JP5832995B2 - 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット - Google Patents
低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット Download PDFInfo
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Description
(2) ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンドデシルアミンである(1)記載の測定方法。
(3) 反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.25〜1.0kU/Lであり、ポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が0.06〜0.3mmol/Lである(2)記載の方法。
(4) ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンである(1)記載の測定方法。
(5) 反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.5〜2.0kU/Lのコレステロール酸化酵素であり、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が0.02〜0.075mmol/Lである(4)記載の方法。
(6) 検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応が、さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質の存在下に行われる、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) 過酸化水素の測定が、過酸化水素測定用試薬を用いて行われる(1)〜(6)のいずれかに記載の測定方法。
(9) ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンドデシルアミンである(8)記載の試薬。
(10) 試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.25〜1.0kU/Lであり、ポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が0.06〜0.3mmol/Lである(9)記載の試薬。
(11) ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンである(8)記載の試薬。
(12) 試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.5〜2.0kU/Lであり、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が0.02〜0.075mmol/Lである(11)記載の試薬。
(13) さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質を含有する、(8)〜(12)のいずれかに記載の試薬。
(14) さらに、過酸化水素測定用試薬を含む(8)〜(13)のいずれかに記載の試薬。
(16) ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、及び、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物が第二試薬に含まれる(15)記載のキット。
(17) ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンドデシルアミンである(15)又は(16)記載のキット。
(18) 第二試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が1.0〜4.0kU/Lであり、第二試薬中のポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が0.25〜1.25mmol/Lである(17)記載のキット。
(19) ポリオキシエチレンアルキルアミンが、ポリオキシエチレンオクタデシルアミンである(15)又は(16)記載のキット。
(20) 第二試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が2.0〜8.0kU/Lであり、第二試薬中のポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が0.075〜0.3mmol/Lである(19)記載のキット。
(21) さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含む、(15)〜(20)のいずれかに記載のキット。
(22) さらに、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有する(15)〜(21)のいずれかに記載のキット。
[1]検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応を、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン及びポリアニオンの存在下に行う工程;
[2]上記[1]の工程で生成する過酸化水素を測定する工程;
[3]予め、既知濃度のLDL−Cを用いて作成された、LDL−C濃度と、該過酸化水素由来の情報量との関係を表す検量線と、上記[2]での測定値とを相関付ける工程;及び、
[4]検体中のLDL−C濃度を決定する工程
を含む。ここで、上記[1]の反応は、さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質の存在下に行うこともできる。すなわち、検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応は、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン・ポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリアニオン、及び、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質の存在下に行うこともできる。
<酵素活性測定用試薬>
リン酸緩衝液(pH7.15) 0.15 mol/L
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル 10 g/L
2−プロパノール 2.5%
4−アミノアンチピリン 0.2 g/L
フェノール 1 g/L
ペルオキシダーゼ 26 kU/L
コレステロール 0.16 g/L
本発明のLDL−C測定用試薬は、POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有する試薬である。本発明のLDL−C測定用試薬は、さらに、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質を含むことができる。
・試薬1
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有する試薬。
・試薬2
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有する試薬。
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、及び、過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
