JP5846523B2 - Escherichia coli expressing β-glucosidase - Google Patents
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Description
本発明は、バイオマス分解酵素を発現する大腸菌に関する。 The present invention relates to E. coli expressing a biomass degrading enzyme.
大腸菌は遺伝子組換えによる有用物質生産に好適に用いられるが、培養中の生育のためにグルコースを必要とする。近年、セルロースなどのバイオマスの有効利用が探索されているが、大腸菌は、このようなバイオマスを直接資化できない。大腸菌の培養にバイオマスを利用するためには、グルコースを得るために、予めセルロースを酵素により糖化する必要がある。大腸菌にバイオマス分解能を付与し、すなわち、バイオマス分解酵素を発現させることができれば、糖化工程を省略して直接バイオマスを炭素源として大腸菌を培養できると期待される。 E. coli is preferably used for production of useful substances by genetic recombination, but requires glucose for growth in culture. In recent years, effective utilization of biomass such as cellulose has been explored, but Escherichia coli cannot directly assimilate such biomass. In order to use biomass for culturing E. coli, it is necessary to saccharify cellulose with an enzyme in advance in order to obtain glucose. If biomass resolution can be imparted to Escherichia coli, that is, biomass degrading enzyme can be expressed, it is expected that Escherichia coli can be cultured directly using biomass as a carbon source without the saccharification step.
しかし、酵母などの真核生物では、バイオマス分解酵素の発現例があるが、大腸菌などの細菌では、バイオマス分解酵素を発現させてバイオマスを分解したという報告例はない。 However, in eukaryotes such as yeast, there are examples of expression of biomass degrading enzymes, but in bacteria such as Escherichia coli there are no reports of biomass degrading by expressing biomass degrading enzymes.
また、細胞表層提示技術は、酵素などをその細胞の表層に提示できる優れた技術である。細胞自体が固定化酵素触媒として利用できる上、提示されている酵素を細胞の回収と同時に回収できる。大腸菌などの細菌の表層に酵素を提示可能なアンカータンパク質としては、PgsAおよびOmpAなどが報告されている（PgsA：特許文献１および２、非特許文献１；およびOmpA：非特許文献２）。
The cell surface presentation technique is an excellent technique that can present enzymes and the like on the surface of the cell. The cell itself can be used as an immobilized enzyme catalyst, and the displayed enzyme can be recovered simultaneously with the recovery of the cells. PgsA and OmpA have been reported as anchor proteins capable of presenting enzymes on the surface of bacteria such as E. coli (PgsA:
本発明は、バイオマス分解酵素を発現する大腸菌を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide Escherichia coli that expresses a biomass degrading enzyme.
本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含み、該（ａ）または（ｂ）のタンパク質を発現する大腸菌を提供する：
（ａ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつβグルコシダーゼ活性を有する、タンパク質。
The present invention provides E. coli that comprises a polynucleotide comprising a gene encoding the following protein (a) or (b) and expresses the protein (a) or (b):
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4;
(B) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and having β-glucosidase activity.
１つの実施態様では、上記ポリヌクレオチドが、以下の（１）または（２）のタンパク質をコードする遺伝子をさらに含み、上記大腸菌は、上記（ａ）または（ｂ）のタンパク質を表層提示する：
（１）配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該（ａ）または（ｂ）のタンパク質を大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
In one embodiment, the polynucleotide further comprises a gene encoding the following protein (1) or (2), and the E. coli displays the protein (a) or (b) on the surface:
(1) a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12;
(2) A protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 A protein capable of presenting the protein of (a) or (b) fused to the protein on the surface of E. coli.
別の実施態様では、上記大腸菌は、BW25113株またはJCM20137株である。 In another embodiment, the E. coli is BW25113 strain or JCM20137 strain.
本発明は、以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質を提供する：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
The present invention provides the following protein (I) or (II):
(I) a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12;
(II) a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 12, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added, A protein capable of presenting the target protein or peptide fused to the protein on the surface of E. coli.
本発明はさらに、以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする遺伝子を提供する：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。
The present invention further provides a gene encoding the following protein (I) or (II):
(I) a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12;
(II) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12, A protein capable of presenting the target protein or peptide fused to the protein on the surface of E. coli.
１つの実施態様では、上記遺伝子は、以下の（Ｉａ）または（IIａ）を含む：
（Ｉａ）配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択される塩基配列からなるＤＮＡ；
（IIａ）該（Ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
In one embodiment, the gene comprises the following (Ia) or (IIa):
(Ia) DNA comprising a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 11;
(IIa) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to DNA consisting of the base sequence of (Ia), and when expressed in E. coli, the target protein or peptide DNA encoding a protein that can be displayed on the surface.
本発明はさらに、上記（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする遺伝子または上記（Ｉａ）または（IIａ）を含む遺伝子を含む、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターを提供する。 The present invention further provides an expression vector for displaying a target protein or peptide on the surface of Escherichia coli, comprising a gene encoding the protein of (I) or (II) or a gene containing the above (Ia) or (IIa). provide.
１つの実施態様では、上記発現ベクターは、以下の（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする核酸あるいは以下の（Ｉａ）または（IIａ）のＤＮＡを含み、該（Ｉ）または（II）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（Ｉａ）または（IIａ）のＤＮＡの下流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸が挿入されて用いる：
（Ｉ）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（II）配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該目的のタンパク質またはぺプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質；
（Ｉａ）配列番号７、配列番号９、および配列番号１１からなる群から選択される塩基配列からなるＤＮＡ；
（IIａ）該（Ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
In one embodiment, the expression vector comprises a nucleic acid encoding the following protein (I) or (II) or the following DNA (Ia) or (IIa): A nucleic acid encoding the protein or peptide of interest is inserted in-frame downstream of the nucleic acid encoding the protein or the DNA of (Ia) or (IIa) and used:
(I) a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12;
(II) a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 12, wherein one or several amino acids are deleted, substituted or added, A protein capable of presenting the target protein or peptide fused to the protein on the surface of E. coli;
(Ia) DNA comprising a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 11;
(IIa) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to DNA consisting of the base sequence of (Ia), and when expressed in E. coli, the target protein or peptide DNA encoding a protein that can be displayed on the surface.
別の実施態様では、上記発現ベクターは、以下の（ｉ）または（ii）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（ｉａ）または（iiａ）のＤＮＡを含み、該（ｉ）または（ii）のタンパク質をコードする核酸あるいは該（ｉａ）または（iiａ）のＤＮＡの上流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸が挿入されて用いる、請求項７に記載の発現ベクター：
（ｉ）配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ii）配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該目的のタンパク質またはぺプチドを大腸菌の表層に提示できる、タンパク質；
（ｉａ）配列番号７または配列番号９の塩基配列からなるＤＮＡ；
（iiａ）該（ｉａ）の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ大腸菌で発現させた際に目的タンパク質またはペプチドを表層提示できるタンパク質をコードする、ＤＮＡ。
In another embodiment, the expression vector comprises a nucleic acid encoding the following protein (i) or (ii) or the DNA of (ia) or (iia), and the protein of (i) or (ii) The expression vector according to claim 7, wherein a nucleic acid encoding the protein or peptide of interest is inserted in-frame upstream of the nucleic acid encoding the DNA or the DNA of (ia) or (iia):
(I) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10;
(Ii) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10, and the target protein fused to the protein Or a protein that can display peptides on the surface of E. coli;
(Ia) DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9;
(Iia) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence of (ia), and when the target protein or peptide is expressed in E. coli, DNA encoding a protein that can be displayed on the surface.
本発明はまた、目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターを提供する。 The present invention also provides an expression vector for displaying the target protein or peptide on the surface of E. coli, further comprising a gene encoding the target protein or peptide.
本発明はまた、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造する方法を提供し、上記の目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子をさらに含む、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターを大腸菌に導入する工程を含む。 The present invention also provides a method for producing Escherichia coli that displays the target protein or peptide on the surface, and further includes a gene encoding the target protein or peptide described above for expressing the target protein or peptide on the surface of E. coli. Introducing the vector into E. coli.
本発明はさらに、上記目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造する方法で製造された大腸菌を提供する。 The present invention further provides E. coli produced by the method for producing E. coli that displays the target protein or peptide on the surface.
本発明によれば、バイオマス分解酵素を発現する大腸菌が提供される。さらに、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる新規なタンパク質、その遺伝子、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現用ベクター、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造する方法、および目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌もまた提供される。 According to the present invention, E. coli expressing a biomass degrading enzyme is provided. Furthermore, a novel protein capable of displaying the target protein or peptide on the surface of E. coli, an expression vector for displaying the gene, the target protein or peptide on the surface of E. coli, and a method for producing E. coli for displaying the target protein or peptide on the surface , And E. coli displaying the protein or peptide of interest on the surface are also provided.
本発明は、βグルコシダーゼを発現する大腸菌を提供する。この大腸菌は、大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質をコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。 The present invention provides E. coli expressing β-glucosidase. This E. coli contains a polynucleotide comprising a gene encoding a β-glucosidase protein whose activity is expressed by E. coli.
