JP5817055B2 - TNF−α、CD40L及びGM−CSF併用遺伝子治療剤 - Google Patents
TNF−α、CD40L及びGM−CSF併用遺伝子治療剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5817055B2 JP5817055B2 JP2010294035A JP2010294035A JP5817055B2 JP 5817055 B2 JP5817055 B2 JP 5817055B2 JP 2010294035 A JP2010294035 A JP 2010294035A JP 2010294035 A JP2010294035 A JP 2010294035A JP 5817055 B2 JP5817055 B2 JP 5817055B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- integer
- pharmaceutical composition
- cd40l
- csf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
〔1〕TNF−αの発現ベクターを有効成分として含有する医薬組成物(1)と、CD40L及びGM−CSFを有効成分として含有する医薬組成物(2)との組み合わせからなる医薬組成物。
〔2〕CD40L及びGM−CSFが遺伝子として発現ベクターに組み込まれている、〔1〕の医薬組成物。
〔3〕CD40L遺伝子及びGM−CSF遺伝子が単一の発現ベクターに組み込まれている、〔2〕の医薬組成物。
〔4〕TNF−αの発現ベクターが投与され、次いでCD40L及びGM−CSFが投与されるように用いられる、〔1〕〜〔3〕のいずれかの医薬組成物。
〔5〕TNF−αの発現ベクターが投与され、次いでCD40L及びGM−CSFが同時に投与されるように用いられる、〔1〕〜〔4〕のいずれかの医薬組成物。
〔6〕TNF−αの発現ベクター、CD40L及び/又はGM−CSFが、下記いずれかのブロック共重合体からなる高分子ミセル、又は下記いずれかのブロック共重合体とカチオン性ポリマーとを含んでなり、ブロック共重合体及びカチオン性ポリマーが有する総カチオン基に対する、ブロック共重合体が有するカチオン基のモル百分率(B/H比)が、25〜99%である高分子ミセルに内包されてなることを特徴とする、〔1〕〜〔5〕のいずれかの医薬組成物:
(1)非荷電親水性ポリマーセグメントとポリカチオン性ポリマーセグメントとを有するブロック共重合体、又は
(2)非荷電親水性ポリマーセグメントとポリカチオン性ポリマーセグメントとを有し、該親水性ポリマーセグメントと該ポリカチオン性ポリマーセグメントがジスルフィド結合を介して結合したブロック共重合体。
〔7〕ブロック共重合体(1)が、下記一般式(I)又は(II)で表される、〔6〕の医薬組成物。
R1は水素原子又は置換されていてもよい直鎖もしくは分枝のC1―12アルキル基を表し、
L1、L2は連結基を表し、
R2はメチレン基又はエチレン基を表し、
R3は水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
R4はR5と同一であるか又は開始剤残基であり、
R5はそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−NH−(CH2)a−X基を表し、ここで、Xはそれぞれ独立してpKa値が7.4以下の嵩高いアミン化合物残基であるか、あるいは一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の一種類又は二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、aは1〜5の整数であり、mは5〜20,000の整数であり、nは2〜5,000の整数であり、xは0〜5,000の整数であるが、xはnより大きくないとする。
また、上記の一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。)
〔8〕ブロック共重合体(1)が、下記一般式(III)又は(IV)で表される、〔6〕の医薬組成物。
R1は水素原子又は置換されていてもよい直鎖もしくは分枝のC1−12アルキル基を表し、
L1、L2は連結基を表し、
R2はメチレン基又はエチレン基を表し、
R3は水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
R4はR5と同一であるか又は開始剤残基であり、R5はそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−NH−(CH2)a−X基を表し、ここでXはそれぞれ独立してpKa値が7.4以下の嵩高いアミン化合物残基であるか、あるいは一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内一種類又は二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、aは1〜5の整数であり、
R6はそれぞれ独立して水素原子又は保護基であり、
mは5〜20,000の整数であり、
nは2〜5,000の整数であり、
yは0〜4,999の整数であり、
zは1〜4,999の整数であるが、zはnより小さく、y+zはnより大きくないとする。