・試薬4
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、及び、過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
・キット1
第一試薬
ポリアニオン
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット2
第一試薬
ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、コレステロール酸化酵素
・キット3
第一試薬
ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
第一試薬
ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット5
第一試薬
ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、コレステロール酸化酵素
・キット6
第一試薬
ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット8
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット9
第一試薬
ポリアニオン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
第一試薬
ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、過酸化水素測定用試薬
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
・キット11
第一試薬
ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロール酸化酵素
・キット12
第一試薬
ポリアニオン、POE多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素
第二試薬
POE・POAアルキルアリールエーテル、POE・POA縮合物、POEアルキルアミン、過酸化水素測定用試薬、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素
MOPS(同仁化学研究所社製)
DOSE(ダイトーケミックス社製)
硫酸ナトリウム(関東化学社製)
デキストラン硫酸ナトリウム(分子量50万)(アマシャム社製)
4−アミノアンチピリン(埼京化成社製)
ペルオキシダーゼ(東洋紡績社製)
CHODI(コレステロール酸化酵素;キッコーマン社製)
LPL−311(コレステロールエステル加水分解酵素;東洋紡績社製)
ブラウノンL−205(ポリオキシエチレンドデシルアミン;青木油脂社製)
ナイミーンS−204(ポリオキシエチレンオクタデシルアミン;日油社製)
アクロネセスKP189R(POE・POAアルキルアリールエーテル;日油社製)
プルロニックL−121(POE・POA縮合物;ADEKA社製)
ニューコール707SF(POE多環エーテル硫酸エステル塩);日本乳化剤社製)
ニューコールB4−SN(POE多環エーテル硫酸エステル塩;日本乳化剤社製)
ディスロールSH(アリールスルホン酸誘導体;日本乳化剤社製)
デモールRN(アリールスルホン酸誘導体;花王社製)
デモールMS(アリールスルホン酸誘導体;花王社製)
デモールSN−B(アリールスルホン酸誘導体;花王社製)
第一試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.75 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 14 g/L
プルロニックL−121 7 g/L
ブラウノンL−205 0.25〜1.75 mmol/L
LPL−311 3 kU/L
CHODI 1.0〜8.0 kU/L
第一試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.75 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 14 g/L
プルロニックL−121 7 g/L
LPL−311 3 kU/L
CHODI 1.0〜8.0 kU/L
(1)検量線の作成
標準液として、生理食塩水(LDL−C濃度:0.0mg/dL)及び血清(LDL−C濃度:140mg/dL)を、キットとして、実施例1及び比較例の各キットを用いて、それぞれ日立7170S形自動分析装置により、LDL−C濃度と「吸光度」との間の関係を示す検量線を作成した。
ここでの「吸光度」とは、以下の反応で測定された2つの吸光度(E1及びE2)を基に、E2からE1を差し引くことにより得られた値を表す。
反応セルへ標準液(3μL)と第一試薬(0.15mL)とを添加し37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E1)を主波長600nm、副波長700nmで測定し、次いで、この反応液に第二試薬(0.05mL)を添加しさらに37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E2)を主波長600nm、副波長700nmで測定した。
(1)の検量線の作成において用いた標準液の代わりにヒト血清検体を用いる以外は(1)の「吸光度」の算出方法と同様の方法により、当該検体に対する「吸光度」を測定した。
(2)で測定出した「吸光度」と、(1)で作成した検量線とから、各検体中のLDL−C濃度を決定した。
次いで、キットとして、市販のLDL−C測定用キットであるデタミナーL LDL−C(協和メデックス社製)を用いて、検体として同じヒト血清50検体を用いて、上記と同様の手順により、それぞれの検体中のLDL−Cを測定した。
第一試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.75 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 14 g/L
プルロニックL−121 7 g/L
ナイミーンS−204 0.075〜0.375 mmol/L
LPL−311 3 kU/L
CHODI 1.0〜8.0 kU/L
第一試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.75 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 14 g/L
プルロニックL−121 7 g/L
ブラウノンL−205 0.75 mmol/L
LPL−311 3 kU/L
CHODI 3 kU/L
第一試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.75 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 14 g/L
プルロニックL−121 7 g/L
ナイミーンS−204 0.15 mmol/L
LPL−311 3 kU/L
CHODI 4 kU/L
異常リポ蛋白の1つであるLpXを多量に含む肝疾患患者由来の血清[以下、LpX検体と記す]を用いて、本発明のLDL−C測定方法において、LpX中のコレステロールに対する反応性が抑制されることを以下の方法により示した。
システム:BIOCAD700E(PreSeptive Biosystems社製)
カラム:SuperoseHR6カラム(ファルマシア社製)
溶出溶媒:EDTA(1mmol/L)を含有する0.15mol/L塩化ナトリウム水溶液(pH7.4)