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質としては、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）のＹＸ株のBGL0937（単に「Tfu0937」という場合もある）およびクロストリジウム・セルロボランス（Clostridium cellulovorans）のBglAタンパク質（単に「BglA」という場合もある）が挙げられる。Tfu0937およびBglAの全長アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列で示される。 The β-glucosidase protein whose activity is expressed by Escherichia coli includes BGL0937 (also referred to simply as “Tfu0937”) of the YX strain of Thermobifida fusca and the BglA protein of Clostridium cellulovorans (simply “ BglA ”). The full-length amino acid sequences of Tfu0937 and BglA are shown by the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, respectively.
大腸菌で発現された際にβグルコシダーゼ活性が失われない程度に、アミノ酸変異（欠失、置換、付加）が起こっているタンパク質もまた用いられ得る。このような変異には、自然界において生じる変異の他に、人為的な変異も含まれる。人為的な変異を生じさせる手段としては、部位特異的突然変異誘発法（Nucleic Acids Res. 1982年, 10巻, 6487-6500頁）が挙げられるがこれに限定されるわけではない。変異（欠失、置換、付加）したアミノ酸の数は、βグルコシダーゼ活性が失われない限りその個数は制限されないが、好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内である。 Proteins in which amino acid mutations (deletions, substitutions, additions) have occurred to the extent that β-glucosidase activity is not lost when expressed in E. coli can also be used. Such mutations include artificial mutations in addition to those occurring in nature. Examples of means for causing artificial mutation include, but are not limited to, site-directed mutagenesis (Nucleic Acids Res. 1982, 10, 6487-6500). The number of amino acids mutated (deleted, substituted, added) is not limited as long as the β-glucosidase activity is not lost, but is preferably within 10 amino acids, more preferably within 5 amino acids.
また、βグルコシダーゼ活性が失われない程度に、配列番号２または４に対して相同性を有するタンパク質もまた挙げられる。相同性は、８０％以上が好ましく、９０％以上が特に好ましい。 Also included are proteins having homology to SEQ ID NO: 2 or 4 to the extent that β-glucosidase activity is not lost. The homology is preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more.
本発明において「相同性」とは、２つのポリペプチドあるいはポリヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象のアミノ酸配列または塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。相同性の数値（％）は両方の（アミノ酸または塩基）配列に存在する同一のアミノ酸または塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸または塩基の総数で割り、得られた数値に100をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび相同性を得るためのアルゴリズムとしては当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなど）が挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、例えばBLASTP、FASTAなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。塩基配列の相同性は、BLASTN、FASTAなどのソフトウェアを用いて決定される。 In the present invention, “homology” means the degree of sequence similarity between two polypeptides or polynucleotides, and is in an optimum state over the region of the amino acid sequence or base sequence to be compared (maximum sequence match). Determined by comparing two sequences aligned to the (state). The homology number (%) determines the number of matching sites by determining the same amino acid or base present in both (amino acid or base) sequences, and then the number of matching sites within the sequence region to be compared. Divided by the total number of amino acids or bases and multiplied by 100. Examples of algorithms for obtaining optimal alignment and homology include various algorithms (for example, BLAST algorithm, FASTA algorithm, etc.) that are usually available to those skilled in the art. The homology of amino acid sequences is determined using sequence analysis software such as BLASTP and FASTA. The base sequence homology is determined using software such as BLASTN and FASTA.
本明細書で用いる「ポリペプチド」という用語はアミノ酸の重合体を指し、便宜的に「タンパク質」なる語を比較的長いポリペプチド、「ペプチド」なる語を比較的短いポリペプチドを示すように用いているが、これらはアミノ酸残基の数を限定するわけではない。したがって、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、いずれもポリペプチドの定義内に含まれる。「タンパク質またはペプチド」はあらゆる長さのポリペプチドを包含する概念である。 As used herein, the term “polypeptide” refers to a polymer of amino acids, and for convenience the term “protein” is used to indicate a relatively long polypeptide and the term “peptide” is used to indicate a relatively short polypeptide. However, they do not limit the number of amino acid residues. Thus, “polypeptide”, “peptide”, and “protein” are all included within the definition of polypeptide. “Protein or peptide” is a concept that encompasses polypeptides of any length.
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質をコードする遺伝子として、サーモビフィダ・フスカのＹＸ株のBGL0937「Tfu0937」をコードする遺伝子およびクロストリジウム・セルロボランスのBglAタンパク質「BglA」をコードする遺伝子が挙げられる。Tfu0937をコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号１に示されるとおりである。この塩基配列は、サーモビフィダ・フスカのＹＸ株のゲノム配列に含まれるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に由来し、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）にNCBI Reference Sequence：YP_003842858.1で登録されている。BglAをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号３に示される。この塩基配列は、クロストリジウム・セルロボランスのゲノム配列に含まれるＯＲＦに由来し、ＮＣＢＩにNCBI Reference Sequence：YP_288998.1で登録されている。 Examples of a gene encoding a β-glucosidase protein whose activity is expressed by E. coli include a gene encoding BGL0937 “Tfu0937” of the YX strain of Thermobifida fusca and a gene encoding BglA protein “BglA” of Clostridium cellulovorans. The base sequence of the gene encoding Tfu0937 is as shown in SEQ ID NO: 1. This base sequence is derived from the open reading frame (ORF) included in the genome sequence of the YX strain of Thermobifida fusca, and is registered with the National Center for Biotechnology Information (NCBI) as NCBI Reference Sequence: YP_003842858.1. The base sequence of the gene encoding BglA is shown in SEQ ID NO: 3. This base sequence is derived from the ORF contained in the Clostridial cellulovorans genome sequence, and is registered in NCBI with NCBI Reference Sequence: YP_288998.1.
該遺伝子としては、配列番号１または３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ大腸菌で発現させた際に、β−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡもまた用いられ得る。 The gene includes β-glucosidase when it is hybridized under stringent conditions with DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, and expressed in E. coli. DNA encoding an active protein can also be used.
ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、0.2×SSC、0.1%SDS、65℃程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるＤＮＡは、上記塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の高い相同性を有することが望ましく、さらに９０％以上の相同性を有することが好ましい。ここで「相同性」については上記のとおりである。 Here, stringent conditions refer to conditions in which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur. Such conditions are usually about 0.2 × SSC, 0.1% SDS, and 65 ° C. The DNA obtained by hybridization desirably has a high homology of 80% or more with the DNA comprising the above base sequence, and preferably has a homology of 90% or more. Here, “homology” is as described above.
βグルコシダーゼ活性は、機能を確認すべきタンパク質を発現するためのベクター（好ましくは、アンカータンパク質を発現する表層提示用ベクター）を構築し、これを大腸菌に導入して発現させ、例えば、pNPG法により活性の有無を確認する。例えば、機能を確認すべきタンパク質を発現させた大腸菌の生菌体を基質p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）と接触させ、遊離したp-ニトロフェノール量を400nmで吸光度測定することによって、βグルコシダーゼ活性が確認され得る。βグルコシダーゼの表層提示は、生菌体との接触により基質ＰＮＰＧが分解されることで確認され得る。さらに、セロビオースを基質とする培地での培養による増殖能を調べることで、βグルコシダーゼの発現（好ましくは表層提示）が確認され得る。 β-glucosidase activity is expressed by constructing a vector for expressing the protein whose function is to be confirmed (preferably, a surface layer-presenting vector for expressing the anchor protein) and introducing it into E. coli, for example, by the pNPG method. Check for activity. For example, a living cell of E. coli expressing a protein whose function is to be confirmed is brought into contact with the substrate p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (PNPG), and the amount of p-nitrophenol released is measured at 400 nm. Can confirm β-glucosidase activity. The surface display of β-glucosidase can be confirmed by the degradation of the substrate PNPG upon contact with live cells. Furthermore, the expression (preferably surface layer presentation) of β-glucosidase can be confirmed by examining the proliferation ability by culturing in a medium using cellobiose as a substrate.
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質をコードする遺伝子は、クロストリジウム・セルロボランスまたはサーモビフィダ・フスカを含む微生物のゲノム（例えば、それぞれアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より入手され得る；クロストリジウム・セルロボランスのゲノムＤＮＡはＡＴＣＣ３５２９６として、サーモビフィダ・フスカのゲノムＤＮＡはＡＴＣＣ２７７３０として入手可能である）から、当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはハイブリダイゼーション技術によって取得され得る。あるいはＤＮＡ合成機などを用いて人工的に合成してもよい。配列の決定は常套方法により配列決定機を用いて行われ得る。 The gene encoding the β-glucosidase protein whose activity is expressed by E. coli can be obtained from the genomes of microorganisms including Clostridium cellulovorans or Thermobifida fusca (eg, the American Type Culture Collection (ATCC, respectively); Clostridium cellulovorans genomes) DNA is available as ATCC 35296 and Thermobifida fusca genomic DNA is available as ATCC 27730) and can be obtained by polymerase chain reaction (PCR) or hybridization techniques well known to those skilled in the art. Alternatively, it may be synthesized artificially using a DNA synthesizer or the like. Sequencing can be performed using a sequencer by conventional methods.
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質をコードする遺伝子の大腸菌への導入は、発現ベクターの形態で宿主に導入されてもよく、あるいは宿主の遺伝子に挿入してまたは宿主の遺伝子との相同組換えで宿主の染色体に組み込まれてもよい。 The gene encoding the β-glucosidase protein whose activity is expressed by E. coli may be introduced into the host in the form of an expression vector, or inserted into the host gene or homologous to the host gene. It may be integrated into the host chromosome by recombination.