また、上記の一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。)
〔9〕Xが下記のA、B、C、D又はE群に示す式で表される基である、〔7〕又は〔8〕の医薬組成物。
〔10〕ブロック共重合体(2)が、下記一般式(V)で表される、〔6〕〜〔9〕のいずれかの医薬組成物。
R12は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、
L3は、NH、CO、下記一般式(VIII):
−(CH2)p1−NH− (VIII)
(式中、p1は1〜5の整数を表す。)
で示される基、又は下記一般式(IX):
−L4a−(CH2)q1−L5a− (IX)
(式中、L4aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L5aは、NH又はCOを表す。q1は1〜5の整数を表す。)
で示される基を表し、m1は30〜150の整数を表し、m2は1〜5の整数を表し、nは100〜400の整数を表す。〕
〔11〕R12が下記一般式(VI):
−NH−(CH2)r−X4− (VI)
(式中、X4は、一級、二級もしくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。)
で示される基、又は下記一般式(VII):
−〔NH−(CH2)s〕t−X5− (VII)
(式中、X5は、一級、二級もしくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。s及びtは、それぞれ独立して、かつ〔NH−(CH2)s〕ユニット間で独立して、sは1〜5の整数を表し、tは2〜5の整数を表す。)
で示される基を表す、〔10〕の医薬組成物。
〔12〕R12が−NH−NH2又は−NH−(CH2)2−NH−(CH2)2−NH2である、〔10〕の医薬組成物。
〔13〕ベクターがプラスミドである、〔1〕〜〔12〕のいずれかの医薬組成物。
〔14〕制御性T細胞を抑制し、拒絶免疫Th1を誘導する、〔1〕〜〔13〕のいずれかの医薬組成物。
〔15〕癌の治療用である、〔1〕〜〔14〕のいずれかの医薬組成物。
本発明の医薬組成物(1)中に有効成分として含まれるTNF−αの発現ベクターは、TNF−αをコードする核酸(以下、TNF-α遺伝子と省略する)がプロモーターと作動可能に連結されたものである。
ACDCRGDCFCG(配列番号7;RGD4Cとも称する)、
DGARYCRGDCFDG(配列番号8;RGD10とも称する)、
CRGDCF(K[H−]KKK)6(配列番号9;cRGD−hKとも称する)、
などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の医薬組成物(2)中には、CD40L及びGM−CSFが有効成分として含まれる。本発明においては、CD40L及びGM−CSFは、タンパク質の形態又は発現ベクターに組み込まれた遺伝子の形態のいずれでもよい。1つの実施態様として、CD40L及びGM−CSFはタンパク質である。この態様においては、CD40L及びGM−CSFは、医薬組成物(1)中に含有されることもできるが、医薬組成物(1)とは別個の医薬組成物(2)中に含有されることが好ましい。
CD40Lの成熟体には、N末端のシグナルペプチドと細胞内ドメインとが切断された分泌型タンパク質が包含され、例えば、配列番号4に記載のアミノ酸配列の113〜261位のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。また、GM−CSFの成熟体には、N末端のシグナルペプチドが切断されたタンパク質が包含され、例えば、配列番号6に記載のアミノ酸配列の18〜144位のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。
CD40Lタンパク質及びGM−CSFタンパク質は、生体内での半減期を延長させるために、PEG(ポリエチレングリコール)等による誘導体を用いることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、上記有効成分が種々のドラッグデリバリーシステム(DDS)に内包されたものであってもよい。使用可能なDDSとしては、リポソーム、高分子ミセル、ウイルスベクター等があげられる。1つの実施態様として、本発明の医薬組成物は、ブロック共重合体からなる高分子ミセルに内包されたものである。
本発明に用いられるブロック共重合体(1)は、好ましくは、下記一般式(I)又は(II)で表される。
R1は水素原子又は置換されていてもよい直鎖もしくは分枝のC1−12アルキル基を表し、
L1、L2は連結基を表し、
R2はメチレン基又はエチレン基を表し、
R3は水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
R4はR5と同一であるか又は開始剤残基であり、
R5はそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−NH−(CH2)a−X基を表し、ここで、Xはそれぞれ独立してpKa値が7.4以下の嵩高いアミン化合物残基であるか、あるいは一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の一種類又は二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、aは1〜5の整数であり、mは5〜20,000の整数であり、nは2〜5,000の整数であり、xは0〜5,000の整数であるが、xはnより大きくないとする。)
