JP5875990B2 - メチオニンγリアーゼ酵素を含む作製された酵素およびその薬理学的調製物 - Google Patents
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Description
本発明は、概して、L-メチオニンを枯渇させる酵素によって癌を処置するための組成物および方法に関する。より具体的には、メチオニン分解活性を有し、かつヒトの治療に適した大きく増強された安定性を有する新規ヒトメチオニンγリアーゼ酵素の作製に関する。
癌性組織においては、必須アミノ酸メチオニンの需要が例外的に高い。メチオニンの枯渇は、非癌性組織に悪影響を及ぼすことなく、多様な腫瘍型を死滅させるために有効であることが示されている。メチオニン枯渇は、アミノ酸を加水分解する酵素の作用を介して達成され得る。ヒトメチオニン枯渇酵素は存在しないが、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来の細菌酵素メチオニンγリアーゼは、診療所において治療的に有効であることが示され、臨床試験において評価されている。しかしながら、細菌タンパク質としてのメチオニンγリアーゼは、高度に免疫原性であって、有害反応および活性の低下をもたらす特異抗体の形成を誘発する。メチオニンγリアーゼは、また、インビトロおよびインビボでおよそ2時間という極めて短い半減期を有し、全身枯渇を達成するためには、極めて頻繁な、非現実的に高い用量の投与を必要とする。
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼと比較して少なくとも1個のアミノ酸置換を含む霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントを含むポリペプチドであって、該シスタチオニンγリアーゼバリアントが、L-メチオニン分解について約10M -1 s -1 〜約1×10 6 M -1 s -1 の触媒特異性定数(catalytic specificity constant)(k cat /K M )を有する、前記ポリペプチド。
[本発明1002]
少なくとも1個のアミノ酸置換が、ネイティブシスタチオニンγリアーゼの基質認識部位の1個または複数個の荷電残基におけるものである、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1003]
少なくとも1個のアミノ酸置換が、ネイティブシスタチオニンγリアーゼの59位、119位、および/または339位のアミノ酸におけるものである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1004]
少なくとも1個のアミノ酸置換が、SEQ ID NO:1の59位、119位、および/または339位のアミノ酸におけるものである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1005]
59位、119位、および/または339位のアミノ酸における置換が、アスパラギン酸(N)、バリン(V)、またはロイシン(L)である、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1006]
59位、119位、および/または339位のアミノ酸における置換が、R119L置換およびE339V置換を含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1007]
59位、119位、および/または339位のアミノ酸における置換が、E59VまたはE59Nの付加的な置換を含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1008]
シスタチオニンγリアーゼバリアントが、L-メチオニン分解について少なくとも約10 4 M -1 s -1 のk cat /K M を有する、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1009]
シスタチオニンγリアーゼバリアントが、L-ホモシスチン分解について約50M -1 s -1 未満のk cat /K M を有する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1010]
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、SEQ ID NO:1の配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1011]
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、SEQ ID NO:1の配列に対して少なくとも98%の配列同一性を有する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1012]
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、SEQ ID NO:18〜20のいずれかの配列を有する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1013]
