JP5879942B2 - 細胞培養基材の製造方法、細胞培養基材、およびそれを用いた細胞シートの製造方法 - Google Patents
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Description
しかしながら、細胞接着性または細胞接着阻害性を有する材料からなる層をパターン状に形成するためには、通常、これらの材料からなる層を基材上の全面に形成し、リソグラフィー法等を用いてパターニングする方法が用いられる。
このため、容易かつ大量に製造することが困難であるといった問題や、基材が凹凸構造を有するものである場合等には、上述のパターンを安定的に形成すること等が困難であるといった問題があった。
以下、本発明の細胞培養基材の製造方法、細胞培養基材および細胞シートの製造方法について詳細に説明する。
まず、本発明の細胞培養基材の製造方法について説明する。
本発明の細胞培養基材の製造方法は、細胞接着阻害性の表面を有する高分子基材の表面にエネルギー照射を行い、上記高分子基材の表面の少なくとも一部を改質することで、細胞接着性を有する細胞接着領域を形成する細胞接着領域形成工程を有することを特徴とするものである。
ここで、図1(b)〜(c)が細胞接着領域形成工程である。また、図1(a)は保護層形成工程である。
また、従来の、基材上に細胞接着材料、細胞接着阻害材料、開始剤等の化学物質を塗布等により形成したものと比較し、これらの材料を用いないことから、高い安全性を有するものとすることができる。例えば、開始剤等の残渣の影響のないものや、リソグラフィー法等によるパターニングを不要とすることができることから、通常、細胞の培養に悪影響を与える現像液等の影響のないものとすることができる。したがって、細胞培養基材を細胞を安定的に培養可能なものとすることができる。
さらに、これらの材料や別途工程が不要であることにより、ロール状の高分子基材からロールトゥロール、ロールトゥシートなどの連続プロセスで細胞培養基材を容易に形成できる。
さらにまた、本発明の製造方法により製造された細胞培養基材は、高分子基材自身の表面に細胞接着領域(改質された領域)および細胞接着阻害領域(改質されていない領域)が形成されるものであることから、例えば、微細凹凸形状を付与することによる細胞の配向制御等や、刺激応答性層を積層することによる刺激応答性の付与等を容易に行うことができる。
以下、本発明の細胞培養基材の製造方法の各工程について詳細に説明する。
本発明における細胞接着領域形成工程は、細胞接着阻害性の表面を有する高分子基材の表面にエネルギー照射を行い、上記高分子基材の表面の少なくとも一部を改質することで、細胞接着性を有する細胞接着領域を形成する工程である。
本工程における高分子基材は、細胞接着阻害性の表面を有するものであり、かつ、エネルギー照射を行うことにより表面が改質され、細胞接着領域を形成できるものであれば特に限定されるものではない。
具体的には、培養する細胞がウシ血管内皮細胞である場合には、播種密度4000cells/cm2以上30000cells/cm2未満の範囲内となるように播種し、37℃インキュベーター内(CO2濃度5%)に保管し、14.5時間培養した時点で接着伸展している細胞の割合を評価することができる。また、ウシ血管内皮細胞である場合の細胞の播種は、10%FBS(血清)入りDMEM培地に懸濁させて播種し、その後、上記細胞ができるだけ均一に分布するよう、上記細胞が播種された基材をゆっくりと振とうすることにより行うものである。
さらに、細胞接着伸展率の測定は、測定直前に培地交換を行って接着していない細胞を除去した後に行う。また、細胞接着伸展率の測定個所としては、細胞の存在密度が特異的になりやすい箇所(例えば、存在密度が高くなりやすい所定領域の中央、存在密度が低くなりやすい所定領域の周縁)を除いて測定を行うものである。
本工程においては、なかでも、80%以上であることが好ましい。細胞接着領域として、細胞を安定的に接着させることができるからである。