βグルコシダーゼのような目的のタンパク質またはペプチドを大腸菌に表層提示させるために、アンカータンパク質が用いられ得る。大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質としては、大腸菌（Escherichia coli）由来のタンパク質slp、blc、およびhdeDが用いられ得る。これらのタンパク質は、膜に局在することが予測されていたのみであり、機能未知のタンパク質であった。slp、blc、およびhdeDのそれぞれの全長アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号８、１０、および１２で示される。ストレプトマイセス・スブチリス（Streptomyces subtilis）のPgsA（特許文献１および２、非特許文献１）もまた用いられ得、PgsAは、プラスミドの形態で入手することができる（pHLA、非特許文献１）。PgsAの全長アミノ酸配列は、配列番号６に示される。これらのアンカータンパク質は、その末端（Ｃ末端またはＮ末端の少なくとも一方）に融合された目的のタンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる。
An anchor protein can be used to display a protein or peptide of interest such as β-glucosidase on the surface of E. coli. As a protein expressed in E. coli and having an anchor function, proteins slp, blc, and hdeD derived from Escherichia coli can be used. These proteins were only predicted to be localized in the membrane and were proteins of unknown function. The full length amino acid sequences of slp, blc, and hdeD are shown in SEQ ID NOs: 8, 10, and 12, respectively. Streptomyces subtilis PgsA (
大腸菌で発現された際に、アンカー機能が失われない（例えば、その末端に融合されたβグルコシダーゼのような目的のタンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる）程度に、アミノ酸変異（欠失、置換、付加）が起こっているタンパク質もまた用いられ得る（このようなタンパク質を、「アンカー変異タンパク質」ともいう）。ここで、「変異」については上記の通りである。変異（欠失、置換、付加）したアミノ酸の数は、上記アンカータンパク質のアンカー機能が失われない限りその個数は制限されないが、好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内である。 When expressed in E. coli, amino acid mutations (deletions, deletions, etc.) to the extent that the anchor function is not lost (for example, the target protein or peptide such as β-glucosidase fused to its terminal can be displayed on the surface of E. coli). Proteins in which substitution, addition) have occurred can also be used (such proteins are also referred to as “anchor mutant proteins”). Here, the “mutation” is as described above. The number of amino acids mutated (deleted, substituted, added) is not limited as long as the anchor function of the anchor protein is not lost, but is preferably within 10 amino acids, more preferably within 5 amino acids.
また、上記アンカータンパク質のアンカー機能が失われない程度に、配列番号６、８、１０、または１２に対して相同性を有するタンパク質もまた用いられ得る。このような相同性タンパク質もまた、「アンカー変異タンパク質」に包含され得る。相同性は、８０％以上が好ましく、９０％以上が特に好ましい。ここで、「相同性」については上記の通りである。 A protein having homology to SEQ ID NO: 6, 8, 10, or 12 can also be used to the extent that the anchor function of the anchor protein is not lost. Such homologous proteins can also be encompassed by “anchor mutant proteins”. The homology is preferably 80% or more, particularly preferably 90% or more. Here, “homology” is as described above.
大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質をコードする遺伝子として、大腸菌由来のタンパク質slp、blc、およびhdeDのそれぞれをコードする遺伝子およびストレプトマイセス・スブチリスのPgsAをコードする遺伝子が挙げられる。slp、blc、およびhdeDのそれぞれをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号７、９、および１１に示されるとおりである。これらの塩基配列は、大腸菌のゲノム配列に含まれるＯＲＦに由来し、それぞれNCBIに以下のNCBI Reference Sequenceで登録されている（Slp: YP_001732337.1、blc:YP_001732919.1、hdeD:YP_001732342.1）。PgsAをコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号５に示される。 Examples of a gene encoding a protein expressed in E. coli and having an anchor function include a gene encoding each of the E. coli-derived proteins slp, blc, and hdeD and a gene encoding PgsA of Streptomyces subtilis. The base sequences of the genes encoding each of slp, blc, and hdeD are as shown in SEQ ID NOs: 7, 9, and 11. These base sequences are derived from ORFs contained in the genome sequence of Escherichia coli, and are registered in NCBI with the following NCBI Reference Sequence (Slp: YP_001732337.1, blc: YP_001732919.1, hdeD: YP_001732342.1) . The base sequence of the gene encoding PgsA is shown in SEQ ID NO: 5.
該遺伝子としては、配列番号５、７、９、および１１に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ大腸菌で発現させた際にアンカー機能を有する（例えば、その末端に融合されたβグルコシダーゼのような目的のタンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示できる）タンパク質をコードする、ＤＮＡ（このようなＤＮＡを、「アンカータンパク質遺伝子変異体」ともいう）もまた用いられ得る。ここで、「ストリンジェントな条件」については上記の通りである。 The gene includes a DNA sequence consisting of a base sequence shown in SEQ ID NOs: 5, 7, 9, and 11, which is hybridized under stringent conditions with a DNA sequence complementary to the DNA sequence and expressed in E. coli. A DNA encoding such a protein having an anchor function (for example, a protein or peptide of interest such as β-glucosidase fused to its terminal can be displayed on the surface of E. coli) (such DNA is referred to as “anchor protein gene mutation”). Also referred to as “body”) can be used. Here, “stringent conditions” are as described above.
大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、大腸菌またはストレプトマイセス・スブチリスを含む微生物のゲノムから、当業者に周知のＰＣＲまたはハイブリダイゼーション技術によって取得され得る。例えば、大腸菌株BW25113（国立遺伝学研究所より入手され得る）から当業者が通常用いる方法に従って調製した大腸菌のゲノムＤＮＡから、本明細書に記載した配列情報（特に、配列番号７、９または１１）に基づいて作製したプライマーまたはプローブを用いて、大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を調製し得る。あるいはＤＮＡ合成機などを用いて人工的に合成してもよい。配列の決定は常套方法により配列決定機を用いて行われ得る。 A gene that is expressed in E. coli and encodes a protein having an anchor function can be obtained from the genome of a microorganism including E. coli or Streptomyces subtilis by PCR or hybridization techniques well known to those skilled in the art. For example, from E. coli genomic DNA prepared according to a method commonly used by those skilled in the art from E. coli strain BW25113 (which can be obtained from the National Institute of Genetics), the sequence information described herein (in particular, SEQ ID NO: 7, 9, or 11) is used. A gene encoding a protein expressed in E. coli and having an anchor function can be prepared using a primer or probe prepared based on (1). Alternatively, it may be synthesized artificially using a DNA synthesizer or the like. Sequencing can be performed using a sequencer by conventional methods.
大腸菌によりその活性が発現されるβグルコシダーゼタンパク質、および大腸菌で発現されてアンカー機能を有するタンパク質は、大腸菌用発現カセットの構築に用いられ得る。このような発現カセットは、PgsA（配列番号６）、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２）のそれぞれのアンカータンパク質あるいは上述したようなアンカー変異タンパク質のＣ末端側に目的のタンパク質またはペプチド（例えば、βグルコシダーゼ）を融合させた融合タンパク質を発現するように構築され得る。また、slp（配列番号８）またはslc（配列番号１０）あるいは上述したようなアンカー変異タンパク質のＮ末端側に目的のタンパク質またはペプチド（例えば、βグルコシダーゼ）を融合させた融合タンパク質を発現するように構築することもできる。 A β-glucosidase protein whose activity is expressed by E. coli and a protein expressed in E. coli and having an anchor function can be used for the construction of an expression cassette for E. coli. Such an expression cassette may be the anchor protein of PgsA (SEQ ID NO: 6), slp (SEQ ID NO: 8), blc (SEQ ID NO: 10), and hdeD (SEQ ID NO: 12) or C of the anchor mutant protein as described above. It can be constructed to express a fusion protein in which a protein or peptide of interest (eg, β-glucosidase) is fused to the terminal side. In addition, slp (SEQ ID NO: 8) or slc (SEQ ID NO: 10) or a fusion protein in which the target protein or peptide (for example, β-glucosidase) is fused to the N-terminal side of the anchor mutant protein as described above is expressed. It can also be constructed.