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、ヒトシスタチオニンγリアーゼ(SEQ ID NO:1)である、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1014]
異種ペプチドセグメントをさらに含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1015]
異種ペプチドセグメントがXTENペプチドである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1016]
ポリエチレングリコール(PEG)と結合している、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1017]
1個または複数個のLys残基またはCys残基を介してPEGと結合している、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1018]
前記本発明のいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
[本発明1019]
細菌における発現のためにコドンが最適化されている、本発明1018の核酸。
[本発明1020]
本発明1019の核酸を含む発現ベクター。
[本発明1021]
本発明1019の核酸を含む宿主細胞。
[本発明1022]
細菌である、本発明1021の宿主細胞。
[本発明1023]
遺伝子ilvAおよびmetAの欠失を有する大腸菌(E.coli)株である、本発明1022の宿主細胞。
[本発明1024]
薬学的に許容される担体中に本発明1001のポリペプチドまたは本発明1018の核酸を含む、薬学的製剤。
[本発明1025]
対象における腫瘍細胞の処置のための、本発明1001〜1017のいずれかのポリペプチド、本発明1018または1019のいずれかの核酸、本発明1020の発現ベクター、本発明1024の薬学的製剤を含む、組成物。
[本発明1026]
対象がメチオニン制限食で維持される、本発明1025の組成物。
[本発明1027]
対象が普通食で維持される、本発明1025の組成物。
[本発明1028]
対象がヒト患者である、本発明1025〜1027のいずれかの組成物。
[本発明1029]
腫瘍細胞が、乳癌、前立腺癌、神経芽腫、または膵癌の細胞である、本発明1025〜1028のいずれかの組成物。
[本発明1030]
腫瘍細胞の栄養培地中にある、本発明1025〜1029のいずれかの組成物。
[本発明1031]
栄養培地が、血液、リンパ液、または脊髄液である、本発明1030の組成物。
[本発明1032]
以下の工程を含む、L-メチオニン分解活性を有する霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントを同定する方法:
(a)ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼと比較して少なくとも1個のアミノ酸置換を含む霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントの集団を、遺伝子ilvAおよびmetAの欠失を有する大腸菌株の細胞において発現させる工程;ならびに
(b)L-メチオニン分解活性を有する霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントを同定する工程であって、該同定されるバリアントを発現する細胞が、ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼを発現するがそれ以外は同一の条件にある細胞と比較して、L-メチオニンが補充された最少培地において、より高い増殖速度を有する、工程。
本発明のその他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明より明白になるであろう。しかしながら、本発明の本旨および範囲に含まれる様々な変化および変更が、この詳細な説明から、当業者には明白になるため、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示すものであって、例示のためにのみ与えられていることが、理解されるべきである。
本開示は、ある種の態様によると、概して、メチオニン分解活性を有するよう作製された新規ヒト酵素を調製するための組成物および方法、ならびにその関連する治療的適用に関する。
リアーゼとは、新たな二重結合または新たな環構造がしばしば形成される、様々な化学結合の切断を触媒する酵素である。例えば、この反応を触媒した酵素は、リアーゼである:ATP→cAMP+PPi。リアーゼは、一方向の反応については一つの基質しか必要としないが、逆反応については二つの基質を必要とする点で、他の酵素と異なる。