このため、本工程において用いられる高分子基材については、細胞毎に上述の細胞接着伸展率を用いる評価方法を行い、所望の細胞接着阻害性の表面を有することおよびエネルギー照射により所望の細胞接着性を有する細胞接着領域を形成できるものであることを確認した上で選択されたものであることが好ましい。
また、本工程においては、特に、ポリスチレンを好ましく用いることができる。上記高分子材料を用いることにより、細胞接着阻害性の表面を容易に形成することができ、また細胞毒性が低いものであるからである。さらに、ガラス転移点が低いため熱インプリントが容易であり、後述するような微細凹凸形状の賦型が容易だからである。
なお、本工程における水接触角が低下する性質とは、エネルギー照射の結果として水接触角が変化するものを示すものであり、水接触角が変化する性質(親水・疎水性の変化)のみならず、結果として水接触角が低下する性質、例えば、エネルギー照射により酸素等を含む官能基が導入される性質も含むものである。
したがって、水接触角が低下する性質を有する材料を用いて細胞接着領域を形成した場合には、細胞接着領域は、水接触角が低下して形成されたもの、上記官能基が導入される等の結果として水接触角が低下して形成されたもの、および、これらが混合して形成されたものを含むものである。
また、本工程における高分子材料は、細胞培養に支障を来たさない程度に、ロール状で取り扱いがしやすいようにゴムなどの成分を含む共重合体であってもよい。また、その他必要な添加剤を含むものであっても良い。
なお、水接触角は、温度25℃、湿度30%、大気圧下で、マイクロシリンジから水を滴下して30秒後に接触角測定器を用いて測定した値を用いることができきる。また、接触角測定器としては例えば、協和界面科学(株)製CA−Z型を用いることができる。
このようなシート状とする厚みとしては、具体的には、用いる高分子材料に応じて適宜設定されるものであるが、1μm〜500μmの範囲内であることが好ましく、なかでも50μm〜200μmの範囲内であることが好ましい。ロール状にすることが容易だからである。
長尺状であることにより、ロール状にして保管することや、ロール状で保管した状態から巻き出しながら本工程を行う等、細胞培養基材の製造プロセスの自由度を高いものとすることができるからである。
また、後述するような刺激応答性層を形成したものや凹凸形状の賦型したものを形成する場合であっても、これらをロールトゥロールで形成することができ、容易かつ大量に形成可能なものとすることができるからである。
さらに、最終的に得られる細胞培養基材を長尺状のままロール状にして保存することや、ロール状で保存した状態から、細胞培養の用途等に合わせてサイズを決定し、所望のサイズの細胞培養基材を切り出して用いることができる等、細胞培養基材の製造プロセスや使用方法の自由度を高いものとすることができるからである。
ここで、長尺状であるとは、ロール状に巻き取ることができる程度の長さのものであることをいうものであり、製造装置に設置できる重量等に応じて任意に決定すればよいが、具体的には、長さが10m以上とすることが好ましく、なかでも、50m〜5000mの範囲内とすることが好ましく、特に、100m〜1000mの範囲内とすることが好ましい。
また、長さは幅に対して10倍以上であることが好ましい。取扱い性等に優れたものとすることができるからである。
本工程において、凹状の細胞培養領域が形成された高分子基材としては、例えば、マイクロウェルプレート等の容器を挙げることができる。
例えば、多孔質を備えた高分子基材を細胞シート作製、2種類の細胞の共培養、薬物透過アッセイなどに使用する場合には、ポアサイズは細胞が遊走又は浸潤しない程度のφ20μm以下であることが好ましい。
このような粘着剤層を有することにより、上記高分子基材を別途用意した支持基板に貼り付け、貼り付けた状態で本工程を行うことや、本発明の製造方法により製造される細胞培養基材を上記支持基板に貼り付けることを容易なものとすることができるからである。