本発明に用いられるブロック共重合体(2)は、好ましくは、下記一般式(V)で表される。
(式(VI)中、X4は、一級、二級もしくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。)
(式(VII)中、X5は、一級、二級もしくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。s及びtは、それぞれ独立して、かつ〔NH−(CH2)s〕ユニット間で独立して、sは1〜5(好ましくは2)の整数を表し、tは2〜5(好ましくは2)の整数を表す。)
−(CH2)p1−NH− (VIII)
(式(VIII)中、p1は1〜5(好ましくは2〜3)の整数を表す。)
で示される基、又は下記一般式(IX):
−L4a−(CH2)q1−L5a− (IX)
(式(IX)中、L4aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L5aは、NH又はCOを表す。q1は1〜5(好ましくは2〜3)の整数を表す。)
で示される基を表す。
−S−S−(CH2)p2−NH2 (X)
(式(X)中、p2は1〜5(好ましくは2〜3)の整数を表す。)
で示される基、又は一般式(XI):
−S−S−L4b−(CH2)q2−L5b (XI)
(式(XI)中、L4bは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L5bは、NH2又はCOOHを表す。q2は1〜5(好ましくは2〜3)の整数を表す。)
で示される基であることが好ましい。
また、本発明においては、非荷電親水性ポリマーセグメントを含まないカチオン性ポリマーセグメントのみからなるポリカチオン荷電性ポリマーを用いることもできる。ポリカチオン荷電性ポリマーは、TNF−αの発現ベクター又はCD40L及びGM−CSFもしくはそれらの発現ベクターとポリイオンコンプレックスを形成し、後述する高分子ミセルと同様に、本発明の医薬組成物に供することができる。かかるポリカチオン荷電性ポリマーとしては、ポリペプチド、多糖、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン、又はビニルポリマーをベースとする主鎖を有し、且つ側鎖として、該主鎖に直接又は連結基を介して結合した式−NH−(CH2)a−(NH(CH2)2)e−NH2で表される基(ここで、a及びeはそれぞれ独立して、1〜5の整数である)を含む荷電性ポリマー由来のセグメント鎖を有するポリマーが挙げられる。好ましい具体例として、下記一般式(XII)で表される化合物又はその塩があげられる。
R14及びR15は、それぞれ独立して、メチレン基又はエチレン基を表し、
R16は水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
R17及びR18は、それぞれ独立して、水酸基、オキシベンジル基、又はNH−(CH2)a−X基を表し、ここでaは1〜5の整数であり、Xはそれぞれ独立して、一級、二級、若しくは三級アミン化合物、若しくは四級アンモニウム塩由来の基を一つ以上含むアミン化合物残基、又は非アミン化合物残基を表し、R17とR18の総数のうち、−NH−(CH2)a−X基(ここで、Xは(NH(CH2)2)e−NH2であり、eは1〜5の整数である)であるものが少なくとも二つ以上存在し、
R19は、それぞれ独立して、水素原子又は保護基であり、ここで保護基はZ基、Boc基、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、
nは2〜5,000の整数であり、
yは0〜5,000の整数であり、
zは0〜5,000の整数であるが、y+zはnより大きくないものとし、
また、上記の一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。
また、本発明においては、ブロック共重合体の安定化を図る観点から、上記のブロック共重合体とカチオン性ポリマーとを含んでなる高分子ミセルを提供することができる。カチオン性ポリマーは、カチオン基を有し、カチオン性(陽イオン性)を示すポリマーである。但し、カチオン性ポリマーは、高分子ミセルの形成を妨げない範囲で多少のアニオン基を有していてもよい。
具体的には、前記のブロック共重合体を含んでなる第1の水性溶液と、前記のカチオン性ポリマーを含んでなる第2の水性溶液とを用意する。第1及び第2の水性溶液は、所望により濾過して精製してもよい。
第1及び第2の水性溶液の溶媒は、水性溶媒であれば、その種類は限定されない。好ましくは水であるが、高分子ミセルの形成を妨げない範囲で、水に他の成分を混合した溶媒、例えば生理食塩水、水性緩衝液、水と水溶性有機溶媒との混合溶媒等も用いることができる。水性緩衝液としては10mM HEPES緩衝液等が挙げられる。
第1及び第2の水性溶液の混合方法も限定されない。第1の水性溶液に第2の水性溶液を加えてもよく、第2の水性溶液に第1の水性溶液を加えてもよい。また、容器に第1及び第2の水性溶液を同時に入れて混合してもよい。得られた第1及び第2の水性溶液の混合液を、適宜攪拌してもよい。
