を用いて、合成オリゴヌクレオチド（すなわち、変更トランスポゾン）の高密度でのターゲットＤＮＡへの組み込みに触媒作用を及ぼしてもよい。この例では、NexteraのTransposome（商標）技術等のトランスポザーゼを用いて、ランダムｄｓＤＮＡ破壊を作り出してもよい。当該Transposome（商標）錯体は、遊離トランスポゾン末端およびトランスポザーゼを含む。当該錯体をｄｓＤＮＡと共に保温すると、当該ＤＮＡは、フラグメント化され、トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの転移鎖は、ＤＮＡフラグメントの５’末端に共有結合する。いくつかのプラットフォーム固有アプリケーション（例えば、Illumina配列決定プラットフォーム）では、トランスポゾン末端は、配列決定プライマー部位に付加してもよい。バッファーと反応条件（例えば、Transposome（商標）錯体の濃度）を変えることにより、フラグメント化および標識されたＤＮＡライブラリーのサイズ分布を制御してもよい。Nextera技術を、Roche/454またはIllumina/Solexa配列決定プラットフォーム等の配列決定プラットフォームと適合する任意のバーコーディングと共に用いて、２標識ライブラリーを作り出してもよい。
トランスポザーゼ触媒ライブラリー構築用のデジタル微小流体手順は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい：核酸は、トランスポザーゼおよび遊離トランスポゾン末端（例えば、NexteraのTransposome（商標）錯体）を含むトランスポザーゼ酵素錯体を用いてフラグメント化および標識されてもよい。いくつかのプラットフォーム固有アプリケーション（例えば、Illumina配列決定プラットフォーム）では、トランスポゾン末端は、配列決定プライマー部位に付加されてもよい。トランスポゾン組み込みと鎖転移は、ターゲット核酸内でのねじれ型ｄｓＤＮＡ破壊を経て起こる。ターゲット核酸は、トランスポゾンシークエンスで５’末端で標識されてもよい。反応は、好ましくは５５℃で起こる。液滴アクチュエーターで、この工程は、（ｉ）サンプル液滴と、（ｉｉ）トランスポザーゼ酵素試薬と反応バッファーとを含む液滴とを、分配し、混合する液滴操作を用いて達成され得る。トランスポザーゼ酵素試薬は、プラットフォーム固有アプリケーション（例えば、Illumina適合ライブラリー用のNextera（商標）Enzyme Mix；Roche454適合ライブラリー用のNextera（商標）Enzyme Mix）のために選択されてもよい。フラグメンテーションと標識化の後、核酸を精製（例えば、ビーズ系洗浄手順）して、続く工程に干渉し得る酵素と試薬を除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。
４つのプライマー反応と共に抑制ＰＣＲを用いて、プラットフォーム固有オリゴヌクレオチドアダプターと任意のバーコードを、フラグメント化され、標識された核酸に付加してもよい。結果として生じる２標識ライブラリーは、両方の標識を含むフラグメントについて濃縮されてもよい。一例では、４つのプライマー反応と共に抑制ＰＣＲを用いて、Roche454適合ライブラリー用の付加を行ってもよい。任意のバーコードを、上流ＰＣＲアダプターとトランスポゾンとの間に付加してもよい。他の一例では、４つのプライマー反応と共に抑制ＰＣＲを用いて、Illumina適合アダプターシークエンス（すなわち、ブリッジＰＣＲ適合アダプター；ｂＰＣＲ）を付加してもよい。任意のバーコードを、下流ＰＣＲアダプターと付加されたトランスポゾンとの間に付加してもよい。液滴アクチュエーターで、この工程は、（ｉ）サンプル液滴と、（ｉｉ）ＰＣＲ試薬とプラットフォーム固有プライマーカクテル（例えば、NexteraのIllumina適合プライマーカクテル、または、NexteraのRoche454適合プライマーカクテル）とを含む液滴とを、分配および混合する液滴操作を用いて達成されてもよい。増幅は、液滴アクチュエーターで反応液滴を温度制御ゾーンの間で限られた数のサイクル（例えば、約５〜約１３サイクル）で熱サイクルすることにより、行われてもよい。一例では、熱サイクル手順は、７２℃で３分間および９５℃で３０秒間、次いで９５℃で１０秒間、７２℃で３０秒間、および７２℃で３分間を１３サイクルの保温を含んでいてもよい。あるいは、核酸は、別の装置での増幅のために液滴アクチュエーターから除去されてもよい。
２標識ライブラリーを精製して（例えば、ビーズ系洗浄手順）、続くＰＣＲ増幅工程に干渉し得る、組み込まれなかったアダプターおよびバーコードを除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。濃縮された２標識ライブラリーは、例えば、Roche454プラットフォームでのエマルションＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）；IlluminaプラットフォームでのブリッジＰＣＲ（bPCR）；液滴アクチュエーター；または他の増幅方法を用いることにより、増幅されてもよい。
増幅されたライブラリーは、続いて、適切なプライマーを用いて配列決定されてもよい。他の実施形態では、２標識ライブラリーは、増幅および配列決定の前にサイズ選択（例えば、＞３００ｂｐサイズ）されてもよい。一例では、２標識ライブラリーは、ゲル電気泳動により液滴アクチュエーターで区分されてもよい。他の一例では、２標識ライブラリーは、Caliper社の微小流体チップ系自動サイズ選択プラットフォーム等の別の装置でのサイズ分離のために液滴アクチュエーターから除去されてもよい。
Illumina配列決定プラットフォーム用の標準配列決定ライブラリーは、ＰＣＲ増幅の使用なし（ＰＣＲフリー）で、結合バイアスを低減するために生み出された。同様の手法をトランスポザーゼ系ライブラリーに用いてもよい。一例では、フローセルブリッジＰＣＲプライマー（ｂＰＣＲ）シークエンスは、転位反応の間に加えられるアダプターに含められてもよい。転位後、ニックトランスレーション反応を行って、Illumina準備ライブラリーを生成してもよい。ＰＣＲフリーのトランスポザーゼ系ライブラリー構築手順は、核酸を配列決定準備フラグメントライブラリーに変換するのに必要な時間を実質的に削減する。
ＰＣＲフリーのトランスポザーゼ触媒ライブラリー構築用のデジタル微小流体手順は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい：核酸は、トランスポザーゼおよび遊離トランスポゾン末端（例えば、NexteraのTransposome（商標）錯体）を含むトランスポザーゼ酵素錯体を用いてフラグメント化および標識されてもよい。Illumina配列決定プラットフォームのために、トランスポソームアダプターシークエンスは、フローセルｂＰＣＲシークエンスおよび付加した配列決定プライマー部位を含んでいてもよい。トランスポゾン組み込みと鎖転移は、ターゲット核酸内でのねじれ型ｄｓＤＮＡ破壊を経て起こる。ターゲット核酸は、トランスポゾンシークエンスで５’末端で標識されてもよい。反応は、好ましくは５５℃で起こる。液滴アクチュエーターで、この工程は、（ｉ）サンプル液滴と、（ｉｉ）トランスポザーゼ酵素試薬と反応バッファーとを含む液滴とを、分配および混合する液滴操作を用いて達成され得る。ＤＮＡポリメラーゼをニックトランスレーション反応で用いて、フラグメンテーション反応と標識反応で生じた一本鎖ギャップを修復してもよい。液滴アクチュエーターで、この工程は、（ｉ）サンプル液滴と、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼと反応バッファー（例えば、Epicentre社から入手可能なFailSafe PCR Mater MixおよびDNAポリメラーゼ）とを含む液滴とを、混合する液滴操作を用いて達成され得る。ニックトランスレーション後、ＤＮＡを精製して（例えば、ビーズ系洗浄手順）、続く工程に干渉し得る酵素と試薬を除去してもよい。液滴アクチュエーターで、この洗浄工程は、本明細書に記載のように、ビーズ上に核酸を捕捉し、そして液滴系洗浄手順を実行することにより達成されてもよい。次いで、核酸はビーズから放出されてもよい。Illuminaプラットフォームでの増幅ブリッジＰＣＲ（ｂＰＣＲ）のための２標識ライブラリーを準備してもよい。増幅されたライブラリーは、続いて、適切なプライマーを用いて配列決定されてもよい。
デジタル微小流体ライブラリー構築手順は、メチシリン耐性スタフィロコッカスアウレウス（MRSA）からの278bp細菌ＤＮＡフラグメントを用いて評価した。ＤＮＡ末端修復（平滑末端化）、ＤＮＡフラグメントのdA-tail化、およびアダプター結合は、New England BioLabs社から入手可能なNEBnext DNA サンプル調製Master Mix セット１を用いて行った。そのセットは、NEBnext End Repair、dA-tailingおよびQuick Ligation モジュールを含む。ＤＮＡサンプル（278bpMRSA ＤＮＡの1，10，30，100，300，または1000ｎｇ）および試薬が、台上で調製され、続いて、液滴アクチュエーターの流体分配リザーバ内に装填された。その実験を４回行い、４つの別の液滴アクチュエーターで実行した。
NEBnext End Repair（２倍の酵素およびバッファー濃度）の希釈標準溶液を、End Repair反応バッファー（3μＬ）、End Repair酵素混合物（1.5μＬ）、0.5%Tween20（1.5μＬ）、および殺菌水（9μＬ）を混合し、最終体積15μＬとすることにより調製した。NEBnext dA-tailing（２倍の酵素およびバッファー濃度）の希釈標準溶液を、dA-tailing反応バッファー（3μＬ）、クレノウフラグメント（エキソ−）（1.8μＬ）、0.5%Tween20（1.5μＬ）、および殺菌水（8.7μＬ）を混合し、最終体積15μＬとすることにより調製した。NEBnext Quick Ligation（３倍の酵素およびバッファー濃度）の希釈標準溶液を、Quick Ligation反応バッファー（9μＬ）、Ｑｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（4.5μＬ）、および0.5％Tween20（1.5μＬ）を混合し、最終体積15μＬとすることにより調製した。磁気応答性ビーズ溶液を、300μＬのAgencourt AMPure XPビーズと3μＬの1％ Tween20とを混合することにより調製した。アダプターを、アダプターとＤＮＡのモル比が10：1で、0.1％ Tween20の最終濃度で調製した。アダプターの濃度をＤＮＡ濃度に応じて変化させた。
ＤＮＡサンプルを、278bpMRSA ＤＮＡ(上限２３μＬ)の1，10，30，100，300，または1000ｎｇ、Agencourt AMPure XPビーズ（1.2μＬ）、ビーズ結合バッファー（25μＬ）、5％Tween20（1μＬ）、および殺菌水を混合して、最終体積50μＬとすることにより調製した。ビーズおよびＤＮＡサンプルを、撹拌しながら室温で10分間保温した。
ＤＮＡサンプル（278bpMRSA ＤＮＡの1，10，30，100，300，または1000ｎｇ）および調製した試薬を、液滴アクチュエーターのリザーバに装填した。分配および処理工程の前に、各ＤＮＡサンプルを、単一工程のビーズ濃縮手順を用いてアクチュエーターで濃縮した。磁気応答性ビーズ上に結合したＤＮＡを有する磁気応答性ビーズを、サンプル分配リザーバ電極の下に位置する磁石を用いて固定した。上澄み液（約50μＬ）を液滴操作を用いて分離し、磁場により保持された固定されたビーズから離して輸送した。次いで、ＤＮＡを、１倍ＤＮＡサンプル液滴中で磁気応答性ビーズから溶離した。
ライブラリー結果（収率）を評価するために用いたデジタル微小流体手順は、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙での電気濡れ媒介液滴操作を用いて行われた以下の工程を含んでいた：１倍ＤＮＡサンプル液滴を、液滴操作を用いて１倍NEBnext End Repair液滴と混合し、２倍反応液滴を生じた。室温で３０分間保温した後、２倍反応液滴を、液滴操作を用いて、４倍磁気応答性ビーズ含有液滴と混合し、６倍ＤＮＡサンプル／ビーズ液滴を生じた。室温で１０分間保温した後、磁石を用いてビーズを固定し、６倍上澄み液を分離して０倍サンプル／ビーズ液滴を生じた。上澄み液を輸送して廃棄した。末端修復されたビーズを、１倍サンプル液滴中のビーズから溶離した。１倍末端修復されたＤＮＡサンプル液滴を、液滴操作を用いて１倍NEBnext A-tailing液滴と混合し、２倍反応液滴を生じた。約３７℃で３０分間保温した後、２倍反応液滴を、液滴操作を用いて４倍磁気応答性ビーズ含有液滴と混合し、６倍ＤＮＡサンプル／ビーズ液滴を生じた。室温で１０分間保温した後、磁石を用いてビーズを固定し、６倍上澄み液を分離して０倍サンプル／ビーズ液滴を生じた。上澄み液を輸送して廃棄した。A-tail化されたＤＮＡを、１倍サンプル液滴中のビーズから溶離した。１倍A-tail化されたＤＮＡサンプル液滴を、液滴操作を用いて１倍NEBnext Quick Ligation液滴および１倍アダプター液滴と混合し、３倍反応液滴を生じた。室温で３０分間保温した後、３倍反応液滴を、液滴操作を用いて２倍磁気応答性ビーズ含有液滴と混合し、５倍ＤＮＡサンプル／ビーズ液滴を生じた。室温で１０分間保温した後、磁石を用いてビーズを固定し、５倍上澄み液を分離して０倍サンプル／ビーズ液滴を生じた。上澄み液を輸送して廃棄した。ビーズを、液滴系ビーズ洗浄手順を用いて２倍洗浄バッファー液滴で３回洗浄した。アダプター結合ＤＮＡを、１倍サンプル液滴中のビーズから溶離した。１倍アダプター結合ＤＮＡサンプル液滴を、液滴操作を用いて液滴アクチュエーター上のサンプル回収リザーバまで輸送し、ライブラリー構築収率の決定のために液滴アクチュエーターから除去した。
表２に、アクチュエーターでのライブラリー構築手順のアガロースゲル分析から計算した収率の結果を示す。ゲル分析のために、ゲルにサンプルを装填する前に、9μＬの1，10，30，および100ｎｇの入力サンプル；5μＬの300ｎｇの入力サンプル；および1.5μＬの1000ｎｇ入力サンプルを、水を用いて10μＬに調整した。MRSA DNA（278bpフラグメント）が、0.9、9、27、90、および150ｎｇでゲルに装填され、標準として使用された。図２は、表２に示したライブラリー出力データを計算するために使用されたアガロースゲルの例示的な写真を示している。ライブラリーサンプルとＭＲＳＡ標準ＤＮＡは、以下の順番でアガロースゲルに装填された（左から右へ）：1ｎｇ入力サンプル、0.9ｎｇMRSA標準、10ｎｇ入力サンプル、9ｎｇMRSA標準、30ｎｇ入力サンプル、27ｎｇMRSA標準、100ｎｇ入力サンプル、90ｎｇMRSA標準、300ｎｇ入力サンプル、150ｎｇMRSA標準、および1000ｎｇ入力サンプル。
ゲル分析は、Image J ソフトウェアを用いて行い、ライブラリー出力を求めた。
ゲル分析は、Image J ソフトウェアを用いて行い、ライブラリー出力を求めた。
その実験を７つの別個の液滴アクチュエーターで追加で７回繰り返された。図３は、10，30，100，300，または1000ｎｇの278bpMRSA DNAを用いたアクチュエーターでのライブラリー構築手順の追加の７回の実行のアガロースゲル分析から計算した収率のプロットを示している。図３のデータを表３にまとめた。
液滴操作手順、反応生化学、および他のシステムパラメーターをさらに選択して、自動化デジタル微小流体ライブラリー構築手順の性能を向上し得る。生化学反応条件の選択は、例えば、各反応工程の性能評価により容易となり得る。
一の実施形態では、手順の各工程後のＤＮＡの定量的な修復または収率は、アクチュエーターで、組み込まれた放射性リン酸エステルまたは組み込まれたヌクレオチドに結合した蛍光標識のいずれかを用いて測定されてもよい。例えば、平滑末端化工程（図１の手順を参照）では、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼが、リン酸エステルを平滑末端化されたＤＮＡの５’−ヒドロキシ末端に付加する。キナーゼ反応バッファーの放射性標識されたＡＴＰ（γ−３２Ｐ ＡＴＰ）を用いることで、平滑末端化されたＤＮＡに付加した末端リン酸エステルは、放射性標識され、容易にモニターされ得る。同様に、A-tail化工程をモニターするため、ｄＡＴＰ中のγ−リン酸エステルは、放射性標識されてもよい。アダプターシークエンスの全てのヌクレオチドは、そのα−リン酸エステルで放射性標識されてもよく、アダプター結合工程は高感度で定量的にモニターされ得る。
他の実施形態では、アダプター結合シークエンス特性（例えば、分解がない）、バイアス（例えば、挿入サイズ、ＧＣ含有量）、および再現性が評価されてもよい。この例では、ライブラリー構築は、異なるサイズおよびＧＣ含有量のＤＮＡアンプリコンを用いて行われてもよい。アダプター結合シークエンスの特性は、処理されたフラグメントを回収し、市販のシークエンサーを用いてＤＮＡシークエンスを評価することにより、評価されてもよい。ライブラリー構築方法は、同じＤＮＡサンプルについて複数回手順を実行することにより再現性を評価されてもよい。液滴アクチュエーターの異なるリザーバ間のばらつきは、同じＤＮＡサンプルを異なるアクチュエーターリザーバに装填することで評価されてもよい。
保温時間、洗浄サイクル数、液滴輸送速度、および装填試薬体積等のデジタル微小流体操作パラメーターは、本開示の観点から当業者により選択されてもよい。台上のシステムに比べて、デジタル微小流体液滴システムでは、混合長さスケールと体積対表面積比が小さいため、液滴システムの保温時間は実質的に低減され得る。酵素反応についての実質的に減少した保温時間と自動化手順（即ち、わずかの時間の操作）との組み合わせにより、ライブラリー構築方法の全体時間は減少し得る。
７．２ 核酸精製
液滴アクチュエーターでのライブラリー構築の手順は、ビーズ系核酸精製工程を含んでいてもよい。ビーズは、磁気応答性であってもよいし、実質的に磁気応答性でなくともよい。一の実施形態では、本明細書に記載の酵素工程のいずれの後に、ビーズ系核酸精製工程を行ってもよい。核酸精製工程および浄化工程は、しばしば、ライブラリー構築手順における収率を制限する工程である。
液滴アクチュエーターでのライブラリー構築の手順は、ビーズ系核酸精製工程を含んでいてもよい。ビーズは、磁気応答性であってもよいし、実質的に磁気応答性でなくともよい。一の実施形態では、本明細書に記載の酵素工程のいずれの後に、ビーズ系核酸精製工程を行ってもよい。核酸精製工程および浄化工程は、しばしば、ライブラリー構築手順における収率を制限する工程である。
一例では、CHARGESWITCH（登録商標）PCR浄化ビーズ（Life TechnologyによりInvitrogen社から入手可能）等の電荷スイッチビーズを用いてもよい。CHARGESWITCH（登録商標）PCR浄化ビーズは、常磁性応答ビーズであり、ｐＨ５で通常９０ｂｐ〜４ｋｂｐの核酸を捕捉することができ、ｐＨ＞８で捕捉した核酸を放出することができる。一例では、デジタル微小流体ライブラリー構築手順の浄化工程でのCHARGESWITCH（登録商標）ビーズの使用は、ビーズから結合したＤＮＡを溶離するために用いる溶離バッファーの緩衝能およびｐＨを調整することにより選択してもよい。表４および５は、溶離バッファー組成と、洗浄回数との、核酸修復のパーセントでの効果を示している。バッファーのｐＨは、１２ＭのＨＣｌを用いて調整された。
溶離バッファー化学および洗浄回数を評価するために用いたデジタル微小流体手順は、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙での電気濡れ媒介液滴操作を用いて実行された以下の工程を含むものであった：48ｎｇの278bpMRSA dsDNA（138ｎｇ／μＬ）を含む350ｎＬ以下の液滴を、液滴操作を用いて、緩衝バッファー（ｐＨ５）中にCHARGESWITCH（登録商標）ビーズ（25ｍｇ／ｍＬ）を含む350ｎＬ以下の液滴と混合して、700ｎＬ以下の液滴を生じた。室温で１分間保温した後、その700ｎＬ以下の液滴を、700ｎＬ以下の洗浄バッファー液滴と混合し、磁石を用いてビーズを固定し、そして、液滴を分割してビーズ含有液滴と上澄み液滴とを生じた。複数の洗浄サイクル（２または６サイクル）を行った後に、CHARGESWITCH（登録商標）ビーズを、350ｎＬ以下の洗浄バッファー液滴中で再懸濁した。次いで、そのビーズ含有液滴を350ｎＬ以下の溶離バッファー液滴と混合して、700ｎＬ以下の溶離液滴を生じた。２分間の保温後、CHARGESWITCH（登録商標）ビーズを永久磁石の磁場内に固定し、その700ｎＬ以下の溶離液滴をビーズから離してアクチュエーターのリザーバ内に輸送した。その700ｎＬ以下の溶離液滴を、リザーバから戻し、水を用いて10μＬ体積に調整した。もしＤＮＡの修復が100％だったならば、qPCR検査へのＤＮＡの入力は、4.8ｐｇのはずである。CHARGESWITCH（登録商標）ビーズを液滴アクチュエーターから戻し、台上で２０μＬ溶離バッファーを用いた別の溶離を行い、液滴アクチュエーターで溶離しなかったいずれのＤＮＡも溶離させた。定量的なＰＣＲ（ｑＰＣＲ）検査を行い、ＤＮＡの修復を評価した。サンプルを１００倍、１０，０００倍および１００，０００倍に希釈した。各サンプルの5μＬを50μＬのｑＰＣＲ検査で分析した。サンプルは、278MRSAアンプリコンの標準曲線に対して分析した。ＤＮＡ修復の効率が100％であったならば、ｑＰＣＲ検査への入力ＤＮＡは、240ｐｇ、2.4ｐｇおよび240ｆｇ（それぞれ、100倍、10,000倍および100,000倍希釈溶液）のはずである。
図４は、台上および液滴アクチュエーターでの溶離工程および核酸浄化工程の実施の比較のプロット４００を示している。台上および液滴アクチュエーターで行われた完全な対末端ライブラリー構築手順での溶離条件を用いた。データは、台上と液滴アクチュエーターでの溶離が比較可能であることを示している。
図５Ａ〜５Ｍは、液滴アクチュエーターの電極配列５００の一部の一例の平面図を表し、ライブラリーの構築用の核酸調製方法を示している。図５Ａ〜５Ｍの方法は、ライブラリー構築手順の一例であり、当該一例で核酸は、磁気応答性ビーズに固定され、可動式の磁石と、一連の混合操作および分割操作とを用いて、ライブラリー構築手順の各工程間で核酸が精製される。
電極配列５００は、液滴操作電極５１０（例えば、電気濡れ電極）の配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上または液滴操作間隙内の液滴操作電極５１０により行われる。ビーズ固定ゾーン５１２は、電極配列５００と結合していてもよい。可動式磁石５１４は、ビーズ固定ゾーン５１２にそろっていてもよく、そしてビーズ固定ゾーン５１２に向けてまたはビーズ固定ゾーン５１２から移動されてもよい。磁石５１４は、磁気応答性ビーズを、液滴操作の間、保持するために用いてもよい。特に、磁石５１４は、少なくとも１つの液滴操作電極５１０、および任意に他の電極もが、磁場内にあるように配置されてもよい。磁石５１４は、例えば、永久磁石または電磁石であってもよい。