本工程に用いられる粘着剤層としては、所望の接着性を発揮することができるものであれば特に限定されるものではなく、公知の粘着剤を塗布してなるものを用いることができるが、具体的には、ポリエステル、アクリル酸エステル、ポリウレタン、ポリエチレンイミン、シランカップリング剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸(PFOS)等の粘着剤を含むものを挙げることができ、なかでもポリエステル、アクリル酸エステル、ポリウレタン等の粘着剤を含むものであることが好ましい。上記高分子基材および支持基板を十分な強度で接着させることができるからである。
本工程は、細胞接着阻害性の表面を有する高分子基材の表面にエネルギー照射を行い、上記高分子基材の表面の少なくとも一部を改質することで、細胞接着性を有する細胞接着領域を形成する工程である。
本工程においては、細胞の増殖の用途に用いる場合には、矩形状、円形状、多角形状であることが好ましく、なかでも、細胞を配向させる等の用途に用いる場合にはライン状であることが好ましい。
なお、本工程が、上記高分子基材が支持基板等に貼り付けられた状態で行われる場合には、上記保護層を支持基板等に貼り付けて用いることもできる。具体的には図2に例示するように支持基板31が蓋34つきの容器30の場合、蓋34に遮光部として保護層3を貼り付け、パターン形成用細胞培養容器30を形成した状態で本工程を行うこともできる。また、図2の例示に限らず、蓋34の内側に遮光部として保護層3を貼り付けて本工程を行うものであっても良い。
このような遮光性材料としては、上記細胞接着領域形成工程の実施終了時まで高分子基材表面に密着性を有し、かつ、細胞培養時には容易に剥離できるものであることが好ましい。上記高分子基材等との積層の際に粘着剤等の使用を回避できるからである。
本工程においては、このような遮光性材料としては、高分子基材を構成する高分子材料等に応じて適宜選択されるものであるが、例えば、黒色着色剤をバインダ樹脂中に分散させたものや、クロム、酸化クロム等の金属薄膜、PDMS(ポリジメチルシロキサン)等のシリコーン樹脂等を挙げることができる。
本工程においては、なかでも、エネルギー照射がUV照射またはVUV照射等である場合には、黒色着色剤をバインダ樹脂中に分散させたもの、金属薄膜等を好ましく用いることができ、エネルギー照射がプラズマ照射である場合には、PDMS等のシリコーン系樹脂を好ましく用いることができる。
また、高分子基材単体にエネルギー照射を行うものであっても良く、高分子基材を別途準備した支持基板に貼り合わせた後にエネルギー照射を行うものであっても良い。
なお、図4中の符号については、図1のものと同一の部材を示すものであるので、ここでの説明は省略する。
本発明の細胞培養基材の製造方法としては、上記細胞接着領域形成工程を少なくとも有するものであれば特に限定されるものではないが、必要に応じて他の工程を有するものであっても良い。
このような他の工程としては、上記細胞接着領域形成工程後に、上記高分子基材表面に刺激応答性層を形成する刺激応答性層形成工程や、上記高分子基材の表面に微細凹凸形状を賦型する微細凹凸形状賦型工程等を挙げることができる。また、高分子材料からなる基材に対して細胞接着阻害性等の評価を行い、所望の細胞接着阻害性および細胞接着領域の形成性を有することを確認し、選択する高分子基材選択工程や、上記細胞接着領域形成工程前の高分子基材上に、細胞接着領域を形成する領域に開口を有する保護層を形成する保護層形成工程、高分子基材のエネルギー照射により改質される表面とは反対側の表面に粘着剤層を形成する粘着剤層形成工程等を有するものであっても良い。
本発明における刺激応答性層形成工程は、上記細胞接着領域形成工程後に、上記高分子基材表面に刺激応答性層を形成する工程である。
本工程を有することにより、刺激応答性層をパターニングすることなく、容易に、細胞接着領域および細胞接着阻害領域のパターンを有し、かつ、刺激応答性を有するものとすることができる。
このため、このような刺激を付与した後の細胞に対して、コラーゲン等の細胞接着材料でコーティングされた基板を接触させた場合には、容易に細胞の回収を行うことができる。
なお、刺激による刺激前後の体積変化は、37℃、細胞培養溶液中に24時間静置した後の刺激応答性層の体積を刺激前の体積とし、その後、それぞれの刺激応答性材料に適した刺激を24時間連続して付与した後の刺激応答性層の体積を刺激後の体積として、刺激後の体積体/刺激前の体積の比により求めることができる。