を触媒する酵素である。したがって、この酵素の二つの基質は、L-メチオニンおよびH2Oであって、三つの生成物はメタンチオール、NH3、および2-オキソブタノエートである。この酵素は、リアーゼのファミリー、具体的には、炭素-硫黄リアーゼのクラスに属している。この酵素クラスの系統名は、L-メチオニンメタンチオール-リアーゼ(脱アミノ2-オキソブタノエート形成)である。一般的に使用されているその他の名称には、L-メチオニナーゼ、メチオニンリアーゼ、メチオニナーゼ、メチオニンデチオメチラーゼ、L-メチオニンγリアーゼ、およびL-メチオニンメタンチオール-リアーゼ(脱アミノ)が含まれる。この酵素はセレノアミノ酸の代謝に参与する。それは、一つの補因子、ピリドキサール-5'-リン酸を利用する。
ヒトはメチオニンγリアーゼ(MGLまたはメチオニナーゼ)を産生しないため、ヒトの治療のためには、生理学的条件下でメチオニンを分解する高い活性および特異性を有し、血清のような生理学的液体において高い安定性を有し、かつ、通常は免疫寛容を誘発するネイティブタンパク質であるために非免疫原性でもあるメチオニナーゼを作製する必要がある。
ある種の局面において、L-メチオニンを枯渇させる新規酵素により、肝細胞癌、黒色腫、および腎細胞癌のような、メチオニン枯渇に感受性の癌を含む疾患を処置するため、ポリペプチドを使用することができる。本発明は、具体的には、メチオニン分解活性を有する改変シスタチオニンγリアーゼを使用した処置法を開示する。下記のように、現在利用可能なメチオニンγリアーゼは、典型的には、細菌由来タンパク質であり、ヒトの治療において使用するためには、いくつかの問題が残っている。本発明のある種の態様は、治療効力の増加のため、メチオニンγリアーゼ活性を有する新規酵素を提供する。
本発明の組成物および方法は、異種ペプチドセグメントまたはポリエチレングリコールのようなポリマーとのコンジュゲートの形成のような、作製されたメチオニナーゼの改良のためのさらなる修飾を含む。さらなる局面において、酵素の水力学的半径を増加させ、したがって、血清持続性を増加させるため、作製されたメチオニナーゼをPEGに連結することができる。ある種の局面において、腫瘍細胞上の外部受容体または結合部位に特異的かつ安定的に結合する能力を有するリガンドのような任意のターゲティング剤に、開示されたポリペプチドをコンジュゲートさせることもできる(米国特許公開第2009/0304666号)。
本発明のある種の態様は、融合タンパク質に関する。これらの分子は、N末端またはC末端で異種ドメインに連結された改変シスタチオナーゼを有することができる。例えば、融合体は、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にするため、他の種に由来するリーダー配列を利用してもよい。別の有用な融合体は、6ヒスチジン残基または抗体エピトープのような免疫学的活性を有するドメインのようなタンパク質アフィニティタグの付加を含み、それらは、好ましくは、融合タンパク質の精製を容易にするため、切断可能である。非限定的なアフィニティタグには、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)が含まれる。
ある種の態様において、作製されたメチオニナーゼを、二官能性架橋試薬を使用して化学的にコンジュゲートさせてもよいし、またはペプチドリンカーを用いてタンパク質レベルで融合させてもよい。
本発明のある種の局面において、作製されたメチオニナーゼのPEG化に関する方法および組成物が開示される。例えば、作製されたメチオニナーゼを、本明細書に開示された方法に従ってPEG化することができる。
ある種の態様において、本発明は、作製されたメチオニナーゼのような、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドを含む新規組成物に関する。これらのペプチドは、融合タンパク質に含まれていてもよいし、または前記のような薬剤にコンジュゲートされていてもよい。
本発明のある種の局面において、作製されたメチオニナーゼまたは改変されたシスタチオナーゼを含有している融合タンパク質をコードする核酸配列が開示され得る。使用される発現系に依って、核酸配列は従来の方法に基づき選択され得る。例えば、作製されたメチオニナーゼは、ヒトシスタチオナーゼに由来し、発現に干渉する可能性のある、大腸菌においては稀にしか利用されない複数個のコドンを含有しており、したがって、それぞれの遺伝子またはそのバリアントを大腸菌発現のためにコドンの最適化を行うことができる。作製されたメチオニナーゼのような関心対象のタンパク質を発現させるためには、様々なベクターを使用することもできる。例示的なベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾンまたはリポソームに基づくベクターが含まれるが、これらに限定されない。