サンプル液滴５１６は、液滴操作電極５１０に沿った液滴操作を用いて輸送されてもよい。サンプル液滴５１６は、例えば、２倍液滴であってもよい。２倍液滴は、液滴操作間隙での専有面積が、１つの液滴操作電極５１０の領域の約２倍であることを意味する。サンプル液滴５１６は、核酸ライブラリー構築のために処理される核酸５１８を含んでいてもよい。一の実施形態では、核酸サンプルはせん断されてもよく、そしてせん断された核酸は、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙に装填されてもよい。核酸は、例えば、流体力学的せん断もしくは機械的な力によりランダムにフラグメント化されてもよく、または酵素消化によってフラグメント化されてもよい。他の実施形態では、核酸等の核酸サンプルは、液滴アクチュエーターでランダムにフラグメント化されてもよい。一例では、低周波電流を用いて、サンプル液滴中の核酸がせん断されるようにサンプル液滴を撹拌してもよい。他の例では、液滴は、交互に膨張と収縮をさせられて、液滴内に、核酸をせん断するのに十分な流体パターンを形成してもよい。他の例では、低周波電流の適用と、液滴の交互の膨張および収縮とを用いて、核酸をせん断してもよい。アクチュエーターでの核酸のせん断を制御して、予測可能なサイズ範囲のフラグメントを与えてもよい。せん断された核酸５１８は、核酸フラグメントライブラリーの構築のための処理の前にサイズ選択をされてもよい。一例では、せん断された核酸５１８は、ゲル電気泳動により分離されてもよい。液滴アクチュエーターでのライブラリー構築用にせん断された核酸を調製する方法の一例は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。
図５Ａは、ビーズ固定ゾーン５１２と磁石５１４とから離れて電極通路５１０に位置しているサンプル液滴５１６を示している。磁石５１４は、例えば、液滴アクチュエーターが取り付けられている装置上に位置していてもよく、液滴アクチュエーターそれ自体に取り付けられていてもよく、液滴操作間隙内に位置していてもよく、または本明細書に記載のような液滴系ビーズ洗浄手順の実行の間に液滴内のビーズを固定可能ないずれの位置にあってもよい。図５Ｂおよび５Ｃは、保温方法を示しており、当該方法では、試薬液滴５２０が液滴操作を用いてサンプル液滴５１６と混合される。図に示したように、試薬液滴５２０は、その専有面積が、ほぼ１つの液滴操作電極５１０の面積であることを意味する１倍液滴（例えば、約250〜約500ｎＬ）である。図５Ｃでは、混合されたサンプル液滴５１６は、いまや３倍液滴である。３倍液滴は、その専有面積が１つの液滴操作電極５１０の領域の約３倍であることを意味する。試薬液滴５２０は、平滑末端化試薬等の酵素を含んでいてもよい。混合された液滴５１６は、核酸フラグメントの平滑末端化を促進するため選択された温度および時間等、必要な温度および必要な時間保温され、所望の反応が達成される。
図５Ｄおよび５Ｅは、核酸の捕捉を表している。核酸または所定の核酸のサブセットを捕捉するように選択された磁気応答性ビーズ５２４を含む１倍試薬液滴５２２が、電極５１４により制御される液滴操作を用いて３倍混合サンプル液滴５１６と混合される。混合されたサンプル液滴５１６は、いまや４倍サンプル液滴である。４倍サンプル液滴は、その専有面積が１つの液滴操作電極５１０の領域の約４倍であることを意味する。混合されたサンプル液滴５１６は、所望の核酸フラグメントが磁気応答性ビーズ５２４と結合するのに十分な期間、室温で保温される。
図５Ｆ、５Ｇおよび５Ｈは、ビーズ洗浄方法を示しており、当該方法では、磁気応答性ビーズ５２４および当該ビーズに結合した核酸５１８を有する４倍混合サンプル液滴５１６が、電極通路５１０に沿った液滴操作を用いて、ビーズ固定ゾーン５１２に輸送される。磁石５１４は、４倍混合サンプル液滴５１６が、磁石５１４の磁場内に位置するように、ビーズ固定ゾーン５１２内の位置に移動される。磁気応答性ビーズ５２４は、磁石５１４の磁場により、固定され、あるいは拘束され、または実質的に固定される。２倍上澄み液滴５２６が、液滴操作を用いて分割され、２倍混合サンプル液滴を形成する。当該２倍混合サンプル液滴は、磁石５１４の磁場内にある液滴操作電極５１０で保持される。これは、５つの下部電極を活性化して液滴を５つの電極にわたって伸長し、次いで、中央の電極を非活性化することにより達成され得る。実質的に全ての磁気応答性ビーズが伸長された液滴の一端に配置され、その後の分割で、その磁気応答性ビーズが１つの娘液滴に一緒に残るように、その５つの電極が、磁石と相対的に配置されてもよい。他の娘液滴は、実質的に上澄み液滴からなり、遠ざけられてもよい。同様の操作を他の液滴サイズの分割に用いてもよく、例えば、４倍液滴の下部の４つの電極の３番目を非活性化して、１つの１倍液滴および１つの３倍液滴を生成し、その１倍液滴または３倍液滴のいずれかに磁気応答性ビーズが保持される。図５Ｇでは、２倍洗浄バッファー液滴５２８が、液滴操作電極５１０に沿って輸送され、液滴操作を用いて２倍混合サンプル液滴５１６と混合され、４倍混合サンプル／洗浄液滴５１６を形成する。混合されたサンプル／洗浄液滴５１６は、液滴操作を用いて２つの液滴（例えば、２倍／２倍または１倍／３倍）に分割されてもよく：１つの液滴がその液滴中に磁気応答性ビーズ５２４を有し、１つの液滴は実質的に磁気応答性ビーズ５２４を有しないもの（例えば、上澄み液滴）であってもよい。図５Ｆ、５Ｇおよび５Ｈに示された工程は、十分な精製の程度が達成されるまで複数回（例えば、６回）繰り返されてもよい。図５Ｉは、任意の工程を示しており、当該工程では、１倍上澄み液滴５２６が液滴操作を用いて２倍液滴から分割され、１倍サンプル液滴５１６を形成し、当該１倍サンプル液滴５１６は、磁石５１４の磁場内にある液滴操作電極５１０に保持される。これは、２倍液滴を３つの下部電極に沿って伸長し、当該液滴を伸長し、次いで、中央の電極を非活性化することにより達成され得る。実質的に全ての磁気応答性ビーズが伸長された液滴の一端に配置され、その後の分割で、その磁気応答性ビーズが１つの娘液滴に一緒に残るように、その３つの電極は、磁石と相対的に配置されてもよい。他の娘液滴は、実質的に上澄み液滴からなり、遠ざけられてもよい。
図５Ｊおよび５Ｋは、保温方法を示しており、当該方法では、１倍溶離バッファー液滴５３０が、液滴操作を用いて１倍サンプル液滴５１６と混合される。磁石５１４は、ビーズ固定ゾーン５１２から離れて移動される。磁気応答性ビーズ５２４および溶離した核酸５１８をその中に有するサンプル液滴５１６は、液滴操作を用いて、磁石５１４の磁場内にある液滴操作電極５１０から離れて輸送され、ビーズ固定ゾーン５１２から離れる。１倍溶離バッファー液滴５３０は、液滴操作を用いてサンプル液滴５１６と混合され、２倍混合サンプル／溶離液滴を形成する。混合されたサンプル／溶離液滴５１６は、磁気応答性ビーズ５２４から結合した核酸５１８が溶離するのに十分な期間（例えば、約１分）、室温で保温される。
図５Ｌは、磁気応答性ビーズ５２４と、結合した核酸５１８とをその中に有する２倍混合サンプル／溶離液滴５１６を示しており、当該液滴は、液滴操作を用いて磁石５１４の磁場内にある液滴操作電極５１０に（すなわち、ビーズ固定ゾーン５１２に）輸送される。磁石５１４は、２倍混合サンプル／溶離液滴５１６が磁石５１４の磁場内にあるように、ビーズ固定ゾーン５１２内の位置に移動される。磁気応答性ビーズ５２４は、磁石５１４の磁場により固定される。
図５Ｍは、２倍サンプル液滴５１６を示しており、当該液滴は、液滴操作を用いて分割された実質的に全ての平滑末端化された核酸５１８を含み（すなわち、全てのビーズがスナップオフされた）、磁石５１４の磁場内にある液滴操作電極５１０から離れて輸送され、磁石５１４から離れている。磁気応答性ビーズ５２４は、磁石５１４の磁場により、磁石５１４の磁場内にある少なくとも１つの液滴操作電極５１０上に固定されたままである。平滑末端化された核酸５１８を含むサンプル液滴５１６は、さらなる処理、すなわち、Ａ−ｔａｉｌ化およびアダプター結合のために輸送されてもよい。他の液滴が輸送され、残ったビーズに接触し得る。当該ビーズは、通常当該ビーズを囲む少量の液体を有する；前記液滴は、この少量の液体と混合し、ビーズは輸送され得る。任意に、この操作の間、ビーズを輸送するために、磁石は、非活性化または離れて移動されてもよい。
図５Ｂ〜５Ｍに示される工程は、ライブラリー構築手順の、Ａ−ｔａｉｌ化およびアダプター結合等の次の処理反応のために繰り返されてもよい。図５Ｂおよび５Ｃに関して、実質的に全ての平滑末端化された核酸５１８を含む２倍サンプル液滴５１６は、液滴操作を用いて第２の１倍試薬液滴５２０と混合され、３倍混合サンプル液滴を形成する。この工程では、試薬液滴５２０は、Ａ−ｔａｉｌ化反応のための酵素および反応成分を含む。混合サンプル液滴５１６の保温は、３７℃で約３０分間行われる。混合サンプル液滴５１６は、図５Ｄ〜５Ｍに関して記載したように処理（すなわち、酵素およびビーズ保温ならびにビーズ洗浄）されてもよい。Ａ−ｔａｉｌ化された核酸５１８を含むサンプル液滴５１６は、さらなる処理、すなわち、アダプター結合のために輸送されてもよい。
図５Ｂおよび５Ｃに関して、実質的に全てのＡ−ｔａｉｌ化された核酸５１８を含む２倍サンプル液滴５１６は、液滴操作を用いて第３の１倍試薬液滴５２０と混合され、３倍混合サンプル液滴を形成する。この工程では、試薬液滴５２０は、アダプター結合のための酵素および反応成分を含む。混合サンプル液滴５１６の保温は、室温で約５分〜約３０分間行われる。混合サンプル液滴５１６は、図５Ｄ〜５Ｍに関して記載したように処理（すなわち、酵素およびビーズ保温ならびにビーズ洗浄）されてもよい。実質的に全てのアダプター結合核酸５１８を含むサンプル液滴５１６は、さらなる処理のために輸送されてもよい。一例では、サンプル液滴５１６の核酸５１８は、ＰＣＲにより増幅されてもよい。用いられるＰＣＲ増幅サイクルの数は、十分に制限されて（例えば、約８〜１５サイクル）、増幅手順のシークエンスバイアスを最小化してもよい。他の例では、サンプル液滴５１６の核酸５１８は、続く定量ＰＣＲおよびゲル電気泳動による分析のために、そして、いくつかの実施形態では、次世代配列決定方法への入力用の回収のために、出力リザーバに輸送されてもよい。
一の実施形態では、充填流体または液滴に、染料を添加して、液滴アクチュエーターの液滴操作間隙からの除去のために液滴の可視化を容易にしてもよい。一の実施形態では、処理されたサンプル液滴は、液滴アクチュエーターの開口部を通じて液滴操作間隙から除去され、斯かる開口部は、ガスケットの開口部を経た流体通路のように、頂部基板、底部基板、または当該２つの基板の間にあってもよい。
一の実施形態では、本発明のライブラリー作製手順は、第１のｐＨで核酸に結合し、第２のｐＨで核酸を溶離し得るビーズを利用してもよい。例えば、本発明のライブラリー作製手順のいずれかの酵素工程から出力される第１の液滴は、第１のｐＨで核酸に結合し得るビーズを含む第２の液滴と混合され、核酸がビーズに捕捉された混合された第３の液滴を生成してもよい。必要に応じて、１つ以上の追加の液滴が、第３の液滴と混合され、ビーズ上の核酸の捕捉を確実にしてもよい。第３の液滴は、次いで、液滴系ビーズ洗浄手順にかけられてもよい。洗浄液滴は、第３の液滴と混合されてもよく；あるいは、第３の液滴は、洗浄液滴の導入の前に分割され、ビーズ含有液滴と上澄み液滴とを生成してもよく；そして洗浄液滴は、ビーズ含有液滴と混合されてもよい。いずれの場合でも、ビーズは固定されてもよく、混合された液滴は、分割され、上澄み液滴とビーズ含有液滴とを生成してもよい。ビーズ含有液滴は、好適には全てのまたは実質的に全てのビーズを含む。必要に応じて、混合−固定および分割技術は、繰り返され、好適には当該方法で全てのまたは実質的に全てのビーズを保持しながら、生成するビーズ含有液滴の異物の所望の低減が達成されてもよい。洗浄液滴は、ビーズに核酸を保持するのに好ましいｐＨを有するバッファーを含んでいてもよい。洗浄後、洗浄されたビーズを含む液滴は、液滴操作を用いて、ビーズから核酸を溶離するために選択したｐＨを有する１つ以上の液滴と混合されてもよい。ビーズは拘束され、拘束されたビーズから液滴を離して輸送することにより、囲んでいる上澄み液がビーズから引き離されてもよい。別の実施形態では、この方法を用いて、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、巨大分子、または小さな分子等の他の目的とする分子が分離されてもよい。重要なことに、発明者らは、この方法がオイルに囲まれた液滴を用いて効果的に実行され得ることを見出した。一の実施形態では、当該方法を達成するために必要な液滴操作の一部または全てが、電気濡れ媒介液滴操作を用いて達成される。物理的バリアもしくは障害物を用いて、ビーズを拘束してもよく、および／または、磁石を用いて、ビーズを拘束して、磁気応答性ビーズを拘束してもよい。この方法への使用に好適なビーズの例は、Bakerによる２００５年７月５日に発行された題名「Isolation of nucleic acids」の米国特許第6,914,137号に記載されており、斯かるビーズの組成、ならびに、斯かるビーズを用いてＤＮＡ等の物質を捕捉および溶離するための条件に関する教示が、参照して援用される。上述したCHARGESWITCH（登録商標）ビーズが斯かるビーズの一例である。
他の実施形態では、本発明の核酸精製技術は、精製のための核酸を含む液滴と、可逆的な方法で核酸分子を吸収（例えば、非共有結合）するビーズを含む液滴と混合する工程を含む。斯かるビーズの例は、McKernanらによる２００３年３月１８日に特許付与された題名「Solid phase technique for selectively isolating nucleic acids」の米国特許第6,534,262号に記載されたビーズを含み、核酸を捕捉するためのビーズ（当該特許では粒子といわれている）および斯かるビーズから核酸を溶離するための化学に関する開示を参照してその開示全体を本明細書に援用する。例えば、SPRI（登録商標）ビーズ（Agencourt Nioscience社から入手可能）等の固相可逆固定ビーズを用いてもよい。SPRI（登録商標）ビーズは、コア−シェル方法を用いて構成され、当該方法は、ポリスチレンコアから始まり、ポリスチレンコアがはじめにマグネタイト（鉄）の層で被覆され、次いで最終的にカルボキシル官能基を含むポリマー層でカプセル化される。一の実施形態では、SPRI（登録商標）ビーズは、約０．０１〜約０．１％Tween-20を含むバッファー液滴、または約０．０１〜約０．１％Tween-20を含むＴＥバッファー、または約０．０１〜約０．１％Tween-20を含むトリスバッファーで供給されてもよい。これらのバッファーは、SPRI（登録商標）ビーズを洗浄するのに用いられてもよい。SPRI（登録商標）ビーズは、（Ｉ）（ｉ）リザーバ内で動き回る試薬液滴の移動、（ｉｉ）リザーバからの試薬液滴の出入り、もしくは（ｉｉｉ）外部のリザーバから液滴操作間隙に延びる流体通路を通じての前後の試薬液滴の輸送、を生じる電気濡れ電極の活性化および非活性化等により、リザーバ内で定期的に混合して懸濁に保たれてもよく、または、（II)液滴を少なくとも部分的に流体通路に入れる毛管力、および、流体通路から液滴を引っ張り出す電気濡れ力を用いる等、流体通路の内外に輸送されてもよい。
本発明のライブラリー構築手順は、当該手順における各精製工程での一貫した、そして効率的な核酸の修復を提供する。一の実施形態では、核酸は、磁気応答性ビーズに固定され、可動式の磁石と、一連の混合および分割操作とが、ライブラリー構築手順の各工程間の核酸の精製に用いられる。他の実施形態では、核酸は、磁気応答性ビーズ（例えば、SPRI（登録商標）ビーズ）に固定され、磁石と、アルコール洗浄液滴を用いた一連の液滴混合および分割洗浄工程とが、ライブラリー構築手順の各工程間の核酸の精製に用いられる。有機洗浄液滴は、約１〜約１００％、または約１０〜約９０％、または約３０〜約８０％、または約５０〜約７５％の何らかの極性プロトン性溶媒を含んでいてもよく、残りは水および本明細書に記載のような界面活性剤を含む他の物質でもよい。一の実施形態では、液滴の溶媒部分は、アルコールおよび／またはカルボン酸である。他の実施形態では、溶媒は、１〜８の炭素、または１〜６の炭素を有するアルコールおよび／またはカルボン酸である。アルコールおよび／またはカルボン酸は、環状、直線状、または分岐状であってもよい。例は、ヘキサノール、ペンタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸を含む。
洗浄液滴は、少なくとも約５０％ｖ／ｖ、６０％ｖ／ｖ、または８０％ｖ／ｖのアルコールを含んでいてもよい。アルコールは、例えば、１〜８の炭素、または１〜６の炭素を有していてもよい。アルコールは、環状、直線状、または分岐状であってもよい。好適なアルコールの例は、ヘキサノール、ペンタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、およびメタノールを含む。
洗浄液滴は、約０．０１〜約１％ｖ／ｖの界面活性剤、約０．０１〜約０．１％ｖ／ｖの界面活性剤を含んでいてもよい。好適な界面活性剤は、胆汁塩等のアニオン性界面活性剤；四級アンモニウム塩等のカチオン性界面活性剤；アルカノイル−Ｎ−ヒドロキシエチルグルカミド、アルカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、アルキルグリコシド、シクロアルカノイルヒドロキシエチルグルカミド、シクロアルキルグリコシド、ポリオキシエチレン等の非イオン性界面活性剤；およびアルキルベタイン、アルキルホスホコリン、アルキルスルホベタイン、シクロアルキルホスホコリン、ホスホエタノールアミン、非洗浄スルホベタイン、スルホベタイン等の双性イオン界面活性剤を含む。ポリソルベート界面活性剤が好ましい。
洗浄液滴は、任意に、無機塩および／または有機塩等の１つ以上の塩を含んでいてもよい。１つ以上の塩は、例えば、１つ以上の、アルミニウム、アンモニウム、バリウム、ベリリウム、カルシウム、セシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ルビジウム、ナトリウム、またはストロンチウム、の塩を含む。１つ以上の塩は、例えば、１つ以上の、クロリド、フルオリド、オキシド、オキソアニオン、炭酸塩、重炭酸塩、ヒドロキシド、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩を含む。１つ以上の塩は、液滴アクチュエーターでの洗浄液滴としての使用に対する洗浄液滴溶液の適合性を害さない限り、いかなる濃度の洗浄液滴溶液で供給されてもよい。例えば、１つ以上の塩は、約０．００１〜約１００ｍＭ、または約０．００１〜約１０ｍＭ、または約０．００１〜約１ｍＭの範囲の濃度の洗浄液滴溶液で供給されてもよい。
図６は、核酸ライブラリー作製方法６００のフローチャートを表し、当該方法は、磁気応答性ビーズ（例えば、SPRI（登録商標）ビーズ）およびアルコール系ビーズ洗浄手順を用いる手順に応じて、反応液滴体積での単位サイズ化された液滴の数は、異なっていてもよい。せん断された核酸サンプル（例えば、２０〜５０μＬ）は、液滴アクチュエーターのサンプル入力リザーバに装填されてもよい。核酸サンプルは、処理の前にアクチュエーターで濃縮されてもよい。サンプル濃縮は、例えば、リザーバ内濃縮（in-reservoir concentration）手順または一連の分配濃縮（serial dispensing concentration）手順を用いて行われてもよい。
２倍サンプル液滴は、分配され、液滴操作を用いて１倍試薬液滴（例えば、３００ｎＬ／サンプル）と混合され、３倍混合サンプル液滴を生成してもよく、当該１倍試薬液滴は、せん断された核酸フラグメントの平滑末端化のための酵素（例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ）および試薬を含む。いくつかの実施形態では、この工程で、ポリヌクレオチドキナーゼおよび試薬が、反応液滴に含まれてもよい。混合３倍サンプル液滴は、平滑末端化反応が完了するのに十分な期間、例えば、約３０分、室温で保温されてもよい。平滑末端化された核酸は、図７を参照して記載したように、捕捉され（５倍サンプル／SPRI（登録商標）ビーズ液滴）、洗浄され（０倍サンプル／ビーズ液滴）、および溶離（２倍溶離サンプル液滴）されてもよい。
実質的に全ての平滑末端化された核酸を含む２倍溶離サンプル液滴は、液滴操作を用いて第２の１倍試薬液滴（３００ｎＬ／サンプル）と混合されて、３倍混合サンプル液滴を形成してもよい。この工程では、１倍試薬液滴は、Ａ−ｔａｉｌ化反応のための酵素および反応（３倍バッファーおよび酵素）成分を含む。混合サンプル液滴の保温は、約３７℃で約３０分間行われてもよい。処理された核酸は、図７を参照して記載したように、捕捉され（５倍サンプル／SPRI（登録商標）ビーズ液滴）、洗浄され（０倍サンプル／ビーズ液滴）、および溶離（２倍溶離サンプル液滴）されてもよい。
実質的に全てのＡ−ｔａｉｌ化された核酸を含む２倍溶離サンプル液滴は、液滴操作を用いて第３の１倍試薬液滴と混合されて、３倍混合サンプル液滴を形成する。この工程では、１倍試薬液滴（３００ｎＬ／サンプル以下）は、アダプター結合のための酵素および反応成分（例えば、アダプター、リガーゼ、およびリガーゼバッファー）を含む。３倍混合サンプル液滴の保温は、室温で約５〜約３０分間行われてもよい。処理された核酸は、図７を参照して記載したように、捕捉され（５倍サンプル／SPRI（登録商標）ビーズ液滴）、洗浄され（０倍サンプル／ビーズ液滴）、および溶離（２倍溶離サンプル液滴）されてもよい。
一の実施形態では、実質的に全ての処理された核酸を含む２倍溶離サンプル液滴は、液滴操作を用いて、サンプル回収および除去リザーバに輸送されてもよい。２倍溶離サンプル液滴は、サンプル回収および除去リザーバに約４〜約１０℃で保管されてもよい。他の実施形態では、処理された核酸（例えば、アダプター結合ＤＮＡ）は、サンプル回収および除去リザーバへのサンプル液滴の輸送前に、ＰＣＲ（例えば、１０〜１５サイクル）を用いて増幅されてもよい。
図７は、ビーズ系洗浄／溶離方法７００のフローチャートを表している。３倍液滴（例えば、その中に核酸を含む３倍サンプル液滴）は、液滴操作を用いて、磁気応答性ビーズ（例えば、SPRI（登録商標）ビーズ）を含む２倍試薬液滴と混合され、５倍混合サンプル／ビーズ液滴を生成してもよい。混合サンプル／ビーズ液滴は、核酸フラグメントが磁気応答性ビーズに結合するのに十分な期間（例えば、約５分）、室温で保温されてもよい。５倍混合サンプル／ビーズ液滴は、ビーズ洗浄手順を用いて洗浄されてもよいが、液滴操作を用いて５倍上澄み液滴が分割され、０倍サンプル／ビーズ液滴（すなわち、核酸に結合したビーズ）を生成することは除く。２倍洗浄液滴（すなわち、エタノール）は、液滴操作を用いて液滴操作電極に沿って輸送され、結合した核酸を有する０倍サンプル／ビーズ液滴を通過してもよい。２倍溶離バッファー液滴（例えば、水液滴）は、液滴操作を用いて輸送され、洗浄０倍サンプル／ビーズ液滴と混合され、２倍溶離バッファー液滴を生成してもよい。溶離バッファー液滴は、磁気応答性ビーズから結合した核酸を溶離するのに十分な期間（例えば、約１分）、室温で保温されてもよい。実質的に全ての分割された核酸（すなわち、全てのスナップオフビーズ）を含む２倍溶離サンプル液滴。核酸を含む２倍溶離サンプル液滴は、さらなる処理、すなわち、ライブラリー構築手順でのＡ−ｔａｉｌ化反応およびアダプター結合のために輸送されてもよい。