本工程においては、上記温度応答性材料が1種類の化合物のみからなるものであっても良く、2種類以上含むものであっても良い。
すなわち、下限臨界温度より高い温度では膜中の高分子が脱水されて高分子が収縮した状態であり、一方で下限臨界温度以下の温度では膜中の高分子が周囲の水に対する親和性をもつことで水和し、高分子が膨潤した状態となるものと考えられる。このとき下限臨界温度より高い温度では、収縮した高分子から露出した高分子基材表面の細胞接着領域の影響により細胞が接着され、下限臨界温度より低い温度では高分子が膨潤して高分子基材の細胞接着領域の影響をほとんど受けることなくPIPAAm膜から細胞が剥離される。細胞接着性に関しては、高分子基材表面の状態が影響を及ぼすものと考えられる。本発明のように細胞接着領域と細胞接着阻害領域がパターン状に形成された高分子基材上にPIPAAm膜を形成することで、細胞接着領域では下限臨界温度より高い温度で細胞接着性をもたせることができ、細胞接着阻害領域では下限臨界温度によらず細胞接着阻害性をもたせることができる。したがって、個数や形状を制御して培養した細胞を、低侵襲で回収することができる。さらに、実質的に平坦な高分子基材表面にPIPAAm膜を形成しているため、当該PIPAAm膜上で培養された細胞シートにコラーゲンが表面に形成された基板を接触させることで容易に細胞の回収を行うことができるのである。
また、本工程において、ロールトゥロールなどの連続プロセス中で重合方法により刺激応答性層を形成する場合には、刺激応答性層用組成物として、モノマー成分のオリゴマーまたはプレポリマーを含むことが好ましい。このようなある程度重合が進行したオリゴマーやプレポリマーを含むことにより、より少ない放射線の照射回数でグラフト重合を行うことができ、生産効率を向上させることができる。
また、重合方法により刺激応答性層を形成する場合において、刺激応答性層用組成物として重合開始剤やシランカップリング剤などのアンカー剤を含むものとしても良い。本工程においては、なかでも、紫外線照射により重合を開始する場合には、重合開始剤やアンカー剤を組合せることが好ましい。
本工程において、刺激応答性層を重合方法により形成する具体例としては、例えば、上記刺激応答性層が温度応答性材料からなるものであり、温度応答性材料としてPIPAAmを用いる場合には、モノマー成分(刺激応答性モノマー)として、n−イソプロピルアクリルアミド(NIPAAm)を用いることができる。
本工程においては、モノマー成分の重合後に、未反応のモノマー成分等を洗浄により除去する除去処理を行うものであっても良い。
本発明における微細凹凸形状賦型工程は、上記高分子基材の表面に微細凹凸形状を賦型する工程である。
本工程を有することにより、例えば、細胞培養基材上で培養する細胞の配向制御等を容易に行うことができる。
このような微細凹凸形状としては、具体的には、細胞の配向制御を行うもの(配向制御用微細凹凸形状)、分化制御を行うもの(分化制御用微細凹凸形状)、機能維持制御等を行うもの(機能維持制御用微細凹凸形状)、さらには、形態・増殖制御を行うもの(形態・増殖制御用微細凹凸形状)等を挙げることができる。
このような所定の幅の凹部がライン状に配された凹凸構造が形成された細胞培養基材に細胞を播種すると、細胞が凹凸構造を認識するため多くの細胞を配向させることができる。
具体的には、このような拍動により動いても溝を認識し配向を維持できる凹凸形状における凹部の幅としては、5μm〜50μmの範囲内であることが好ましく、なかでも、5μm〜30μmの範囲内であることが好ましい。また、凹部の深さとしては、0.2μm〜10μmの範囲内であることが好ましく、なかでも1μm〜7μmの範囲内であることが好ましい。
このような凹凸構造としては、具体的には、細胞の種類や制御したい分化状態に応じて適宜設定されるものである。例えば、文献(Control of stem cell fate by physical interactions with the extracelluar matrix.Cell Stem Cell.,2009,5,17−26)では、アイランド状に形成したフィブロネクチンの足場にヒト間葉系幹細胞を播種し、細胞が足場に接着して伸展すると骨芽細胞へ、一方細胞が足場に接着するが伸展しないと脂肪細胞へ分化誘導されることが報告されている。すなわち、ヒト間葉系幹細胞が接着できる表面を小さくしていくと、骨芽細胞へ分化する割合が減少し、逆に脂肪細胞へ分化する割合が増加する。