本発明の医薬組成物は、TNF−αの発現ベクターを有効成分として含有する医薬組成物(1)と、CD40L及びGM−CSFを有効成分として含有する医薬組成物(2)との組み合わせである。医薬組成物(1)及び医薬組成物(2)は、それぞれの有効成分であるTNF−αの発現ベクターならびにCD40L及びGM−CSFを薬学的に許容される担体とともに含むものであってもよく、前記したDDSに内包されたものであってもよいが、標的部位への到達性及び生体内での安定性等を考慮すると、有効成分がDDSに内包されたものであることが好ましく、非荷電親水性ポリマーセグメント及びカチオン性ポリマーセグメントを有するブロック共重合体に由来する高分子ミセルに内包されたものがより好ましい。
ブロック共重合体とカチオン性ポリマーとを含んでなる高分子ミセルを用いる場合は、ブロック共重合体及びカチオン性ポリマーに対するTNF−αの発現ベクター又はCD40L及びGM−CSFの発現ベクターの比率は、[前記ベクターが有するリン酸基]に対する[ブロック共重合体及びカチオン性ポリマーが有するカチオン性基]のモル比で表すことができる。本発明においてこの比率は限定されるものではないが、通常2以上、好ましくは4以上、より好ましくは6以上、また、通常200以下、好ましくは100以下、より好ましくは50以下の範囲である。当該高分子ミセルを含有する本発明の医薬品組成物は、核酸導入効率に優れているため、より少ない核酸の使用量で効率的に核酸を送達し、遺伝子発現することが可能である。
−〔NH−(CH2)s〕t−NHX’ (XIII)
(式中、X’は、マレイン酸誘導体を表す。s及びtは、それぞれ独立して、かつ〔NH−(CH2)s〕ユニット間で独立して、sは1〜5の整数を表し、tは2〜5の整数を表す。)
である化合物又はその塩が挙げられる。
a) TNF−α、CD40L及びGM−CSFが単一の発現ベクターから発現するベクターを含有する医薬組成物1種からなる単一の製剤;
b) TNF−αの発現ベクターを含有する医薬組成物(1)と、CD40L及びGM−CSFを含有する医薬組成物(2)との2種の製剤;
c) TNF−αの発現ベクターを含有する医薬組成物(1)と、CD40Lを含有する医薬組成物(2)とGM−CSFを含有する医薬組成物(2)とが別々の剤形となっている3種の製剤;
d) TNF−αの発現ベクターを含有する医薬組成物(1)と、CD40L及びGM−CSFの発現ベクターを含有する医薬組成物(2)との2種の製剤;
e) TNF−αの発現ベクターを含有する医薬組成物(1)と、CD40Lの発現ベクター含有する医薬組成物(2)とGM−CSFの発現ベクターを含有する医薬組成物(2)とが別々の剤形となっている3種の製剤。
本発明において「Th2優位からTh1優位にシフトさせる」とは、医薬組成物の投与前と比べて投与後の個体において、Th2サイトカインの血中レベルが低下するとともにTh1サイトカインの血中レベルが上昇することをいう。ここで、Th2サイトカインとしては、IL-4、IL-5、IL-10等があげられ、Th1サイトカインとしては、IFN-γ、IL-2、TNF-α等があげられる。
正常免疫能を有する6週齢雌性BALB/cマウスは、日本クレアから購入した。すべてのマウスは、高圧滅菌した飼料及び滅菌水を自由摂取させて飼育した。動物実験は、東京大学及び九州大学の動物実験に関するガイドラインの原則に従って行った。
マウスTNF-α、CD40L、GM-CSFの単独又は複数同時発現ベクターは、プラスミドを用いて常法に従って構築した。複数の遺伝子を同時に発現するプラスミドを作製するために、ヒトGRP78プロモーター/サイトメガロウイルスCMVエンハンサー及びポリAシグナル;ヒトGRP94プロモーター/SV40エンハンサー及びポリAシグナルが組み込まれた発現プラスミドpVIVO1(インビボジェン製)を鋳型に用いた。一つの作製例を挙げる。マウスCD40Lのシグナルペプチド及び成熟型マウスCD40LをコードするDNAを連結させ、ヒトGRP78プロモーター/サイトメガロウイルスCMVエンハンサーの下流(クローニングサイト2)に組み込んで、マウスCD40Lを発現するプラスミドpVIVO-mCD40Lを構築した。このプラスミドのヒトGRP94プロモーター/SV40エンハンサーの下流(クローニングサイト1)に、マウスGM-CSFのシグナルペプチド及び成熟型マウスGM-CSFをコードするDNAを組み込んで、CD40LとGM-CSFを同時に発現するプラスミドpVIVO-mCD40L+mGMCSFを構築した。単独遺伝子発現プラスミドの作製例としては、マウスTNF-αのシグナルペプチド及び成熟型マウスTNF-αをコードするDNAを連結させ、ヒトGRP78プロモーター/サイトメガロウイルスCMVエンハンサーの下流(クローニングサイト2)に組み込んで、マウスTNF-αを発現するプラスミドpVIVO-mTNF-αを構築した。
発現プラスミド(pVIVO-mTNF-α、pVIVO-mCD40L、pVIVO-mGMCSF、pVIVO-mCD40L+mGMCSF)の概略を図1に示す。
国際公開第2007/09960号パンフレットの実施例1に記載の方法に準じて、PEG-SS-P[Asp(DET)]を調製した。
実施例1で得られたTNF-α、CD40L及びGM-CSFの発現プラスミド、CD40L及びGM-CSF(「CD40L+GM-CSF」と称する場合がある)の同時発現プラスミド、並びに実施例2で得られた高分子ポリマー(PEG-SS-P[Asp(DET)])を10mMリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)に別々に溶解し、N/P比が20となるように混合し、各種発現プラスミドを内包した高分子ミセル(TNF-α-PEG-SS-P[Asp(DET)]、CD40L-PEG-SS-P[Asp(DET)]、GM-CSF-PEG-SS-P[Asp(DET)]、CD40L+GM-CSF-PEG-SS-P[Asp(DET)])を調製した。