本発明の方法は、さらに応用して、大（例えば、約４００ｂｐ〜約１０ｋｂｐ）小（例えば、約２００ｂｐ）の核酸ライブラリーの全自動化構築を提供してもよい。一の実施形態では、本発明の方法は、応用して、液滴アクチュエーターでの核酸、すなわち、ＲＮＡまたはＤＮＡの自動フラグメンテーションを含んでもよい。一例では、本発明の方法は、応用して、ＲＮＡ系ライブラリー用のＲＮＡのフラグメンテーションおよび逆転写を含んでもよい。この例では、核酸フラグメンテーションは、バッファー系フラグメンテーションを用いて行われてもよい。他の例では、核酸のフラグメンテーション（例えば、細菌性または真核性）は、酵素系フラグメンテーション反応を用いて行われてもよい。例えば、NEBNext（商標）dsDNA Fragmentase（商標）等のフラグメンターゼを用いて時間依存手法によりdsDNA破壊を生じさせ、約１００〜８００ｂｐのＤＮＡフラグメントを生成してもよい。NEBNext dsDNA Fragmentaseは、２つの酵素を含み、一方の酵素は、dsDNAにランダムに切れ目を生じさせ、他方の酵素は、切れ目部位を認識し、その切れ目から反対のＤＮＡ鎖を切って、dsDNA破壊を作り出す。他の例では、NexteraのTransposome（商標）技術等のトランスポザーゼを用いてdsDNA破壊を生じさせてもよい。Transposome（商標）錯体は、遊離トランスポゾン末端およびトランスポザーゼを含む。当該錯体をdsDNAと共に保温すると、当該ＤＮＡは、フラグメント化され、トランスポゾン末端オリゴヌクレオチドの転移鎖は、ＤＮＡフラグメントの５’末端に共有結合する。Transposome錯体の濃度を変えることにより、フラグメント化され、標識されたＤＮＡライブラリーのサイズ分布が制御されてもよい。サンプル液滴は、液滴操作間隙でフラグメンテーション試薬を含む液滴と混合されてもよく、生成する液滴は、保温されてフラグメント化された核酸を生成してもよい。必要な液滴操作は、充填流体中で行われてもよい。
他の実施形態では、本発明の方法は、入力核酸（未処理サンプル）および出力核酸（処理サンプル）の定量化を含むように適応してもよい。一例では、ｑＰＣＲを用いて各処理ライブラリーサンプルのＤＮＡ濃度を決定してもよい。ｑＰＣＲデータを用いて、各処理サンプルは、そのまま、またはアクチュエーターでの希釈手順を用いて希釈されて、またはアクチュエーターでのＰＣＲ手順を用いてさらに増幅されて、サンプルの貯蔵前に適切な濃度範囲を達成してもよい。
他の実施形態では、本発明の方法は、構築されたライブラリーの品質保証テストを提供するように適応してもよい。一例では、TaqManまたはMolecular Beacon等のプローブ系ハイブリダイゼーション分析を用いて、完了したライブラリーの質を検証してもよい。TaqManおよびMolecular Beaconプローブは、リアルタイムまたはＰＣＲ分析の完了点で用いられてもよい。
デジタル微小流体の柔軟性とプログラム可能性のため、本発明のライブラリー構築手順は、多数の異なる次世代配列決定プラットフォームでの使用に容易に適応され得る。次世代配列決定プラットフォームの例は、これらに限定されないが、Illumina、454、SOLiD、PacBioおよびIon Torrentを含む。
図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃは、液滴アクチュエーターの電極配列８００の一部の一例の平面図を表し、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、ビーズをスナップオフする方法を示す。電極配列８００は、液滴操作電極８１０（例えば、電気濡れ電極）の配列を含んでいてもよい。
液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極８１０頂部で行われる。一例では、電極配列８００は、液滴操作電極８１０Ａ、８１０Ｂ、８１０Ｃ、８１０Ｄ、８１０Ｅ、および８１０Ｆを含み、これらの電極は、一直線にまたは通路で配置されている。さらに、磁石８１２は、例えば、液滴操作電極８１０Ａがその磁場内にあるように位置している。磁石８１２は、永久磁石または電磁石であってもよい。
本発明のビーズをスナップオフする方法の一態様では、液滴の専有面積よりも大きい電気濡れ表面領域を使用し、このことが、可能な限り最小量の液体でビーズを留置することの鍵となる。一例では、液滴が１倍液滴のとき、ビーズをスナップオフする方法で使用される電気濡れ表面領域は、２倍である。他の例では、液滴が２倍液滴のとき、ビーズをスナップオフする方法で使用される電気濡れ表面領域は、３倍である。他の例では、液滴が３倍液滴のとき、ビーズをスナップオフする方法で使用される電気濡れ表面領域は、４倍、等である。例として、図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃは、３倍電気濡れ表面領域を用いて、２倍液滴からビーズがスナップオフされるシナリオを示している。この例では、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、ビーズをスナップオフする方法は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。
図８Ａに関して、この工程では、一定量の磁気応答性ビーズ８１６を含む２倍液滴８１４は、液滴操作電極８１０Ａおよび８１０Ｂの頂部に位置している。これは、この工程では、液滴操作電極８１０Ａおよび８１０Ｂがオンになっていて、一方、液滴操作電極８１０Ｃ、８１０Ｄ、８１０Ｅ、および８１０Ｆがオフになっているからである。液滴操作電極８１０Ａが磁石８１２の磁場内にあるため、２倍液滴８１４内にある磁気応答性ビーズ８１６は、液滴操作電極８１０Ａに引き付けられる。
図８Ｂに関して、この工程では、液滴操作電極８１０Ａ、８１０Ｅおよび８１０Ｆがオフになっていて、一方、液滴操作電極８１０Ｂ、８１０Ｃおよび８１０Ｄがオンになっている。これが、２倍液滴８１４に３つの液滴操作電極８１０にわたって伸びさせる。この伸びた２倍液滴８１４の末端が、磁石８１２のほぼ端にあり、まだ磁気応答性ビーズ８１６を保持している。磁石８１２の磁場のため、磁気応答性ビーズ８１６は、この伸びた２倍液滴８１４の末端に保持される。２倍液滴８１４が３倍電気濡れ表面領域である３つの液滴操作電極にわたって伸びる動作は、２倍液滴８１４の末端にやや尖った形状をとらせる。事実上、磁気応答性ビーズ８１６を保持したまま、磁石８１２の端から液体を引きはがす。
図８Ｃに関して、この工程では、液滴操作電極８１０Ａ、８１０Ｂおよび８１０Ｆがオフになっていて、一方、液滴操作電極８１０Ｃ、８１０Ｄおよび８１０Ｅがオンになっている。これが、２倍液滴８１４に、３倍電気濡れ表面領域にわたって伸ばされながら、磁石８１２からさらに離れる移動を引き起こしている。これが、磁気応答性ビーズ８１６に、可能な限り最小量の液体でビーズを留置しながら、磁石８１２のほぼ端にスナップオフされることを引き起こしている。未だ３倍電気濡れ表面領域にわたって伸ばされている２倍液滴８１４は、実質的にビーズがない。
液滴マイクロアクチュエーターでのライブラリー作製化学ワークにおける重要な挑戦は、有機溶媒洗浄液滴を用いた液滴操作を行うことに対する特有な要求を伴う。様々な実施形態では、有機洗浄液滴は、約１〜約１００％、または約１０〜約９０％、または約３０〜約８０％、または約５０〜約７５％の何らかの極性プロトン性溶媒で構成され、残りは水および本明細書に記載のような界面活性剤を含む他の物質であってもよい。一の実施形態では、溶媒は、１つ以上のアルコールおよび／またはカルボン酸である。他の実施形態では、溶媒は、１〜８の炭素または１〜６の炭素を有する、１つ以上のアルコールおよび／またはカルボン酸である。アルコールおよび／またはカルボン酸は、環状、直線状、または分岐状であってもよい。例は、ヘキサノール、ペンタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸を含む。液滴アクチュエーターの改良、分配技術、および、斯かる溶媒を用いた液滴操作の実行技術は、本明細書の他の箇所で検討される。
７．３ 液滴アクチュエーターの構成およびアセンブリ
液滴アクチュエーターは、例えば、底部基板および頂部基板を含んでいてもよい。電極は、いずれかまたは両方の基板に供給され、液滴操作の実行のために配置されてもよい。液滴アクチュエーターは、多重ライブラリー構築および特別なライブラリー構築手順の用途のために適応してもよい。例えば、充填流体の組成および添加界面活性剤の濃度は、本開示に基づいて核酸ライブラリー構築手順で用いられる試薬に伴う性能のために選択されてもよい。液滴輸送電圧および周波数も、本開示に基づいてライブラリー構築手順で用いられる試薬に伴う性能のために選択されてもよい。一例では、液滴アクチュエーターは、並列での１０，２０，３０，４０，５０またはそれ以上の異なるライブラリーの構築のために構成される。アクチュエーターでのリザーバの数および配置、独立した電極接続の数、異なるリザーバの大きさ（体積）、磁石／ビーズ洗浄領域の配置、電極サイズ、電極間の間隔、および間隙高さ（頂部基板と底部基板との間）等の設計パラメーターは、本開示の観点から当業者により異なっていてもよい。
液滴アクチュエーターは、例えば、底部基板および頂部基板を含んでいてもよい。電極は、いずれかまたは両方の基板に供給され、液滴操作の実行のために配置されてもよい。液滴アクチュエーターは、多重ライブラリー構築および特別なライブラリー構築手順の用途のために適応してもよい。例えば、充填流体の組成および添加界面活性剤の濃度は、本開示に基づいて核酸ライブラリー構築手順で用いられる試薬に伴う性能のために選択されてもよい。液滴輸送電圧および周波数も、本開示に基づいてライブラリー構築手順で用いられる試薬に伴う性能のために選択されてもよい。一例では、液滴アクチュエーターは、並列での１０，２０，３０，４０，５０またはそれ以上の異なるライブラリーの構築のために構成される。アクチュエーターでのリザーバの数および配置、独立した電極接続の数、異なるリザーバの大きさ（体積）、磁石／ビーズ洗浄領域の配置、電極サイズ、電極間の間隔、および間隙高さ（頂部基板と底部基板との間）等の設計パラメーターは、本開示の観点から当業者により異なっていてもよい。
液滴アクチュエーターは、（ｉ）磁気応答性ビーズの固定のための１つ以上の磁石および（ｉｉ）所定の反応ゾーンおよび／または洗浄ゾーン内で温度を制御するための１つ以上のヒーターアセンブリ等、の液滴アクチュエーターについて有用な所定の部材を囲う装置のデッキに適合するように設計されてもよい。装置のデッキに結合した磁石は、永久磁石であってもよい。磁石は、位置固定されていてもよいし、または移動可能であってもよい。
図９は、多重ライブラリー構築手順の実行での使用に適した液滴アクチュエーター９００の一例の平面図を表している。液滴アクチュエーター９００は、液滴操作間隙（図示せず）により分離された底部基板９１０と頂部基板９１２を含んでいてもよい。底部基板９１０は、例えば、プリント基板（ＰＣＢ）であってもよい。頂部基板９１２は、例えば、ガラス、射出成型プラスチック、ケイ素から作られていてもよい。頂部基板９１２は、導電性インクまたはインジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）等の導電体で液滴操作間隙に面した側面を被覆されていてもよく、さらにフルオロポリマーコーティング等の疎水性のコーティングで被覆されていてもよい。
図９の頂部基板９１２に関して、頂部基板９１２は、多量の液体を受け入れるようにそれぞれ設計された、様々な大きさおよび形状の一連の液体リザーバ９１６を含む。液体は、例えば、本発明のライブラリー構築手順の実行に必要な様々な試薬を含んでいてもよい。例は、平滑末端化試薬、リン酸化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、アダプター結合試薬、洗浄バッファー、核酸捕捉ビーズ、および核酸増幅試薬を含む。各リザーバは、リザーバから液滴操作間隙への流体通路を構築する開口部を含む。試薬は、開口部９１５を通って液滴操作間隙内に流れ、そこで試薬は電気濡れ媒介液滴操作等の電極媒介液滴操作にかけられてもよい。電気濡れ媒介液滴操作または誘電泳動媒介液滴操作等の液滴操作を用いて、試薬は、サブ液滴に分配され、ライブラリー構築手順等の液滴操作手順に従って輸送され、他の試薬液滴および／またはサンプル液滴と接触してもよい。頂部基板９１２は、任意に磁気応答性ビーズに固定されたせん断された核酸等のサンプル液滴のような液体の注入のための１つ以上のピペット注入開口部９１４も含んでいてもよい。
底部基板９１０は、電気濡れ電極配列９２２を含む。電極配列９２２は、開口部９１５またはピペット注入部位９１４を経て液滴操作間隙に流れた液体を受け入れるように配置された分配電極を含む。電極配列９２２の分配電極は、例えば、液滴操作電極（例えば、電気濡れ電極）の通路、ライン、および／または配列を通じて相互接続されている。電極は、電気接点９１０に配線されている。
一例では、核酸サンプルは、例えば、手動でまたは自動でサンプルをサンプル注入部位を経て液滴操作間隙に注入する等、サンプル注入部位９１４を経て液滴操作間隙に装填されてもよい。異なる核酸サンプルは、液滴アクチュエーター９００上の異なる電極レーンで処理され、サンプル間の汚染の可能性を低減してもよい。他の実施形態では、各サンプルは、固有のレーンを含んでいてもよく、そしてサンプルが共通の開口部から抽出される必要がないように、各レーンは、当該レーンからサンプルを抽出するための開口部を含んでいてもよい。したがって、ライブラリー構築手順の終了時には、レーンの各々からのアダプター結合核酸は、異なる出口または出口リザーバ（図示せず）で浄化および回収されてもよい。
図１０は、核酸ライブラリーの構築用の核酸サンプルを処理するために構成された電極配列１０００の他の例の平面図を表している。この例では、電極配列１０００は、１２の異なる核酸ライブラリー構築用に上限１２の異なる核酸サンプルを並行して処理するために構成されている。電極配列１０００は、分配電極１０１０および１０１２と同様に、一連のサンプル回収電極１０１４を含む。液滴操作間隙で、（ｉ）外部リザーバ（例えば、図９に関して記載したような）に結合した開口部もしくは流体通路から液体を受け入れる、または、（ｉｉ）当該開口部もしくは流体通路に液体を流すことができるように、分配電極１０１０および１０１２ならびにサンプル回収電極１０１４は、配列されてもよい。操作では、分配電極１０１０は、試薬の分配に用いられてもよい。例は、平滑末端化試薬、リン酸化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、アダプター結合試薬、洗浄バッファー、核酸捕捉ビーズ、および核酸増幅試薬を含む。分配電極１０１２は、サンプルを分配するために用いられ、ここに示すように、１２の核酸サンプルのための１２のサンプル入力分配電極１０１２である。サンプル出力回収電極１０１４は、サンプル流体を受け入れるために用いられ、ここに示すように、液滴操作間隙から回収される処理核酸ライブラリーを受け入れるための１２のサンプル出力回収電極である。試薬分配電極１０１０、サンプル入力分配電極１０１２、およびサンプル出力回収電極１０１４は、液滴操作電極１０１８（例えば、電気濡れ電極）の通路または配列等の配列を通じて相互接続される。各サンプル入力分配電極１０１２およびその対応するサンプル出力回収電極１０１４から延びる液滴操作電極１０１８の通路は、専用電極レーン１０２０（例えば、１２の専用電極レーン１０２０）を形成する。専用電極レーン１０２０は、異なる核酸サンプルを処理するための別個の反応ゾーンを提供する。サンプル液滴に専用のレーンを使用することにより、異なる核酸の間での相互汚染が最小化される。各核酸サンプルは、他のいずれのサンプルの通路とも交差しない液滴操作間隙内の通路を横断するため、相互汚染の可能性が最小化される。さらに、試薬液滴がサンプル通路を横断する間に、サンプル液滴が同じ通路を横断する前に、試薬液滴が常にサンプル通路を横断するように、手順が実行され得るため、試薬液滴が、サンプルレーン間での核酸汚染の源となり得る可能性を低減する。
電極配列１０００は、１つ以上の温度制御ゾーン１０２２と共に提供されてもよい。一例では、３つの温度制御ゾーン１０２２（すなわち、温度制御ゾーン１０２２ａ、１０２２ｂ、および１０２２ｃ）を用いてもよい。温度制御素子（図示せず）が、温度制御ゾーン１０２２での充填流体（図示せず）の領域の温度を定める。他で述べたように、温度制御素子は、いくつかの実施形態では、デッキに結合されてもよく、当該デッキは、液滴アクチュエーターカートリッジを搭載し、液滴操作および検出等のカートリッジの働きを制御するシステムにカートリッジを電気的に結合させる。温度制御ゾーンは、約３７℃で提供されてもよく、当該温度は、Ａ−ｔａｉｌ化反応での酵素活動に十分に適した温度である。温度制御ゾーンは、核酸サンプルまたは生成物の増幅を実行するのに適した温度で構築されてもよい。３つの温度制御ゾーン１０２２が示されたが、他の任意の好適な数の温度制御ゾーン１０２２が、電極配列１０００と結合されてもよい。
液滴アクチュエーターは、１つ以上の磁石１０２４(例えば、１２個の磁石１０２４)を含んでいてもよく、または１つ以上の磁石１０２４に結合されていてもよく、当該磁石は、磁気応答性ビーズを保持するため個々の専用電極レーン１０２０に近接して位置してもよい。各磁石１０２４は、例えば、永久磁石または電磁石であってもよい。一の実施形態では、磁石１０２４は、対応する専用電極レーン１０２０に近接するようにおよび当該専用電極レーンから離れるように移動可能であってもよい。各磁石１０２４は、酵素反応間の洗浄の間の核酸が付着したビーズの空間的な固定と、処理核酸の溶離後のビーズ除去とを確実にするように位置している。いくつかの実施形態では、混合および保温は、磁石から離れた専用電極レーン１０２０で行われてもよい。
この筺体では、基板のいずれかまたは両方が、１以上の液滴操作の実行のために配置された電極を含んでいてもよい。液滴操作は、例えば、電気濡れ媒介液滴操作、誘電泳動媒介液滴操作、および／または光電濡れ媒介液滴操作であってもよい。液滴操作は、代わりに、または付加的に、以下の他のメカニズムにより媒介されてもよい：流体力学的な流体圧を誘起する装置等、機械的原理（例えば、外部シリンジポンプ、空気圧膜ポンプ、振動膜ポンプ、真空装置、遠心力、圧電ポンプ／超音波ポンプ、および音響力）に基づく操作を行う装置；電気的原理または磁気的原理（例えば、電気浸透流、動電学的ポンプ、強磁性流体プラグ、電気流体力学ポンプ、磁力を利用した引力または斥力、および電磁流体力学ポンプ）に基づく操作を行う装置；熱力学的原理（例えば、気泡発生／相転移体積膨張）に基づく操作を行う装置；他の種類の表面湿潤原理（例えば、電気濡れ、および光電濡れと同様に化学的な、熱的な、構造的なおよび放射性の誘起表面張力勾配）に基づく操作を行う装置；重力に基づく操作を行う装置；表面張力（例えば、毛細管現象）に基づく操作を行う装置；静電力（例えば、電気浸透流）に基づく操作を行う装置；遠心力（コンパクトディスク上に配置され、回転された基板）に基づく操作を行う装置；磁力（例えば、振動イオンが引き起こす流れ）に基づく操作を行う装置；電磁流体力学的な力に基づく操作を行う装置；および真空差または加圧差等に基づく操作を行う装置等。いくつかの実施形態では、上記技術の２つ以上の組み合わせを用いて、本発明の液滴アクチュエーターでの液滴操作を行ってもよい。
図１１は、核酸ライブラリーの構築のために液滴アクチュエーターでの核酸の処理のために構成された電極配列１１００の他の一例の平面図を表している。この例では、試薬分配電極が、電極配列の中央領域に位置し、１２の各サンプル入力分配電極およびサンプル処理電極の２セットが各端に位置している。分配電極、液滴操作電極（例えば、サンプル処理電極）、および回収電極の配列は、試薬液滴が分配され、専用サンプル処理領域（すなわち、専用ライブラリー構築レーン）に輸送される配列である。反応生成物（すなわち、処理核酸）および廃棄生成物（例えば、洗浄液滴）は、専用ライブラリー構築レーン上をそれぞれ、専用サンプル回収リザーバおよび廃棄物回収リザーバに輸送される。電極配列１１００は、２４の異なる核酸ライブラリー構築のために専用反応レーンで並行して上限２４の異なる核酸サンプルを処理するために構成されている。各核酸ライブラリーを識別する固有のアダプターバーコード標識は、ライブラリー作製方法の間に、各核酸サンプルに結合されてもよい。
電極配列１１００は、複数の分配電極を含む。例えば、電極配列１１００は、１１の試薬分配電極１１１０等、異なる試薬流体（例えば、平滑末端化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、アダプター結合試薬、ビーズ溶液、洗浄バッファー、溶離バッファー）を分配するための１つ以上の試薬分配電極１１１０を含んでいてもよい。電極配列１１００は、サンプル流体を分配するための１つ以上のサンプル入力分配電極１１１２も含んでいてもよい（例えば、核酸を分配するための２４のサンプル入力分配電極１１１２）。電極配列１１００は、アダプターバーコード標識を分配するための１つ以上のアダプター分配電極１１１４（例えば、２４のアダプター分配電極１１１４）も含んでいてもよい。分配電極１１１０，１１１２，および１１１４の各配列は、専用試薬輸送レーン１１１１，１１１２，および１１１５を含んでいてもよく、当該専用試薬輸送レーンは、試薬が他のいずれの反応レーンを横断する必要なく、分配された試薬液滴を分配電極１１１０，１１１２，および１１１４から当該分配電極の個々の反応レーン１１２４まで輸送するように配置された電極を含む。組立液滴アクチュエーターでは、分配電極１１１０，１１１２，および１１１４は、流体通路と結合され、当該流体通路は、試薬を分配電極の十分近傍に流し、分配電極は、試薬の液滴を液滴操作表面上または液滴操作間隙内に分配するために用いられてもよい。例えば、流体通路は、頂部基板リザーバから液滴操作間隙内への通路であってもよい。分配電極１１１０は、液滴を配列のいずれかの側から分配するように配置されている。したがって、独立して、試薬を専用輸送レーン１１１１に沿って２方向に、専用反応通路１１２４まで供給する。
電極配列１１００は、複数の回収電極も含んでいてもよい。例えば、電極配列１１００は、サンプル流体を受け入れるための１つ以上のサンプル出力回収電極１１１６（例えば、処理核酸液滴を受け入れるための２４のサンプル出力回収電極１１１６）を含んでいてもよい。電極配列１１００は、廃棄流体を回収するための１つ以上の廃棄物回収電極１１１８（例えば、２４の廃棄物回収電極１１１８）も含んでいてもよい。回収電極１１１６および１１１８の各配列は、それぞれ、専用試薬輸送レーン１１１７および１１１９と接触していてもよく、当該レーンは、液滴が他のいずれの反応レーンを横断する必要なく、反応レーン１１２４から回収電極１１１６および１１１８まで分配された試薬液滴を輸送するように配置された電極を含む。サンプル出力回収電極１１１６および／または廃棄物回収リザーバ１１１８は、流体通路と結合されてもよく、当該流体通路は、回収のために試薬を当該回収電極から流体通路またはリザーバまたは液滴アクチュエーター外に流す。例えば、流体通路は、回収電極から液滴操作間隙外のリザーバまで、または液滴操作間隙の領域内のリザーバまでの通路であってもよい。
試薬分配電極１１１０、サンプル入力分配電極１１１２、アダプター分配電極１１１４、サンプル出力回収電極１１１６、および廃棄物回収電極１１１８は、液滴操作電極１１２０（例えば、電気濡れ電極）の通路または配列等の配列を通じて相互接続されている。液滴操作電極１１２０の配列は、反応ゾーン１１２２を提供する。特に、各サンプル入力分配電極１１１２、アダプター分配電極１１１４ならびにそれらの対応するサンプル出力回収電極１１１６および廃棄物回収電極１１１８から延びる液滴操作電極１１２０の配列は、各サンプル入力についての２つの専用電極レーン１１２４等の専用電極レーン１１２４を形成する。反応ゾーン１１２２内の専用電極レーン１１２４は、（ｉ）異なる核酸サンプルを処理するための別個の反応レーン（すなわち、ライブラリー構築）、および、（ｉｉ）所定の反応工程（例えば、ビーズ除去工程）の間、反応液滴を往復するための「遮断」レーンを提供する。サンプル液滴用の専用レーンおよび集中型試薬分配を用いることにより、異なる核酸間の相互汚染を最小化する。
１つ以上の磁石（図示せず）は、磁気応答性ビーズを保持するために専用電極レーン１１２４近傍に位置されてもよい。磁石は、例えば、永久磁石または電磁石であってもよい。一例では、磁石は、各専用電極レーン１１２４に近接するようにおよび当該専用電極レーンから離れるように移動可能であってもよい。各磁石は、酵素反応間の洗浄の間の核酸が付着したビーズの空間的な固定と、処理核酸の溶離後のビーズ除去とを確実にするように位置している。混合および保温は、磁石から離れた専用電極レーン１１２４で行われてもよい。
