JP5878207B2 - 照明された試料を光学的に捕捉するための方法および装置 - Google Patents
照明された試料を光学的に捕捉するための方法および装置 Download PDFInfo
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Description
文献(以下参照)では、構造化された照明は2種類に分けられている。第1のものは、側方解像度を向上させるために使用することができ、対象空間内に形成される照明構造(例えばライン構造)の向きを変化させることも必要である。構造化された照明の第2の形態は、光学的断面を形成するために使用することができる。この場合、側方解像度の上昇は達成されない(ツァイス社(Zeiss)APOTOM、ドイツ、イエナ(Jena)所在)。本発明は、両方の種類の構造化された照明に、またはそれらの組合せにも使用可能である。
第1の例示的実施形態では、位相位置の調整に加えて、試料に投影される構造の向きを変化させることができ、ある範囲内では投影される構造に使用される光の波長から独立である実装形態が選択される。波長独立の特性と、向きの調整が可能なことは、すべての適用例または実装形態に必要なわけではない。したがってこの付加的特性の実現はオプションである。本発明は、3つの特性(位相シフト、向きの変更、波長独立性)のすべてが組み合わされた実装形態を含むが、この組合せに限定されるものではない。
周期的構造として、図1に示すような2次元格子を使用することができる。
図1に示された構造は、同様に回折次数の6回の対称性を有する回折パターンを瞳内に形成する。ここで対向する照明の対は、1つの空間方向における構造のそれぞれの向きに対応している。対物レンズの瞳内またはこれと共役な平面内での典型的な照明分布が図2に示されている。
φ=360/N
にほぼ相当するか、またはそれよりわずかに大きい。2つの開口部は図3には白く示されており、円弧は角度φに相当する。光軸は、破線で示された対称軸の交点にある。
本発明によれば、瞳内の回折像中にあって、光軸に関して対向する所定の回折次数だけが絞り調整に応じて選択的に絞りを透過する。したがって絞りの回転によって所定の回折次数を選択し、試料内における照明構造の向きを調整することができる。
本発明によれば構造化された位相プレートが付加的に使用される。この位相プレートは、瞳の近傍で別個のエレメント上に存在してもよく、また図3に示した絞りの開口部の一方または両方にはめ込むこともできる。一般性を制限することなく、ここではただ1つの位相プレートの使用について説明する。この位相プレートは、図3のマスクの上側開口部にはめ込まれ、絞りとともに1つの機能ユニットを形成する。位相プレートと絞りからなるこのような一体化された組合せが図4に示されている。
σ=2π/P
である。
ここで位相差2πは、λの光路差に相当する。最低でも位相構造は、3つの調整ステップに対応する3つの異なる位相(0次の次数なし)を有する。試料上で絞りの中央の開口部(図3には図示せず。以下の図も同様)を通る0次の次数を有する場合、少なくとも5つの位相が必要である。
γ=φ/P
の大きさの角度セグメントに分割されている。
図5は、瞳内におけるマスク/位相構造の配置を示す。ここで瞳縁部は赤い円で示されている。瞳内の回折個所の位置は、図2に緑色で示されている。
試料内に形成されるライン分布は、部分図a)からc)に向き1を、部分図d)からf)に向き2を有する。なぜなら回折次数の他の対はそれぞれマスクを通過することができるからである。さらに形成される構造のそれぞれ3つの異なる位相ステップが示されている。なぜならマスク構造の2つの開口部を通過する回折次数は、位相プレートのどの円弧にこの回折次数が存在するかに応じて、異なる相対的位相シフトを受けるからである。位相ステップを調整するのに小さな調整距離しか必要でなく、これにより高い速度を達成することができる。加えて、エレメントを連続的に回転させることにより、位相ステップと構造の向きとからなる対応するシーケンスを連続させることができ、このときエレメントの角度位置と画像記録との同期は、相応の角度エンコーダ(Winkelgebers)を使用することにより行うことができる。
