JP5851092B2 - ペプチド組成物、およびその製造方法 - Google Patents
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Description
コラゲナーゼ活性を有するプロテアーゼ処理後のサンプルを用いて、0.1%溶液(45%アセトニトリル−0.1%トリフルオロ酢酸)を調製し、分子量分布を測定した。
<測定条件>
・カラム:東ソー社製TSK-GEL G2500PW XL(78mmID×30cm)
・カラム温度:40℃
・移動相:45%アセトニトリル−0.1%トリフルオロ酢酸)
・流速:0.8ml/分
・注入量:10μl
・検出波長:214nm
<分子量マーカー(各0.1%終濃度)>
Myoglobin(分子量:17800)
Aprotinin(分子量:6500)
I nsulin chain B(分子量:3400)
Oxytocin(分子量:1007)
Glutathione(分子量:307)
エキソペプチダーゼ処理後のサンプルを用いて、等容量の5%トリクロロ酢酸を加え除タンパクした後、遠心分離(12000rpm、4℃、10分)を行った。得られた上清を用いて、LC-MS/MSにてL-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを定量分析し、L-プロリル-L-ヒドロキシプロリン含有量を測定した。標品としてはBachem社のL-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを用いた。
<システム>
・LC:Waters社製ACQUITY UPLCTM
・MS:Waters社製Quattro Premier XEタンデムマス検出器
<HPLC>
・カラム:Waters社製ACQUITY UPLCTM HSS T3 1.8μm(2.1×50mm)
・カラム温度:40℃
・移動相A:0.05%ペンタフルオロプロピオン酸
・移動相B:アセトニトリル
・グラジエント:移動相B:0%(0−4分)、移動相B:0→25%(4−9分)、
移動相B:25→80%(9−9.01分)、移動相B:80%(9.01−10分)
・流速:0.3ml/分
・注入量:5μl
・分析時間:13分
ゼラチンを水に加温して溶解し、10%ゼラチン溶液100mLを調製した。そして、基質であるゼラチンに対して1%(w/w)となるようにコラゲナーゼ(天野エンザイム社製)を添加し、50℃で30分間反応させた。その後、10分間煮沸して酵素反応を停止させた。
得られたプロテアーゼ処理組成物について、分子量分布を測定した。結果を図1に示した。コラゲナーゼ処理により、プロテアーゼ処理組成物が得られたことを確認した。
実施例1で得られたプロテアーゼ処理組成物を用いて、10%プロテアーゼ処理組成物の水溶液100mLを調製した後、水酸化ナトリウム水溶液を添加してpH8に調整した。そして、基質であるトリペプチド含有組成物に対して2%(w/w)または5%(w/w)となるように酵素を添加し、50℃で6時間または24時間反応させた。その後、10分間煮沸して酵素反応を停止させた。
酵素処理後のL-プロリル-L-ヒドロキシプロリン含有組成物について、L-プロリル-L-ヒドロキシプロリン含有量を測定した。まず、基質に対して酵素を2%(w/w)添加し、6時間反応させた場合の結果を表1に示した。エキソペプチダーゼ活性を有する酵素の中で、プロテアーゼA(天野エンザイム社製)、プロテアーゼM(天野エンザイム社製)、デナチームAP(ナガセケムテックス社製)、ウマミザイムG(天野エンザイム社製)の4種類は、L-プロリル-L-ヒドロキシプロリン含有量が2mg/g以上(L-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを組成物(固形分)あたり質量基準で0.2%(w/w)含有)と非常に高く、L-プロリル-L-ヒドロキシプロリン生成量を高めることができた。
また、基質に対してウマミザイムG(天野エンザイム社製)を5%(w/w)添加した場合の結果を表2に示した。酵素量を増加することによりL-プロリル-L-ヒドロキシプロリン含有量は約2倍になり、さらに反応時間を24時間にすることによりL-プロリル-L-ヒドロキシプロリン含有量は10mg/g以上(L-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを組成物(固形分)あたり質量基準で1.0%(w/w)含有)と非常に高く、L-プロリル-L-ヒドロキシプロリン生成量を高めることができた。また、分子量分布においても、図2に示したように明確なL-プロリル-L-ヒドロキシプロリンのピークを確認することができた(図2)。
Claims (5)
- ジペプチドであるL-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを含有する組成物の製造方法であって、
(a)L-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを含むアミノ酸配列を有するコラーゲンおよび/またはゼラチンに、コラゲナーゼを作用させる工程と、
(b)前記プロテアーゼ処理後の組成物に、プロテアーゼA、プロテアーゼM、デナチームAPからなる群より選択される、いずれか1種のエキソペプチダーゼを作用させて、ジペプチドであるL-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを含有する組成物を生成させる工程と、を含み、
前記工程(b)のエキソペプチダーゼ処理後の反応溶液に対して、L-プロリル-L-ヒドロキシプロリン含有量を高めるための抽出、分画、濃縮による精製工程を行わずに、前記工程(b)のエキソペプチダーゼ処理後の反応溶液に対して、ジペプチドであるL-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを含有する組成物を取り出すための抽出、濃縮、乾燥による工程のみを行う方法であって、得られた前記ジペプチドであるL-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを含有する組成物が、ジペプチドであるL-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを、組成物(固形分)あたり質量基準で0.2〜10%含有する、前記L-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを含有する組成物であることを特徴とする、方法。 - 前記工程(b)のエキソペプチダーゼ処理後の反応溶液に対して、L-プロリル-L-ヒドロキシプロリン含有量を高めるための抽出、分画、濃縮による精製工程を行わずに、前記工程(b)のエキソペプチダーゼ処理後の反応溶液に対して、ジペプチドであるL-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを含有する組成物を取り出すための抽出、濃縮、乾燥による工程のみを行う方法であって、得られた前記ジペプチドであるL-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを含有する組成物が、ジペプチドであるL-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを、組成物(固形分)あたり質量基準で0.2〜1%含有する、前記L-プロリル-L-ヒドロキシプロリンを含有する組成物であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(b)における温度が45〜55℃であり、工程(b)におけるpHが7.5〜8.5である、請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記工程(b)における前記エキソペプチダーゼの添加量が、前記工程(a)のコラゲナーゼ処理後の組成物に対して0.1〜10%である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記工程(b)における前記エキソペプチダーゼの添加量が、前記工程(a)のコラゲナーゼ処理後の組成物に対して2〜5%である、請求項4に記載の製造方法。
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