反応ゾーン１１２２は、１つ以上の温度制御ゾーン（図示せず）も含んでいてもよい。温度制御素子は（例えば、ヒーターまたはヒートシンク、図示せず）、反応ゾーン１１２２内の専用電極レーン１１２４近傍に位置してもよい。温度制御素子を用いて、温度制御ゾーン周辺で充填流体（図示せず）の温度を制御してもよい。
一の実施形態では、サンプル入力分配電極は、小さなサンプル入力体積用に設計されてもよい。例えば、１μＬサンプル体積は、液滴アクチュエーターに装填され、６６０ｎＬ液滴として処理されてもよい。
他の実施形態では、サンプル入力分配電極およびリザーバは、大きなサンプル入力体積用に設計されてもよい。一例では、ビーズ濃縮手順を用いて、アクチュエーター外のサンプルリザーバでのサンプル体積から核酸を濃縮および回収してもよい。磁気応答性ビーズを、液滴アクチュエーターでサンプルリザーバにサンプルを装填する前に、約１０〜約２０μＬ等の大きなサンプル体積に添加してもよい。大容量サンプルは、次いで、ビーズ濃縮手順を用いてアクチュエーターで３３０ｎＬ液滴に処理されてもよい。他の例では、大きなサンプル体積は、アクチュエーターのサンプルリザーバで濃縮されてもよい。この例では、一連の６６０ｎＬ液滴が、順次、磁気応答性ビーズと共に、アクチュエーターのサンプルリザーバで保温されてもよい。混合電極を用いてビーズの混合を促進してもよい。デジタル微小流体の柔軟性とプログラム可能性により、サンプル処理手順は、アクチュエーターで、アクチュエーター外で、または、サンプル処理のいずれの組み合わせでも容易に応用され得る。
他の実施形態では、各核酸ライブラリー（例えば、図示した電極配列１１００を用いて上限２４の異なる核酸ライブラリー）は、個々の専用サンプル出力回収電極１１１６で回収されてもよい。サンプル出力回収リザーバは、例えば、バッファー溶液で満たされて、リザーバからの処理核酸サンプルの除去を容易にしてもよい。一例では、サンプル出力回収リザーバは、バッファーを用いて手動で充填（例えば、手動のピペット操作）されてもよい。他の例では、サンプル出力リザーバは、ロボット装置を用いてバッファーで充填されてもよい。サンプル回収は、例えば、各サンプル出力回収リザーバ（図示せず）から処理サンプルを手動で除去（例えば、手動のピペット操作）することで行われてもよい。他の例では、サンプル回収は、ロボット装置を用いて行われ、個々の出力回収リザーバ（図示せず）から各処理サンプルを除去してもよい。
他の実施形態では、１つ以上の異なる核酸ライブラリーは、当該ライブラリーが、サンプル出力回収電極での回収前に、液滴アクチュエーターで貯蔵されるように、液滴操作を用いて混合されてもよい。１つ以上の核酸ライブラリーの貯蔵前に、各サンプルの処理核酸の量を決定して、貯蔵する全ての個々のサンプルの濃度を等量に確実にしてもよい。一例では、ｑＰＣＲを用いて各処理サンプルの核酸の濃度を決定してもよい。ｑＰＣＲデータを用いて、各処理サンプルは、そのまま、またはアクチュエーターでの希釈手順を用いて希釈されて、またはアクチュエーターでのＰＣＲ手順を用いてさらに増幅されて、サンプルの貯蔵前に適切な濃度範囲を達成してもよい。
他の例では、核酸サンプルを処理する前に、アクチュエーターでの核酸定量手順を用いてもよい。この例では、各サンプルについての入力核酸の濃度が、決定され、（必要であれば）各サンプルについて核酸ライブラリー構築手順での処理前に調整される。
図１２は、核酸ライブラリーの構築用に液滴アクチュエーターで核酸を処理をするように構成された電極配列１２００の他の一例の平面図を表している。この例では、電極配列１２００は、上限２４の異なる核酸ライブラリーのために２つの別個の処理モジュールの各々で、並行して上限１２の異なる核酸サンプルを処理するように構成されている。一の実施形態では、処理モジュールは、一の処理モジュールが、他の処理モジュールとは独立して用いられてもよいように、液滴アクチュエーター上で物理的に分離されている。例えば、一のライブラリー処理モジュールを含む液滴アクチュエーターの一部は、充填流体（例えば、シリコーンオイル）で充填され、上限１２の異なる核酸ライブラリーの処理のために用いられてもよい。第２のライブラリー処理モジュールを含む液滴アクチュエーターの他の一部は、今後の使用のために未使用のままでもよい。
一の実施形態では、電極配列１２００は、２つのサンプル処理モジュール１２１０ａおよび１２１０ｂを含んでいてもよい。２つのサンプル処理モジュール１２１０を示したが、サンプル処理モジュールは、任意の数および組み合わせで用いられてもよい。各サンプル処理モジュール１２１０は、複数の電極を含む。例えば、各サンプル処理モジュール１２１０は、異なる試薬流体（例えば、平滑末端化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、アダプター結合試薬、ビーズ溶液、洗浄バッファー、溶離バッファー）を分配するために、１２の試薬分配電極１２１２等の１つ以上の試薬分配電極１２１２を含んでいてもよい。各サンプル処理モジュール１２１０は、サンプル流体を分配するため、１つ以上のサンプル入力分配電極１２１４（例えば、核酸を分配するための１２のサンプル入力分配電極１２１４）も含んでいてもよい。各サンプル処理モジュール１２１０は、サンプル流体を受け入れるため、１つ以上のサンプル出力回収電極１２１６（例えば、処理核酸液滴を受け入れるための１２のサンプル出力回収電極１２１６）も含んでいてもよい。他の実施形態では、サンプル出力回収電極１２１６は、アダプター分配電極として使用されてもよい。
試薬分配電極１２１２、サンプル入力分配電極１２１４、およびサンプル出力回収電極１２１６は、液滴操作電極１２１８（例えば、電気濡れ電極）の通路または配列等の配列を通じて相互接続されている。各サンプル入力分配電極１２１４およびその対応するサンプル出力回収電極１２１６から延びる液滴操作電極１２１８の通路は、１２の専用電極レーン１２２０等の専用電極レーン１２２０を形成する。専用電極レーン１２２０は、異なる核酸サンプル処理のための別個の反応ゾーンを提供する。サンプル液滴に専用のレーンを使用することにより、異なる核酸の間での相互汚染が最小化される。
電極配列１２００は、１つ以上の温度制御ゾーン１２２２を含んでいてもよい。一例では、３つの温度制御ゾーン１２２２（すなわち、温度制御ゾーン１２２２ａ、１２２２ｂ、および１２２２ｃ）が用いられてもよい。温度制御素子（図示せず）が、温度制御ゾーン１２２２近傍での充填流体（図示せず）の温度を制御する。
１つ以上の磁石（例えば、１２の磁石１２２４）が、磁気応答性ビーズを保持するために個々の専用電極レーン１２２０近傍に位置されてもよい。専用電極レーン１２２０に関する磁石１２２４の位置決めは、所定の反応工程（例えば、ビーズ除去工程）の間、反応液滴を往復するための「遮断」領域を提供する。各磁石１２２４は、例えば、永久磁石または電磁石であってもよい。各磁石１２２４は、各専用電極レーン１２２０に近接するようにおよび当該専用電極レーンから離れるように移動され得る可動式磁石であってもよい。各磁石１２２４は、酵素反応の間の洗浄時における核酸が付着したビーズの空間的な固定と、処理核酸の溶離後のビーズ除去と、を確実にするように位置している。混合および保温は、磁石から離れた専用電極レーン１２２０で行われてもよい。
図１３Ａおよび１３Ｂは、それぞれ、多重核酸ライブラリー構築手順の実行での使用に適した組立液滴アクチュエーター１３００の平面図および斜視図を表している。液滴アクチュエーター１３００は、液滴操作間隙で分離された底部基板１３１０および頂部基板１３１２を含んでいてもよい。底部基板１３１０は、例えば、ＰＣＢ、プラスチックまたはシリコンチップであってもよい。底部基板１３１０は、核酸ライブラリーの構築用の核酸を処理するために構成された電極配列１３１４を含んでいてもよい。電極配列１３１４の詳細は、図１４を参照して記載される。液滴操作は、液滴操作表面上の電極配列１３１４頂部で行われる。好適な実施形態では、底部基板１３１０は、ＰＣＢであり、当該ＰＣＢは、厚み約０．０３１２５インチであり、銅フラッドがなく（すなわち、電極間のＰＣＢ上に銅層がない）製造されており、これにより、底部基板１３１０と頂部基板１３１２との間の液滴操作間隙での液滴中の磁気応答性ビーズを制御するために用いられる磁場との干渉を低減し、底部基板を通じた熱エネルギーの透過を低減する。他の実施形態では、底部基板１３１０は、厚み約０．０６２５インチのＰＣＢであってもよい。
頂部基板１３１２は、例えば、ポリカーボネート等の射出材料で形成されてもよい。複数の流体分配リザーバが頂部基板１３１２に組み込まれてもよい。例えば、頂部基板１３１２は、異なる試薬流体（例えば、平滑末端化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、アダプター結合試薬、ビーズ溶液、洗浄バッファー、溶離バッファー）を分配するための１つ以上の試薬分配リザーバを含んでいてもよい。一例では、頂部基板１３１２は、試薬分配リザーバ１３１７Ａ、１３１７Ｂ、１３１７Ｃ、１３１７Ｄ、および１３１７Ｅに沿って、試薬分配リザーバ１３１６Ａ、１３１６Ｂ、１３１６Ｃ、および１３１６Ｄを含む。頂部基板１３１２は、サンプル流体を分配するための１つ以上のサンプル入力リザーバを含んでいてもよい。例えば、頂部基板１３１２は、サンプル入力リザーバ１３１８Ａ〜１３１８Ｆの第１列（またはカラム）およびサンプル入力リザーバ１３１８Ｇ〜１３１８Ｌの第２列（またはカラム）を含む。頂部基板１３１２は、アダプターバーコード標識を分配するための１つ以上のアダプター分配リザーバも含んでいてもよい。例えば、頂部基板１３１２は、アダプター分配リザーバ１３２０Ａ〜１３２０Ｆの第１列（またはカラム）およびアダプター分配リザーバ１３２０Ｇ〜１３２０Ｌの第２列（またはカラム）を含む。
頂部基板１３１２は、複数の回収リザーバも含んでいてもよい。例えば、頂部基板１３１２は、処理核酸液滴を受け入れるための２列（またはカラム）の６つのサンプル出力回収リザーバ１３２２等の処理サンプル流体を受け入れるための１つ以上のサンプル出力回収リザーバ１３２２を含んでいてもよい。頂部基板１３１２は、廃棄物回収リザーバ１３２４Ａおよび１３２４Ｂ等の廃棄流体を回収するための１つ以上の廃棄物回収リザーバ１３２４も含んでいてもよい。
試薬分配リザーバ１３１６、サンプル入力リザーバ１３１８、およびアダプター分配リザーバ１３２０は、開口部または流体通路に結合し、当該開口部または流体通路は、流体を流体分配電極近傍に流すために配置され、当該電極は図１４を参照して記載したように底部基板１３１０上に配置されている。サンプル出力回収リザーバ１３２２および廃棄物回収リザーバ１３２４は、実質的に開口部または流体通路に結合し、当該開口部または流体通路は、流体を流体回収電極からサンプル出力回収リザーバ１３２２および廃棄物回収リザーバ１３２４に流すように配置され、当該電極は図１４を参照して記載したように底部基板１３１０上に配置されている。
底部基板１３１０の周辺の少なくとも約１ｃｍの広さの領域は、底部基板１３１０を頂部基板１３１２に結合するための結合領域を提供する。加えて、底部基板１３１０を頂部基板１３１２に機械的に取り付けるために、１つ以上の「熱支柱（heat stake）」を用いられてもよい。熱支柱法（または熱可塑性支柱法）は、周知の機械的結合方法である。一例では、接着剤層は、幅約１ｃｍ未満および高さ約４２５ミクロンであってもよい。
図１３Ｃは、液滴アクチュエーター１３００の頂部基板１３１２の一実施例の平面図を表している。頂部基板１３１２の開口部は、頂部基板にリザーバがないため、ピペット操作による装填のためのものである。この図は、試薬分配リザーバ１３１６Ａ、１３１６Ｂ、１３１６Ｃ、および１３１６Ｄ；試薬分配リザーバ１３１７Ａ、１３１７Ｂ、１３１７Ｃ、１３１７Ｄ、および１３１７Ｅ；サンプル入力リザーバ１３１８Ａ〜１３１８Ｆ；サンプル入力リザーバ１３１８Ｇ〜１３１８Ｌ；アダプター分配リザーバ１３２０Ａ〜１３２０Ｆ、およびアダプター分配リザーバ１３２０Ｇ〜１３２０Ｌ、の開口部を示している。図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃに関して、液滴アクチュエーター１３００のリザーバのための装填体積および液滴の例を表６に示す。
図１４は、図１３Ａおよび１３Ｂの液滴アクチュエーター１３００の底部基板１３１０の一例の平面図を表し、当該底部基板は、当該基板上に形成された電極配列１３１４を有する。この例では、試薬分配電極は、電極配列１３１４の中央部に位置し、電極配列１３１４の各側面に６つのサンプル入力分配電極のセットと、６つのサンプル処理電極のセットとが位置している。
電極配列１３１４は、複数の分配電極を含む。例えば、電極配列１３１４は、異なる試薬流体（例えば、平滑末端化試薬、Ａ−ｔａｉｌ化試薬、アダプター結合試薬、ビーズ溶液、洗浄バッファー、溶離バッファー）を分配するための９つの試薬分配電極１４１０等の１つ以上の試薬分配電極１４１０を含んでいてもよい。電極配列１３１４は、サンプル流体を分配するための１つ以上のサンプル入力分配電極１４１２を含んでいてもよい（例えば、核酸を分配するための２列（またはカラム）の６つのサンプル入力分配電極１４１２）。電極配列１３１４は、アダプターバーコード標識を分配するための１つ以上のアダプター分配電極１４１４（例えば、２列（またはカラム）の６つのアダプター分配電極１４１４）を含んでいてもよい。
電極配列１３１４は、複数の回収電極を含んでいてもよい。例えば、電極配列１３１４は、処理サンプル流体を受け入れるための１つ以上のサンプル出力回収電極１４１６（例えば、処理核酸液滴を受け入れるための２列（またはカラム）の６つのサンプル出力回収電極１４１６）を含んでいてもよい。電極配列１３１４は、廃棄流体を回収するための１つ以上の廃棄物回収電極１４１８（例えば、廃棄物回収電極１４１８ａおよび１４１８ｂ）を含んでいてもよい。試薬分配電極１４１０、サンプル分配電極１４１２、アダプター分配電極１４１４、サンプル出力回収電極１４１６、および廃棄物回収電極１４１８は、実質的に流体リザーバにそろっていて、当該リザーバは、図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃの液滴アクチュエーター１３００の頂部基板１３１２に組み込まれている。
試薬分配電極１４１０、サンプル入力分配電極１４１２、アダプター分配電極１４１４、サンプル出力回収電極１４１６、および廃棄物回収電極１４１８は、液滴操作電極１４２０（例えば、電気濡れ電極）の配列を通じて相互接続されている。例えば、各サンプル入力分配電極１４１２およびその対応するサンプル出力回収電極１４１６から延びる液滴操作電極１４２０の通路は、１３の専用電極レーン１４２２等の専用電極レーン１４２２を形成する。専用電極レーン１４２２は、ライブラリー構築手順での異なる核酸サンプル処理のための別個の反応レーンを提供する。サンプル液滴用の専用レーンおよび集中型試薬分配を用いることにより、異なる核酸間の相互汚染を最小化する。
所定の処理工程を行うために１つ以上のビーズ固定ゾーン１４２４（例えば、ビーズ固定ゾーン１４２４ａおよび１４２４ｂ）が、電極配列１３１４に関連して提供されてもよい。例えば、ビーズ固定ゾーン１４２４は、Halbach配列等の磁石の配列により形成されてもよく、ビーズ固定ゾーンは、液滴アクチュエーターに十分に近接して設置され、その結果の磁場は、液滴操作間隙内の液滴中の磁気応答性ビーズを、斯かる液滴を用いた液滴操作の間、実質的に拘束する。磁石により作られる、ビーズ固定ゾーン１４２４での磁場は、磁気応答性ビーズを保持するのに用いられてもよい。一例では、磁石の配列は、可動式配列であってもよく、当該可動式配列は図２３Ａ、２３Ｂ、および２４に関して記載したように、ビーズ固定ゾーン１４２４に近接するようにまたは離れるように移動されてもよい。磁石配列は、（ｉ）サンプル濃縮、（ｉｉ）酵素反応間の洗浄、および（ｉｉｉ）処理核酸の溶離後のビーズ除去、等の所定の処理工程の間に、磁気応答性ビーズの保持を確実にするように位置している。
いくつかの処理工程を行うために、１つ以上の温度制御ゾーン１４２６（例えば、温度制御ゾーン１４２６ａ〜１４２６ｄ）が、液滴アクチュエーター内に提供されてもよい。例えば、加熱棒等の１つ以上の加熱素子（図示せず）が、組立液滴アクチュエーターに近接して提供され、液滴操作間隙内で１つ以上の温度制御ゾーン１４２６を作り出してもよい。加熱棒は、（ｉ）液滴アクチュエーター１３００の液滴操作間隙内の充填流体の温度制御、および、（ｉｉ）温度制御ゾーン１４２６を通じて液滴アクチュエーターの電極通路に沿って輸送される液滴の加熱または冷却のために用いられてもよい。１つ以上の加熱パッド１４２８を用いて温度制御ゾーン１４２６での熱の流れを制御してもよい。
図１５は、液滴アクチュエーターの底部基板１５００の一例の平面図を表し、当該底部基板は、最適化された液滴輸送と作業行程時間のための、前記基板上に形成された電極配列１５１０を有する。液滴アクチュエーターは、ＰＣＢであってもよい底部基板１５００と結合された頂部基板（図示せず）を用いて形成されてもよく、これらの底部基板１５００と頂部基板は間隙によって分離されている。電極配列１５１０は、リザーバ電極および／または液滴操作電極等の種々の電極で形成されてもよい。
本発明の電極配列１５１０の主な態様は、当該電極配列が、例えば、他方と電気的に独立した２つの部分を有する。例えば、図１５は、部分Ａと部分Ｂとに電気的に区分けされていてもよい電極配列１５１０を示している。例えば、電極配列１５１０の部分Ａで液滴操作が起こり、並行かつ独立して部分Ｂで液滴操作が起こってもよく、逆でもよい。液滴操作が電極配列１５１０の部分ＡとＢとで並行かつ独立して起こってもよいため、液滴輸送と作業行程時間が最適化され得る。すなわち、この基板設計は、連続液滴輸送と作業行程操作を要求してもよい。対照的に、部分ＡとＢとで並行かつ独立して、液滴操作が起こり得るため、本発明の底部基板１５００および電極配列１５１０は、液滴輸送と作業行程時間の最小化を可能とする。
図１５に示された例では、底部基板１５００が頂部基板（図示せず）と組み合わされて、液滴アクチュエーターを形成する場合、電極配列１５１０は、様々な容量のアクチュエーターの所定の流体リザーバを支持する。例えば、底部基板１５００の他の流体リザーバに関して、電極配列１５１０は、一列になって配置された８つの大容量流体リザーバ１５１２等の複数の大容量流体リザーバ１５１２を支持してもよい。一例では、大容量流体リザーバ１５１２は、サンプル流体および／または廃棄流体を保持するために用いられてもよい。底部基板１５００の他の流体リザーバに関して、電極配列１５１０は、一列になって配置された７つの中容量流体リザーバ１５１４等の複数の中容量流体リザーバ１５１４を支持してもよい。一例では、中容量流体リザーバ１５１４は、洗浄試薬、溶離バッファー試薬、バッファー試薬（液滴回収用の）、酵素試薬、所定のビーズ含有試薬等を保持するための試薬リザーバであってもよい。底部基板１５００の他の流体リザーバに関して、電極配列１５１０は、一列になって配置された７つの小容量流体リザーバ１５１６等の複数の小容量流体リザーバ１５１６を支持してもよい。一例では、小容量流体リザーバ１５１６は、所定の酵素試薬を保持するための試薬リザーバであってもよい。
加えて、底部基板１５００の電極配列１５１０は、これらに限定されないが、８つの回収リザーバ１５１８の列、８つの一時貯蔵リザーバ１５２０の列、および、８つのアダプターリザーバ１５２２の列等の他のリザーバを支持してもよい。一時貯蔵リザーバ１５２０は、一時液体保持リザーバである。一例では、一時貯蔵リザーバ１５２０は、一時的なビーズ溶液の保持のために用いられる。一例では、アダプターリザーバ１５２２は、アダプター溶液の保持のために用いられる。電極配列１５１０により支持されるアクチュエーターのリザーバの更なる詳細は、図１６〜２１を参照して記載される。
液滴操作電極１５２４（例えば、電気濡れ電極）の様々なライン、通路、および／または配列が用いられ、大容量流体リザーバ１５１２、中容量流体リザーバ１５１４、小容量流体リザーバ１５１６、回収リザーバ１５１８、一時貯蔵リザーバ１５２０、および／またはアダプターリザーバ１５２２を相互接続する。一例では、図１５は、１つ以上の混合閉回路１５２６を示し、当該閉回路は液滴操作電極１５２４の所定の配列により形成される。例えば、８つの混合閉回路１５２６の列が、個々の大容量流体リザーバ１５１２の近くに実装される。他の例では、図１５は、液滴操作電極１５２４の他の配列により形成される分配閉回路１５２８を示している。例えば、分配閉回路１５２８は、中容量流体リザーバ１５１４および小容量流体リザーバ１５１６の近傍に実装されている。一例では、溶離液滴は、分配閉回路１５２８で処理されてもよい。
一般的に、回収リザーバ１５１８、一時貯蔵リザーバ１５２０、およびアダプターリザーバ１５２２は、８つの混合閉回路１５２６と分配閉回路１５２８との間に配置されている。７つの中容量流体リザーバ１５１４および７つの小容量流体リザーバ１５１６が、分配閉回路１５２８の一方の側面を提供している。８つの大容量流体リザーバ１５１２が、それぞれ、８つの混合閉回路１５２６を提供している。
底部基板１５００は、いくつかの入力／出力（Ｉ／Ｏ）パッド１５３０も含む。Ｉ／Ｏパッド１５３０は、ＰＣＢに配線することにより電極に電気的に接続されている電気接点である。一例では、Ｉ／Ｏパッド１５３０は、液滴操作電極１５２４および／または任意のリザーバ電極に電気濡れ電圧をかけるために用いられる。
加えて、図１５は、複数の温度ゾーンを含んでいてもよい底部基板１５００を示し、当該ゾーンは、所定の温度制御素子（図示せず）で制御される。一例では、温度ゾーン１５４０は、混合閉回路１５２６の領域で提供される。当該ゾーンは、例えば、指定逆転写（ＲＴ）ゾーンであってもよい。加えて、温度ゾーン１５４２は、混合閉回路１５２６とアダプターリザーバ１５２２の領域で提供される。当該ゾーンは、例えば、指定加熱ゾーンであってもよい。さらに、温度ゾーン１５４４は、一時貯蔵リザーバ１５２０と分配閉回路１５２８の領域で提供される。当該ゾーンは、例えば、指定装填ゾーンであってもよい。一例では、温度ゾーン１５４０は、約ｘｘ℃〜約ｘｘ℃で保持されてもよく、温度ゾーン１５４２は、約ｘｘ℃〜約ｘｘ℃で保持されてもよく、そして温度ゾーン１５４４は、約ｘｘ℃〜約ｘｘ℃で保持されてもよい。
電極配列１５１０の部分Ａおよび部分Ｂに関して、大容量流体リザーバ１５１２および混合閉回路１５２６が部分Ａにある。中容量流体リザーバ１５１４、小容量流体リザーバ１５１６、回収リザーバ１５１８、一時貯蔵リザーバ１５２０、アダプターリザーバ１５２２、および分配閉回路１５２８が、部分Ｂにある。
操作では、電極配列１５１０の部分Ａで、酵素および／または結合反応が起こってもよい。混合および／またはサンプル濃縮工程が、大容量流体リザーバ１５１２で起こってもよく、当該リザーバはサンプル流体および／または廃棄流体を保持していてもよい。加えて、いくつかの保温操作（例えば、上限約３０分の保温時間）が、部分Ａで起こってもよい。
それと同時に、電極配列１５１０の部分Ｂで、いくつかの液滴が、試薬リザーバである中容量流体リザーバ１５１４および小容量流体リザーバ１５１６から予備分配されてもよく、次いで、分配閉回路１５２８での処理を待つ。中容量流体リザーバ１５１４および小容量流体リザーバ１５１６から予備分配された液滴は、作動するまでの時間を最小化する（輸送および作業行程時間を最小化する）。
時々、長期間（例えば、３時間）、ビーズを懸濁に保つことは難しい場合もある。そのため、電極配列１５１０の部分Ｂを用いて、ビーズの数滴（例えば、８液滴）をいずれかのリザーバから一時貯蔵リザーバ１５２０まで予備分配してもよい。ビーズの体積が小さいほど、懸濁を保つのが容易である。一例では、回収リザーバ１５１８は、検査手順の最終生成物である処理サンプルの回収のために用いられる。