流速:0.3mL/分
発色試薬:
(1)総コレステロール(TC)測定用キット:デタミナーL TC II(協和メデックス社製)
発色反応温度:37℃
検出波長:主波長600nm;副波長800nm
サンプル量:4μL
(2)遊離型コレステロール(FC)測定用キット:デタミナーL FC(協和メデックス社製)
発色反応温度:37℃
検出波長:主波長600nm;副波長700nm
サンプル量:4μL
第一試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
デキストラン硫酸ナトリウム 0.75 g/L
硫酸ナトリウム 2 g/L
DOSE 0.3 g/L
POE多環エーテル硫酸エステル塩またはアリールスルホン酸誘導体(その種類と濃度は第3表参照)
ペルオキシダーゼ 10 kU/L
第二試薬
MOPS(pH7.0) 20 mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5 g/L
ペルオキシダーゼ 20 kU/L
アクロネセスKP189R 14 g/L
プルロニックL−121 7 g/L
ブラウノンL−205 0.75 mmol/L
LPL−311 3 kU/L
CHODI 4 kU/L
検体として、低LDL血症患者由来の血清を用い、キットとして、実施例7のキットを用いる以外は、実施例2に記載の方法と同様の方法により、当該検体中のLDL−C濃度を決定した。その結果を第3表に示す。
Claims (13)
- 検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンドデシルアミン及びポリアニオンの存在下に、反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.25〜1.0kU/Lであり、反応液中のポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が0.06〜0.3mmol/Lである濃度で反応させ、該反応で生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
- 検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素とを、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンオクタドデシルアミン及びポリアニオンの存在下に、反応液中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.5〜2.0kU/Lであり、反応液中のポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が0.02〜0.075mmol/Lである濃度で反応させ、該反応で生成する過酸化水素を測定することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法。
- 検体と、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素との反応が、さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質の存在下に行われる、請求項1又は2記載の方法。
- 過酸化水素の測定が、過酸化水素測定用試薬を用いて行われる請求項1〜3のいずれかに記載の測定方法。
- ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンドデシルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有し、試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.25〜1.0kU/Lであり、試薬中のポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が0.06〜0.3mmol/Lであることを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
- ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物、ポリオキシエチレンオクタデシルアミン、ポリアニオン、コレステロールエステル加水分解酵素、及び、コレステロール酸化酵素を含有し、試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が0.5〜2.0kU/Lであり、試薬中のポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が0.02〜0.075mmol/Lであることを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用試薬。
- さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質を含有する、請求項5又は6記載の試薬。
- さらに、過酸化水素測定用試薬を含む請求項5〜7のいずれかに記載の試薬。
- ポリアニオンを含む第一試薬、コレステロール酸化酵素及びポリオキシエチレンドデシルアミンを含む第二試薬を含有し、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物、及び、コレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有し、第二試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が1.0〜4.0kU/Lであり、第二試薬中のポリオキシエチレンドデシルアミンの濃度が0.25〜1.25mmol/Lであることを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
- ポリアニオンを含む第一試薬、コレステロール酸化酵素及びポリオキシエチレンオクタデシルアミンを含む第二試薬を含有し、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物、及び、コレステロールエステル加水分解酵素のそれぞれを第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有し、第二試薬中のコレステロール酸化酵素の濃度が2.0〜8.0kU/Lであり、第二試薬中のポリオキシエチレンオクタデシルアミンの濃度が0.075〜0.3mmol/Lであることを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のコレステロール測定用キット。
- ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアリールエーテル、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン縮合物が第二試薬に含まれる請求項9又は10記載のキット。
- さらに、ポリオキシエチレン多環エーテル硫酸エステル塩およびアリールスルホン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1つの物質を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含む、請求項9〜11のいずれかに記載のキット。
- さらに、過酸化水素測定用試薬を第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有する請求項9〜12のいずれかに記載のキット。
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