目的タンパク質またはペプチドの大腸菌の表層提示のために、上記発現カセットは、分泌シグナル配列を含み得る。分泌シグナル配列とは、一般に細胞外（ペリプラズムも含む）に分泌されるタンパク質（分泌性タンパク質）のＮ末端に結合している、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むアミノ酸配列をいい、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に除去される。分泌シグナル配列は、発現カセットにおいてＮ末端側に配置され得る。発現産物を細胞膜へ導くことができる分泌シグナル配列であれば、どのような分泌シグナル配列でも用いられ得、起源は問わない。例えば、分泌シグナル配列は、大腸菌にて機能し得る分泌シグナル配列を添加しても、アンカータンパク質自身のものを利用しても、あるいは目的タンパク質またはペプチド自身のものを利用してもよい。アンカータンパク質（PgsA（配列番号６）、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２））は、これらのタンパク質自身に分泌シグナル配列を含むと考えられ、βグルコシダーゼタンパク質であるTfu0937（配列番号２）もまた、このタンパク質自身に分泌シグナル配列を含むと考えられる。アンカータンパク質に融合している目的タンパク質またはペプチドの活性に影響を及ぼさないのであれば、大腸菌で発現される際に、アンカータンパク質と目的タンパク質またはペプチドとの融合タンパク質における分泌シグナル配列の一部または全部が該融合タンパク質のＮ末端に残ってもよい。 For surface display of the protein or peptide of interest in E. coli, the expression cassette may contain a secretory signal sequence. The secretory signal sequence is an amino acid sequence containing many amino acids rich in hydrophobicity, which is generally bound to the N-terminus of a protein (secretory protein) secreted extracellularly (including the periplasm). Sex proteins are removed when they pass through the cell membrane and are secreted outside the cell. A secretory signal sequence can be placed N-terminally in the expression cassette. Any secretory signal sequence can be used as long as it is a secretory signal sequence capable of leading the expression product to the cell membrane, regardless of its origin. For example, the secretory signal sequence may be a secretory signal sequence that can function in E. coli, the anchor protein itself, or the target protein or peptide itself. Anchor proteins (PgsA (SEQ ID NO: 6), slp (SEQ ID NO: 8), blc (SEQ ID NO: 10), and hdeD (SEQ ID NO: 12)) are thought to contain secretory signal sequences in these proteins themselves, and β-glucosidase The protein Tfu0937 (SEQ ID NO: 2) is also thought to contain a secretory signal sequence in the protein itself. If it does not affect the activity of the target protein or peptide fused to the anchor protein, part or all of the secretory signal sequence in the fusion protein of the anchor protein and the target protein or peptide when expressed in E. coli May remain at the N-terminus of the fusion protein.
本発明は、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌もまた提供する。このような大腸菌は、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２）のそれぞれのアンカータンパク質あるいは上述したようなアンカー変異タンパク質、および目的のタンパク質またはペプチドを発現し得る。目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌は、上記のような発現カセットを宿主大腸菌で発現させることによって作製され得る。また、例えば、以下に説明するような発現ベクターを、宿主大腸菌に導入することによって作製され得る。 The present invention also provides E. coli that displays the target protein or peptide on the surface. Such Escherichia coli expresses the respective anchor proteins of slp (SEQ ID NO: 8), blc (SEQ ID NO: 10), and hdeD (SEQ ID NO: 12) or the above-mentioned anchor mutant protein and the target protein or peptide. obtain. E. coli that displays the target protein or peptide on the surface can be produced by expressing an expression cassette as described above in the host E. coli. For example, it can be prepared by introducing an expression vector as described below into host E. coli.
本発明は、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターを提供する。この発現ベクターは、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２）のそれぞれのアンカータンパク質あるいは上述したようなアンカー変異タンパク質をコードする遺伝子（核酸）を含む。あるいは、slp（配列番号７）、blc（配列番号９）、およびhdeD（配列番号１１）のＤＮＡあるいは上述したようなアンカータンパク質遺伝子変異体を含む。目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターは、目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子（核酸）をさらに含み得る。目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターは、上述したような分泌シグナル配列をコードする遺伝子を含み得る。 The present invention provides an expression vector for displaying a target protein or peptide on the surface of E. coli. This expression vector includes a gene (nucleic acid) encoding each anchor protein of slp (SEQ ID NO: 8), blc (SEQ ID NO: 10), and hdeD (SEQ ID NO: 12) or an anchor mutant protein as described above. Alternatively, it includes DNA of slp (SEQ ID NO: 7), blc (SEQ ID NO: 9), and hdeD (SEQ ID NO: 11), or an anchor protein gene variant as described above. The expression vector for displaying the target protein or peptide on the surface layer of E. coli may further contain a gene (nucleic acid) encoding the target protein or peptide. An expression vector for displaying the target protein or peptide on the surface of E. coli can contain a gene encoding a secretory signal sequence as described above.
１つの実施態様では、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターは、slp（配列番号８）、blc（配列番号１０）、およびhdeD（配列番号１２）または上記のアンカー変異タンパク質（以下、まとめて「Ｃ末端側アンカータンパク質」）のＣ末端側に該目的タンパク質またはペプチドを融合させた融合タンパク質を発現するように配置されればよく、好ましくは、Ｃ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の下流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）が挿入される形態である。「インフレーム」とは、アンカーと目的のタンパク質またはペプチドが一続きで読めればよく、間に数アミノ酸〜数十アミノ酸でなるスペーサーを介するように連結されてもよい。この発現ベクターは、Ｃ末端側アンカータンパク質をコードする核酸を含み、Ｃ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の下流に、インフレームにて目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）を挿入可能な、好適な制限酵素部位を有し得る。目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）を、該組換えベクター中のＣ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の下流（３’末端側）に、インフレームにて挿入して得られた構築物を大腸菌に導入し、発現させるとＣ末端側アンカータンパク質のＣ末端側に目的タンパク質またはペプチドが融合した融合タンパク質が発現し、その結果、目的タンパク質またはペプチドは大腸菌の表層に提示され得る。 In one embodiment, the expression vector for displaying the target protein or peptide on the surface of E. coli is slp (SEQ ID NO: 8), blc (SEQ ID NO: 10), and hdeD (SEQ ID NO: 12) or the above-mentioned anchor mutant protein. (Hereinafter collectively referred to as “C-terminal anchor protein”) may be arranged so as to express a fusion protein in which the target protein or peptide is fused, and preferably encodes a C-terminal anchor protein. In this form, a nucleic acid (gene) encoding the target protein or peptide is inserted in-frame downstream of the target nucleic acid. The “in-frame” may be such that the anchor and the target protein or peptide can be read continuously, and may be linked via a spacer consisting of several amino acids to several tens of amino acids. This expression vector contains a nucleic acid encoding a C-terminal anchor protein, and a nucleic acid (gene) encoding a target protein or peptide can be inserted in-frame downstream of the nucleic acid encoding a C-terminal anchor protein. It may have a suitable restriction enzyme site. A construct obtained by inserting a nucleic acid (gene) encoding a target protein or peptide in-frame downstream (3 ′ end side) of a nucleic acid encoding a C-terminal anchor protein in the recombinant vector When introduced into E. coli and expressed, a fusion protein in which the target protein or peptide is fused to the C-terminal side of the C-terminal anchor protein is expressed. As a result, the target protein or peptide can be presented on the surface of E. coli.
別の実施態様では、目的タンパク質またはペプチドを大腸菌の表層に提示させるための発現ベクターは、slp（配列番号８）およびblc（配列番号１０）または上記のアンカー変異タンパク質（以下、まとめて「Ｎ末端側アンカータンパク質」）のＮ末端側に該目的タンパク質またはペプチドを融合させた融合タンパク質を発現するように配置されればよく、好ましくは、Ｎ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の上流に、インフレームにて該目的のタンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）が挿入される形態である。この発現ベクターは、Ｎ末端側アンカータンパク質をコードする核酸を含み、Ｎ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の上流に、インフレームにて目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）を挿入可能な、好適な制限酵素部位を有し得る。目的タンパク質またはペプチドをコードする核酸（遺伝子）を、該組換えベクター中のＮ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の上流（５’末端側）に、インフレームにて挿入して得られた構築物を大腸菌に導入し、発現させるとＮ末端側アンカータンパク質のＮ末端側に目的タンパク質またはペプチドが融合した融合タンパク質が発現し、その結果、目的タンパク質またはペプチドは大腸菌の表層に提示され得る。 In another embodiment, the expression vector for displaying the target protein or peptide on the surface of E. coli is slp (SEQ ID NO: 8) and blc (SEQ ID NO: 10) or the above-mentioned anchor mutant protein (hereinafter collectively referred to as “N-terminal”). It may be arranged so as to express a fusion protein in which the target protein or peptide is fused to the N-terminal side of the side anchor protein "), preferably in-frame upstream of the nucleic acid encoding the N-terminal anchor protein. In this form, a nucleic acid (gene) encoding the target protein or peptide is inserted. This expression vector includes a nucleic acid encoding an N-terminal anchor protein, and can insert a nucleic acid (gene) encoding the target protein or peptide in frame upstream of the nucleic acid encoding the N-terminal anchor protein. It may have a suitable restriction enzyme site. A construct obtained by inserting a nucleic acid (gene) encoding a target protein or peptide in-frame upstream (5 ′ end side) of a nucleic acid encoding an N-terminal anchor protein in the recombinant vector When introduced into E. coli and expressed, a fusion protein in which the target protein or peptide is fused to the N-terminal side of the N-terminal anchor protein is expressed. As a result, the target protein or peptide can be presented on the surface of E. coli.
各種ＤＮＡおよび組換えＤＮＡの合成、結合、および発現ベクターへの挿入は、当業者が通常用い得る技法で行われ得る。 Various DNA and recombinant DNA can be synthesized, ligated, and inserted into an expression vector by techniques commonly used by those skilled in the art.
発現ベクターとしては、宿主大腸菌内で自律的に複製可能なプラスミドまたはファージから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ベクターは、導入されるグラム陰性細菌に適合した複製開始起点、選択可能なマーカー、プロモーター等の発現制御配列、ターミネーターを含むのが好ましい。プラスミドベクターとしては、例えば大腸菌で発現させる場合は、pET系ベクター、pET15bが挙げられる。ファージベクターとしてはλファージベクターなどが挙げられる。 Suitable expression vectors are those constructed for gene recombination from plasmids or phages that can replicate autonomously in host E. coli. The vector preferably contains an origin of replication suitable for the gram-negative bacterium to be introduced, a selectable marker, an expression control sequence such as a promoter, and a terminator. Examples of plasmid vectors include pET vectors and pET15b when expressed in E. coli. Examples of the phage vector include a λ phage vector.