頂部基板（図示せず）は、図１５の底部基板１５００に関連して配置され、液滴アクチュエーターを形成する。図１６は、電極配列１５１０により支持されたアクチュエーターの流体リザーバを充填するための頂部基板（図示せず）の開口部に関連した図１５の底部基板１５００の平面図を表している。例えば、図１６は、複数の開口部１５５０を示し、この開口部１５５０は、各流体リザーバに対して１つ設けられる。一例では、大容量流体リザーバ１５１２、中容量流体リザーバ１５１４、および小容量流体リザーバ１５１６のための開口部１５５０は、約３ミリメートル（ｍｍ）の直径を有していてもよい。回収リザーバ１５１８およびアダプターリザーバ１５２２のための開口部は、約２ｍｍの直径を有していてもよい。大容量流体リザーバ１５１２、中容量流体リザーバ１５１４、小容量流体リザーバ１５１６、回収リザーバ１５１８、一時貯蔵リザーバ１５２０、およびアダプターリザーバ１５２２の更なる詳細は、図１７，１８，１９，２０、および２１を参照して記載される。
一の実施形態では、全ての操作は、リザーバ空間内で起こってもよい。例えば、全ての混合および結合は、大容量流体リザーバ１５１２内で起こってもよい。例えば、大容量流体リザーバ１５１２の前方部を用いて結合および溶離を行ってもよい。斯かる実施形態では、各サンプルレーンの混合閉回路１５２６は、追加のユニットセルを装着することができる。
図１７は、１つの大容量流体リザーバ１５１２を含む底部基板１５００の一部の側面図および平面図を表している。大容量流体リザーバ１５１２は、複数の別個に制御される電極の配列から形成され、当該電極は、集合的に、図１５の電極配列１５１０内に、大容量流体リザーバ１５１２を形成する。
例えば、大容量流体リザーバ１５１２の中央に沿って、４つの区分けされたリザーバ電極１５６０があってもよい。中央のこの４つの区分けされたリザーバ電極１５６０は、その各側面が４つのより小さなリザーバ側面電極１５６２と面するように位置してもよい。別個に制御される電極のこの配列は、液滴操作電極１５２４（例えば、電気濡れ電極）の通路、ライン、および／または配列に関連して配置される。加えて、液滴操作電極１５２４のラインは、各側面が１つ以上の通路側面電極１５６４と面するように位置していてもよい。さらに、装填電極１５６６は、大容量流体リザーバ１５１２の開口部１５５０に関連して配置されてもよい。
本発明の大容量流体リザーバ１５１２の一態様では、当該リザーバが複数の別個に制御される電極に区分けされている。区分けされた電極デザインの利点は、所定の電極活性シークエンスを用いることで、複雑な混合操作を大容量流体リザーバ１５１２の複数のリザーバ電極頂部で起こし得ることである。区分けされた電極デザインの他の利点は、大容量流体リザーバ１５１２の区分けにより異なる体積の流体を扱う能力を提供することである。一例では、大容量流体リザーバ１５１２は、約２０マイクロリットル（μＬ）〜約１３０μＬの範囲の体積の流体を扱ってもよい。実質的に開口部１５５０に位置している装填電極１５６６は、流体の意図した最小体積（例えば、約２０μＬ）を保持する大きさと形状である。一例では、大容量流体リザーバ１５１２用の開口部１５５０の直径は、約３ｍｍである。
図１７の側面図は、頂部基板１５７０に関連して、底部基板１５００を示している。液滴操作電極１５２４に沿った高さＨ１の間隙がある。この例では、頂部基板１５７０の側面に段があり、複数のリザーバ電極の領域での間隙高さＨ２は、間隙高さＨ１よりも大きい。頂部基板１５７０の側面をテーパー状として、間隙高さＨ２から間隙高さＨ１への変移を容易にしてもよい。間隙高さの変化とテーパー状が、いずれのリザーバ電極を活性化することなく流体をリザーバに引き戻すことに役立ち得る。一例では、Ｈ１は、約５０〜約６００μｍ、または約２００〜約４００μｍ、または約３００μｍであってもよい。一例では、Ｈ２は、約１０００〜約５０００μｍ、または約２０００〜約３０００μｍ、または約２８００μｍであってもよい。
図１８は、１つの中容量流体リザーバ１５１４を含む底部基板１５００の一部の側面図および平面図を表している。中容量流体リザーバ１５１４も、複数の別個に制御される電極の配列から形成され、当該電極は、集合的に、図１５の電極配列１５１０内に、中容量流体リザーバ１５１４を形成する。
図１７の大容量流体リザーバ１５１２からは独特の大きさおよび／または形状となっているが、中容量流体リザーバ１５１４も、区分けされたリザーバ電極１５６０、リザーバ側面電極１５６２、液滴操作電極１５２４、および通路側面電極１５６４を含む。中容量流体リザーバ１５１４も、開口部１５５０に関連した装填電極１５６６を含む。中容量流体リザーバ１５１４の区分けされた電極デザインの利点（例えば、混合能力および異なる体積の流体を扱う能力）は、図１７の大容量流体リザーバ１５１２に関して記載したものと実質的に同じである。
一例では、中容量流体リザーバ１５１４は、約８μＬ〜約１００μＬの範囲の体積の流体を扱ってもよい。実質的に開口部１５５０に位置している装填電極１５６６は、流体の意図した最小体積（例えば、約８μＬ）を保持する大きさと形状である。一例では、中容量流体リザーバ１５１４用の開口部１５５０の直径は、約３ｍｍである。
図１８の側面図は、頂部基板１５７０に関連して、底部基板１５００を示している。液滴操作電極１５２４に沿った高さＨ１の間隙がある。この例では、頂部基板１５７０の側面に段があり、複数のリザーバ電極の領域での間隙高さＨ２は、間隙高さＨ１よりも大きい。頂部基板１５７０の側面をテーパー状として、間隙高さＨ２から間隙高さＨ１への変移を容易にしてもよい。間隙高さの変化とテーパー状が、いずれのリザーバ電極を活性化することなく、流体をリザーバに引き戻すことに役立ち得る。一例では、Ｈ１は、約５０〜約６００μｍ、または約２００〜約４００μｍ、または約３００μｍであってもよい。一例では、Ｈ２は、約５００〜約１０００μｍ、または約７００〜約９００μｍ、または約８００μｍであってもよい。
図１９は、１つの小容量流体リザーバ１５１６を含む底部基板１５００の一部の側面図および平面図を表している。小容量流体リザーバ１５１６も、複数の別個に制御される電極の配列から形成され、当該電極は、集合的に、図１５の電極配列１５１０内に、小容量流体リザーバ１５１６を形成する。
図１７の大容量流体リザーバ１５１２からは独特の大きさおよび／または形状となっているが、小容量流体リザーバ１５１６も、区分けされたリザーバ電極１５６０、リザーバ側面電極１５６２、液滴操作電極１５２４、および通路側面電極１５６４を含む。小容量流体リザーバ１５１６も、開口部１５５０に関連した装填電極１５６６を含む。小容量流体リザーバ１５１６の区分けされた電極デザインの利点（例えば、混合能力および異なる体積の流体を扱う能力）は、図１７の大容量流体リザーバ１５１２に関して記載したものと実質的に同じである。
一例では、小容量流体リザーバ１５１６は、約６μＬ〜約２０μＬの範囲の体積の流体を扱ってもよい。実質的に開口部１５５０に位置している装填電極１５６６は、流体の意図した最小体積（例えば、約６μＬ）を保持する大きさと形状である。一例では、中容量流体リザーバ１５１４用の開口部１５５０の直径は、約３ｍｍである。
図１９の側面図は、頂部基板１５７０に関連して、底部基板１５００を示している。液滴操作電極１５２４に沿った高さＨ１の間隙がある。この例では、頂部基板１５７０の側面に段があり、複数のリザーバ電極の領域での間隙高さＨ２は、間隙高さＨ１よりも大きい。頂部基板１５７０の側面をテーパー状として、間隙高さＨ２から間隙高さＨ１への変移を容易にしてもよい。間隙高さの変化とテーパー状が、いずれのリザーバ電極を活性化することなく、流体をリザーバに引き戻すことに役立ち得る。一例では、Ｈ１は、約５０〜約６００μｍ、または約２００〜約４００μｍ、または約３００μｍであってもよい。一例では、Ｈ２は、約５００〜約１０００μｍ、または約７００〜約９００μｍ、または約８００μｍであってもよい。
液滴操作電極１５２４の側面に位置する通路側面電極１５６４は、電気濡れ力を増加させ、電気濡れ領域を増加させることによりリザーバから分配領域まで液体を引く働きをする。この例では、液滴操作電極１５２４に関連した通路側面電極１５６４のずれが、液体が隣接する電極に進行するのを補助する。
図２０は、１つの回収リザーバ１５１８を含む底部基板１５００の一部の側面図と平面図を表している。回収リザーバ１５１８は、液滴操作電極１５２４の配列から形成される。一例では、回収リザーバ１５１８用の開口部１５５０の直径は、約２ｍｍである。図２０の側面図は、頂部基板１５７０に関連して、底部基板１５００を示している。液滴操作電極１５２４に沿って高さＨ１の間隙がある。この例では、頂部基板１５７０の側面には段がない。したがって、液滴操作電極１５２４に沿って実質的に均一な間隙高さＨ１がある。一例では、Ｈ１は、約５０〜約６００μｍ、または約２００〜約４００μｍ、または約３００μｍであってもよい。
図２１は、１つの一時貯蔵リザーバ１５２０と１つのアダプターリザーバ１５２２とを含む底部基板１５００の一部の側面図と平面図を表している。一時貯蔵リザーバ１５２０とアダプターリザーバ１５２２も、複数の別個に制御される電極の配列から形成され、当該電極は、集合的に、図１５の電極配列１５１０内に、一時貯蔵リザーバ１５２０とアダプターリザーバ１５２２とを形成する。
図１７の大容量流体リザーバ１５１２からは、独特の大きさおよび／または形状となっているが、一時貯蔵リザーバ１５２０およびアダプターリザーバ１５２２も、区分けされたリザーバ電極１５６０を含む。この例では、区分けされたリザーバ電極１５６０は、例えば、Ｔ型、Ｙ型、Ｈ型、および／または他のいずれの形状であってもよいが、電気濡れの向上のために、液体が隣接する電極に接触するのを確実にする、または、少なくとも補助する。一時貯蔵リザーバ１５２０およびアダプターリザーバ１５２２の区分けされた電極デザインの利点（例えば、混合能力および異なる体積の流体を扱う能力）は、図１７の大容量流体リザーバ１５１２に関して記載したものと実質的に同じである。
一例では、一時貯蔵リザーバ１５２０およびアダプターリザーバ１５２２は、約１μＬ〜約５．５μＬの体積の流体を扱ってもよい。図１７は、アダプターリザーバ１５２２に関連して、開口部１５５０も示している。一例では、アダプターリザーバ１５２２用の開口部１５５０の直径は、約２ｍｍである。一時貯蔵リザーバ１５２０についての開口部１５５０はない。
図２１の側面図は、頂部基板１５７０と関連した底部基板１５００を示している。液滴操作電極１５２４に沿って高さＨ１の間隙がある。この例では、頂部基板１５７０の側面には段があり、区分けされたリザーバ電極１５６０の領域での間隙高さＨ２は、間隙高さＨ１より大きい。頂部基板１５７０の側面をテーパー状として、間隙高さＨ２から間隙高さＨ１への変移を容易にしてもよい。間隙高さの変化とテーパー状が、いずれのリザーバ電極を活性化することなく流体をリザーバに引き戻すことに役立ち得る。一例では、Ｈ１は、約５０〜約６００μｍ、または約２００〜約４００μｍ、または約３００μｍであってもよい。一例では、一時貯蔵リザーバ１５２０でのＨ２は、約５００〜約１０００μｍ、または約６００〜約７００μｍ、または約６２５μｍであってもよく、アダプターリザーバ１５２２でのＨ２は、約２５０〜約７５０μｍ、または約４００〜約５００μｍ、または約４２５μｍであってもよい。
図１５〜２１に関して、開口部１５５０を供給するアクチュエーター外の流体リザーバ（図示せず）は、底部基板１５００に関連する頂部基板に組み込まれてもよい。したがって、アクチュエーター外の流体リザーバは、これらに限定されないが、大容量流体リザーバ１５１２、中容量流体リザーバ１５１４、小容量流体リザーバ１５１６、回収リザーバ１５１８、一時貯蔵リザーバ１５２０、およびアダプターリザーバ１５２２等のアクチュエーターの流体リザーバと組み合わせて用いられる。
他の実施形態では、電気濡れ装置の液滴操作間隙での液滴操作を実行する方法が提供される。本発明の方法は、ＣＹＴＯＰ（登録商標）（東京、旭硝子社から入手可能）等のアモルファスフルオロポリマーで被覆された分配領域を有する装置を供給する工程、分配領域で有機溶媒を分配する工程、およびＣＹＴＯＰ（登録商標）で被覆されていない領域に有機溶媒を輸送する工程を含む。ＣＹＴＯＰ（登録商標）で被覆されていない領域は、例えば、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、DuPont社から入手可能なTEFLON（登録商標）コーティング）等のフッ化炭素で被覆されていてもよい。有機溶媒は、いずれの有機溶媒でもよいが、好適には極性プロトン性溶媒である。一の実施形態では、溶媒は、アルコールおよび／またはカルボン酸である。他の実施形態では、溶媒は、１〜８の炭素、または１〜６の炭素を有するアルコールおよび／またはカルボン酸である。アルコールおよび／またはカルボン酸は、環状、直線状、または分岐状であってもよい。例は、ヘキサノール、ペンタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸を含む。
２つの基板は、当該２つの基板間に液滴操作間隙を開けたままにするいずれの方法で共に結合されていてもよい。通常、液滴操作間隙は、周囲がシールされるが、これは常に必要ではない。間隙の開口部は、液体を導入または移動するのに有用となり得る。例えば、基板は機械的に結合されてもよく、液滴操作間隙は、ガスケットで周囲をシールされてもよい。液滴操作間隙の結合とシールは、例えば、接着材料を用いて達成されてもよい。ＰＣＢ基板は、液滴操作間隙の周囲もシールする接着剤を用いてプラスチック頂部基板に結合されてもよい。ＰＣＢ基板は、液滴操作間隙の周囲もシールする接着剤を用いてアクリル頂部基板に結合されてもよい。ＰＣＢ基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするウレタンメタクリレートポリマーを用いてプラスチック頂部基板に結合されてもよい。ＰＣＢ基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするポリマーの接着剤を用いてアクリル頂部基板に結合されてもよい。ＰＣＢ基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするウレタンメタクリレートポリマーを用いてアクリル頂部基板に結合されてもよい。ウレタンメタクリレートポリマーは、例えば、ＵＶ硬化性接着剤のPERMABOND（登録商標）UV648またはUV632を含む。ＰＣＢ基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするポリマーの接着剤を用いてガラス頂部基板に結合されてもよい。ＰＣＢ基板は、液滴操作間隙の周囲もシールするＵＶ硬化性エポキシ樹脂系ポリマーを用いてガラス頂部基板に結合されてもよい。好ましいＵＶ硬化性エポキシ樹脂系ポリマーの例は、NJ、Hackensack、Master Bond社から入手可能な当該ポリマー（例えば、MASTER BOND（登録商標）UV15x−5）を含む。ポリマーの接着剤を用いる場合、ポリマーは、底部基板または頂部基板の周囲のビードラインに堆積され、その後、他の表面（ＰＣＢまたはプラスチック）の位置決めがされてもよい。ＵＶ硬化性ポリマーは、次いで、ＵＶ硬化のためにＵＶ光に露光されてもよい。いくつかの実施形態では、接着剤が、底部基板と頂部基板との間の液滴操作間隙の周囲をシールする。液滴操作間隙は、シリコーンオイル等の充填流体で実質的に充填されてもよい。
他の実施形態では、頂部基板と底部基板は、アクリル接着剤等の接着剤で被覆されたテープ等の接着テープで結合される。接着テープは、液滴操作間隙の周囲の一部または全てをシールするのに好適な形状にカットされてもよい。好適な接着テープの例は、布テープ、ポリエチレン発泡テープ、ウレタンテープ、紙テープ、ポリエステルテープ、ティシューテープ、およびビニルテープを含む。好ましい例は、３Ｍ（商標）300LSE接着剤の接着剤転写テープ、：9453FL、9471FL、9472FL、；および３Ｍ（商標）ＶＨＢ（商標）テープを含む。これらのおよび他の好適なテープは、TN、Nashville、Can-Do National Tape社および他の供給業者から入手可能である。いくつかの実施形態では、テープが、底部基板と頂部基板との間の液滴操作間隙の周囲をシールする。液滴操作間隙は、シリコーンオイル等の充填流体で実質的に充填されてもよい。
一の実施形態では、ＰＣＢ材料で作られた底部基板は、例えば、プラスチック頂部基板に、PERMABOND（登録商標）UV648ＵＶ硬化性接着剤等のウレタンメタクリレートポリマーを用いて結合されて、構造を形成してもよい。ポリマーは、底部基板または頂部基板の周囲のビードラインに堆積され、その後、他の表面（ＰＣＢまたはプラスチック）の位置決めおよびＵＶ硬化がされてもよい。他の実施形態では、ウレタンメタクリレートポリマーは、底部基板と頂部基板との間に筺体を形成し、当該筺体はシリコーンオイル等のオイルを含んでいてもよい。他の実施形態では、当該構造は、さらに基板の１つ以上の表面上に電極を含み、電気濡れ媒介液滴操作および／または誘電泳動媒介液滴操作等の液滴操作を実行するために配置されている。さらに他の実施形態では、当該構造は、微小流体装置を含む。
本発明者らは、有機溶媒洗浄液滴は、液滴アクチュエーターで電気濡れ分配技術等を用いて確実に分配することが困難であることを発見した。斯かる分配を向上させる溶液は、本明細書に記載の充填流体配合および洗浄液滴配合である。充填流体配合溶液および液滴配合溶液と別個にまたは一緒に用いてもよい他の溶液は、有機溶媒がＣＹＴＯＰ（登録商標）コーティング（東京、旭硝子社から入手可能）等のアモルファスフルオロポリマーで被覆された表面により確実に分散するという発見に起因する。一の実施形態では、分配の間有機液滴に接触した液滴アクチュエーター表面（例えば、液滴分配領域の液滴操作間隙に面した頂部基板および／または底部基板の表面）は、アモルファスフルオロポリマーで被覆される一方、他の領域は非フルオロポリマーコーティングで被覆される。他の実施形態では、分配の間有機液滴に接触した液滴アクチュエーター表面は、ＣＹＴＯＰ（登録商標）フルオロポリマーコーティングで被覆される一方、他の領域は別のフルオロポリマーコーティングで被覆される。同様に、本発明は、アモルファスフルオロポリマーで被覆された分配領域で電気濡れ分配技術を用いて有機溶媒液滴を分配する工程、および分配された有機溶媒液滴をアモルファスフルオロポリマーで被覆されていない領域に輸送する工程を含む。同様に、本発明は、ＣＹＴＯＰ（登録商標）アモルファスフルオロポリマーで被覆された分配領域で電気濡れ分配技術を用いて有機溶媒液滴を分配する工程、および分配された有機溶媒液滴をＣＹＴＯＰ（登録商標）アモルファスフルオロポリマーで被覆されていない領域に輸送する工程を含む。同様に、本発明は、ＣＹＴＯＰ（登録商標）アモルファスフルオロポリマーで被覆された分配領域で電気濡れ分配技術を用いて有機溶媒液滴を分配する工程、および分配された有機溶媒液滴をTEFLON（登録商標）アモルファスフルオロポリマーで被覆された領域に輸送する工程を含む。TEFLON（登録商標）ポリテトラフルオロエチレンコーティングは、DE、Wilmington、E. I. DuPont de Nemours & Co社から入手可能である。
７．４ 磁石配列
液滴アクチュエーターは、磁石の配列を含んでもよく、または磁石の配列と結合されていてもよい。例えば、液滴アクチュエーターは、装置デッキ上に取り付けられてもよく、液滴アクチュエーターは、装置デッキ上に収まるように設計され、当該デッキは、液滴アクチュエーターのいくつかの処理ゾーン内で温度を制御するための（ｉ）磁石および、（ｉｉ）ヒートシンクのヒーター等の温度制御装置、等の追加の機構を収容する。磁石は、液滴アクチュエーターで磁気応答性ビーズの固定のために用いられてもよい。磁石は、液滴アクチュエーターで液滴操作にかけられる液滴の磁気応答性ビーズの固定のために用いられてもよい。磁石は、液滴アクチュエーターアセンブリの頂部基板に形成されたリザーバ等の液滴アクチュエーターのリザーバ内で磁気応答性ビーズの固定のために用いられてもよい。磁石を用いて、ビーズ洗浄工程の間のビーズの固定等、核酸ライブラリー構築手順での様々な処理工程に必要とされる液滴操作のために磁気応答性ビーズを操作してもよい。磁石を用いて、娘液滴の１つにおける全てのまたは実質的に全てのビーズを保持するための液滴分割操作の間のビーズの固定等、核酸ライブラリー構築手順での様々な処理工程に必要とされる液滴操作のために磁気応答性ビーズを操作してもよい。
液滴アクチュエーターは、磁石の配列を含んでもよく、または磁石の配列と結合されていてもよい。例えば、液滴アクチュエーターは、装置デッキ上に取り付けられてもよく、液滴アクチュエーターは、装置デッキ上に収まるように設計され、当該デッキは、液滴アクチュエーターのいくつかの処理ゾーン内で温度を制御するための（ｉ）磁石および、（ｉｉ）ヒートシンクのヒーター等の温度制御装置、等の追加の機構を収容する。磁石は、液滴アクチュエーターで磁気応答性ビーズの固定のために用いられてもよい。磁石は、液滴アクチュエーターで液滴操作にかけられる液滴の磁気応答性ビーズの固定のために用いられてもよい。磁石は、液滴アクチュエーターアセンブリの頂部基板に形成されたリザーバ等の液滴アクチュエーターのリザーバ内で磁気応答性ビーズの固定のために用いられてもよい。磁石を用いて、ビーズ洗浄工程の間のビーズの固定等、核酸ライブラリー構築手順での様々な処理工程に必要とされる液滴操作のために磁気応答性ビーズを操作してもよい。磁石を用いて、娘液滴の１つにおける全てのまたは実質的に全てのビーズを保持するための液滴分割操作の間のビーズの固定等、核酸ライブラリー構築手順での様々な処理工程に必要とされる液滴操作のために磁気応答性ビーズを操作してもよい。
いくつかの実施形態では、本発明は、可動式磁石を提供する。一例では、可動式磁石は、サンプル濃縮の間に、核酸が付着したビーズの空間的な固定を確実にするように位置されてもよい。サンプル濃縮は、例えば、ビーズ濃縮手順の単一の工程を用いて行われてもよい。サンプル濃縮は、一連の分配ビーズ濃縮手順を用いて行われてもよい。他の例では、可動式磁石は、酵素反応間のビーズ洗浄の間に、核酸が付着したビーズの空間的な固定を確実にするように位置されてもよい。他の例では、可動式磁石は、処理核酸の溶離後のビーズ除去の間に、ビーズの空間的な固定を確実にするように位置されてもよい。液滴操作（電気濡れプログラム）のシークエンス、温度制御、および磁石位置は、例えば、調整可能なソフトウェアおよびプログラム可能なソフトウェアインターフェースを用いてプログラムされてもよい。
一例では、装置デッキは、液滴アクチュエーターの所定の処理ゾーンにそろって位置している１つ以上の可動式磁石配列（例えば、Halbach配列）および１つ以上のヒーターアセンブリ（例えば、加熱棒）と同様に、電極の活性と非活性を制御するための電気的接続、および液滴アクチュエーターの他の電気的機能（例えば、センサー）も含んでいてもよい。この例は、図２２Ａ、２２Ｂ、および２３を参照して記載されている。
図２２Ａおよび２２Ｂは、磁石アクチュエーター２２００の斜視図を表している。磁石アクチュエーター２２００は、フレーム構造２２１０を含んでいてもよく、当該フレーム構造は、立方体磁石２２１４のセットを保持するためにフレーム構造に設置されたスライド可能なプレート２２１２を有する。ソレノイド２２１６が、フレーム構造２２１０に固定される。フレーム構造２２１０に対するスライド可能なプレート２２１２の位置が、ソレノイド２２１６で制御される。すなわち、ソレノイド２２１６のアクチュエーターが、スライド可能なプレート２２１２の一部に対して圧力をかけ、立方体磁石２２１４をフレーム構造２２１０に対して動かす。スライド可能なプレート２２１２および立方体磁石２２１４の直線的な運動を制御するために、調整可能なネジ２２１８のセット等の所定の機構が提供されてもよい。スライド可能なプレート２１２２は、溝形状およびスロット形状等のフレーム２２１０構成要素と組み合わされてもよく、本明細書に記載の機能を達成するためにプレート２１２２の動きが特定の範囲に制約される。