本工程においては、例えば、ヒト間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化するのを誘導するには、上記分化制御用微細凹凸形状として、細胞が接着して伸展できる形状および/または大きさ、具体的には、細胞の大きさの3倍以上の面積とするとよく、さらに具体的な数値を挙げると100μm×100μmの正方形等とするとよい。
一方、ヒト間葉系幹細胞を脂肪細胞へ分化するのを誘導する場合には、細胞の一部が接着するが、伸展できない形状および/または大きさ、具体的には、細胞の大きさの1倍以下の面積とするとよく、さらに具体的な数値を挙げると10μm×10μmの正方形等とするとよい。
なお、上記は例示であり微細凹凸形状の平面視形状は、細胞の種類や特性に応じて適宜設定すればよい。
本工程における加熱の程度としては、上記型を押し付けることにより微細凹凸形状を転写できるものであれば特に限定されるものではないが、通常、高分子基材を構成する高分子材料のガラス転移点以上とすることができる。
また、本工程における加熱の方法としては、所望の微細凹凸形状を賦型できるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、加熱した型を用いる方法や、オーブン等の加熱装置を用いる方法を挙げることができる。
なお、この例では、型としてロール状の型を用い、連続的に賦型する方法を示すものである。
本工程においては、上記高分子基材が長尺状である場合には、ロール状であることが好ましい。高分子基材表面に連続的に微細凹凸形状を賦型することができ、本工程を短時間で実施可能なものとすることができるからである。
本発明における高分子基材選択工程としては、高分子材料からなる高分子基材に対して細胞接着阻害性等の評価を行い、所望の細胞接着性および細胞接着領域の形成性を有することを確認し、選択する工程である。
本工程を有することにより、細胞に適した細胞接着領域および細胞接着阻害領域を安定的に形成する可能なものとすることができる。
なお、本工程における細胞接着阻害性等の評価方法としては、上記「1.細胞接着領域形成工程」の項に記載の接着伸展率を用いる評価方法と同様とすることができるので、ここでの説明は省略する。
本発明における保護層形成工程は、上記細胞接着領域形成工程前に、上記高分子基材上に、細胞接着領域を形成する領域に開口部を有する保護層を形成する工程である。
本工程を有することにより、上記細胞接着領域形成工程の実施タイミングを細胞の播種直前に容易に行うことができる。また、上記細胞接着領域形成工程後も上記保護層を積層した状態を維持することにより、エネルギー照射を受けていない領域(細胞接着阻害領域)が、露光されることから防ぐことができる。したがって、細胞接着領域形成工程から細胞の播種の間に経時的に細胞接着領域のパターンが変化することを防ぎ、細胞を所望のパターンで培養可能なものとすることができる。
なお、パターニング方法としては、フォトリソグラフィー法等の公知の方法を用いることができる。
本工程においては、なかでも、上記高分子基材が長尺状である場合には、上記保護層形成用層を積層し、フォトマスクを用いたフォトリソグラフィー法を用いる方法を好ましく用いることができる。ロールトゥロールで保護層を形成することができ、大量生産が容易なものとすることができるからである。なお、フォトリソグラフィー法によりパターニングする場合には、上記保護層形成用層がネガ型またはポジ型の感光性を有するものであることが好ましい。別途レジスト等の積層が不要であり、パターニングされた保護層を容易に形成できるからである。
本発明における粘着剤層形成工程は、高分子基材のエネルギー照射により改質される表面とは反対側の表面に粘着剤層を形成する工程である。
本工程により形成される粘着剤層としては、上記「1.高分子基材」の項に記載の内容と同様とすることができる。