選択可能なマーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。 Examples of selectable markers include antibiotic resistance genes such as ampicillin resistance gene and streptomycin resistance gene.
発現ベクターは、発現制御配列を含むものが好ましい。発現制御配列とは、ＤＮＡ配列に適切に連結した場合、グラム陰性細菌において、そのＤＮＡ配列を発現させることが出来る配列を意味する。発現制御配列には少なくともプロモーターが含まれる。プロモーターは構成的プロモーターであっても誘導可能なプロモーターであってもよい。さらに該発現ベクターには転写終結シグナル、即ちターミネーター領域が好ましくは含まれる。 The expression vector preferably contains an expression control sequence. The expression control sequence means a sequence capable of expressing the DNA sequence in gram-negative bacteria when appropriately linked to the DNA sequence. The expression control sequence includes at least a promoter. The promoter may be a constitutive promoter or an inducible promoter. Furthermore, the expression vector preferably contains a transcription termination signal, ie a terminator region.
発現ベクターは、Ｃ末端側アンカータンパク質またはＮ末端側アンカータンパク質と目的タンパク質またはペプチドとの融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡの構築を容易にするために、Ｃ末端側アンカータンパク質またはＮ末端側アンカータンパク質をコードする核酸の末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することにより作製することができる。 In order to facilitate the construction of a chimeric DNA encoding a fusion protein of a C-terminal anchor protein or N-terminal anchor protein and a target protein or peptide, the expression vector contains a C-terminal anchor protein or an N-terminal anchor protein. It can be prepared by adding an appropriate restriction enzyme recognition site to the end of the nucleic acid to be encoded by a conventional method.
目的のタンパク質またはペプチドとしては、特に限定されず、本来大腸菌の細胞表層に局在しないタンパク質であって、大腸菌の細胞表層に固定することを目的として配置されるタンパク質が好ましい。例えば、酵素（例えば、βグルコシダーゼ）、抗体、抗原、リガンドなどが挙げられる。 The target protein or peptide is not particularly limited, and is preferably a protein that is not originally localized on the cell surface of E. coli and is arranged for the purpose of fixing to the cell surface of E. coli. For example, an enzyme (for example, β-glucosidase), an antibody, an antigen, a ligand and the like can be mentioned.
目的タンパク質またはペプチドの起源は宿主として用いる大腸菌に対して異種のものであってもよいし、宿主として用いる大腸菌由来のものであってもよい。 The origin of the target protein or peptide may be heterologous to E. coli used as a host or derived from E. coli used as a host.
上述したように、上記のアンカータンパク質をコードする遺伝子（核酸）に加え、目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子（核酸）をさらに含む発現ベクターを作製し得る。このようなアンカータンパク質をコードする遺伝子（核酸）および目的タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子（核酸）を含む発現ベクターを大腸菌に導入することで、目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌を製造できる。 As described above, in addition to the gene (nucleic acid) encoding the anchor protein, an expression vector further containing a gene (nucleic acid) encoding the target protein or peptide can be prepared. By introducing an expression vector containing such a gene (nucleic acid) encoding the anchor protein and a gene (nucleic acid) encoding the target protein or peptide into E. coli, E. coli that displays the target protein or peptide on the surface can be produced.
発現ベクターの大腸菌への導入には、当業者が通常用いる方法が用いられ得る。このような方法としては、例えば、塩化カルシウム法、コンピテント法、３親接合（triparental mating）法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。発現ベクターの大腸菌への導入により得られる大腸菌形質転換体は、必要に応じて、当業者が通常用いる方法でスクリーニングされ得る。 For the introduction of the expression vector into E. coli, methods commonly used by those skilled in the art can be used. Examples of such methods include calcium chloride method, competent method, triparental mating method, electroporation method and the like. An E. coli transformant obtained by introducing an expression vector into E. coli can be screened by a method commonly used by those skilled in the art, if necessary.
融合タンパク質を発現させる方法は遺伝子工学の常法に基づいて行うことができる。大腸菌に用いられるベクターの情報や外来遺伝子の導入、発現、形質転換体のスクリーニングなどの方法は多くの実験書に記載されている（例えば、Sambrook, J.et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd Edition, CSHL Press, 2001）。 The method for expressing the fusion protein can be performed based on a conventional method of genetic engineering. Information on vectors used in E. coli, introduction of foreign genes, expression, screening of transformants, etc. are described in many experimental documents (for example, Sambrook, J. et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd Edition). , CSHL Press, 2001).
用いる宿主は大腸菌であれば特に限定されない。好ましくは、BW25113（国立遺伝学研究所より入手され得る）およびJCM20137（理研BRC微生物材料開発室より入手され得る）が挙げられる。 The host to be used is not particularly limited as long as it is Escherichia coli. Preferred examples include BW25113 (available from National Institute of Genetics) and JCM20137 (available from RIKEN BRC Microbial Materials Development Office).
形質転換体である宿主細菌の培養形態は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して培養条件を適宜選択すればよく、通常液体培養で行われる。培地の炭素源としてはグルコース、グリセロールなどが挙げられるが、βグルコシダーゼを表層提示している場合はセロビオースを含んでもよい。窒素源としては硫酸アンモニウム、カザミノ酸などが挙げられる。その他、塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどを所望により使用できる。 The culture form of the host bacterium which is a transformant may be appropriately selected in consideration of the nutritional physiological properties of the host, and is usually carried out in liquid culture. Examples of the carbon source of the medium include glucose, glycerol and the like, but when β-glucosidase is displayed on the surface, cellobiose may be included. Examples of the nitrogen source include ammonium sulfate and casamino acid. In addition, salts, specific amino acids, specific vitamins and the like can be used as desired.
培養温度は宿主大腸菌が生育し、目的タンパク質またはペプチドを提示する範囲で適宜変更できるが、一般に大腸菌の場合、温度37℃、12時間、pH7.2の培養条件でよい。 The culture temperature can be appropriately changed as long as the host E. coli grows and presents the target protein or peptide. In general, in the case of E. coli, the culture condition may be 37 ° C., 12 hours, pH 7.2.
目的タンパク質またはペプチドを表層提示する大腸菌は、表面に提示された目的タンパク質またはペプチドの種類に応じて利用することができる。目的タンパク質またはペプチドが酵素である場合、酵素を表層提示する大腸菌を含む酵素剤として提供され得る。酵素がβグルコシダーゼの場合は、バイオマス分解に用いられ得る。 E. coli that displays the target protein or peptide on the surface can be used depending on the type of the target protein or peptide displayed on the surface. When the target protein or peptide is an enzyme, it can be provided as an enzyme agent containing E. coli that displays the enzyme on the surface. When the enzyme is β-glucosidase, it can be used for biomass degradation.
βグルコシダーゼを発現する（好ましくは表層提示する）大腸菌は、βグルコシダーゼ活性を有する。さらにセロビオースを含む培地で増殖も可能である。本発明により、バイオマスを分解しながら増殖できる大腸菌が得られた。 E. coli expressing β-glucosidase (preferably displaying on the surface) has β-glucosidase activity. Furthermore, it can grow on a medium containing cellobiose. According to the present invention, E. coli capable of growing while decomposing biomass was obtained.
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated, this invention is not limited by this Example.
（実施例１：大腸菌で活性を持つβグルコシダーゼの探索）
大腸菌で活性を持つβグルコシダーゼを探索するために、表層提示用プラスミドベクターpHLA（非特許文献１）を用いた。pHLAは、大腸菌表層提示のためのアンカータンパク質であるストレプトマイセス・スブチリス（Streptomyces subtilis）のPgsAを含み、PgsAのＣ末端側に目的のタンパク質のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるためのものである。
(Example 1: Search for β-glucosidase having activity in Escherichia coli)
In order to search for β-glucosidase having activity in Escherichia coli, a surface layer display plasmid vector pHLA (Non-patent Document 1) was used. pHLA contains PgsA of Streptomyces subtilis, which is an anchor protein for E. coli surface display, and expresses a fusion protein in which the N-terminus of the target protein is fused to the C-terminal side of PgsA It is.
クロストリジウム・セルロボランスのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ３５２９６）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号１３）およびリバースプライマー（配列番号１４）を使用してＰＣＲを行い、クロストリジウム・セルロボランスのBglA（「BglA」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびSpeIで切断し、同じく切断したベクターpHLに連結し、BglA-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113（国立遺伝学研究所より入手）およびJCM20137（理研BRC微生物材料開発室より入手）のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。 PCR was performed using Clostridium cellulovorans genomic DNA (obtained from ATCC: ATCC 35296) as a template using forward primer (SEQ ID NO: 13) and reverse primer (SEQ ID NO: 14), and BglA (“BglA”) of Clostridium cellulovorans The gene fragment was prepared. This was cleaved with BamHI and SpeI and ligated to the same cleaved vector pHL to obtain BglA-pHLA. The obtained plasmid was electroporated into each of E. coli BW25113 (obtained from the National Institute of Genetics) and JCM20137 (obtained from the RIKEN BRC Microbial Materials Development Office) to obtain transformants.