操作では、スライド可能なプレート２２１２上の立方体磁石２２１４は、液滴アクチュエーター２２２０等の液滴アクチュエーターに近接して位置している。ソレノイド２２１６は、立方体磁石２２１４を液滴アクチュエーターの表面に近づけるまたは遠ざけるために用いられる。図２２Ａは、非通電状態のソレノイド２２１６および、液滴アクチュエーター２２２０に関して非係合状態の立方体磁石２２１４を有するスライド可能なプレート２２１２を示している。図２２Ｂは、通電状態のソレノイド２２１６および、液滴アクチュエーター２２２０に関して係合状態の立方体磁石２２１４を有するスライド可能なプレート２２１２を示している。
図２３は、１つ以上の磁石アクチュエーターおよび１つ以上のヒーター機構を保持するための機械的固定具２３００の一例の平面図を表している。機械的固定具２３００は、核酸ライブラリーの構築のための液滴アクチュエーターでの核酸の処理での使用に好適である。一例では、機械的固定具２３００は、立方体磁石２２１４ａのライン（line)を含む磁石アクチュエーター２２００ａおよび立方体磁石２２１４ｂのラインを含む磁石アクチュエーター２２００ｂ等の２つの磁石アクチュエーター２２００を含む。立方体磁石２２１４の各セットまたは各ラインは、例えば、図２４Ａ、２４Ｂ、２５Ａ、および２５Ｂに関して記載したように、Halbach配列であってもよい。立方体磁石２２１４は、磁石アクチュエーター２２００の動作で液滴アクチュエーター（図示せず）に接近してまたは近傍から離れて移動されてもよい。一例では、立方体磁石２２１４は、２．２５ｍｍの立方体磁石であってもよい。他の例では、立方体磁石２２１４は、４．５ｍｍの立方体磁石であってもよい。
機械的固定具２３００は、ヒーター２３１０ａ〜２３１０ｄ等の１つ以上のヒーター２３１０を含んでいてもよい。ヒーター２３１０は、例えば、加熱棒であってもよい。ヒーター２３１０を用いて、液滴アクチュエーターの指定温度制御ゾーン内の温度を制御してもよい。例えば、一の温度制御ゾーンは、Ａ−ｔａｉｌ化反応のために３７℃を提供してもよく、または、３−温度ＰＣＲの実行のために適切な温度を提供してもよい。コントローラー（図示せず）を用いて、ヒーター２３１０の出力温度を制御してもよい。
他の実施形態では、機械的固定具２３００は、（ｉ）ヒートシンク、または、（ｉｉ）ペルチェ素子等の熱電冷却装置、等の冷却装置を含んでいてもよい。冷却装置は、周囲の温度よりも低い液滴アクチュエーターの領域の温度を維持するのに用いられてもよい。冷却装置は、液滴アクチュエーターの他の領域の加熱の間、液滴アクチュエーターのある領域が過熱するのを防ぐために用いられてもよい。ヒーターと冷却装置とを組み合わせて用いることで、３−温度ＰＣＲ反応の実行等の液滴アクチュエーターでの所望の温度プロフィールが達成され得る。コントローラー（図示せず）を用いて、ヒーター２３１０およびペルチェ素子を制御してもよい。
図２３は、アセンブリ上で液滴アクチュエーターを所定位置に保持するためのクリップ２３２０も示している。操作の間、液滴アクチュエーターアセンブリを傷つけることなく、または操作を他に妨げることなく、液滴アクチュエーターアセンブリをしっかりと所定位置に保持するように配置されている限りは、いずれの種類の拘束要素でも適用可能である。
磁石を配置して、液滴アクチュエーターのビーズの固定が要求されている領域で磁場を補強してもよい。磁石を配置して、液滴アクチュエーター内の磁場が所望の操作を別に妨げる領域の磁場を取り消してもまたは消滅させてもよい。磁石を配置して、流束分布を作り出し、液滴アクチュエーター内のビーズの固定が要求されている領域で磁場を補強し、そして液滴アクチュエーター内の磁場が所望の操作を別に妨げる領域の磁場を消滅させてもよい。
図２４Ａおよび２４Ｂは、Halbach磁石配列２４００の一例の斜視図を表している。図２４Ａに関して一例では、Halbach磁石配列２４００は、立方体磁石２４１０ａ〜２４１０ｅ等の複数の立方体磁石２４１０を含んでいてもよい。各立方体磁石２４１０の磁場の方向が、矢印で示されている。立方体磁石２４１０の配列は、当該配列の一方の側面で磁場が強められるのに対して、配列の他の側面では磁場がほぼゼロにまで取り消されるものである。配列は、任意の回数繰り返されて、任意の長さの磁石配列を提供してもよい。
図２４Ｂは、集束磁石２４１２として役立つ１つ以上のポストを有するHalbach磁石配列２４００を表している。集束磁石２４１２は、Halbach磁石配列２４００の特定の位置に磁場をさらに集束させるために用いられる。例えば、Halbach磁石配列２４００は、集束磁石２４１２ａおよび２４１２ｂを含む。また、各集束磁石２４１２の磁場の方向が、矢印で示されている。
図２５Ａおよび２５Ｂは、例えば、図２４Ａおよび２４ＢのHalbach磁石配列２４００の、液滴アクチュエーター２５００の電極に対する磁場の関係を表している。液滴アクチュエーター２５００は、間隙２５１４で分離された底部基板２５１０および頂部基板２５１２を含んでいてもよい。底部基板２５１０は、液滴操作電極２５１６（例えば、電気濡れ電極）の通路または配列等の電極配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極２５１６頂部で行われる。
この例では、Halbach磁石配列２４００は、液滴アクチュエーター２５００の下に位置している。Halbach磁石配列２４００は、複数の立方体磁石２４１０ａ〜２４１０ｎを含んでいてもよい。図２５Ａおよび２５Ｂで、立方体磁石２４１０で作られる磁力線は、Halbach磁石配列２４００および液滴アクチュエーター２５００の頂部にかぶせて表現されている。立方体磁石２４１０は、例えば、４．５ｍｍ立方体磁石であってもよい。
図２５Ａおよび２５Ｂの磁力線は、磁場が一つおきの立方体磁石２４１０（例えば、立方体磁石２４１０ａ、２４１０ｃ、２４１０ｅ、２４１０ｇ、２４１０ｉ、２４１０ｋ、２４１０ｍ）に集中していることを示している。好ましい実施形態では、これらの集中した磁場領域が、例えば、４．５ｍｍ立方体磁石２４１０について約４．５ｍｍピッチで配置されている周期的な電極レーンに実質的にそろっている。この例では、集中した磁場領域が、約９ｍｍごとにある。他の例では、２．２５ｍｍ立方体磁石２４１０が用いられる場合、集中した磁場領域は、約４．５ｍｍごとにある。
図２６Ａおよび２６Ｂは、図２４Ａおよび２４ＢのHalbach磁石配列２４００に関連した図２５Ａおよび２５Ｂの液滴アクチュエーター２５００の他の図（すなわち、平面図）を表している。例えば、図２６Ａおよび２６Ｂは、液滴操作電極２５１６のいくつかのラインに関連したHalbach磁石配列２４００の立方体磁石２４１０を示している。図２６Ａは、集束磁石２４１２がないHalbach磁石配列２４００を示す一方、図２６Ｂは、集束磁石２４１２があるHalbach磁石配列２４００を示す。Halbach磁石配列２４００の配列は、立方体磁石２４１０の中央が液滴操作電極２５１６のラインにほぼ位置する配列である。一の用途では、Halbach磁石配列２４００は、サンプル濃縮の間等、所定の処理工程の間に、磁気応答性ビーズの空間的な固定を確実にするように位置されている。サンプル濃縮は、例えば、ビーズ濃縮手順の単一の工程を用いて行われてもよい。サンプル濃縮は、一連の分配ビーズ濃縮手順を用いて行われてもよい。サンプル濃縮方法の一例が図２７に関して記載される。
図２７は、液滴アクチュエーターでのサンプル濃縮の方法２７００のフローチャートを表している。例えば、方法２７００は、図２２Ａ、２２Ｂ、および２３の１つ以上の磁石アクチュエーター２２００を利用して、液滴アクチュエーターに関連した可動式磁石を提供してもよい。方法２７００は、アクチュエーター外で上限５０μＬのサンプル体積から始め、当該サンプルは、約５０〜１００ナノグラムの核酸を含む。次いで、アクチュエーター外で、サンプルは、結合バッファー溶液（５０μＬ）中のビーズと混合される。その結果、１００μＬの流体が、次いで、アクチュエーター外で一定時間（例えば、約１０分間）保温される。保温期間後に、その１００μＬの流体は、液滴アクチュエーターに装填される。次いで、磁石（例えば、１つ以上の磁石アクチュエーター２２００の立方体磁石２２１４）がサンプル流体に近接するように移動される。結果として、実質的に全てのビーズが、１００μＬのサンプル流体から引き抜かれ、立方体磁石２２１４の磁場内に濃縮される。ビーズは、次いで、洗浄され、溶離される。核酸が溶離され、液滴がビーズをスナップオフしてもよい。バッファー液滴を用いて、ビーズを回収し、ビーズを、例えば、廃棄リザーバまたは電極配列の未使用の領域に除去してもよい。
７．５ 液滴アクチュエーターと共に使用するローラーアセンブリ
本発明のローラーアセンブリは、磁石およびヒーター等の液滴アクチュエーターに関連した有用な所定の構成を収納する装置デッキ上に収まるように設計されている。本発明の液滴アクチュエーターは、多数の異なる次世代配列決定プラットフォームでの使用に応用され得るので、異なるライブラリー構築手順のために、装置構成の異なる配列が要求され得る。
本発明のローラーアセンブリは、磁石およびヒーター等の液滴アクチュエーターに関連した有用な所定の構成を収納する装置デッキ上に収まるように設計されている。本発明の液滴アクチュエーターは、多数の異なる次世代配列決定プラットフォームでの使用に応用され得るので、異なるライブラリー構築手順のために、装置構成の異なる配列が要求され得る。
図２８Ａ〜２８Ｄは、液滴アクチュエーターに関連した有用な他の構成の配列を含むローラーアセンブリ２８００の側面図および断面図を表している。図２８Ａに関して、ローラーアセンブリ２８００は、ローラー本体２８１０を含んでいてもよい。ローラー本体２８１０は、例えば、円筒状の形状であってもよい。ローラー本体２８１０は、取り付け棒（または軸）２８１２で装置（図示せず）に接続されていてもよい。ローラーアセンブリ２８００の回転（例えば、時計回りまたは反時計回り）は、ステッピングモーター等のモーター（図示せず）で制御されてもよい。図２８Ａおよび２８Ｂに関して、ローラー本体２８１０は、スロット２８１４ａ〜２８１４ｄ等の１つ以上のスロット２８１４を含んでいてもよく、当該スロットは、これらに限定されないが、磁石、温度制御装置、および超音波処理装置等の１つ以上の構成を含んでいてもよい。一の実施形態では、磁石２８１６ａ〜２８１６ｄは、スロット２８１４ａ〜２８１４ｄに、それぞれ位置されてもよい。各磁石２８１６は、永久磁石または電磁石であってもよい。一例では、各磁石２８１６は、棒磁石であってもよい。他の例では、各磁石２８１６は、複数のより小さい磁石（図示せず）であってもよい。他の例では、磁石２８１６は、異なる磁気の強さを有していてもよい。単一のローラーアセンブリ２８００は、異なる磁石、異なる磁気の強さ、異なる磁石の配列等を有する複数の磁石のセットを含んでいてもよい。
図２８Ｃおよび２８Ｄに関して、ローラーアセンブリ２８００は、液滴アクチュエーター２８１８に近接して位置されてもよい。液滴アクチュエーター２８１８は、底部基板２８２０を含んでいてもよい。底部基板２８２０は、液滴操作電極２８２２（例えば、電気濡れ電極）の配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極２８２２頂部で行われる。一例では、ローラーアセンブリ２８００は、スロット２８１４ａおよび磁石２８１６ａが所定の液滴操作電極２８２２にそろうように位置されてもよい。
操作では、磁気応答性ビーズ２８２６を含む液滴２８２４は、所定の液滴操作電極２８２２上に位置して、ローラーアセンブリ２８００の磁石２８１６ａにそろってもよい。磁石２８１６ａの磁力のため、磁気応答性ビーズ２８２６は、液滴操作電極２８２２の表面に保持される。ローラーアセンブリ２８００は、磁石２８１６ａが液滴２８２４から離れて移動されるように、例えば、反時計回りに回転されてもよい。ローラーアセンブリ２８００および磁石２８１６ａが回転して液滴２８２４から離れるので、磁石２８１６ａの磁力の低減のため、磁気応答性ビーズ２８２６は液滴２８２４内で再び懸濁される。一例では、ローラーアセンブリ２８００は、液滴２８２４が磁石２８１６ａおよび２８１６ｂの間に位置するように回転および停止されてもよい。この位置では、液滴２８２４は、磁石２８１６ａおよび２８１６ｂの磁場の外にあってもよい（すなわち、磁石２８１６ａおよび２８１６ｂの磁場が、基本的に「遮断」されている）。
他の実施形態では、スロット２８１４内の１つ以上の磁石２８１６は、いくつかの反応ゾーンおよび／または洗浄ゾーン内の温度を制御するために、ヒーターアセンブリまたは冷却アセンブリ（例えば、熱電冷却器またはペルチェ素子）に置換されてもよい。他の実施形態では、スロット２８１４内の１つ以上の磁石２８１６は、細胞***および核酸せん断に用いられる音波処理器等の超音波処理装置に置換されてもよい。他の実施形態では、磁石、ヒーター、冷却器、音波処理器、および他の構成の任意の組み合わせが、ローラーアセンブリ２８００内で用いられてもよい。ローラーアセンブリ２８００の回転により、様々な構成が所定の液滴操作領域に関する位置に対して近づけられ、および離れされ得るため、液滴アクチュエーター上の同じ領域が、デジタル微小流体検査で複数の異なる処理に用いられてもよい。他の実施形態では、異なるローラーアセンブリ２８００が、特定の検査要求および／またはアクチュエーターサイズおよび構造に適合する特殊化した構成配列に提供されてもよい。ローラーアセンブリ２８００は、一のローラーアセンブリ２８００が、装置から容易に除去され、当該装置に異なるローラーアセンブリ２８００が容易に挿入されるように設計されていてもよい。
７．６ 廃棄液滴の処分
図２９Ａおよび２９Ｂは、それぞれ、液滴アクチュエーター２９００の一部の一例の平面図および断面図を表し、液滴を投棄して廃棄する方法を示している。液滴アクチュエーター２９００は、間隙２９１４で分離された底部基板２９１０および頂部基板２９１２を含んでいてもよい。間隙２９１４は、高さｈ１を有する。底部基板２９１０は、例えば、ＰＣＢであってもよい。頂部基板２９１２は、例えば、ガラス、射出成型プラスチック、ケイ素、および／またはＩＴＯから作られていてもよい。液滴アクチュエーター２９００は、液滴操作電極２９１６（例えば、電気濡れ電極）の配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極２９１６頂部で行われる。
図２９Ａおよび２９Ｂは、それぞれ、液滴アクチュエーター２９００の一部の一例の平面図および断面図を表し、液滴を投棄して廃棄する方法を示している。液滴アクチュエーター２９００は、間隙２９１４で分離された底部基板２９１０および頂部基板２９１２を含んでいてもよい。間隙２９１４は、高さｈ１を有する。底部基板２９１０は、例えば、ＰＣＢであってもよい。頂部基板２９１２は、例えば、ガラス、射出成型プラスチック、ケイ素、および／またはＩＴＯから作られていてもよい。液滴アクチュエーター２９００は、液滴操作電極２９１６（例えば、電気濡れ電極）の配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極２９１６頂部で行われる。
本発明の一態様は、頂部基板および／または底部基板に、および液滴操作電極に隣接して、液滴を投棄するための陥凹エリアを含む。一例では、図２９Ａおよび２９Ｂは、陥凹エリア２９１８をさらに含む頂部基板２９１２を示している。陥凹エリア２９１８で作られる底部基板２９１０と頂部基板２９１２との間の空洞は、高さｈ２を有し、間隙２９１４の高さｈ１より大きい。配列は、より大きい間隙高さの領域でよりエネルギー的に安定なコンホメーションへの液滴の変形により引き起こされる移動の結果として、液滴が陥凹エリアに入るように構成されていてもよい。
操作では、いくつかの液滴操作電極２９１６の電源がオンである限り、液滴は電極通路にとどまる。しかしながら、電源がオンになっている液滴操作電極２９１６がない場合、液滴にとってエネルギー的に安定な位置は、隣接する陥凹エリアにある。すなわち、毛管力のために液滴は、この空間に引き込まれる。したがって、液滴は、もはや不要の場合は、電極通路から投棄され得る。
例として、図２９Ａおよび２９Ｂは、電極が電源オンになっているときに、所定の液滴操作電極２９１６頂部に位置している所定の液滴２９２０を示している。図２９Ａおよび２９Ｂは、通路から投棄され、陥凹エリア２９１８にある液滴２９２２も示している。
陥凹エリア２９１８の形状は、例えば、階段状またはスロープ状であってもよく、当該形状が、投棄された液滴が電極通路に干渉しないように、投棄された液滴が電極通路から十分に離れた位置に保持されるのを補助する。同様に、液滴が容易に陥凹領域に移動し過ぎる場合、液滴移動を遅くするために、頂部基板および／または底部基板に突起部または障害物が含まれていてもよい。活性化された電極の存在下では液滴を電極通路に保持するが、移動の結果として、液滴が陥凹領域に入り得るどのような移行領域であっても適用可能である。
図３０は、図２９Ａおよび２９Ｂの液滴アクチュエーター２９００の他の実施形態の断面図を表している。この実施形態では、陥凹エリア２９１８が開口している（例えば、頂部基板２９１２の開口部２９３０）。図３０は、液滴アクチュエーター２９００内の充填流体２９３２も示している。頂部基板２９１２内に開口部２９３０が存在するため、液滴は、毛管誘電泳動または他の処理のために、例えば、ピペットで、または他の装置もしくはこの装置の一部に、回収され得る。
７．７ ＰＣＲ増幅および高分解能融解（ＨＲＭ）分析
１つ以上の目的遺伝子内でのシークエンスバリエーション（例えば、単一ヌクレオチド多型、ヌクレオチド反復多型、突然変異走査、および核酸メチル化の評価）の検出のために、ＨＲＭ分析は、ＰＣＲ増幅と組み合わせて用いられてもよい。ＰＣＲアンプリコンは、飽和核酸挿入蛍光染料、５’−標識されたプライマー、または標識されたプローブを用いて、増幅の間、蛍光標識されてもよい。様々な実施形態で、本発明は、液滴アクチュエーター系サンプル調製および同じ液滴アクチュエーターでのシークエンスバリエーションの検出をも提供する。
１つ以上の目的遺伝子内でのシークエンスバリエーション（例えば、単一ヌクレオチド多型、ヌクレオチド反復多型、突然変異走査、および核酸メチル化の評価）の検出のために、ＨＲＭ分析は、ＰＣＲ増幅と組み合わせて用いられてもよい。ＰＣＲアンプリコンは、飽和核酸挿入蛍光染料、５’−標識されたプライマー、または標識されたプローブを用いて、増幅の間、蛍光標識されてもよい。様々な実施形態で、本発明は、液滴アクチュエーター系サンプル調製および同じ液滴アクチュエーターでのシークエンスバリエーションの検出をも提供する。
一の実施形態では、本発明の液滴アクチュエーター装置および方法は、（ｉ）核酸の調製、（ｉｉ）ターゲットＰＣＲ増幅および（ｉｉｉ）脆弱Ｘ症候群の遺伝子型決定をするためのＨＲＭ分析、に用いられてもよい。
目的遺伝子内のシークエンスバリエーション（例えば、多型、突然変異、およびメチル化）の検出用のデジタル微小流体手順は、ターゲットシークエンスのＰＣＲ増幅と、単一の液滴アクチュエーターでのターゲットアンプリコンの高分解能溶融（ＨＲＭ）分析とを組み合わせる。ＨＲＭ分析は、目的遺伝子の二本鎖ターゲットシークエンス（すなわち、アンプリコン）についての核酸溶融温度の物理的特性に基づいている。生物体の各遺伝子（個々の）は、通常、２つ（またはそれ以上）のコピー、すなわち、２つの対立遺伝子が存在する。対立遺伝子は、同一、すなわち同型接合性であってもよく、または異なって、すなわち異型接合性であってもよい。核酸サンプルの増幅の間、両方の対立遺伝子が増幅される。増幅された核酸は、変性され、ＰＣＲ後にＨＲＭ分析のために冷却されるので、アニールされた二本鎖アンプリコンの異なる組み合わせが形成され得る。同型接合性サンプルは、ホモ二本鎖となる。シークエンスの組成の違いのため、異なる同型接合性サンプルは、異なる溶融曲線をもたらす異なる変性温度を有する。異型接合性サンプルは、２つの異なる対立遺伝子を含み、２つの異なる対立遺伝子はホモ二本鎖（すなわち、２つのホモ二本鎖生成物）とヘテロ二本鎖（すなわち、２つのヘテロ二本鎖生成物）の両方を形成する。ヘテロ二本鎖は、核酸の非相補鎖のアニーリングから生じ、核酸の非相補鎖は、例えば、サンプルの急冷の間に形成する。ヘテロ二本鎖内の誤対合領域のため、二本鎖アンプリコンは不安定であり、そのため、低温で解離する。低い溶融温度は、異なる溶融曲線プロフィールを作成する。異なる溶融曲線プロフィールが作成されるため、異型接合性サンプルは、同型接合性サンプルから区別され得る。
デジタル微小流体手順では、急速なＰＣＲ熱サイクルが、各サイクルで反応液滴がオイルが充填された液滴アクチュエーター内の異なる温度ゾーン間を循環的に輸送されるフォーマットを経たフローで行われてもよい。ＰＣＲ反応のモニターと続くＨＲＭ分析のために、ターゲットアンプリコンへの蛍光標識の組み込みを用いてもよい。一の実施形態では、ターゲットアンプリコンは、LCGreen（UT、Salt Lake City、 Idaho Technology社から入手可能）、EvaGreen（CA、Hayward、Biotium社から入手可能）、またはSYTO 9（CA、Carlsbad、Life Technology社のInvitrogen（商標）から入手可能）等の飽和二本鎖核酸挿入染料を用いたＰＣＲ増幅の間、蛍光標識されてもよい。他の実施形態では、５−蛍光標識されたプライマーを用いてターゲットアンプリコンを標識してもよい。他の実施形態では、蛍光標識されたプローブを用いてターゲットアンプリコンを標識してもよい。最適な循環パラメーターと試薬濃度とを含む確立されたＰＣＲ手順が、各目的遺伝子のために選択されてもよく、当該試薬は、Ｔａｑポリメラーゼ、バッファーおよびプライマー（順方法のプライマーと逆方向のプライマー）を含む。例えば、順方法のプライマーと逆方向のプライマーのシークエンスおよび長さを選択して、対立遺伝子の正確な識別に十分な長さのアンプリコンを作製してもよい。各プライマーの濃度、プライマーアニーリング温度およびマグネシウム濃度を選択して、高収率での目的遺伝子の特有の増幅を提供してもよい。アニーリング時間／延長時間および熱サイクルの数を選択して、高品質アンプリコンとＰＣＲ−ＨＲＭ一体手順での迅速な処理能力を提供してもよい。
対立遺伝子識別のための確立されたＨＲＭ手順は、液滴アクチュエーター１，２での使用に応用されてもよい。例えば、ＨＲＭ分析の前に、増幅された核酸は、通常、ヘテロ二本鎖形成を高めるように選択された変性およびアニーリングの最終ラウンドにかけられる。変性と冷却の速度は、ヘテロ二本鎖の実質的な形成のために選択されてもよい。一例では、より高い加熱速度（例えば、０．４℃／秒）および急速な冷却速度（例えば、約０．１℃／秒より大きく、約５℃／秒未満）を選択して、対立遺伝子のより正確な識別のためのより多くのヘテロ二本鎖を作製してもよい。他の例では、アニーリングバッファーのイオン強度（例えば、低イオン強度）が、ヘテロ二本鎖の実質的な形成のために選択されてもよい。直接溶融、すなわち、選択した温度遷移速度（例えば、０．０５℃／秒）での約５０℃〜約９５℃の核酸アンプリコンの正確な加温を用いて、最終ＨＲＭ分析が、二本鎖核酸アンプリコンについて行われてもよい。
７．８ 液滴分配電極構成