6週齢雌性BALB/cマウスを1週間馴化した後に、同種大腸癌細胞株CT26細胞を腹腔内に2x105個移植し、腹膜播種モデルを作製した。実施例3により調製したTNF-α、CD40L及びGM-CSFを内包する各種高分子ミセル(プラスミド50μg/匹;生理食塩水200μL)を腹膜播種モデルマウスの腹腔内に投与した。これら遺伝子治療の制御性T細胞に及ぼす影響を検討するために、遺伝子治療後7日目に(播種後14日)にマウス脾臓を採取し、細胞を単離して以下の免疫学的解析を行った。対照群としては、腫瘍を移植しない正常マウス及び無治療の腹膜播種マウス(播種7日後及び14日後)を用いた。単離した細胞に、抗マウスCD4抗体及び抗マウスFoxP3抗体(いずれもベクトン・ディッキンソン(BD)製)を添付のプロトコールに準じて反応させた後、フローサイトメーター(BD FACScalibur、BD製)を用いて、CD4陽性リンパ球のうちの制御性T細胞(Treg)の割合を解析した。
6週齢雌性BALB/cマウスを1週間馴化した後に、同種大腸癌細胞株CT26細胞又は乳癌細胞株4T1細胞を腹腔内に2x105個移植し、正常免疫能を有するマウスの腹膜播種モデルを作製した。移植後1週間目に、実施例2で作製したTNF-α発現プラスミド内包PEG-SS-P[Asp(DET)]高分子ミセル(混合比(N/P)=20;DNAの含有量は50μg)を腹腔内に投与する治療を単回行った。生理食塩水を同様に投与した群をコントロール群とした。治療後1週間後に腹膜播種癌を採取し、自動細胞単離装置GentleMACS dissociator(ミルテニーバイオテック)を用いて、腫瘍組織中の細胞を単離し、リンパ球のマーカー抗体CD3、CD4、CD8及び制御性T細胞のマーカー抗体FoxP3とインキュベーションさせた。その後、フローサイトメーターBD FACScalibur(べクトンディッキンソン)を用いて、リンパ球の細胞集団の同定と該細胞集団の中でのFoxP3陽性の制御性T細胞の割合を解析した。その結果を図3に示す。尚、制御性T細胞の抑制効果に関し、キャリアの種類には依存しないこと、即ち、高分子ミセルに限定されずウイルスベクター等のEPR効果を有するナノサイズのキャリアであればよいことは追加実験にて検証している。
実施例4と同様に、6週齢雌性BALB/cマウスを1週間馴化した後に、同種大腸癌細胞株CT26細胞を腹腔内に2x105個移植し、腹膜播種モデルを作製した。腹膜播種1週間後に、実施例3により調製したTNF-α、CD40L及びGM-CSFを内包する各種高分子ミセル(プラスミド50μg/匹;生理食塩水200μL)をマウス腹腔内に投与した。更に、TNF-α遺伝子治療により制御性T細胞を低下させた状態下で併用遺伝子治療を行うことで、免疫バランスが腫瘍寛容状態(Th2細胞優位な状態)から腫瘍拒絶状態(Th1細胞優位な状態)へ変化するか否かを検討した。具体的には、TNF-α遺伝子治療を行った3日後に、マウス腹腔内にCD40L、GM-CSF及びCD40L+GM-CSFを内包する各種高分子ミセル(プラスミド50μg/匹;生理食塩水200μL)を再び投与し、その4日後(播種移植後14日目)に採血を行った。Th1細胞とTh2細胞の指標となるサイトカインの血中濃度をベクトン・ディッキンソンCBSキットを用いて測定し、全身の免疫バランスに関する解析を行った。対照群としては、腫瘍を移植しない正常マウス及び無治療(生理食塩水投与)の腹膜播種マウス(播種14日後)を用いた。
6週齢雌性BALB/cマウスを1週間馴化した後に、同種大腸癌細胞株CT26細胞を腹壁皮下に5x106個移植し、皮下腫瘍モデルを作製した。腫瘍径が約7-8mmに達した時点で、実施例3により調製したTNF-αを内包する高分子ミセル(TNF-α-PEG-SS-P[Asp(DET)])(プラスミド50μg/匹;生理食塩水100μL)を皮下腫瘍内に投与した。亜群として、TNF-α遺伝子治療の3日後にCD40L+GM-CSF-PEG-SS-P[Asp(DET)]を皮下腫瘍内に追加投与した。生理食塩水を腫瘍内投与したマウスを対照群とした。
実施例4と同様に、6週齢雌性BALB/cマウスを1週間馴化した後に、同種大腸癌細胞株CT26細胞を腹腔内に2x105個移植し、腹膜播種モデルを作製した。腹膜播種1週間後に、実施例3により調製したTNF-α、CD40L及びGM-CSFを内包する各種高分子ミセル(プラスミド50μg/匹;生理食塩水200μL)をマウス腹腔内に投与した。更に、TNF-α遺伝子治療により制御性T細胞を低下させた状態下で併用遺伝子治療を行うことで、腹膜播種に対する治療効果が増強するか否かを検討した。具体的には、TNF-α遺伝子治療を行った3日後に、マウス腹腔内にCD40L、GM-CSF及びCD40L+GM-CSFを内包する各種高分子ミセル(プラスミド50μg/匹;生理食塩水200μL)を再び投与し、播種後の生存期間を、併用遺伝子治療群又は単独遺伝子治療群と対照群(生理食塩水のみ投与)とで比較検討した。
Claims (15)
- TNF−αの発現ベクターを有効成分として含有する医薬組成物(1)と、CD40L及びGM−CSFを有効成分として含有する医薬組成物(2)との組み合わせからなる、癌又は感染症の治療用の医薬組成物。