宿主細胞は、作製されたメチオニナーゼおよびそのコンジュゲートの発現および分泌を可能にするために形質転換可能な任意のものであり得る。宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、酵母、または糸状菌であり得る。様々な細菌には、エスケリキア(Escherichia)およびバチルス(Bacillus)が含まれる。サッカロミセス(Saccharomyces)属、クルイベロミセス(Kiuyveromyces)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、またはピキア(Pichia)属に属する酵母は、適切な宿主細胞として有用である。以下の属を含む、糸状菌の様々な種が、発現宿主として使用可能である:アスペルギルス(Aspergillus)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、ニューロスポラ(Neurospora)属、ペニシリウム(Penicillium)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、アクリャ(Achlya)属、ポドスポラ(Podospora)属、エンドチア(Endothia)属、ムコール(Mucor)属、コクリオボルス(Cochliobolus)属、およびピリキュラリア(Pyricularia)属。
タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術には、あるレベルにおいて、ホモジナイゼーション、ならびに細胞、組織、または器官のポリペプチド画分および非ポリペプチド画分への粗分画が含まれる。関心対象のタンパク質またはポリペプチドは、特記しない限り、部分精製または完全精製(または均質になるまでの精製)を達成するため、クロマトグラフィおよび電気泳動の技術を使用してさらに精製されてもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル排除クロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィ、イムノアフィニティクロマトグラフィ、および等電点電気泳動である。特に効率的なペプチド精製法は、ファストパフォーマンスリキッドクロマトグラフィ(fast performance liquid chromatography/FPLC)またはさらには高速液体クロマトグラフィ(HPLC)である。
局所的に進行した癌または転移性の癌を有する癌患者において、腫瘍細胞増殖を阻害するため、最も好ましくは、癌細胞を死滅させるため、新規メチオニナーゼを全身投与または局所投与し得ることが企図される。それらは、静脈内、くも膜下腔内、および/または腹腔内に投与可能である。それらは、単独で投与されてもよいし、または抗増殖薬と組み合わせて投与されてもよい。一つの態様において、それらは、手術またはその他の手技の前に、患者における癌量を低下させるために投与される。あるいは、それらは、残存する癌(例えば、手術によって排除し得なかった癌)が生存しないことを確実にするため、手術の後に投与されてもよい。
本発明のある種の局面は、治療用キットのようなキットを提供し得る。例えば、キットは、本明細書に記載される一つまたは複数の薬学的組成物を含むことができ、任意で、その使用のための説明を含むことができる。キットは、そのような組成物の投与を達成するための一つまたは複数の装置を含んでいてもよい。例えば、本発明のキットは、薬学的組成物、および組成物の癌性腫瘍への直接静脈注射を達成するためのカテーテルを含むことができる。他の態様において、本発明のキットは、任意で、医薬品として製剤化されていてもよいし、または送達装置により使用するため凍結乾燥されていてもよい、作製されたメチオニナーゼの予め充填されたアンプルを含むことができる。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を証明するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成すると見なされ得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮すれば、開示された具体的な態様に多くの変化を施しても、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似の結果を得ることが可能であることを認識するべきである。
ネイティブヒトシスタチオニンγリアーゼおよび改変ヒトシスタチオニンγリアーゼの遺伝子の合成および発現
シスタチオニンγリアーゼ(CGL)酵素およびメチオニンγリアーゼ(MGL)酵素の配列および構造アラインメントを指針として使用して、CGL、具体的には、ヒトCGL(hCGL)を、メチオニンを効率的に分解するための酵素に変換した。
メチオニンγリアーゼ活性についての96穴プレートスクリーニングおよびクローンの順位付け
MGLおよびCGLは、いずれも、それぞれの基質から2-ケトブタン酸を生成する。小さなライブラリーをスクリーニングし、最も大きなMETase(メチオニンγリアーゼ)活性を有するクローンを順位付けするため、α-ケト酸3-メチルベンゾチアゾリン-2-オンヒドラゾン(MBTH)の検出のための比色定量アッセイ(Takakura et al.,2004)を、96穴プレートフォーマットの規模に調整した。
メチオニンγリアーゼ活性についての遺伝学的選択