図３１は、電極配列３１００の一例の一部の平面図および２倍液滴分配のためのリザーバ分配シークエンスを表している。電極配列３１００は、（流体リザーバの）分配電極３１１０を含んでいてもよく、当該分配電極は、複数の別個に制御される電極に区分けされている。例えば、分配電極３１１０の中心に沿って、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、３１１２Ｃ、および３１１２Ｄがあってもよい。より小さなリザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、および３１１４Ｄが、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、３１１２Ｃ、および３１１２Ｄの一方の側面に配置されていてもよい。より小さなリザーバ側面電極３１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、３１１４ＣＣ、および３１１４ＤＤが、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、３１１２Ｃ、および３１１２Ｄの他の側面に配置されていてもよい。分配電極３１１０の区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄは、液滴操作電極（例えば、電気濡れ電極）の通路、ライン、および／または配列に関連して配置されている；以降、通路電極３１１６という。加えて、通路側面電極３１１８Ａが、通路電極３１１６の一方の側面に配置されてもよく、一方、通路側面電極３１１８Ｂが、通路電極３１１６の他の側面に配置されてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上のこれら様々な電極頂部で行われる。複数の別個に制御される電極を含む分配電極３１１０は、複雑な液滴混合操作および／または液滴分配操作を行うよう設計された流体リザーバを支持する。
図３１は、電極配列３１００の一例の一部の平面図および２倍液滴分配のためのリザーバ分配シークエンスを表している。電極配列３１００は、（流体リザーバの）分配電極３１１０を含んでいてもよく、当該分配電極は、複数の別個に制御される電極に区分けされている。例えば、分配電極３１１０の中心に沿って、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、３１１２Ｃ、および３１１２Ｄがあってもよい。より小さなリザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、および３１１４Ｄが、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、３１１２Ｃ、および３１１２Ｄの一方の側面に配置されていてもよい。より小さなリザーバ側面電極３１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、３１１４ＣＣ、および３１１４ＤＤが、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、３１１２Ｃ、および３１１２Ｄの他の側面に配置されていてもよい。分配電極３１１０の区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄは、液滴操作電極（例えば、電気濡れ電極）の通路、ライン、および／または配列に関連して配置されている；以降、通路電極３１１６という。加えて、通路側面電極３１１８Ａが、通路電極３１１６の一方の側面に配置されてもよく、一方、通路側面電極３１１８Ｂが、通路電極３１１６の他の側面に配置されてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上のこれら様々な電極頂部で行われる。複数の別個に制御される電極を含む分配電極３１１０は、複雑な液滴混合操作および／または液滴分配操作を行うよう設計された流体リザーバを支持する。
本発明の区分けされた分配電極３１１０の一態様は、リザーバが十分に充填されていないとき、様々な大きさの液滴を分配するために、流体のより小さな体積が、分配電極３１１０の分配末端に移動され得るというものである。加えて、通路電極３１１６の側面にある通路側面電極３１１８は、活性化されて、分配電極３１１０の液体を引き抜き、電極通路上に移すのを補助してもよい。次いで、通路側面電極３１１８が非活性化され、次いで、通路上の中間電極が非活性化され、分配された液滴を生成する。リザーバ分配シークエンスの例が、図３１、３２、および３３を参照して示されている。
再び図３１に関して、２倍液滴分配のためのリザーバ分配シークエンスの一例は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。
工程１では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが非活性化される；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄが活性化される；そして、リザーバ側面電極３１１４Ｄおよび３１１４ＤＤが活性化される。このようにして、一定量の流体（図示せず）が、分配電極３１１０の分配末端に引かれ得る。分配電極３１１０の分配末端は、通路電極３１１６のラインに最も近い端である。
工程２では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが非活性化されたままである；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化されたままである；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄが活性化されたままである；そして、リザーバ側面電極３１１４Ｄおよび３１１４ＤＤが活性化されたままである。加えて、ラインの初めの４つの通路電極３１１６が活性化され、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂの両方が活性化される。結果として、所定体積の流体（図示せず）が、さらに通路電極３１１６のライン上に引かれ得る。
工程３では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが非活性化されたままである；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化されたままである；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄが活性化されたままである；そして、リザーバ側面電極３１１４Ｄおよび３１１４ＤＤが活性化されたままである。ラインの初めの４つの通路電極３１１６が活性化されたままである。通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂの両方が活性化されたままである。加えて、ラインの隣（５番目）の通路電極３１１６が、活性化され、所定体積の流体（図示せず）が、さらに通路電極３１１６のライン上に引かれる。
工程４では、全てのリザーバ側面電極３１１４が非活性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄを除いて、全ての区分けされたリザーバ電極３１１２が、非活性化される；そして、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂも非活性化される。区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄおよび５つの通路電極３１１６のみが活性化されたままである。これにより、所定体積の流体が、５つの通路電極３１１６のラインに沿って、分配電極３１１０の区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄに集中する。
工程５では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａおよび３１１２Ｂが非活性化される；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４ＡＡ、および３１１４ＢＢが非活性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｃおよび３１１２Ｄが活性化される；そして、側面電極３１１４Ｃ、３１１４Ｄ、３１１４ＣＣ、および３１１４ＤＤが活性化される。加えて、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂが、非活性化されたままである。さらに、ラインの３番目の通路電極３１１６が非活性化されるのに対し、１番目、２番目、４番目、および５番目の通路電極３１１６は活性化されたままである。中間通路電極３１１６の１つが電源オフになり、２倍液滴（図示せず）が例えば、４番目と５番目の通路電極３１１６頂部に残されるため、結果として、液滴分割操作が起こる。
図３２は、図３１の電極配列３１００の平面図および１倍液滴を分配するためのリザーバ分配シークエンスを表している。１倍液滴分配のためのリザーバ分配シークエンスの一例は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。
工程１では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが非活性化される；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄが活性化される；そして、リザーバ側面電極３１１４Ｄおよび３１１４ＤＤが活性化される。このようにして、一定量の流体（図示せず）が、分配電極３１１０の分配末端に引かれ得る。分配電極３１１０の分配末端は、通路電極３１１６のラインに最も近い端である。
工程２では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが非活性化されたままである；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化されたままである；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄが活性化されたままである；そして、リザーバ側面電極３１１４Ｄおよび３１１４ＤＤが活性化されたままである。加えて、ラインの初めの４つの通路電極３１１６が活性化され、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂの両方が活性化される。さらに、ラインの５番目の通路電極３１１６が非活性化される。結果として、所定体積の流体（図示せず）が、さらに通路電極３１１６のライン上に引かれ得る。
工程３では、全てのリザーバ側面電極３１１４が非活性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄを除いて、全ての区分けされたリザーバ電極３１１２が、非活性化される；そして、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂも非活性化される。区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄおよび５つの通路電極３１１６のうち初めの４つのみが活性化されたままである。これにより、４つの通路電極３１１６のラインに沿って、所定体積の流体が、分配電極３１１０の区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄに集中する。
工程４では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａおよび３１１２Ｂが非活性化される；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４ＡＡ、および３１１４ＢＢが非活性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｃおよび３１１２Ｄが活性化される；そして、側面電極３１１４Ｃ、３１１４Ｄ、３１１４ＣＣ、および３１１４ＤＤが活性化される。加えて、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂが、非活性化される。ラインの１番目、２番目、および４番目の通路電極３１１６は活性化されたままである。さらに、ラインの３番目の通路電極３１１６が非活性化されるのに対し、ラインの１番目、２番目、および４番目の通路電極３１１６は活性化されたままである。中間通路電極３１１６の２つが電源オフになり、１倍液滴（図示せず）が例えば、４番目の通路電極３１１６頂部に残されるため、結果として液滴分割操作が起こる。
図３３は、図３１の電極配列３１００の他の実施形態の平面図および１倍液滴を分配するための他のリザーバ分配シークエンスを表している。電極配列３１００のこの実施形態では、示したように、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂの大きさと、分配電極３１１０の区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄに関連した通路電極３１１６の位置が、若干変更されている。より詳細には、通路電極３１１６に関連した通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂのずれが、液体が隣接する電極に進行するのを補助する。すなわち、１倍液滴を分配するためのリザーバ分配シークエンスの他の例は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。
工程１では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａおよび３１１２Ｂが非活性化される；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４ＡＡ、および３１１４ＢＢが非活性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｃ、３１１２Ｄが活性化される；そして、側面電極３１１４Ｃ、３１１４Ｄ、３１１４ＣＣ、および３１１４ＤＤが活性化される。加えて、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂが非活性化される。さらに、通路電極３１１６が非活性化される。このようにして、一定量の流体（図示せず）が、分配電極３１１０の分配末端に引かれ得て、分配電極３１１０の分配末端は、通路電極３１１６のラインに最も近い端である。
工程２では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが非活性化される；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄが活性化されたままである；そして、リザーバ側面電極３１１４Ｄおよび３１１４ＤＤが活性化されたままである。加えて、ラインの初めの２つの通路電極３１１６が活性化され、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂの両方が活性化される。結果として、所定体積の流体（図示せず）が、さらに通路電極３１１６のライン上に引かれ得る。
工程３では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａ、３１１２Ｂ、および３１１２Ｃが非活性化されたままである；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４Ｃ、３１１４ＡＡ、３１１４ＢＢ、および３１１４ＣＣが非活性化されたままである；そして、区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄが活性化されたままである。リザーバ側面電極３１１４Ｄおよび３１１４ＤＤが今度は非活性化される。加えて、今度はラインの初めの３つの通路電極３１１６が活性化される。これにより、流体（図示せず）が、通路電極３１１６のラインに集中し、同様に、分配電極３１１０の区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄ上ならびにリザーバ側面電極３１１４Ｄおよび３１１４ＤＤ上にも集中する。
工程４では、全てのリザーバ側面電極３１１４が非活性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄを除いて、全ての区分けされたリザーバ電極３１１２が、非活性化される；そして、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂも非活性化される。区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄおよび初めの３つの通路電極３１１６が活性化されたままである。これにより、所定体積の流体が、初めの３つの通路電極３１１６に沿って、分配電極３１１０の区分けされたリザーバ電極３１１２Ｄに集中する。
工程５では、区分けされたリザーバ電極３１１２Ａおよび３１１２Ｂが非活性化される；リザーバ側面電極３１１４Ａ、３１１４Ｂ、３１１４ＡＡ、および３１１４ＢＢが非活性化される；区分けされたリザーバ電極３１１２Ｃおよび３１１２Ｄが活性化される；そして、側面電極３１１４Ｃ、３１１４Ｄ、３１１４ＣＣ、および３１１４ＤＤが活性化される。加えて、通路側面電極３１１８Ａおよび３１１８Ｂが非活性化されたままである。さらに、通路電極３１１６のラインの２番目の通路電極３１１６が非活性化されるのに対し、１番目および３番目の通路電極３１１６は活性化されたままである。中間通路電極３１１６の１つが電源オフになり、１倍液滴（図示せず）が例えば、３番目の通路電極３１１６頂部に残されるため、結果として液滴分割操作が起こる。
図３４Ａ〜３４Ｅは、液滴アクチュエーターの電極配列３４００の一部の一例の平面図を表し、液滴アクチュエーターでの対立遺伝子識別のためのＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析を一体化する方法を示している。図３４Ａ〜３４Ｅの本発明の方法は、増幅およびＨＲＭ分析手順の一例であり、ここでターゲットアンプリコンは、LCGreen等の飽和二本鎖核酸挿入染料を用いたＰＣＲ増幅の間、蛍光標識されてもよい。挿入染料は、二本鎖核酸に特異的に結合する。挿入染料が二本鎖核酸に結合すると、蛍光シグナルが作られる。ＨＲＭ分析の間、二本鎖核酸が加熱され、核酸の二本鎖が溶離し、二本鎖核酸の存在が減少し、その結果として蛍光シグナルが少なくなる。蛍光の減少速度は、通常、ＰＣＲ生成物の溶融温度（Ｔｍ）近くで最大である。溶融温度は、ＧＣ−含有量（ＴｍはＧＣリッチなＰＣＲ生成物でより高い）、長さ、およびシークエンス含有量を含むＰＣＲ生成物特性の関数である。データは、取得し、相対的な蛍光対温度、および／または、派生溶融ピークを示す溶融曲線としてプロットしてもよい。
電極配列３４００は、ＰＣＲ増幅とＨＲＭ分析用に構成された液滴操作電極３４１０の配列を含んでいてもよい。液滴操作は、液滴操作表面上の液滴操作電極３４１０頂部で行われる。温度制御ゾーン３４１２ａおよび３４１２ｂ等の２つの温度制御ゾーン３４１２は、電極配列３４００と関連してもよい。温度制御素子（図示せず）は、温度制御ゾーン３４１２ａおよび３４１２ｂ周辺の充填流体（図示せず）の温度を制御する。例えば、温度制御ゾーン３４１２ａは、約９５℃まで加熱されてもよく、当該温度は、二本鎖核酸の変性に十分な温度である。温度制御ゾーン３４１２ｂは、例えば、約５５℃まで加熱されてもよく、当該温度は、プライマーアニーリングと延長に十分な温度である。
一例では、温度制御ゾーン３４１２ａおよび３４１２ｂは、ＰＣＲ熱サイクルのために用いられてもよい。他の例では、温度制御ゾーン３４１２ｂの熱条件は、ＨＲＭ分析用の溶融曲線の取得のために調整されてもよい。２つの温度制御ゾーン３４１２を示したが、任意の数の温度制御ゾーン３４１２が、電極配列３４１０と関連してもよい。検出スポット３４１４は、温度制御ゾーン３４１２ｂ内の液滴操作電極３４１０Ｄに近接して配置されてもよい。
ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析の一般的な方法の一例は、これらに限定されないが、以下の工程を含んでいてもよい。
一の工程では、図３４Ａは、温度制御ゾーン３４１２ａ内の所定の液滴操作電極３４１０に位置しているサンプル液滴３４１６を示している。サンプル液滴３４１６は、例えば、増幅のための核酸テンプレート（核酸ターゲット）を含んでいてもよい。一例では、核酸テンプレートは、特定遺伝子用の目的変異領域を含んでいてもよい。サンプル液滴３４１６が温度制御ゾーン３４１２ａ内にあるため、核酸テンプレートは変性（一本鎖）される。
他の工程では、図３４Ｂおよび３４Ｃは、保温方法を示し、当該方法で、試薬液滴３４１８が、液滴操作を用いて温度制御ゾーン３４１２ａ内のサンプル液滴３４１６と混合され、反応液滴３４２０を生成する。試薬液滴３４１８は、ターゲット増幅用のプライマーおよびＰＣＲ試薬（例えば、ｄＮＴＰｓ、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ）を含んでいてもよい。試薬液滴３４１８は、LCGreen等の蛍光飽和ＤＮＡ挿入染料を含んでいてもよい。反応液滴３４２０は、液滴操作を用いて温度制御ゾーン３４１２ｂ内の特定の液滴操作電極３４１０に輸送される。反応液滴３４２０は、温度制御ゾーン３４１２ｂで、プライマーアニーリング／延長および蛍光挿入染料の組み込みに十分な期間保温される。反応液滴３４２０は、ターゲット核酸のＰＣＲ増幅のために、温度反応ゾーン３４１２ｂおよび３４１２ａの間を液滴操作を用いて任意の数のサイクルを前後して繰り返し輸送されてもよい。
図３４Ｃに関して、反応液滴３４２０は、液滴操作を用いて液滴操作電極３４１０Ｄに輸送されてもよく、当該電極は、検出スポット３４１４の範囲内にある。検出スポット３４１４に近接して配置された画像化装置（例えば、蛍光光度計、図示せず）を用いて、反応液滴３４２０の蛍光の量を捕捉および定量化してもよい。増幅された核酸は、任意の数の増幅サイクル後（すなわち、リアルタイムまたは完了点）に検出されてもよい。
図３４Ｄは、ＰＣＲ増幅の完了後に、液滴操作を用いて温度制御ゾーン３４１２ａ内の特定の液滴操作電極３４１０に輸送された反応液滴３４２０を示している。この工程では、反応液滴３４２０内の増幅された核酸の最終変性および冷却が行われ、対立遺伝子のより正確な識別のための多数のヘテロ二本鎖を生成する。一例では、温度制御ゾーン３４１２ａ内の温度を調整して、ヘテロ二本鎖の形成を高める、より高い加熱速度（例えば、０．４℃／秒）および急速な冷却速度（例えば、約０．１℃／秒より大きく、約５℃／秒未満）を提供してもよい。
図３４Ｅは、液滴操作を用いて温度制御ゾーン３４１２ｂ内の液滴操作電極３４１０Ｄに輸送された反応液滴３４２０を示し、当該電極は、検出スポット３４１４の範囲内にある。この工程では、ＨＲＭ分析が行われる。一例では、温度制御ゾーン３４１２ｂ内の温度は、傾斜速度０．２℃／秒で約５０℃〜約９５℃で調整されていてもよい。検出スポット３４１４に近接して配置された画像化装置（例えば、蛍光光度計、図示せず）を用いて、温度の上昇に伴い反応液滴３４２０の蛍光の量を連続して捕捉および定量化する。
本発明は、液滴アクチュエーターでの脆弱Ｘ症候群の検出用の一体化されたＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析方法を提供する。脆弱Ｘ症候群は、Ｘ染色体上の脆弱なＸ−精神遅滞１（ＦＭＲ１）遺伝子の５’−未翻訳領域での単一ＣＧＧトリヌクレオチド反復の延長と関連している。この遺伝子でエンコードされたＦＭＲ１タンパク質は、正常な神経発達に要求される。脆弱Ｘ突然変異がない人々の間で、ＣＧＧ反復の数は、６〜約４０まで異なる。脆弱Ｘ突然変異は、増大したＣＧＧ反復の数を伴う。順列と呼ばれる約５５〜約２００のＣＧＧ反復の増大が、影響を受けないキャリアで見られる。約４０〜約５５の反復は、正常な大きさの範囲および順列の大きさの範囲が重なる「グレーゾーン」と考えられる。完全順列と呼ばれる２００反復を超える増大は、核酸のその領域の増大したメチル化に関連し、当該メチル化はＦＭＲ１タンパク質の発現を効果的に抑制する。