本工程において粘着剤層を形成する方法としては、粘着剤層に含まれる粘着剤を含有する粘着剤層形成用塗工液を塗布する方法や、別途形成した粘着剤層を高分子基材上に積層する方法を用いることができる。
なお、塗布方法については、均一な厚みの粘着剤層を形成できる方法であれば特に限定されるものではなく、公知の塗布方法を用いることができる。具体的には、上記「(1)刺激応答性層形成工程」の項に記載の方法を用いることができる。
本発明の細胞培養基材の製造方法は、上記細胞接着領域形成工程等を含むものであるが、高分子基材が長尺状である場合には、これらの各工程が独立して行われるもの、すなわち、工程毎に長尺状の高分子基材をロール状に巻き取られた状態から巻き出し、所定の処理を行った後に巻き取るものであっても良いが、全工程が連続して行われること、すなわち、最終製造物である細胞培養基材までロールトゥロールにて行われることが好ましい。大量生産可能なものとすることができるからである。
次に、本発明の細胞培養基材について説明する。
本発明の細胞培養基材は、細胞接着阻害性を有する細胞接着阻害領域および細胞接着性を有する細胞接着領域が連続した表面に形成された高分子基材を含むことを特徴とするものである。
以下、本発明の細胞培養基材の各構成について説明する。
本発明に用いられる高分子基材は、細胞接着阻害領域および細胞接着領域が連続した表面に形成されたもの、すなわち、高分子基材自身の表面の改質されていない領域を細胞接着領域として含み、改質された領域を細胞接着領域として含むものである。
このような高分子基材、細胞接着領域および細胞接着阻害領域については、上記「A.細胞培養基材の製造方法」の項に記載の内容と同様とすることができるので、ここでの説明は省略する。
本発明の細胞培養基材は、上記高分子基材を少なくとも含むものであるが、必要に応じて、上記高分子基材上に刺激応答性層、保護層および粘着剤層等を有するものであっても良い。このような刺激応答性層、保護層および粘着剤層については、上記「A.細胞培養基材の製造方法」の項に記載の内容と同様とすることができるので、ここでの説明は省略する。
次に、本発明のパターン細胞シートの製造方法について説明する。
本発明のパターン細胞シートの製造方法は、上述の細胞培養基材の製造方法を用いて細胞培養基材を製造し、上記細胞培養基材の細胞接着領域上に細胞を接着させ培養する細胞培養工程と、上記細胞接着領域に隣接する上記細胞接着阻害領域の少なくとも一部に対してエネルギー照射を行い、上記高分子基材の表面を改質することで拡張細胞接着領域を形成する拡張細胞接着領域形成工程と、を有することを特徴とするものである。
なお、図11(a)が細胞培養工程であり、図11(b)〜(c)が拡張細胞接着領域形成工程である。
なお、細胞シートとは、細胞間結合で細胞同士が少なくとも単層で連結されたシート状の細胞集合体である。
以下、本発明のパターン細胞シートの製造方法の各工程について詳細に説明する。
本発明における細胞培養工程は、上述の細胞培養基材の製造方法により製造された細胞培養基材の細胞接着領域上に細胞を接着させ培養する工程である。
本工程に用いられる細胞培養基材および細胞培養基材の製造方法については、上記「A.細胞培養基材の製造方法」の項に記載の内容と同様であるので、ここでの説明は省略する。
また、細胞接着領域上に接着させた細胞を培養する方法についても、一般的な培養方法を用いることができる。
本発明における拡張細胞接着領域形成工程は、上記細胞接着領域に隣接する上記細胞接着阻害領域の少なくとも一部に対してエネルギー照射を行い、上記高分子基材の表面を改質することで拡張細胞接着領域を形成する工程である。
ここで、細胞接着領域に隣接するとは、平面視上、他の部材により隔てられていないものであれば特に限定されるものではなく、細胞接着領域と接するように形成されるものであっても良く、細胞接着領域と接しないように形成されるものであっても良い。また、細胞接着領域と接しないように形成される場合には、細胞が細胞接着領域から拡張細胞接着領域に向かって移動可能な程度の間隔が設けられるものであっても良い。なお、細胞が移動可能な程度の間隔とは、通常、細胞1〜2個分の間隔をいうものであり、例えば、10μm〜60μmの範囲内とすることができる。