サーモビフィダ・フスカＹＸのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ２７７３０）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号１５）およびリバースプライマー（配列番号１６）を使用してＰＣＲを行い、サーモビフィダ・フスカＹＸのBGL0937（「Tfu0937」）の遺伝子断片を調製した。これをXhoIおよびHindIIIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、Tfu0937-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。 PCR was performed using the thermobifida fusca YX genomic DNA (obtained from ATCC: ATCC27730) as a template using the forward primer (SEQ ID NO: 15) and reverse primer (SEQ ID NO: 16), and BGL0937 (“Tfu0937” of Thermobifida fusca YX). )) Gene fragment was prepared. This was cleaved with XhoI and HindIII and ligated to the same cleaved vector pHLA to obtain Tfu0937-pHLA. The obtained plasmid was electroporated into each of E. coli BW25113 and JCM20137 to obtain transformants.
サッカロファガス・デグラダンス（Saccharophagus degradans）２−４０のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ４３９６１）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号１７）およびリバースプライマー（配列番号１８）を使用してＰＣＲを行い、サッカロファガス・デグラダンス2-40 Sde0245（「Sde0245」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびXhoIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、Sde0245-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。 Using Saccharophagus degradans 2-40 genomic DNA (obtained from ATCC: ATCC 43961) as a template, PCR was performed using a forward primer (SEQ ID NO: 17) and a reverse primer (SEQ ID NO: 18). A gene fragment of Lofagas degradans 2-40 Sde0245 (“Sde0245”) was prepared. This was cleaved with BamHI and XhoI and ligated with the same cleaved vector pHLA to obtain Sde0245-pHLA. The obtained plasmid was electroporated into each of E. coli BW25113 and JCM20137 to obtain transformants.
サッカロファガス・デグラダンス２−４０のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号１９）およびリバースプライマー（配列番号２０）を使用してＰＣＲを行い、サッカロファガス・デグラダンス２−４０のSde2497（「Sde2497」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびXhoIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、Sde2497-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。 PCR was performed using the forward DNA (SEQ ID NO: 19) and reverse primer (SEQ ID NO: 20) using the genomic DNA of Saccharophaga degradans 2-40 as a template, and Sde2497 (" A gene fragment of “Sde2497”) was prepared. This was cleaved with BamHI and XhoI and ligated to the same cleaved vector pHLA to obtain Sde2497-pHLA. The obtained plasmid was electroporated into each of E. coli BW25113 and JCM20137 to obtain transformants.
サイトファガ・ハチンソニ（Cytophaga hutchinsonii）のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ３３４０６）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２１）およびリバースプライマー（配列番号２２）を使用してＰＣＲを行い、サイトファガ・ハチンソニのCHU2268（「CHU2268」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびXhoIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、CHU2268-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。 Cytophaga hutchinsonii genomic DNA (obtained from ATCC: ATCC 33406) was used as a template to perform PCR using a forward primer (SEQ ID NO: 21) and a reverse primer (SEQ ID NO: 22). A gene fragment of “CHU2268”) was prepared. This was cleaved with BamHI and XhoI and ligated with the same cleaved vector pHLA to obtain CHU2268-pHLA. The obtained plasmid was electroporated into each of E. coli BW25113 and JCM20137 to obtain transformants.
ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣより入手：ＡＴＣＣ２７２１０）を鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２３）およびリバースプライマー（配列番号２４）を使用してＰＣＲを行い、ルミノコッカス・アルブスのR_BGL（「R.albus」）の遺伝子断片を調製した。これをBamHIおよびXhoIで切断し、同じく切断したベクターpHLAに連結し、R.albus-pHLAを得た。得られたプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。 PCR was performed using a forward primer (SEQ ID NO: 23) and a reverse primer (SEQ ID NO: 24) using Ruminococcus albus genomic DNA (obtained from ATCC: ATCC27210) as a template, and A gene fragment of R_BGL (“R.albus”) was prepared. This was cleaved with BamHI and XhoI and ligated to the same cleaved vector pHLA to obtain R. albus-pHLA. The obtained plasmid was electroporated into each of E. coli BW25113 and JCM20137 to obtain transformants.
さらに、PgsAをコードする核酸を取り除いたpHLAにTfu0937を導入したベクターも作製した。このベクターはTfu0937のみを発現させるために作製した。サーモビフィダ・フスカＹＸのゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２５）およびリバースプライマー（配列番号２６）を使用してＰＣＲを行って得られた遺伝子断片をBglIIおよびHindIIIで切断し、BglIIおよびHindIIIで切断したpHLAに連結した。これにより、PgsAをコードする核酸が切り出されて除かれ、Tfu0937が導入されたベクターTfu0937ΔPgsA-pHLAを得た。このプラスミドを大腸菌BW25113およびJCM20137のそれぞれにエレクトロポレーションし、形質転換体を得た。 Furthermore, a vector in which Tfu0937 was introduced into pHLA from which the nucleic acid encoding PgsA was removed was also prepared. This vector was made to express only Tfu0937. The gene fragment obtained by PCR using Thermobifida fusca YX genomic DNA as a template and the forward primer (SEQ ID NO: 25) and reverse primer (SEQ ID NO: 26) was cleaved with BglII and HindIII, and BglII and HindIII Ligated with pHLA cleaved with. As a result, the nucleic acid encoding PgsA was excised and removed to obtain a vector Tfu0937ΔPgsA-pHLA into which Tfu0937 had been introduced. This plasmid was electroporated into each of E. coli BW25113 and JCM20137 to obtain transformants.
これらの形質転換体をルリア−ベルタニ（ＬＢ）培地で３７℃にて２４時間培養して、菌体数を揃えて、培養後の液体を15000rpmにて５分間遠心して菌体と上清とを分離した後、培養上清および菌体のβグルコシダーゼ活性を測定した。βグルコシダーゼ活性の測定は、pNPG法で行った。菌体または培養上清を基質p-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）と接触させ、遊離したp-ニトロフェノール量を400nmで吸光度測定した。この結果を図１に示す。 These transformants were cultured in Luria-Bertani (LB) medium at 37 ° C. for 24 hours, the number of cells was aligned, and the cultured liquid was centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes to separate the cells and supernatant. After separation, the β-glucosidase activity of the culture supernatant and the cells was measured. β-glucosidase activity was measured by the pNPG method. The cells or the culture supernatant were contacted with the substrate p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (PNPG), and the amount of the released p-nitrophenol was measured at 400 nm. The result is shown in FIG.
図１は、大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）で発現させた種々の候補タンパク質のβグルコシダーゼ活性を示すグラフである。図１の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は、βグルコシダーゼ活性（400nmでの吸光度）を示す。横軸の「BglA」、「Sde0245」、「CHU2268」、「R.albus」、および「Tfu0937」はそれぞれ、PgsAのＣ末端側にこれらのタンパク質のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現してこれらのタンパク質を表層提示する形質転換大腸菌の結果を表す。横軸の「Tfu0937ss」は、PgsAと融合させずにTfu0937のみを発現させた形質転換大腸菌の結果を表す。横軸の「pHLA」は、βグルコシダーゼ候補タンパク質なしでPgsAのみを導入したコントロール大腸菌の結果を表す。各結果とも、左側に菌体、右側に培養上清のβグルコシダーゼ活性を示す。 FIG. 1 is a graph showing β-glucosidase activity of various candidate proteins expressed in E. coli BW25113 (A) and JCM20137 (B). In both FIG. 1A and FIG. 1B, the vertical axis represents β-glucosidase activity (absorbance at 400 nm). “BglA”, “Sde0245”, “CHU2268”, “R.albus”, and “Tfu0937” on the horizontal axis express fusion proteins in which the N-terminus of these proteins is fused to the C-terminal side of PgsA. The result of the transformed E. coli displaying the protein of 1 is shown. “Tfu0937ss” on the horizontal axis represents the result of transformed Escherichia coli expressing only Tfu0937 without being fused with PgsA. “PHLA” on the horizontal axis represents the result of control Escherichia coli into which only PgsA was introduced without the β-glucosidase candidate protein. In each result, the microbial cells are shown on the left side, and the β-glucosidase activity of the culture supernatant is shown on the right side.
図１に示されるように、BglAおよびTfu0937で、高いβグルコシダーゼ活性が見られた。これらのタンパク質は、実験に用いた２種類の大腸菌ともに活性を示し、また菌体表層にも活性があることがわかった。また、Tfu0937を単独（アンカータンパク質なし）で発現させた大腸菌においても、菌体表層に活性を持つことが示された。 As shown in FIG. 1, high β-glucosidase activity was observed with BglA and Tfu0937. These proteins were found to be active in both of the two types of E. coli used in the experiment, and also to be active in the cell surface. In addition, E. coli expressing Tfu0937 alone (without anchor protein) was also shown to have activity on the cell surface.
続いて、これらの菌体を初期光学濃度（OD）=0.01で、セロビオースを炭素源とする最小培地（K2HPO4 0.7%, KH2PO4 0.3%, (NH4)SO4 0.1%, MgSO4・7H2O 0.01%, セロビオース0.2%）に植菌し、３７℃で培養しながら、ODの経時変化をモニターし、形質転換大腸菌の増殖能を調べた。この結果を図２に示す。 Subsequently, these cells were prepared with a minimum medium (K 2 HPO 4 0.7%, KH 2 PO 4 0.3%, (NH 4 ) SO 4 0.1%, with initial optical density (OD) = 0.01 and cellobiose as a carbon source, MgSO 4 · 7H 2 O 0.01%, cellobiose 0.2%), and the time course of OD was monitored while culturing at 37 ° C. to examine the growth ability of the transformed E. coli. The result is shown in FIG.