一の実施形態では、本発明は、液滴系の一体化された、ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ検査のための方法を提供する。当該一体化されたＨＲＭ検査は、ＦＲＭ１アンプリコン溶融点とＣＧＧ反復ドメインの長さとが相互に関連する。核酸分子の溶融温度は、核酸分子の長さと、核酸分子の特定のヌクレオチドシークエンス構成（例えば、より高いＴｍは、より高いＧＣ含有量と関連する）との両方に依存する。一例では、ＰＣＲプライマーを選択して、脆弱Ｘ症候群と関連することが示されたＦＭＲ１対立遺伝子のＣＧＧ反復ドメインの領域を増幅してもよい。プライマー対（順方向のプライマーおよび逆方向のプライマー）を選択して、多型ＣＧＧ領域内での対立遺伝子の正確な識別のための十分な長さのアンプリコンを作製してもよい。ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析は、図１に関して記載したように行われてもよい。
他の実施形態では、本発明は、液滴系の一体化された、ＰＣＲ増幅およびＨＲＭ検査用の方法を提供する。当該一体化されたＨＲＭ検査は、ＦＲＭ１アンプリコン溶融点とＦＲＭ１対立遺伝子のメチル化とが相互に関連する。メチル化固有溶融曲線分析による、高メチル化されたＦＭＲ１対立遺伝子の検出に基づく脆弱Ｘ症候群のための既存の検査は、液滴アクチュエーター３での使用に適応されてもよい。一般的に、メチル化固有溶融曲線分析は、ＰＣＲ増幅の前に、分離された核酸の亜硫酸水素ナトリウム処理を用いる。亜硫酸水素塩処理は、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換するのに用いられるが、メチル化されたシトシンは未変化４のままである。続くＰＣＲ増幅の間、ウラシルは、次いでチミンに変換されるのに対し、メチルシトシンは、シトシンとして増幅される。メチルシトシンの異なる含有量を有する亜硫酸水素塩処理された核酸テンプレートから生成したＰＣＲ生成物は、溶融温度で違いを示し、その違いは、溶融分析で解決され得る。溶融プロフィールを用いて、４つの異なるメチル化状態を区別してもよい：メチル化されていない対立遺伝子は、単一の低い溶融ピークを生成し、完全メチル化対立遺伝子は、単一の高い溶融ピークを生成し、メチル化されていない対立遺伝子と完全メチル化対立遺伝子との混合物は、低い溶融ピークと高い溶融ピークの両方を生成し、そして、不均一にメチル化された対立遺伝子は、低い溶融ピークと高い溶融ピーク３の間に位置する幅広の溶融ピークを生成する。
一例では、シリカ超常磁性応答ビーズ（ＳＳＢｓ）５を用いた核酸メチル化の単一チューブ分析は、液滴アクチュエーター上での使用に適応されてもよい。メチル化固有溶融曲線分析のためのデジタル微小流体手順の一例は、これに限定されないが、以下を含んでいてもよい：核酸は、口腔内擦過物からの液滴アクチュエーターで、CHARGESWITCH（登録商標）ビーズ等の超常磁性応答ビーズを用いて調製されてもよい。磁気応答性ビーズ上の精製された核酸と共に磁気応答性ビーズを含むサンプル液滴は、液滴操作を用いて、分配され、温度制御ゾーンまで輸送され、精製された核酸は、例えば、４２℃でのアルカリ処理（ＮａＯＨ）を用いて変性される。その中に変性された核酸を有するサンプル液滴は、液滴操作を用いて亜硫酸水素塩試薬液滴と混合され、反応液滴を生成する。反応液滴は、例えば、５５℃で、メチル化されていないシトシンがウラシルに変換するのに十分な期間保温される。亜硫酸水素塩変換の後、反応液滴は、液滴操作を用いて磁石のある所まで輸送され、混合および分割洗浄手順を用いて洗浄されて、変換された核酸が精製される。精製された核酸は、次いで、CHARGESWITCH（登録商標）ビーズから、10mMのトリスHCl、1mMのEDTAを用いてpH7.4で溶離される。CHARGESWITCH（登録商標）ビーズを囲む液滴に含まれる溶離核酸は、次いで、液滴系の一体化されたＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析を行うために、ビーズから離して輸送されてもよい。図１に関して記載したように、変換されたサンプル液滴についてＰＣＲ増幅およびＨＲＭ分析が行われてもよい。ＰＣＲ増幅のために、メチル化非感受性増幅用またはメチル化感受性増幅用のプライマーが選択されてもよい。
７．９ システム
ライブラリー構築カートリッジに関して、ユーザーは、カートリッジを再使用しようと試みることがあり、または、２４のサンプルが入手可能な場合、ユーザーは、いくつかのサンプルを今実行し、残りのサンプルを後で実行しようとすることがある。このことは、品質保証等の多くの理由から、望ましいことではない場合がある。一の実施形態では、ＰＣＢで、またはカートリッジ内でヒューズが飛ぶことがある。ヒューズは、ＰＣＢにはんだづけされた電子部品であったり、またはＰＣＢ上の配線（例えば、銅以外の材料で形成された）かもしれない。ヒューズは、例えば、装置全体で物理的に好ましい頂部プレートへの通路に置かれてもよい。装置の物理的な無力化に代わる手段として、ヒューズは少しのデータを保存するのに用いられることがある。この場合、制御者は、運転を進める前に、ヒューズの状態を調べる。この場合、「ヒューズ」は、制御者に書かれたまたは読まれたその電気状態を有することがあり、例えば、静電容量の変化は、状態を表す開路／ショートの代わりに用いられることがある。他の実施形態では、装置は、金属化されたブリスターパックであってもよく、または、他の使い捨ての特徴を有していてもよく、使用状態またはカートリッジの耐久性を検出するのに用いられる電気的痕跡を生成し得る。この場合、「書き込み」は、カートリッジの通常の使用を通じて作製され、装置は検出機能のみを実行する。他の実施形態では、複数のデータがカートリッジ内でエンコードされてもよい。例えば、カートリッジは、他のデータと同様に、カートリッジの使用状態をエンコードするのに用いられＥＥＰＲＯＭを含み得る。一の実施形態では、ＥＥＰＲＯＭ認証システムは、カートリッジの再使用を避けるように設計され、ユーザーの次善策としてのＥＥＰＲＯＭのクローン作製および置換にも抵抗する。使用状態以外の他の多くの種類のデータがＥＥＰＲＯＭに含まれ得る。１つの特徴は、バーコードナンバーを含んでいてもよい。カートリッジのバーコードステッカーは、バーコードリーダーで、研究所の自動システムに対してカートリッジを同定するために用い得る。他の実施形態では、核酸用途について追加の代替策は、再使用を防ぐためにカートリッジ内部表面を意図的に汚染することである。例えば、最終工程として、高濃度の核酸を含む液滴を、以前に未使用の領域も含めてカートリッジ全体を送ることができる。したがって、意図的にカートリッジ内部表面を汚染し、再使用を防ぐ。１９９９年８月１９日に出願された題名「Indicator Components For Microfluidic Sytems」の米国特許第6,495,104号明細書の開示全体を参照して、カートリッジが使用されたか否かを特定するために有用で好適な指示素子に関する教示が参照により本明細書に援用される。
ライブラリー構築カートリッジに関して、ユーザーは、カートリッジを再使用しようと試みることがあり、または、２４のサンプルが入手可能な場合、ユーザーは、いくつかのサンプルを今実行し、残りのサンプルを後で実行しようとすることがある。このことは、品質保証等の多くの理由から、望ましいことではない場合がある。一の実施形態では、ＰＣＢで、またはカートリッジ内でヒューズが飛ぶことがある。ヒューズは、ＰＣＢにはんだづけされた電子部品であったり、またはＰＣＢ上の配線（例えば、銅以外の材料で形成された）かもしれない。ヒューズは、例えば、装置全体で物理的に好ましい頂部プレートへの通路に置かれてもよい。装置の物理的な無力化に代わる手段として、ヒューズは少しのデータを保存するのに用いられることがある。この場合、制御者は、運転を進める前に、ヒューズの状態を調べる。この場合、「ヒューズ」は、制御者に書かれたまたは読まれたその電気状態を有することがあり、例えば、静電容量の変化は、状態を表す開路／ショートの代わりに用いられることがある。他の実施形態では、装置は、金属化されたブリスターパックであってもよく、または、他の使い捨ての特徴を有していてもよく、使用状態またはカートリッジの耐久性を検出するのに用いられる電気的痕跡を生成し得る。この場合、「書き込み」は、カートリッジの通常の使用を通じて作製され、装置は検出機能のみを実行する。他の実施形態では、複数のデータがカートリッジ内でエンコードされてもよい。例えば、カートリッジは、他のデータと同様に、カートリッジの使用状態をエンコードするのに用いられＥＥＰＲＯＭを含み得る。一の実施形態では、ＥＥＰＲＯＭ認証システムは、カートリッジの再使用を避けるように設計され、ユーザーの次善策としてのＥＥＰＲＯＭのクローン作製および置換にも抵抗する。使用状態以外の他の多くの種類のデータがＥＥＰＲＯＭに含まれ得る。１つの特徴は、バーコードナンバーを含んでいてもよい。カートリッジのバーコードステッカーは、バーコードリーダーで、研究所の自動システムに対してカートリッジを同定するために用い得る。他の実施形態では、核酸用途について追加の代替策は、再使用を防ぐためにカートリッジ内部表面を意図的に汚染することである。例えば、最終工程として、高濃度の核酸を含む液滴を、以前に未使用の領域も含めてカートリッジ全体を送ることができる。したがって、意図的にカートリッジ内部表面を汚染し、再使用を防ぐ。１９９９年８月１９日に出願された題名「Indicator Components For Microfluidic Sytems」の米国特許第6,495,104号明細書の開示全体を参照して、カートリッジが使用されたか否かを特定するために有用で好適な指示素子に関する教示が参照により本明細書に援用される。
本発明の様々な態様が、方法、システム、コンピューターで読み取り可能な媒体、および／またはコンピュータープログラム製品として実施されてもよいことが理解される。本発明の態様は、ハードウェアの実施形態、ソフトウェアの実施形態（ファームウェア、常駐ソフトウェア、マイクロコード等を含む）、または通常、本明細書で「回路」、「モジュール」または「システム」として言及した全てのソフトウェアおよびハードウェアの態様を組み合わせた実施形態を取り得る。さらに、本発明の方法は、コンピューターで使用可能なストレージ媒体でのコンピュータープログラムプロダクトの形態を取ってもよく、当該媒体は、当該媒体で実施されるコンピューターで使用可能なプログラムコードを有する。
本発明のソフトウェアの態様について、任意の好適なコンピューターで使用可能な媒体が利用されてもよい。コンピューターで使用可能なまたはコンピューターで読み取り可能な媒体は、例えば、これらに限定されないが、電気的、磁気的、光学的、電磁気的、赤外線の、もしくは半導体の、システム、機器、装置、または伝播媒質であってもよい。コンピューターで読み取り可能な媒体は、一時的および／または持続的実施形態を含んでいてもよい。コンピューターで読み取り可能な媒体のより詳細な例（非包括的なリスト）は、以下の一部または全部を含む：１つ以上の配線を有する電気的接続、ポータブルコンピューターディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリー（ＲＯＭ）、イレーザブル（消去可能）プログラマブルリードオンリーメモリー（ＥＰＲＯＭまたはフラッシュメモリー）、光ファイバー、ポータブルコンパクトディスクリードオンリーメモリー（ＣＤ−ＲＯＭ）、光学ストレージデバイス、インターネットまたはイントラネットをサポートする伝送媒体等の伝送媒体、または磁気ストレージデバイス。プログラムが、例えば、紙または他の媒体の光学スキャンを経て電子的に保存され、次いで蓄積され、読み取られ、または好適な手法で他に処理され、必要ならば、次いでコンピューターのメモリーに保存されるので、コンピューターで使用可能なまたはコンピューターで読み取り可能な媒体は、紙またはプログラムが印刷された他の好適な媒体であってもよい。本文書の文脈では、コンピューターで使用可能なまたはコンピューターで読み取り可能な媒体は、指示実行システム、機器、もしくは装置により、または、指示実行システム、機器、もしくは装置に関連して、使用プログラムを含み、保存し、通信し、伝搬し、または伝送し得るいずれの媒体であってもよい。
本発明の操作を実行するためのプログラムコードは、Java、Smalltalk、C++等のオブジェクト指向プログラム言語で書かれていてもよい。しかしながら、本発明の操作を実行するためのプログラムコードは、「Ｃ」プログラム言語または同様のプログラム言語等の従来の手続のプログラム言語で書かれていてもよい。プログラムコードは、プロセッサー、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、またはプログラムコードを実行する他の構成で実行されてもよい。プログラムコードは、メモリー（上述したコンピューターで読み取り可能な媒体等）に保存されるソフトウェアアプリケーションと単に呼ばれるものであってもよい。プログラムコードは、プロセッサー（または他のプロセッサー制御装置）にグラフィカルユーザーインターフェース（「ＧＵＩ」）を生成させてもよい。グラフィカルユーザーインターフェースは、ディスプレイ装置に視覚的に生成されてもよく、さらにグラフィカルユーザーインターフェースは、可聴式特徴を有していてもよい。しかしながら、プログラムコードは、コンピューター、サーバー、携帯情報端末、電話、テレビ、またはプロセッサーおよび／またはデジタル信号プロセッサーを利用するいずれのプロセッサー制御装置等のいずれのプロセッサー制御装置内で操作してもよい。
プログラムコードは、局所的または遠隔的に実行されてもよい。プログラムコードは、例えば、全体または一部がプロセッサー制御装置のローカルメモリーに保存されてもよい。しかしながら、プログラムコードは、少なくとも部分的に、プロセッサー制御装置に、遠隔的に、保存され、アクセスされ、およびダウンロードされてもよい。ユーザーのコンピューターは、例えば、プログラムコードを全て実行してもよいし、またはプログラムコードを一部のみ実行してもよい。プログラムコードは、少なくとも一部がユーザーのコンピューターにあるスタンドアローンソフトウェアパッケージであってもよく、および／または、リモートコンピューターで部分的に実行されてもよいし、またはリモートコンピューターもしくはサーバーで全て実行されてもよい。後者の状況では、リモートコンピューターは、ユーザーのコンピューターにコミュニケーションネットワークを通じて接続されていてもよい。
本発明は、ネットワーク環境に関わらず適用してもよい。コミュニケーションネットワークは、無線周波数ドメインおよび／またはインターネットプロトコル（ＩＰ）ドメインのケーブルネットワーク操作であってもよい。しかしながら、コミュニケーションネットワークは、インターネット（時々、代替的に「ワールドワイドウェブ」として知られている）、イントラネット、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、および／または広域ネットワーク（ＷＡＮ）等の分散コンピューティングネットワークを含んでいてもよい。コミュニケーションネットワークは、同軸ケーブル、銅線、光ファイバー線、および／またはハイブリッド同軸線を含んでいてもよい。コミュニケーションネットワークは、電磁気スペクトルのいずれかの部分およびシグナリング標準（標準のＩＥＥＥ802ファミリー、GSM/CDMA/TDMAまたはセルラー方式標準、および／またはＩＳＭ帯等）のいずれかを利用する無線部分を含んでいてもよい。コミュニケーションネットワークは、電力線部分を含んでいてもよく、そこで信号は電気配線を通じて伝えられる。本発明は、物理的構成部品、物理的構成、またはfunctionコミュニケーション標準に関わらず、いずれの無線／有線コミュニケーションネットワークに適用してもよい。
本発明のいくつかの態様は、様々な方法および方法の工程を参照して記載されている。各方法の工程が、プログラムコードにより、および／または機械命令により実施され得ることが理解される。プログラムコードおよび／または機械命令は、方法に固有の機能／動作を実施するための手段を作り出してもよい。
プログラムコードは、コンピューターで読み取り可能なメモリーに保存されてもよく、当該メモリーは、コンピューターで読み取り可能なメモリーに保存されたプログラムコードが、様々な方法の工程の態様を実施する指示手段を含む製品を作成または変換するように、プロセッサー、コンピューター、または他のプログラム可能なデータを処理する機器を特定の方法で機能するように指示することができる。
プログラムコードは、コンピューターまたは他のプログラム可能なデータを処理する機器に搭載され、プログラムコードが本発明の方法で規定された様々な機能／動作を実施するための工程を提供するように、プロセッサー／コンピューターが実施する処理を生成するように行われる一連の操作工程を引き起こしてもよい。
８ 結び
実施形態のこれまでの詳細な説明は、添付の図面を参照し、当該図面は、本発明の特定の実施形態を表し、説明のためのみのものである。本発明の範囲から逸脱しない異なる構造および操作を有する他の実施形態は、本記載の観点から当業者に容易に理解される。用語「発明」等は、本明細書で説明した出願人の発明の多くの代替の態様または実施形態のいくつかの特定の例を参照して用いられ、その使用または欠如が出願人の発明の範囲またはクレームの範囲を限定する意図ではない。本明細書は、読者の便宜のためのみにセクションに分割されている。見出しは、発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。定義は本発明の記載の一部として意図されている。本発明の範囲を逸脱することなく本発明の様々な詳細を変更してもよいことが理解される。
実施形態のこれまでの詳細な説明は、添付の図面を参照し、当該図面は、本発明の特定の実施形態を表し、説明のためのみのものである。本発明の範囲から逸脱しない異なる構造および操作を有する他の実施形態は、本記載の観点から当業者に容易に理解される。用語「発明」等は、本明細書で説明した出願人の発明の多くの代替の態様または実施形態のいくつかの特定の例を参照して用いられ、その使用または欠如が出願人の発明の範囲またはクレームの範囲を限定する意図ではない。本明細書は、読者の便宜のためのみにセクションに分割されている。見出しは、発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでない。定義は本発明の記載の一部として意図されている。本発明の範囲を逸脱することなく本発明の様々な詳細を変更してもよいことが理解される。
Claims (19)
- （ａ）オイル中の液滴内で核酸フラグメントを平滑末端化し、平滑末端化された核酸フラグメントを生成する工程；
（ｂ）オイル中の液滴で平滑末端化された核酸フラグメントをリン酸化し、リン酸化された核酸フラグメントを生成する工程；
（ｃ）オイル中の液滴内でＡ−ｔａｉｌをリン酸化された核酸フラグメントに結合させ、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを生成する工程；および
（ｄ）オイル中の液滴内で核酸アダプターをＡ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントに結合させ、アダプター結合核酸フラグメントを含む核酸ライブラリーを生成する工程、
を含む、オイルと接触した液滴内の核酸ライブラリーの作製方法。 - 工程１（ｄ）からのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程１（ａ）に入力された核酸フラグメントのモル基準で少なくとも５０％である、請求項１に記載の方法。
- 工程１（ｄ）からのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程１（ａ）に入力された核酸フラグメントのモル基準で少なくとも７５％である、請求項１または２に記載の方法。
- 工程１（ｄ）からのアダプター結合核酸フラグメントの修復が、工程１（ａ）に入力された核酸フラグメントのモル基準で少なくとも９０％である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 単一の液滴内で、工程１（ａ）および工程１（ｂ）が共に行われる、請求項１に記載の方法。
- 単一の液滴内で、工程１（ｂ）および工程１（ｃ）が共に行われる、請求項１に記載の方法。
- 単一の液滴内で、工程１（ａ）、工程１（ｂ）および工程１（ｃ）が共に行われる、請求項１に記載の方法。
- 工程１（ｂ）の開始前に、平滑末端化された核酸フラグメントを精製する工程を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- 工程１（ｃ）の開始前に、リン酸化された核酸フラグメントを精製する工程を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
- 工程１（ｄ）の開始前に、Ａ−ｔａｉｌ化された核酸フラグメントを精製する工程を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記精製工程が、オイル中の液滴内でビーズ上に核酸を捕捉する工程およびオイル中で前記ビーズを洗浄する工程を含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ビーズが、電荷スイッチビーズまたは固相可逆固定ビーズを含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記精製工程が、以下の工程を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
（ａ）洗浄液滴と、前記ビーズを含む液滴とを混合し、混合された液滴を生成する工程；および
（ｂ）前記ビーズを拘束している間に前記混合された液滴を分割し、前記ビーズを含む娘液滴と、前記ビーズを実質的に含まない娘液滴とを生成する工程。 - 請求項１３の工程（ｂ）において、いかなるビーズ損失も、核酸ライブラリーをその意図された目的に不適当とするのに十分なものではない、請求項１３に記載の方法。
- 前記核酸フラグメントが、５’−突出および／または３’−突出を有する核酸フラグメントを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
- 平滑末端化工程が、オイル中で、前記核酸フラグメントを含む液滴と、平滑末端化試薬を含む液滴とを混合する工程を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
- リン酸化工程が、オイル中で、前記核酸フラグメントを含む液滴と、リン酸化試薬を含む液滴とを混合する工程を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
- Ａ−ｔａｉｌを結合させる工程が、オイル中で、前記核酸フラグメントを含む液滴と、Ａ−ｔａｉｌ化試薬を含む液滴とを混合する工程を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸アダプターを結合させる工程が、オイル中で、前記核酸フラグメントを含む液滴と、アダプター結合試薬を含む液滴とを混合する工程を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
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