大腸菌において、α-ケトブチレートは、イソロイシン生合成経路の最初の酵素としての(ilvAによりコードされる)トレオニンデアミナーゼの作用により生成される。ほぼ40年前に、GrimmingerおよびFeldnerが、イソロイシン要求体であるトレオニンデアミナーゼ変異体を同定し(Grimminger and Feldner 1974)、より最近、イソロイシンが培地から省かれた時、正常な増殖能力の<5%しか有しないと報告されている一般的な発現株BLR(DE3)において、トレオニンデアミナーゼ点変異体が見出された(Goyer et al.,2007)。α-ケトブチレートを生成するメチオニナーゼの発現は、ilvA変異体の増殖をレスキューし、したがって、最少培地におけるコロニー形成を可能にすることが示された。しかしながら、BLR(DE3)のトレオニンデアミナーゼ遺伝子は、点変異体であり、特に、極めて大きなライブラリーでは、復帰という別の可能性を有する。トレオニンデアミナーゼは、イソロイシン生合成オペロンilvGMEDAにおける遠位の遺伝子であり、オペロンの一部として、または内部プロモーターから独立に発現される(Lopes and Lawther 1989)。
hCGLの残基E59、R119、およびE339における変異誘発の効果
構造分析は、残基E59、R119、およびE339が、基質L-シスタチオニンについてのhCGLの認識に関与している可能性が高いことを示した。これらの部位におけるNNSコドン飽和ライブラリーは、以下の変異誘発プライマー
を用い、鋳型DNAとしてのhCGL遺伝子、ならびに特異的な末端プライマー
を用いて構築し、スクリーニングした。PCR産物をNcoIおよびEcoRIにより消化し、T4 DNAリガーゼによりpET28aベクターにライゲートした。得られたライゲーションを直接大腸菌(BL21)に形質転換し、実施例2に記載されたようなその後のスクリーニングのため、LB-カナマイシンプレート上に播種した。ライブラリーの理論上の多様性より2倍多くのコロニーをスクリーニングした。活性を示したクローンを単離し、変異を同定するため、hCGL遺伝子の配列を決定した。
ヒトシスタチオニンγリアーゼバリアントの特徴付け
最も高い触媒活性を有するとしてスクリーニングから同定された2個のhCGLバリアントは、N末端His6タグ付加に加え、以下の変異を有することが見出された:E59NまたはV、R119L、およびE339V。これらのバリアントを、それぞれ、hCGL-NLV(SEQ ID NO:10)およびhCGL-VLV(SEQ ID NO:11)と呼んだ。これらのバリアントの両方を、実施例2に記載されたものに類似した1ml規模のMBTHアッセイを使用して、pH7.3および37℃で、100mM PBS緩衝液において、L-Metを分解する能力について動力学的に特徴付けた。容易な連続アッセイをもたらす、hCGLバリアントのL-Metに対する触媒作用からのメタンチオールの放出を検出するためのエルマン試薬(DTNB)。hCGL-NLVおよびhCGL-VLVの両方が、L-Metに対するおよそ1×104s-1M-1というkcat/KMを有していた。親酵素ネイティブhCGLは、これらのアッセイの検出限度内でL-Metを分解することができなかった。
神経芽腫に対するヒトメチオニンγリアーゼの細胞傷害性
神経芽腫細胞株Lan-1を用いて、hCGLおよびpMGLのインビトロ細胞傷害性を評価した。LAn-1細胞をおよそ7000細胞/ウェルで播種し、様々な濃度のpMGLまたはhCGL-NLVと共にインキュベートした。3〜5日の曝露の後、増殖をWST-8を使用して測定し、見かけのIC50値を計算するため、データをプロットした(Hu and Cheung 2009)。得られたデータ(図6)の分析は、pMGLにより処理された細胞についての0.34U/ml(およそ0.6μM)という見かけのIC50値、hCGL-NLVにより処理された細胞についての0.15U/ml(およそ0.3μM)という見かけのIC50値を与えた。
神経芽腫細胞株のパネルに対するPEG化ヒトメチオニンγリアーゼの細胞傷害性
NB細胞株(BE(1)N,BE(2)N,BE(2)S,BE(2)C,SK-N-LD,NMB-7,SH-EP-1,IMR32,CHP-212,SKN-MM,LAN-1,LAI-66N,LAI-55N,LAI-5S)のインビトロの増殖を、様々な濃度のPEG-hMGLまたはPEG-hCGL-NLVを含む96穴プレート(BD Biosciences,Bedford,MA)においてアッセイした。
ヒトシスタチオニンγリアーゼバリアントの薬理学的調製物