ここで、複数回行う態様としては、例えば、細胞接着領域と接するように形成される拡張細胞接着領域を順次拡張するものを挙げることができる。
本発明のパターン細胞シートの製造方法は、上記細胞培養工程および拡張細胞接着領域形成工程を有するものであるが、必要に応じて適宜他の工程を有するものであっても良い。
例えば、上記拡張細胞接着領域形成工程後に、上記細胞培養工程で接着させた細胞とは異なる種類の細胞を拡張細胞接着領域に接着させる複数細胞培養工程や、上記拡張細胞接着領域形成工程後に、細胞接着領域および拡張細胞接着領域に接着している細胞または細胞シートを剥離する剥離工程を挙げることができる。
また、上記細胞培養基材として、刺激応答性層が高分子基材上に形成されたものを用いる場合には、刺激応答性層の性質に合わせた刺激を付与して剥離する方法を用いることができる。
具体的には、上記刺激応答性層が、温度応答性材料であるポリ−N−イソプロピルアクリルアミド(PIPAAm)を含む温度応答性層である場合には、37℃近傍で細胞を培養することで細胞シート等を形成し、32℃以下に温度を低下させることにより、細胞シート等を剥離する方法を用いることができる。
SUNDIC社製OPSシート(高分子基材)に、100μm角の開口部を有するフォトマスクを介して254nmのUV光を26J/cm2照射し、細胞接着領域を形成した。ウシ血管内皮細胞を3×104cells/cm2で播種したところ、フォトマスク開口部に相当する領域に細胞が接着し、細胞パターンが得られた。細胞パターンは、少なくとも3週間維持した。なお、3週間後の細胞培養基材表面の細胞を撮影した顕微鏡写真を図12に示す。
開口部の形状を300μm角とした以外は、実施例1−1と同様にして細胞接着領域を形成し、細胞を播種した。その結果、実施例1−1と同様に、フォトマスク開口部に相当する領域に細胞が接着し、細胞パターンが得られた。細胞パターンは、少なくとも3週間維持した。なお、3週間後の細胞培養基材表面の細胞を撮影した顕微鏡写真を図13に示す。
SUNDIC社製OPSシート(高分子基材)に、10μmのライン状凹部が10μm間隔で形成された矩形ラインパターンの凹凸付きPDMSを密着させ、プラズマ(400W、3分)を照射して細胞接着領域を形成した。ウシ血管内皮細胞を3×104cells/cm2で播種したところ、PDMSの凹部相当領域に細胞が接着し、細胞パターンが得られた。なお、3週間後の細胞培養基材表面の細胞を撮影した顕微鏡写真を図14に示す。
ライン状凹部の幅を70μm、間隔70μmのPDMSを用いた以外は、実施例2−1と同様にして細胞接着領域を形成し、細胞を播種した。その結果、実施例2−1と同様にPDMSの凹部相当領域に細胞が接着し、細胞パターンが得られた。なお、3週間後の細胞培養基材表面の細胞を撮影した顕微鏡写真を図15に示す。
SUNDIC社製OPSシート(高分子基材)に、熱インプリントにて幅10μm、深さ5μm、周期20μmの微細凹凸形状を付与した。微細凹凸付きOPSシートに実施例1−1と同形状のフォトマスクを介して254nmのUV光を26J/cm2照射し、細胞接着領域を形成した。ウシ血管内皮細胞を3×104cells/cm2で播種したところ、フォトマスク開口部に相当する領域に細胞が接着し、細胞パターンが得られた。なお、3週間後の細胞培養基材表面の細胞を撮影した顕微鏡写真を図16に示す。
実施例1−2と同形状のフォトマスクを用いた以外は、実施例3−1と同様にして細胞培養基材を形成し、細胞を播種した。3週間後の細胞培養基材表面の細胞を撮影した顕微鏡写真を図17に示す。
SUNDIC社製OPSシート(高分子基材)に、開口部300μm幅、遮光部60μm幅のフォトマスクを介して172nmのUV光を144mJ/cm2照射し、細胞接着領域を形成した。続いてN−イソプロピルアクリルアミド10w/w%IPA溶液を塗布し、50kGy(150kV)の電子線を照射し、刺激応答性層を有する細胞培養基材を形成した。水洗後にウシ血管内皮細胞を3×104cells/cm2で播種したところ、細胞がパターン状に接着した。1週間培養後、細胞培養基材を37℃の恒温槽から取出し、室温(23℃)に静置する低温処理を行うと細胞がパターンから剥離した。その際の様子を撮影した顕微鏡写真を図18に示す。なお、図18中の(a)が23℃の室温に静置した直後の写真であり、(b)が23℃の室温に静置後20分経過後の写真であり、(c)が23℃の室温に静置後40分経過後の写真である。
高分子基材として、(1)三菱樹脂社製サントクリア(逐次二軸延伸)、(2)昭和パックス社製エスクレア(無延伸インフレ)、(3)大石産業スチロファン(インフレ縦一軸延伸)を準備し、それぞれ実施例1−2と同形状のフォトマスクを介して254nmの光を26J/cm2照射し細胞培養基材を形成した。
その後、ウシ血管内皮細胞を3×104cells/cm2で播種したところ、細胞がパターン状に接着した。3週間後の細胞培養基材表面の細胞を撮影した顕微鏡写真を図19に示す。なお、図19中の(a)〜(c)は、それぞれ高分子基材として、(a)三菱樹脂社製サントクリア(実施例5)、(b)昭和パックス社製エスクレア(実施例6)、(c)大石産業スチロファン(実施例7)を用いたものである。
実施例5〜7より、本手法により、様々な製法で製造された高分子基材へのパターニングが可能であると分かった。
2a … 細胞接着領域
2b … 細胞接着阻害領域
3 … 保護層
4 … 刺激応答性層
10 … 細胞培養基材
30 … パターン形成用細胞培養容器
Claims (8)
- 細胞接着阻害性の表面を有する高分子基材の表面にエネルギー照射を行い、前記高分子基材の表面の少なくとも一部を改質することで、細胞接着性を有する細胞接着領域を形成する細胞接着領域形成工程を有し、
前記細胞接着領域形成工程後に、前記高分子基材表面に刺激応答性層を形成する刺激応答性層形成工程を有し、
前記刺激応答性層形成工程は、前記高分子基材の細胞接着阻害性を有する細胞接着阻害領域および前記細胞接着領域の両者を覆うように前記刺激応答性層を形成するものであることを特徴とする細胞培養基材の製造方法。 - 前記高分子基材の表面に微細凹凸形状を賦型する微細凹凸形状賦型工程を有することを特徴とする請求項1に記載の細胞培養基材の製造方法。
- 前記高分子基材が長尺状であり、前記高分子基材を搬送しながらエネルギー照射を行うことを特徴とする請求項1または請求項2に記載の細胞培養基材の製造方法。
- 前記刺激応答性層に含まれる刺激応答性材料が光応答性材料、電位応答性材料または磁力応答性材料であることを特徴とする請求項1から請求項3までのいずれかの請求項に記載の細胞培養基材の製造方法。
- 前記刺激応答性層形成工程の前記刺激応答性層を形成する方法が、前記刺激応答性層を前記高分子基材表面に貼り付ける方法または前記高分子基材表面に、刺激応答性材料を含む刺激応答性層用塗工液を塗布し乾燥および硬化させる方法であることを特徴とする請求項1から請求項4までのいずれかの請求項に記載の細胞培養基材の製造方法。
- 前記高分子基材を構成する高分子材料がポリスチレンであることを特徴とする請求項1から請求項5までのいずれかの請求項に記載の細胞培養基材の製造方法。
- 細胞接着阻害性を有する細胞接着阻害領域および細胞接着性を有する細胞接着領域が連続した表面に形成された高分子基材を含み、
前記高分子基材の前記細胞接着阻害領域および前記細胞接着領域の両者を覆うように形成された刺激応答性層を有することを特徴とする細胞培養基材。 - 細胞接着阻害性の表面を有する高分子基材の表面にエネルギー照射を行い、前記高分子基材の表面の少なくとも一部を改質することで、細胞接着性を有する細胞接着領域を形成する細胞接着領域形成工程を有する細胞培養基材の製造方法を用いて細胞培養基材を製造し、前記細胞培養基材の前記細胞接着領域上に細胞を接着させ培養する細胞培養工程と、
前記細胞接着領域に隣接する前記細胞接着阻害領域の少なくとも一部に対してエネルギー照射を行い、前記高分子基材の表面を改質することで拡張細胞接着領域を形成する拡張細胞接着領域形成工程と、
を有することを特徴とするパターン細胞シートの製造方法。
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