- CD40L及びGM−CSFが遺伝子として発現ベクターに組み込まれている、請求項1に記載の医薬組成物。
- CD40L遺伝子及びGM−CSF遺伝子が単一の発現ベクターに組み込まれている、請求項2に記載の医薬組成物。
- TNF−αの発現ベクターが投与され、次いでCD40L及びGM−CSFが投与されるように用いられる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- TNF−αの発現ベクターが投与され、次いでCD40L及びGM−CSFが同時に投与されるように用いられる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- TNF−αの発現ベクター、CD40L及び/又はGM−CSFが、下記いずれかのブロック共重合体からなる高分子ミセル、又は下記いずれかのブロック共重合体とカチオン性ポリマーとを含んでなり、ブロック共重合体及びカチオン性ポリマーが有する総カチオン基に対する、ブロック共重合体が有するカチオン基のモル百分率(B/H比)が、25〜99%である高分子ミセルに内包されてなることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物:
(1)非荷電親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとを有するブロック共重合体、又は
(2)非荷電親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとを有し、該親水性ポリマーセグメントと該カチオン性ポリマーセグメントがジスルフィド結合を介して結合したブロック共重合体。 - ブロック共重合体(1)が、下記一般式(I)又は(II)で表される、請求項6に記載の医薬組成物。
R1は水素原子又は置換されていてもよい直鎖もしくは分枝のC1―12アルキル基を表し、
L1、L2は連結基を表し、
R2はメチレン基又はエチレン基を表し、
R3は水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
R4はR5と同一であるか又は開始剤残基であり、
R5はそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−NH−(CH2)a−X基を表し、ここで、Xはそれぞれ独立してpKa値が7.4以下の嵩高いアミン化合物残基であるか、あるいは一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の一種類又は二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、aは1〜5の整数であり、mは5〜20,000の整数であり、nは2〜5,000の整数であり、xは0〜5,000の整数であるが、xはnより大きくないとする。
また、上記の一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。) - ブロック共重合体(1)が、下記一般式(III)又は(IV)で表される、請求項6に記載の医薬組成物。
R1は水素原子又は置換されていてもよい直鎖もしくは分枝のC1−12アルキル基を表し、
L1、L2は連結基を表し、
R2はメチレン基又はエチレン基を表し、
R3は水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表し、
R4はR5と同一であるか又は開始剤残基であり、R5はそれぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−NH−(CH2)a−X基を表し、ここでXはそれぞれ独立してpKa値が7.4以下の嵩高いアミン化合物残基であるか、あるいは一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内一種類又は二種類以上を含むアミン化合物残基であるか、あるいはアミンでない化合物残基であり、aは1〜5の整数であり、
R6はそれぞれ独立して水素原子又は保護基であり、
mは5〜20,000の整数であり、
nは2〜5,000の整数であり、
yは0〜4,999の整数であり、
zは1〜4,999の整数であるが、zはnより小さく、y+zはnより大きくないとする。
また、上記の一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。) - Xが下記のA、B、C、D又はE群に示す式で表される基である、請求項7又は8に記載の医薬組成物。
- ブロック共重合体(2)が、下記一般式(V)で表される、請求項6〜9のいずれか1項に記載の医薬組成物。
R12は、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、
L3は、NH、CO、下記一般式(VIII):
−(CH2)p1−NH− (VIII)
(式中、p1は1〜5の整数を表す。)
で示される基、又は下記一般式(IX):
−L4a−(CH2)q1−L5a− (IX)
(式中、L4aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L5aは、NH又はCOを表す。q1は1〜5の整数を表す。)