図２は、種々のβグルコシダーゼ候補タンパク質を表層提示させた大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。図２の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は大腸菌数（ＯＤ値）、横軸は培養時間（時間）を示す。図２の（Ａ）および（Ｂ）とも、塗りつぶした菱形はpHLA、塗りつぶした四角はBglA-pHLA、白抜き三角はSde0245-pHLA、×はSde2497-pHLA、白抜き菱形はCHU2268-pHLA、白抜き丸はR.albus-pHLA、塗りつぶした丸はTfu0937-pHLAss、塗りつぶした三角はTfu0937-pHLAの発現ベクターを用いた場合の結果を示す。 FIG. 2 is a graph showing the ability of Escherichia coli BW25113 (A) and JCM20137 (B) to grow on a cellobiose substrate medium on which various β-glucosidase candidate proteins are displayed on the surface. In both FIG. 2A and FIG. 2B, the vertical axis represents the number of E. coli (OD value) and the horizontal axis represents the culture time (hours). In both (A) and (B) of FIG. 2, the filled diamond is pHLA, the filled square is BglA-pHLA, the white triangle is Sde0245-pHLA, the x is Sde2497-pHLA, the white diamond is CHU2268-pHLA, and white Circles indicate the results using the expression vector of R. albus-pHLA, filled circles indicate the expression vector of Tfu0937-pHLAss, and filled triangles indicate the expression vector of Tfu0937-pHLA.
図２に示されるように、セロビオースからの増殖においては、Tfu0937を用いた場合（「Tfu0937-pHLA」）に最も増殖がよかった。どちらの大腸菌においても同様の結果となった。Tfu0937単独（アンカータンパク質なし「Tfu0937-pHLAss」）発現の場合も増殖能は高かった。BglAを用いた場合（「BglA-pHLA」）も、コントロールのpHLAよりも増殖能が高められた。 As shown in FIG. 2, in the growth from cellobiose, the growth was the best when Tfu0937 was used (“Tfu0937-pHLA”). Similar results were obtained for both E. coli. The proliferation ability was also high in the case of expressing Tfu0937 alone (“Tfu0937-pHLAss” without anchor protein). When BglA was used (“BglA-pHLA”), the proliferation ability was enhanced as compared with the control pHLA.
（実施例２：大腸菌表層提示のためのアンカータンパク質の探索）
クロストリジウム・セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２７）およびリバースプライマー（配列番号２８）を使用してＰＣＲを行って、BglAの遺伝子断片を得た。このBglA遺伝子断片をXhoIおよびBamHIで切断し、XhoIで切断したpHLAに連結した。
(Example 2: Search for anchor protein for E. coli surface display)
PCR was performed using the forward primer (SEQ ID NO: 27) and reverse primer (SEQ ID NO: 28) using Clostridium cellulovorans genomic DNA as a template to obtain a BglA gene fragment. This BglA gene fragment was digested with XhoI and BamHI and ligated to pHLA digested with XhoI.
以下のアンカー候補タンパク質をコードする遺伝子断片を調製した。大腸菌のゲノムＤＮＡは、国立遺伝学研究所より入手したBW25113株から調製したゲノムＤＮＡを用いた。 Gene fragments encoding the following anchor candidate proteins were prepared. E. coli genomic DNA prepared from BW25113 strain obtained from National Institute of Genetics was used.
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号２９）およびリバースプライマー（配列番号３０）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌hdeD（「hdeD」）の遺伝子断片を調製した。 Using the genomic DNA of E. coli as a template, PCR was performed using a forward primer (SEQ ID NO: 29) and a reverse primer (SEQ ID NO: 30) to prepare a gene fragment of E. coli hdeD (“hdeD”).
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３１）およびリバースプライマー（配列番号３２）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌slp（「slp」）の遺伝子断片を調製した。 Using the genomic DNA of E. coli as a template, PCR was performed using a forward primer (SEQ ID NO: 31) and a reverse primer (SEQ ID NO: 32) to prepare a gene fragment of E. coli slp (“slp”).
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３３）およびリバースプライマー（配列番号３４）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌blc（「blc」）の遺伝子断片を調製した。 Using the genomic DNA of E. coli as a template, PCR was performed using a forward primer (SEQ ID NO: 33) and a reverse primer (SEQ ID NO: 34) to prepare a gene fragment of E. coli blc (“blc”).
コリネ菌で表層提示アンカーとして報告のあるPorBの遺伝子断片（Applied Microbiology and Biotechnology, 2009年, 84巻, 733-739頁）もまた、候補アンカータンパク質として用いた。 The PorB gene fragment (Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 84, 733-739) reported as a surface-presented anchor in Corynebacterium was also used as a candidate anchor protein.
得られた候補アンカータンパク質遺伝子断片をBglIIおよびBamHIで切断し、このBamHI側を上記のBglA遺伝子断片のBamHI側にそしてBglII側を、BglIIで切断したpHLAに連結した。これにより、PgsAの代わりにこれらのアンカー候補タンパク質のＣ末端側にBglAのＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（それぞれhdeD-BglA、slp-BglA、blc-BglA、およびPorB-BglA）を得た。形質転換大腸菌の調製およびβグルコシダーゼ活性および増殖能の測定は、実施例１と同様に行った。 The obtained candidate anchor protein gene fragment was cleaved with BglII and BamHI, and this BamHI side was ligated to the BamHI side of the BglA gene fragment and the BglII side was ligated to pHLA cleaved with BglII. As a result, vectors (hdeD-BglA, slp-BglA, blc-BglA, and PorB-BglA) for expressing fusion proteins in which the N-terminus of BglA is fused to the C-terminal side of these anchor candidate proteins instead of PgsA Obtained. Preparation of transformed Escherichia coli and measurement of β-glucosidase activity and proliferation ability were carried out in the same manner as in Example 1.
図３は、大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）におけるBglAの表層提示のために種々のアンカー候補タンパク質を用いた形質転換大腸菌のβグルコシダーゼ活性を示すグラフである。図３の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は、βグルコシダーゼ活性（400nmでの吸光度）を示す。横軸の「pgsA」、「hdeD」、「slp」、「blc」、および「porB」はそれぞれ、これらのタンパク質のＣ末端側にBglAのＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させた形質転換大腸菌の結果を表す。各結果とも、左側に菌体、右側に培養上清のβグルコシダーゼ活性を示す。 FIG. 3 is a graph showing β-glucosidase activity of transformed E. coli using various anchor candidate proteins for BglA surface display in E. coli BW25113 (A) and JCM20137 (B). In both FIGS. 3A and 3B, the vertical axis represents β-glucosidase activity (absorbance at 400 nm). “PgsA”, “hdeD”, “slp”, “blc”, and “porB” on the horizontal axis are transformed Escherichia coli expressing a fusion protein in which the N-terminus of BglA is fused to the C-terminal side of these proteins. Represents the result of. In each result, the microbial cells are shown on the left side, and the β-glucosidase activity of the culture supernatant is shown on the right side.
図３に示されるように、hdeD、slp、およびblcで高いβグルコシダーゼ活性が見られた。既にコリネバクテリウムで表層提示アンカーとして報告のあるPorBを用いた場合、ほとんど活性を示さなかった。 As shown in FIG. 3, high β-glucosidase activity was seen with hdeD, slp, and blc. Almost no activity was observed when using PorB, which has already been reported as a surface-presenting anchor in Corynebacterium.
図４は、種々のアンカー候補タンパク質を用いてBglAを表層提示させた大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。図２の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は大腸菌数（ＯＤ値）、横軸は培養時間（時間）を示す。図４の（Ａ）および（Ｂ）とも、塗りつぶした菱形はpgsA、塗りつぶした四角はhdeD、塗りつぶした三角はslp、白抜き丸はblc、塗りつぶした丸はporBを表層提示アンカーとして用いた場合の結果を示す。 FIG. 4 is a graph showing the ability of Escherichia coli BW25113 (A) and JCM20137 (B) grown on the cellobiose substrate medium with BglA surface-displayed using various anchor candidate proteins. In both FIG. 2A and FIG. 2B, the vertical axis represents the number of E. coli (OD value) and the horizontal axis represents the culture time (hours). In both (A) and (B) of FIG. 4, the filled diamond is pgsA, the filled square is hdeD, the filled triangle is slp, the open circle is blc, and the filled circle is porB as the surface presentation anchor. Results are shown.
図４に示されるように、hdeDおよびblcが特によい増殖を示し、これらは、pgsAを用いたときよりも２倍を上回る高い増殖を示した。Slpもまたよい増殖を示した。 As shown in FIG. 4, hdeD and blc showed particularly good growth, which was more than twice as high as when using pgsA. Slp also showed good growth.
（実施例３）
サーモビフィダ・フスカＹＸのゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３５）およびリバースプライマー（配列番号３６）を使用してＰＣＲを行い、サーモビフィダ・フスカＹＸ BGL0937（「Tfu0937」）の遺伝子断片を調製した。これをBglIIおよびHindIIIで切断し、HindIIIで切断したpHLAに連結した。
(Example 3)
PCR was performed using Thermobifida fusca YX genomic DNA as a template and a forward primer (SEQ ID NO: 35) and reverse primer (SEQ ID NO: 36) to prepare a gene fragment of Thermobifida fusca YX BGL0937 (“Tfu0937”). . This was cleaved with BglII and HindIII and ligated to pHLA cleaved with HindIII.