一つの例外を除き、実施例1に記載されたようにして、hCGL-NLVを精製した:IMACカラムに結合させた後、0.1%トリトン114を含有しているIMAC緩衝液により充分に(90〜100カラム体積)、試料中のタンパク質を洗浄する。10〜20カラム体積のIMAC緩衝液、次いで、IMAC溶出緩衝液(50mM NaPO4/250mMイミダゾール/300mM NaCl、pH8)により溶出させた。トリトン114による洗浄は、内毒素(リポ多糖)夾雑を低下させるために利用された。精製されたタンパク質を、10,000 MWCO濾過装置(Amicon)を使用した、100mM NaPO4緩衝液(pH8.3)への緩衝液交換に供した。その後、PLPを10mMの濃度で添加し、タンパク質を25℃で1時間インキュベートした。次いで、メトキシPEGスクシンイミジルカルボキシメチルエステル5000MW(JenKem Technology)を80:1モル比でhCGL-NLVに添加し、絶えず攪拌しながら25℃で1時間反応させた。得られた混合物を、100,000 MWCO濾過装置(Amicon)を使用して、充分に緩衝液交換し(10%グリセロールを含むPBS)、0.2ミクロン注射器フィルター(VWR)により滅菌した。全てのPEG化酵素を、Limulus Amebocyte Lysate(LAL)キット(Cape Cod Incorporated)を使用して、リポ多糖(LPS)含量について分析した。
マウスにおけるPEG MW 5000 hCGL-NLVの薬力学的分析
マウス(balb/c)(n=5)において、50UのPEG-hCGL-NLVの尾静脈注射の後、PEG化hCGLバリアントのインビボ半減期を決定した。異なる時点で血液試料を採取し、hCGL-NLV活性を上記のようにして決定した。t=1時間において採取された血液における活性を、100%に設定した。データへの指数関数適合は、28±4時間というT1/2を明らかにした(図7)。これは、PEG-pMGLと比較して14倍の改良である。
マウス血漿におけるメチオニン枯渇
処理前にメチオニン(-)ホモシスチン(-)コリン(-)(Met(-)Hcyss(-)Chl(-))食を与えられたマウス(n=5)に、尾静脈注射により200UのPEG-hCGL-NLVを投与した。基本的には他に記載されたようにして(Sun,et al.2005)、HPLCにより、L-Metレベルについて血漿試料を分析した。血中メチオニンレベルは、処理前の124±37μMから、8時間目に、3.9±0.7μMという最低値にまで減少し、24時間以上、低いままであった(図8)。
LAN-1腫瘍異種移植片に対するPEG-hCGL-NLVの効果
PEG-hCGL-NLV投与についてのスケジュールは、体重減少を最小化し、かつPEG-hCGL-NLVの薬物動態を最大化するために考案された。(インビボの唯一の用量制限毒性は、メチオニン枯渇後の体重減少である。)LAN-1を異種移植された胸腺欠損マウスを、100単位のPEG-hCGL-NLVにより、4週間、週3回、静脈内処理した時、15〜20%の可逆的な体重減少が観察された。処理の最終(第4)週の3回目のPEG-hCGL-NLV注射の24時間後、血漿メチオニン濃度は、処理前の124±37μMとは対照的に、Met(-)Hcyss(-)Chl(-)食を与えられたPEG-hCGL-NLVにより処理されたマウスにおいては5.8±2.1μMであった(n=10)。Met(-)Hcyss(-)Chl(-)食を与えられたマウスは、10〜15%の可逆的な体重減少を有し、血漿メチオニン濃度はMet(-)Hcyss(-)Chl(-)食の間、13.2±4.5μMであった。100単位のPEG-hCGL-NLVによる処理をMet(-)Hcyss(-)Chl(-)食と組み合わせた時、未処理群またはMet(-)Hcyss(-)Chl(-)食のみを受容した群と比較して、LAN-1異種移植片に対する有意な抗腫瘍効果(p<0.01)が観察された(図10)。
霊長類メチオニンγリアーゼの作製
チンパンジー、スマトラオランウータン、およびカニクイザルのような霊長類種に由来するCGLの配列は、それぞれ、ヒトCGLとアミノ酸組成が約99%、96%、および95%同一である。メチオニンγリアーゼ活性を付与する変異を有する霊長類CGL酵素は、実施例4に記載されるような標準的な変異誘発技術を使用して構築される。得られた遺伝子をpET28aへクローニングする。次いで、L-メチオニナーゼ活性を有する非ヒト霊長類hGCLを、上記のようにして発現させ精製する。NまたはV59、L119、およびV339に相当するアミノ酸位置により作製された霊長類CGLは、少なくとも1×102s-1M-1のkcat/KM値でL-Metを分解する。
スマトラオランウータンCGL-NLV(Genbank ID NP_001124635.1を有するネイティブ配列(即ち、SEQ ID NO:18)に対するV59N置換、R119L置換、およびE339V置換、ならびにN末端His6タグの付加を有するSEQ ID NO:12)、スマトラオランウータンCGL-VLV(Genbank ID NP_001124635.1を有するネイティブ配列に対するR119L置換およびE339V置換、ならびにN末端His6タグの付加を有するSEQ ID NO:13);
カニクイザルCGL-NLV(Genbank ID AAW71993.1を有するネイティブ配列(即ち、SEQ ID NO:19)に対するE59N置換、R119L置換、およびE339V置換、ならびにN末端His6タグの付加を有するSEQ ID NO:14)、カニクイザルCGL-VLV(Genbank ID AAW71993.1を有するネイティブ配列に対するE59V置換、R119L置換、およびE339V置換、ならびにN末端His6タグの付加を有するSEQ ID NO:15);
チンパンジーCGL-NLV(Genbank ID XP_513486.2を有するネイティブ配列(即ち、SEQ ID NO:20)に対するE59N置換、R119L置換、およびE339V置換、ならびにN末端His6タグの付加を有するSEQ ID NO:16)、ならびにチンパンジーCGL-VLV(Genbank ID XP_513486.2を有するネイティブ配列に対するE59V置換、R119L置換、およびE339V置換、ならびにN末端His6タグの付加を有するSEQ ID NO:17)。
Claims (21)
- ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼと比較して少なくとも3個のアミノ酸置換を含む霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントを含むポリペプチドであって、
該ポリペプチドはメチオニン分解活性を有し、
少なくとも3個のアミノ酸置換が、配列番号:1のE59、R119、およびE339に相当するアミノ酸の位置におけるものであり、
配列番号:1のE59、R119、およびE339に相当するアミノ酸の位置における置換が、(1)それぞれV、LおよびV、または、(2)それぞれN、LおよびVであり、かつ
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、配列番号:1の配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、
前記ポリペプチド。 - ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、配列番号:18〜20のいずれかの配列からなる、請求項1記載のポリペプチド。
- ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、配列番号:1に記載のヒトシスタチオニンγリアーゼである、請求項1記載のポリペプチド。
- 霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントが、配列番号:10〜17からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項1記載のポリペプチド。
- 異種ペプチドセグメントをさらに含む、請求項1記載のポリペプチド。
- 異種ペプチドセグメントがXTENペプチドである、請求項5記載のポリペプチド。
- ポリエチレングリコールと結合している、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 1個または複数個のLys残基またはCys残基を介してPEGと結合している、請求項7記載のポリペプチド。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸。
- 細菌における発現のためにコドンが最適化されている、請求項9記載の核酸。
- 請求項9記載の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項9記載の核酸を含む宿主細胞。
- 細菌である、請求項12記載の宿主細胞。
- 遺伝子ilvAおよびmetAの欠失を有する大腸菌(E.coli)株である、請求項13記載の宿主細胞。
- 薬学的に許容される担体中に請求項1記載のポリペプチドまたは請求項9記載の核酸を含む、薬学的製剤。
- 対象における腫瘍細胞の処置のための、
・請求項1〜8のいずれか一項記載のポリペプチド、
・請求項9または10のいずれか一項記載の核酸、
・請求項11記載の発現ベクター、または
・請求項15記載の薬学的製剤
を含む、組成物。 - 対象がメチオニン制限食で維持される、請求項16記載の組成物。
- 対象が普通食で維持される、請求項16記載の組成物。
- 対象がヒト患者である、請求項16記載の組成物。
- 腫瘍細胞が、乳癌、前立腺癌、神経芽腫、または膵癌の細胞である、請求項16記載の組成物。
- 以下の工程を含む、L-メチオニン分解活性を有する霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントを同定する方法:
(a)請求項1〜8のいずれか一項に定義される霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントの集団を、遺伝子ilvAおよびmetAの欠失を有する大腸菌株の細胞において発現させる工程;ならびに
(b)L-メチオニン分解活性を有する霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントを同定する工程であって、該同定されるバリアントを発現する細胞が、ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼを発現するがそれ以外は同一の条件にある細胞と比較して、L-メチオニンが補充された最少培地において、より高い増殖速度を有する、工程。
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