で示される基を表し、m1は30〜150の整数を表し、m2は1〜5の整数を表し、nは100〜400の整数を表す。〕 - R12が下記一般式(VI):
−NH−(CH2)r−X4− (VI)
(式中、X4は、一級、二級もしくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表し、rは0〜5の整数を表す。)
で示される基、又は下記一般式(VII):
−〔NH−(CH2)s〕t−X5− (VII)
(式中、X5は、一級、二級もしくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。s及びtは、それぞれ独立して、かつ〔NH−(CH2)s〕ユニット間で独立して、sは1〜5の整数を表し、tは2〜5の整数を表す。)
で示される基を表す、請求項10に記載の医薬組成物。 - R12が−NH−NH2又は−NH−(CH2)2−NH−(CH2)2−NH2である、請求項10に記載の医薬組成物。
- ベクターがプラスミドである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 制御性T細胞を抑制し、拒絶免疫Th1を誘導する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 癌の治療用である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の医薬組成物。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010294035A JP5817055B2 (ja) | 2010-12-28 | 2010-12-28 | TNF−α、CD40L及びGM−CSF併用遺伝子治療剤 |
PCT/JP2011/080515 WO2012091137A1 (ja) | 2010-12-28 | 2011-12-28 | TNF-α、CD40L及びGM-CSF併用遺伝子治療剤 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010294035A JP5817055B2 (ja) | 2010-12-28 | 2010-12-28 | TNF−α、CD40L及びGM−CSF併用遺伝子治療剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012140369A JP2012140369A (ja) | 2012-07-26 |
JP5817055B2 true JP5817055B2 (ja) | 2015-11-18 |
Family
ID=46383224
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010294035A Active JP5817055B2 (ja) | 2010-12-28 | 2010-12-28 | TNF−α、CD40L及びGM−CSF併用遺伝子治療剤 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5817055B2 (ja) |
WO (1) | WO2012091137A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107922559B (zh) * | 2014-10-15 | 2020-07-24 | 康涅狄格大学 | 用于药物递送的生物可还原的自装配液晶嵌段共聚物 |
JP2023181674A (ja) * | 2022-06-13 | 2023-12-25 | 国立大学法人 東京大学 | 核酸とカチオン性ポリマーとのポリイオンコンプレックスであって、正の表面電位を有し、核酸を脳組織に送達することができるポリイオンコンプレックス |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8592385B2 (en) * | 2006-03-01 | 2013-11-26 | The University Of Tokyo | Polymer micelle complex including nucleic acid |
-
2010
- 2010-12-28 JP JP2010294035A patent/JP5817055B2/ja active Active
-
2011
- 2011-12-28 WO PCT/JP2011/080515 patent/WO2012091137A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2012091137A1 (ja) | 2012-07-05 |
JP2012140369A (ja) | 2012-07-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7181880B2 (ja) | 免疫療法のためのコア/シェル構造プラットホーム | |
Li et al. | Rational design of polymeric hybrid micelles to overcome lymphatic and intracellular delivery barriers in cancer immunotherapy | |
JP2021073296A (ja) | 抗CTLA−4抗体又は抗PD−1抗体との併用におけるIL−2Rβ選択的作動薬 | |