波長λ1およびλ2の回折次数が、瞳と共役な平面内で光軸から異なる径方向距離r1およびr2の所に存在する。前に述べたように、瞳内の光分布は、図1に示したエレメントによって形成される。次式が成立する(図8参照)。
図8には、P=5の位相ステップを有する位相プレートの例が示されている。したがって回折次数が距離rの所に存在する任意の波長λに対し、位相プレートによって形成される光路差OPDについて、次式が成立しなければならない。
したがって色補正のための位相プレートは、半径rに比例しなければならない光路差を有しなければならない。本発明によれば位相プレートの径方向依存性は、連続的または擬似連続的とすることができる。複数の離散的な固定波長を使用する場合、位相プレートの径方向依存性を区間ごとに一定にすることもできる。
上に述べたように色補正は、構造化された照明のための装置の有用な特性であるが、決して必要な特性ではないことを強調しておく。適切に較正することにより、波長に依存する位相ステップを決定することができ、アルゴリズムで相応に考慮することができる。
図16は、微小光学モジュール(Mikrooptischen Moduls:MOM)を、側面図a)と、光軸に対して垂直な視野方向での平面図b)に示す。ここで微小光学モジュール(MOM)は好ましくはファイバ光学系(FO)に結合され、次の微小光学的コンポーネント、すなわち、光学的光導体、光学的ビームスプリッタ、微小光学的集積ミラー、マイクロレンズの組合せを含むことができる。
ここでは構造化された照明のための方法を、散乱光およびバックグランド光を低減するために有利に使用することができ、これにより供給される画像のコントラストを格段に高めることができる。さらに眼の網膜の結像では、眼の生理学的状況によって、開口数が制限され、それに伴って解像度も制限される(使用可能な瞳サイズが制限される)。しかし比較的小さなアパーチャを使用することが、光学的解像度が小さくとも、眼の自然の欠陥に基づく結像誤差を低減するためには望ましい。したがって構造化された照明を解像度向上の目的で有効に使用することができる。これにより、システムの物理的アパーチャを(困難であり、欠点と結び付いた)増大させずに、網膜の画像を比較的高い解像度で形成することができる。これは、網膜細部(棹状体および錐状体の少なくとも一方)の望ましい解像度をもたらし、したがって医学診断とって追加の利益となる。
図20は、図19に示すようなマスク内の偏光器を通る透過率、および出力調節による損失の補正を、回転角の関数として示す(0度では偏光器の軸と入力偏光が一致する)。
文献
[1]ニール、エム エー エー(Neil M.A.A.)、ユスカイティス、アール(Juskaitis R.)、ウィルソン、ティー(Wilson T.):「従来の顕微鏡における構造化された光を用いた光学的断面の取得方法」、Opt.Lett.22(24):1905〜1907、1997
[2]ルーコス、ダブリュー(Lukosz W.)、マルシャン、エム(Marchand M.)、「回折によって条件づけられた解像限界を超える光学的解像度」、Optica Acta 16、241〜255、1963
[3]ハインツマン、アール(Heintzmann R.)、クリーマー、シー(Cremer C.)、「横方向に変調された励起による顕微鏡法:回折格子を用いることによる解像度の改善」、Proc.of SPIE 3568:185〜196、1998[4]ニール、エム エー エー(Neil M.A.A.)、ユスカイティス、エー(Juskaitis A.)、ウィルソン、ティー(Wilson T.)、「2本のビームの干渉照明によるリアルタイム3D蛍光顕微鏡法」、Opt.Comm.153:1〜4、1998
[5]ハインツマン、アール(Heintzmann R.)、ジョヴィン、ティー エム(Jovin T.M.)、クリーマー、シー(Cremer C.)、「飽和パターン化励起による顕微鏡法−光学的解像度向上のためのコンセプト」JOSA A、19(8):1599〜1609、2002
[6]グスタフソン、エム ジー エル(Gustafsson,M.G.L.)、アガルド、ディー エー(Agard,D.A.)、セダト、ジェー ダブリュー(Sedat,J.W.)、「構造化された照明による広視野蛍光顕微鏡法の横方向解像度の倍増」Proc.of SPIE 3919:141〜150、2000
[7]グスタフソン、エム ジー エル(Gustafsson,M.G.L.)、「非線形に構造化された照明による顕微鏡法:理論的に無限の解像度をもつ広視野蛍光イメージング」、PNAS 102:13081〜13086、2005
[8]ゲストナー、フォルカー(GERSTNER VOLKER)(DE);ヘヒト、フランク(HECHT FRANK)(DE);ランゲ、ラルフ(LANGE RALPH)(DE);ブロース、ヘルムート(BLOOS HELMUT)(DE)、「光学画像システムの深度弁別向上のためのアセンブリ」、米国特許出願公開第2003/086067号明細書、国際公開第02/12945号パンフレット
[9]ウィルソン、トニー(WILSON TONY)(GB);ニール、マーク アンドリュー アクウィラ(NEIL MARK ANDREW AQUILLA)(GB):ユスカイティス、リムヴィダス(JUSKAITIS RIMVYDAS)(GB)、「顕微鏡画像形成装置および方法」、米国特許第6376818号明細書、2002年
[10]ケンプ、ミヒャエル(KEMPE MICHAEL)(DE);ウォレシェンスキー、ラルフ(WOLLESCHEENSKY RALF)(DE):「顕微鏡法用の光学システムは、試料と瞳との間の平面内で照明光を試料上に集束させ、この平面上または近傍で、放出された検出光を分離することを含む」、独国特許出願公開第10257237号明細書
[11]エム シュタルダー(M.Stalder)、エム シャッド(M.Schadt)、「液晶偏光コンバータにより軸対称に発生される直線偏光光」、Opt.Lett.21(1996)、1948−1950
[12]ジョージ イー クラッグ(George E.Cragg)、ピーター ティー シー ソー(Peter T.C.So)、「エヴァネッセント定在波による側方解像度の向上」、Opt.Lett.25(2000)、46−48
Claims (47)
- 照明された試料を光学的に捕捉するための方法であって、
照明光が少なくとも1つの平面内で空間的に構造化されて該試料に当たり、該試料の複数の画像が該試料上の構造の様々な位置で検出器によって記録され、該複数の画像から光学的断面画像および解像度の少なくとも一方が高められた画像が計算される方法において、
該試料の方向で、対物レンズの瞳内もしくは該対物レンズの瞳と共役な平面内または該瞳の近傍の回折次数の存在する位置に回折パターンが形成され、該回折パターンに、様々な位相遅延の領域を備える構造化された位相プレートが割り当てられ、該位相プレートが、少なくとも1つの回折次数に対して、該対物レンズの瞳に回折次数が到達する前に、照明光の様々な位相位置を該試料上で調整するために移動され、回折次数を選択するために用いられる変位可能な絞りと前記位相プレートとが、相互に結合された回転可能または変位可能な2つのエレメント上に配置されていることを特徴とする方法。 - 中間画像面内において、空間的な周期的構造体を介して照明光の構造化が行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記空間的な周期的構造体がN回の対称性、N=2,4,6,...を有し、前記試料内でN/2の空間方向で構造化を行うために、該空間的な周期的構造体が、瞳内または瞳の近傍の回折次数の存在する位置で、光軸に関して対称な照明パターンを形成する、請求項2に記載の方法。
- 前記位相プレートが、様々な位相遅延を有する少なくとも部分的に円弧状の領域により円形に形成されており、光軸の周りで回転可能である、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記様々な位相遅延が、様々な屈折率および様々なプレート厚の少なくとも一方によって調整される、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法。
- 色補正のために、前記位相遅延が、光軸に対して垂直な方向で変更される、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記位相プレートが連続的に回転または変位され、画像記録と同期され、先行の領域と位相遅延の異なる領域に達したときに画像記録が行われる、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記位相プレートが離散的ステップで回転/変位される、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記変位可能な絞りは、対物レンズの瞳内もしくは対物レンズの瞳と共役な平面内またはその近傍の回折次数の存在する位置に配置されている、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記絞りが、対向する通過開口部を備える円形のマスクであり、光軸の周りで回転する、請求項9に記載の方法。
- 照明された試料を光学的に捕捉するための、請求項1乃至10のいずれか1項に記載の方法であって、
照明光が少なくとも1つの平面内で空間的に構造化されて該試料に当たり、該試料の複数の画像が該試料上の構造の様々な位置で検出器によって記録され、該複数の画像から光学的断面画像および解像度の少なくとも一方が高められた画像が計算され、
構造化された照明作用を該試料上で生じさせる光分布が、瞳内またはその近傍の回折次数の存在する位置で生じる、方法。 - 前記光分布が、照明方向で前記瞳の前方にある平面内における周期的構造体の回折像に対応する、請求項11に記載の方法。
- 前記光分布が、ファイバの出力部によって形成される、請求項11または12に記載の方法。
- 前記ファイバの出力部が、マイクロレンズ、微小構造体およびコーティングの少なくとも一つを有する、請求項13に記載の方法。
- 前記構造化の位相位置が、前記ファイバから出射する光の相対位相の変化によって変更される、請求項13または14に記載の方法。
- 前記光分布が、異なるファイバ出力部への切換えによって変更される、請求項13乃至15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記照明光のスペクトル組成が変更され、
瞳面とファイバの出力部との間で中間的結像が行われる、請求項13乃至16のいずれか1項に記載の方法。 - 照明された試料を光学的に捕捉するための、請求項1乃至17のいずれか1項に記載の方法であって、
照明光が少なくとも1つの平面内で空間的に構造化されて該試料に当たり、該試料の複数の画像が該試料上の構造の様々な位置で検出器によって記録され、該複数の画像から光学的断面画像および解像度の少なくとも一方が高められた画像が計算され、
回折像または光分布が、瞳面と共役な平面内に形成され、中間的結像によって、複数の反射領域を備える透明なビームスプリッタの平面内に伝達され、該ビームスプリッタが、該回折像または光分布を、該反射領域を介して試料の方向にさらに導く、方法。 - 照明された試料を光学的に捕捉するための装置であって、
照明光を少なくとも1つの平面内で空間的に構造化して該試料に当て、該試料の複数の画像を該試料上の構造の様々な位置で検出器が記録し、該複数の画像から光学的断面画像および解像度の少なくとも一方が高められた画像を計算する装置において、
該試料の方向で、対物レンズの瞳内もしくは該瞳の近傍の回折次数の存在する位置に、または該対物レンズの瞳と共役な平面内に回折パターンを形成し、該回折パターンに、様々な位相遅延の領域を備える構造化された位相プレートを割り当て、該位相プレートが、少なくとも1つの回折次数に対して、該対物レンズの瞳に回折次数が到達する前に、照明光の様々な位相位置を該試料上で調整するために移動可能に構成され、回折次数を選択するために用いられる変位可能な絞りと前記位相プレートとが、相互に結合された回転可能または変位可能な2つのエレメント上に配置されていることを特徴とする装置。 - 中間画像面内において、空間的な周期的構造体が、照明光を構造化するために配置されている、請求項19に記載の装置。
- 前記空間的な周期的構造体がN回の対称性、N=2,4,6,...を有し、
前記試料内でN/2の空間方向で構造化を行うために、該空間的な周期的構造体が、瞳内または瞳の近傍の回折次数の存在する位置で、光軸に関して対称な照明パターンを形成する、請求項20に記載の装置。 - 前記位相プレートが、様々な位相遅延を有する少なくとも部分的に円弧状の領域により円形に形成されており、光軸の周りで回転可能である、請求項19乃至21のいずれか1項に記載の装置。
- 前記様々な位相遅延を、様々な屈折率および位相プレートの様々なプレート厚の少なくとも一方によって実現する、請求項19乃至22のいずれか1項に記載の装置。
- 色補正のために、前記位相遅延を、光軸に対して垂直な方向で変更する、請求項19乃至23のいずれか1項に記載の装置。
- 前記位相プレートが連続的に回転可能または変位可能であり、画像記録と同期され、先行の領域と位相遅延の異なる領域に達したときに画像記録を行う、請求項19乃至24のいずれか1項に記載の装置。
- 前記位相プレートが離散的ステップで回転可能または変位可能である、請求項19乃至25のいずれか1項に記載の装置。
- 前記回折次数を選択するための変位可能な絞りが対物レンズの瞳内もしくはその近傍の回折次数の存在する位置に、または対物レンズの瞳と共役な平面内に配置されている、請求項19乃至26のいずれか1項に記載の装置。
- 絞りが、対向する通過開口部を備える円形のマスクであり、光軸の周りで回転可能である、請求項19乃至27のいずれか1項に記載の装置。
- 結合が伝達部を介して行われる、請求項19記載の装置。
- 前記絞りおよび位相プレートの少なくとも一方の駆動が、ステップモータによって行われる、請求項19または29に記載の装置。
- 照明された試料を光学的に捕捉するための、請求項19乃至30に記載のいずれか1項に記載の装置であって、
照明光を少なくとも1つの平面内で空間的に構造化して該試料に当て、該試料の複数の画像を該試料上の構造の様々な位置で検出器が記録し、該複数の画像から光学的断面画像および解像度の少なくとも一方が高められた画像を計算し、
構造化された照明作用を該試料上で生じさせる光分布を形成する手段が、瞳内またはその近傍の回折次数の存在する位置に設けられている装置。 - 前記光分布が、前記瞳の前方にある中間画像面内における周期的構造体の回折像に対応する、請求項31に記載の装置。
- 前記光分布を、ファイバの出力部が形成する、請求項31または32に記載の装置。
- 前記ファイバの出力部が、マイクロレンズおよび微小構造体およびコーティングの少なくとも一つを有する、請求項33に記載の装置。
- 前記構造化の位相位置を、前記ファイバから出射する光の位相を変化させる手段によって変更する、請求項33または34に記載の装置。
- 前記光分布を、異なるファイバ出力部に切り換える手段が変更する、請求項33乃至35のいずれか1項に記載の装置。
- 前記照明光のスペクトル組成を、切り換える手段が変更する、請求項31乃至36のいずれか1項に記載の装置。
- 瞳面とファイバの出力部との間で中間結像を行う、請求項33乃至37のいずれか1項に記載の装置。
- ファイバの端部を顕微鏡のビーム路に収容/結合するためのプラグインモジュールが設けられている、請求項33乃至38のいずれか1項に記載の装置。
- 前記光を試料の方向に偏向させるためのミラーが設けられている、請求項31乃至39のいずれか1項に記載の装置。
- 前記ファイバの端部が、顕微鏡の瞳の縁部に配置されている、請求項33、38、又は39に記載の装置。
- 前記ファイバが光軸に対して垂直に前後に並べて配置されている、請求項33、38、又は39に記載の装置。
- 前記ファイバが光軸に対して平行に上下に重ねて配置されている、請求項33、38、又は39に記載の装置。
- 照明された試料を光学的に捕捉するための装置であって、
照明光を少なくとも1つの平面内で空間的に構造化して該試料に当て、該試料の複数の画像を該試料上の構造の様々な位置で検出器が記録し、該複数の画像から光学的断面画像および解像度の少なくとも一方が高められた画像を計算し、
回折像または光分布を、瞳面と共役な平面内に形成し、有利には中間的結像によって、複数の反射領域を備える透明なビームスプリッタの平面内に結像し、該ビームスプリッタが、該照明光を、該反射領域を介して試料の方向にさらに導く、請求項19乃至43のいずれか1項に記載の装置。 - 前記ビームスプリッタが、瞳内または瞳の近傍の回折次数の存在する位置に配置されている、請求項44に記載の装置。
- 顕微鏡において用いられる、請求項1乃至18のいずれか1項に記載の方法。
- 顕微鏡において用いられる、請求項19乃至45のいずれか1項に記載の装置。
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