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３７）およびリバースプライマー（配列番号３８）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌blc（「blc」）の遺伝子断片を調製した。 Using the genomic DNA of E. coli as a template, PCR was performed using a forward primer (SEQ ID NO: 37) and a reverse primer (SEQ ID NO: 38) to prepare a gene fragment of E. coli blc (“blc”).
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号３９）およびリバースプライマー（配列番号４０）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌hdeD（「hdeD」）の遺伝子断片を調製した。 Using the genomic DNA of E. coli as a template, PCR was performed using a forward primer (SEQ ID NO: 39) and a reverse primer (SEQ ID NO: 40) to prepare a gene fragment of E. coli hdeD (“hdeD”).
得られたblcまたはhdeDの遺伝子断片をBglIIおよびNotIで切断し、このBglII側を上記のTfu0937遺伝子断片のBglII側にそしてNotI側を、NotIで切断したpHLAに連結した。これにより、blcまたはhdeDのＣ末端側にTfu0937のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（blc-Tfu0937、hdeD-Tfu0937）を得た。形質転換大腸菌の調製およびβグルコシダーゼ活性および増殖能の測定は、実施例１と同様に行った。 The obtained blc or hdeD gene fragment was cleaved with BglII and NotI, and this BglII side was ligated to the BglII side of the Tfu0937 gene fragment and the NotI side was ligated to pHLA cleaved with NotI. As a result, vectors (blc-Tfu0937, hdeD-Tfu0937) for expressing a fusion protein in which the N-terminus of Tfu0937 was fused to the C-terminal side of blc or hdeD were obtained. Preparation of transformed Escherichia coli and measurement of β-glucosidase activity and proliferation ability were carried out in the same manner as in Example 1.
（実施例４）
サーモビフィダ・フスカＹＸのゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号４１）およびリバースプライマー（配列番号４２）を使用してＰＣＲを行い、サーモビフィダ・フスカＹＸ BGL0937（「Tfu0937」）の遺伝子断片を調製した。これをBglIIおよびHindIIIで切断し、BglIIで切断したpHLAに連結した。
Example 4
Using the genomic DNA of Thermobifida fusca YX as a template, PCR was performed using a forward primer (SEQ ID NO: 41) and reverse primer (SEQ ID NO: 42) to prepare a gene fragment of Thermobifida fusca YX BGL0937 ("Tfu0937") . This was cleaved with BglII and HindIII and ligated to pHLA cleaved with BglII.
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号４３）およびリバースプライマー（配列番号４４）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌slp（「slp」）の遺伝子断片を調製した。 Using the genomic DNA of E. coli as a template, PCR was performed using a forward primer (SEQ ID NO: 43) and a reverse primer (SEQ ID NO: 44) to prepare a gene fragment of E. coli slp (“slp”).
大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー（配列番号４５）およびリバースプライマー（配列番号４６）を使用してＰＣＲを行い、大腸菌blc（「blc」）の遺伝子断片を調製した。 Using the genomic DNA of E. coli as a template, PCR was performed using a forward primer (SEQ ID NO: 45) and a reverse primer (SEQ ID NO: 46) to prepare a gene fragment of E. coli blc ("blc").
得られたslpまたはblcの遺伝子断片をXhoIおよびHindIIIで切断し、このHindIII側を上記のTfu0937遺伝子断片のHindIII側にそしてXhoI側を、XhoIで切断したpHLAに連結した。これにより、slpまたはblcのＮ末端側にTfu0937のＣ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（Tfu0937-slp、Tfu0937-blc）を得た。形質転換大腸菌の調製およびβグルコシダーゼ活性および増殖能の測定は、実施例１と同様に行った。 The obtained slp or blc gene fragment was cleaved with XhoI and HindIII, and the HindIII side was ligated to the HindIII side of the Tfu0937 gene fragment and the XhoI side was ligated to pHLA cleaved with XhoI. As a result, vectors (Tfu0937-slp, Tfu0937-blc) for expressing a fusion protein in which the C-terminal of Tfu0937 was fused to the N-terminal side of slp or blc were obtained. Preparation of transformed Escherichia coli and measurement of β-glucosidase activity and proliferation ability were carried out in the same manner as in Example 1.
実施例３および４の形質転換大腸菌のセロビオース培地での増殖能の結果を図５に示す。 The results of the growth ability of the transformed E. coli cells of Examples 3 and 4 on cellobiose medium are shown in FIG.
図５は、blcまたはhdeDのＣ末端側にTfu0937のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（blc-Tfu0937、hdeD-Tfu0937）あるいはslpまたはblcのＮ末端側にTfu0937のＣ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクター（Tfu0937-slp、Tfu0937-blc）を用いて形質転換した大腸菌BW25113（Ａ）およびJCM20137（Ｂ）のセロビオース基質培地での増殖能を示すグラフである。PgsAのＣ末端側にTfu0937のＮ末端を融合した融合タンパク質を発現させるベクターで形質転換した大腸菌の結果もまた併せて示す。図５の（Ａ）および（Ｂ）とも、縦軸は大腸菌数（ＯＤ値）、横軸は培養時間（時間）を示す。図５の（Ａ）および（Ｂ）とも、白抜き三角はPgsA-Tfu、塗りつぶした丸はTfu-blc、塗りつぶした三角はTfu-slp、塗りつぶした菱形はblc-Tfu、×はhdeD-Tfuを発現ベクターとして用いた場合の結果を示す。 FIG. 5 shows a vector (blc-Tfu0937, hdeD-Tfu0937) for expressing a fusion protein in which the N-terminus of Tfu0937 is fused to the C-terminus of blc or hdeD, or the C-terminus of Tfu0937 is fused to the N-terminus of slp or blc. It is a graph which shows the growth ability in the cellobiose substrate culture medium of Escherichia coli BW25113 (A) and JCM20137 (B) transformed using the vector (Tfu0937-slp, Tfu0937-blc) which expresses a fusion protein. The results of E. coli transformed with a vector that expresses a fusion protein in which the N-terminus of Tfu0937 is fused to the C-terminus of PgsA are also shown. In both FIGS. 5A and 5B, the vertical axis represents the number of E. coli (OD value), and the horizontal axis represents the culture time (hours). 5A and 5B, the open triangle is PgsA-Tfu, the filled circle is Tfu-blc, the filled triangle is Tfu-slp, the filled diamond is blc-Tfu, and x is hdeD-Tfu. The results when used as an expression vector are shown.
図５に示されるように、fu0937-blc形質転換大腸菌およびblc-Tfu0937形質転換大腸菌は、セロビオース培地での増殖能に優れていた。blcは、提示したいタンパク質をそのN末端、C末端のどちらにも融合できる。Tfu0937-slp形質転換大腸菌もまた、セロビオース培地での増殖能が良好であった。Slpもまた、提示したいタンパク質をそのN末端、C末端のどちらにも融合できる。 As shown in FIG. 5, fu0937-blc transformed Escherichia coli and blc-Tfu0937 transformed Escherichia coli were excellent in the ability to grow on cellobiose medium. blc can fuse the protein you want to present to either its N-terminus or C-terminus. Tfu0937-slp transformed E. coli also had good growth ability on cellobiose medium. Slp can also fuse the protein it wants to display to either its N-terminus or C-terminus.
本発明によって、セロビオースを分解して増殖できる大腸菌の獲得に成功した。大腸菌の培養にバイオマスを利用できればバイオマスの糖化工程を省略でき、そして有用物質を生産するように組換え技術を利用した大腸菌を用いることで、バイオマスから直接有用物質を生産できるようになり、大幅なコストダウンにつながる。 According to the present invention, E. coli capable of decomposing and growing cellobiose was successfully obtained. If biomass can be used for cultivation of E. coli, the saccharification process of biomass can be omitted, and by using E. coli that uses recombinant technology to produce useful substances, it becomes possible to produce useful substances directly from biomass. This leads to cost reduction.
Claims (3)
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加され、かつ９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつβグルコシダーゼ活性を有する、タンパク質。 E. coli containing a polynucleotide containing a gene encoding the following protein (a) or (b) and expressing the protein (a) or (b):
(A) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2;
(B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an identity of 90 % or more, and has β-glucosidase activity ,protein.
（ａ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加され、かつ９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつβグルコシダーゼ活性を有する、タンパク質；
（１）配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（２）配列番号６、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加され、かつ９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ該タンパク質に融合された該（ａ）または（ｂ）のタンパク質を大腸菌の表層に提示できる、タンパク質。 A polynucleotide comprising a gene encoding the following protein (a) or (b) and a gene encoding the following protein (1) or (2), the protein of (a) or (b) Escherichia coli displaying the surface:
(A) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4;
(B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 and having an identity of 90 % or more, and β A protein having glucosidase activity;
(1) a protein comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12;
(2) In an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12, one or several amino acids are deleted, substituted or added, and 90 % or more A protein comprising an amino acid sequence having identity and capable of presenting the protein (a) or (b) fused to the protein on the surface of E. coli.
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