US20210369862A1 (en) | Therapeutic nanoparticles and methods of use thereof | |
JP2021531266A (ja) | 免疫応答を調節可能な金属含有製剤のための組成物および方法 | |
CA3137081A1 (en) | Compositions and methods of manufacturing star polymers for ligand display and/or drug delivery | |
CN113015540A (zh) | 使用mrna治疗剂治疗癌症的方法和组合物 | |
WO2011097384A2 (en) | Tumor targeted delivery of immunomodulators by nanoplymers | |
Kim et al. | Augmenting the synergies of chemotherapy and immunotherapy through drug delivery | |
AU2016294602A1 (en) | Compositions and methods for treating peritoneal cancers | |
JP2021529552A (ja) | 癌に対するマクロファージベースの養子細胞療法の有効性を改善するil−31 | |
JP7221545B2 (ja) | ホスファチジルセリン標的化融合分子およびそれらの使用方法 | |
JP5817055B2 (ja) | TNF−α、CD40L及びGM−CSF併用遺伝子治療剤 | |
KR20200143455A (ko) | 인간 키누레니나제 효소 및 이의 사용법 | |
Peng et al. | Vesicular IFN-γ as a cooperative attacker to enhance anti-cancer effect of 5-fluorouracil via thymidine phosphorylase upregulation and tumor microenvironment normalization | |
US20230381112A1 (en) | Compositions and Methods of Manufacturing Amphiphilic Block Copolymers that Form Nanoparticles in Situ | |
Pappalardo et al. | Characterization of a nanovaccine platform based on an α1, 2-mannobiose derivative shows species-non-specific targeting to human, bovine, mouse, and teleost fish dendritic cells | |
KR100718077B1 (ko) | 만노스화 키토산 유도체 및 이를 이용한 유전자 전달체 | |
Yuba et al. | Preparation of glycopeptide-modified pH-sensitive liposomes for promoting antigen cross-presentation and induction of antigen-specific cellular immunity | |
WO2011002077A1 (ja) | 高分子ミセル内包TNF-α遺伝子治療剤 | |
WO2020158863A1 (ja) | アントラサイクリン系化合物を含むミセル剤と免疫賦活剤との組み合わせ医薬 | |
EP3938048A1 (en) | Mrna vaccine | |
CN117695242A (zh) | 环二核苷酸自组装纳米粒子及其制备和应用 | |
Liu et al. | Unlocking the power of immunotherapy: Combinatorial delivery of plasmid IL-15 and gemcitabine to synergistically remodeling the tumor microenvironment | |
CN118320110A (zh) | 一种白血病用共载肿瘤抗原和免疫佐剂的囊泡纳米疫苗及其制备与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131226 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20131226 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150106 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150306 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150818 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150910 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5817055 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |