JP5812387B2 - Plant tan genes and uses thereof - Google Patents
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Description
本発明は、植物の病害虫等による外的障害に対する色素反応に関わるtan遺伝子、tan遺伝子を標的とした病原性糸状菌に対する植物の感受性または抵抗性の判定方法、ならびにtan遺伝子を利用した病原性糸状菌に対する抵抗性の植物の作出方法に関する。 The present invention relates to a tan gene involved in a pigment reaction to an external disorder caused by a plant pest, etc., a method for determining the susceptibility or resistance of a plant to a pathogenic filamentous fungus targeting the tan gene, and a pathogenic filamentous form using the tan gene The present invention relates to a method for producing a plant resistant to bacteria.
ソルガムは病害虫への応答反応として、アントシアニンを合成し病気に犯された部分や食害を受けた部分の周辺は一般的に赤紫褐色からオレンジ色を呈する。これに対して、tan形質と呼ばれるものでは、これらの部分においてはアントシアニンが合成されず黄褐色を呈する(図1)。 As a response reaction to pests, sorghum generally synthesizes anthocyanins, and the area around the part that was afflicted by the disease and the part that was damaged by the sorghum generally changes from magenta to orange. On the other hand, in the so-called tan trait, anthocyanins are not synthesized in these parts and a yellowish brown color is exhibited (FIG. 1).
これまでの研究から、ソルガムのtan形質は、単一劣性遺伝子支配であることが解明されるに至っている(非特許文献1)。また、tan形質を持つソルガムは紋枯病に対して圃場抵抗性が上昇することが知られている(非特許文献2)。さらに、tan形質のソルガム(非特許文献3)やアントシアニンの前駆物質であるフラバン-4-オールを溜め込むソルガムはカビに対する全体的な抵抗性が高まることが知られている(非特許文献4)。また、tan形質はインドなどの熱帯地域のソルガムでは広く用いられている形質であり、そのような環境条件下では病害抵抗性などの点で有利な形質であると考えられる。 From previous studies, it has been elucidated that the tan trait of sorghum is dominated by a single recessive gene (Non-patent Document 1). In addition, it is known that sorghum having a tan trait increases field resistance against coat blight (Non-patent Document 2). Furthermore, it is known that sorghum having a tan character (Non-patent Document 3) and sorghum that stores flavan-4-ol, which is a precursor of anthocyanin, increase the overall resistance to mold (Non-patent Document 4). The tan trait is a trait that is widely used in sorghum in tropical regions such as India, and is considered to be an advantageous trait in terms of disease resistance under such environmental conditions.
一方、ソルガムには自然界ではあまり見られないアントシアニンである3-デオキシアントシアニンが多く含まれていることが知られている。ソルガムの果皮に多く含まれている3-デオキシアントシアニンは、アピゲニニジン(Apigeninidin(赤))および3’OHのルテオリニジン(luteolinidin(黒紫))であり(非特許文献5)、植物界に広く存在する他のアントシアニジンと同様に、これら3-デオキシアントシアニジンは、配糖体の形態にて細胞内の液胞に蓄積すると考えられている(非特許文献6)。これまでの知見では、3-デオキシアントシアニンの合成経路は、アントシアニン生合成経路から分岐していると考えられている。さらに、ナリンゲニンからフラバノン-4-還元酵素(DFR)により、3-デオキシアントシアニン生合成が分岐することが示唆されている(非特許文献7)。また、こうしてできたフラバン-4-オールは、重合化してフロバフェン(phlobaphenes)になるほか、3-デオキシアントシアニジンへと生成されると考えられている。この3-デオキシアントシアニジンへの合成反応は、これまではアントシアニジン合成酵素(ANS)によるものと考えられていたが、最終段階の反応をつかさどる酵素がANSである可能性は低いことが示されている(非特許文献7)。 On the other hand, it is known that sorghum contains a large amount of 3-deoxyanthocyanin, which is an anthocyanin that is rarely found in nature. 3-Deoxyanthocyanin, which is abundant in the sorghum peel, is apigeninidin (Apigeninidin (red)) and 3'OH luteolinidin (luteolinidin (black purple)) (Non-patent Document 5) and is widely present in the plant kingdom. Like other anthocyanidins, these 3-deoxyanthocyanidins are thought to accumulate in intracellular vacuoles in the form of glycosides (Non-Patent Document 6). Based on the knowledge thus far, the synthesis route of 3-deoxyanthocyanin is thought to be branched from the anthocyanin biosynthesis route. Furthermore, it has been suggested that 3-deoxyanthocyanin biosynthesis branches from naringenin by flavanone-4-reductase (DFR) (Non-patent Document 7). The flavan-4-ol thus produced is considered to be polymerized to flobaphenes and also to 3-deoxyanthocyanidins. The synthesis reaction to 3-deoxyanthocyanidin was previously thought to be due to anthocyanidin synthase (ANS), but it has been shown that the enzyme responsible for the final reaction is unlikely to be ANS. (Non-patent document 7).
さらに、ソルガムは、これまで日本国においては主に家畜飼料として栽培されていたが、近年になり、バイオ燃料(エタノール)の原料としても注目されるようになってきた。そのため病害によるソルガムの減収を防ぐことは、農業政策のみならず、エネルギー政策の上でも重要な課題である。しかしながら、これまでソルガムにおいては、その主たる用途が家畜飼料であったことなどから、病気一般に対する薬剤による防除は、ほとんど行われてこなかったのが現状である。 Furthermore, sorghum has been mainly cultivated as a livestock feed in Japan until now, but in recent years, it has been attracting attention as a raw material for biofuel (ethanol). For this reason, preventing sorghum revenues due to disease is an important issue not only for agricultural policy but also for energy policy. However, in the past, sorghum has been rarely used to control diseases in general because of its main use being livestock feed.
そのため、カビに対する全体的な抵抗性と関連性を有する3-デオキシアントシアニン合成経路や紋枯病等に対する抵抗性と関連性を有する、tan形質をもたらす遺伝子の同定が期待されているものの、未だ明らかになってはいない。 Therefore, although it is expected to identify a gene that causes a tan trait and has a relationship with resistance to 3-deoxyanthocyanin synthesis pathway and blight disease, which is related to the overall resistance to mold, it is still clear It is not.
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ソルガムにおける3-デオキシアントシアニン合成経路や、紋枯病等に対する抵抗性と関連性を有するtan形質をもたらす遺伝子を同定することにある。さらに、本発明は、ソルガムにtan形質をもたらす遺伝子に対応する他の植物における遺伝子を同定することを目的とする。また、本発明は、同定された遺伝子に基づき、植物のtan形質を簡便に判定する方法を提供することを目的とする。さらなる本発明の目的は、解明されたtan形質の発症の機構に基づき、tan形質を導入した植物を効率的に作出する方法を提供することにある。 The present invention has been made in view of such a situation, and its purpose is to identify a gene that causes a tan trait having a relationship with 3-deoxyanthocyanin synthesis pathway in sorghum, resistance to blight, etc. There is to do. Furthermore, the present invention aims to identify genes in other plants that correspond to genes that cause tan traits in sorghum. Moreover, an object of this invention is to provide the method of determining easily the tan character of a plant based on the identified gene. A further object of the present invention is based on the development of mechanisms elucidated tan trait is to provide a method for efficiently producing a plant introduced with tan trait.
本発明者らは、上記課題を解決すべく、ソルガムで病害により紫色(purple)を示す品種、那系MS-3Bとtan形質の品種Greenleafの大規模な交配集団(F3,F5)において、ソルガムのSSRマーカーおよび挿入・欠失マーカーを利用して、tan遺伝子のマッピングを行った(図1、図2)。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have established a sorghum in a large-scale crossing population (F3, F5) of a variety of sorghum that shows purple due to disease, a cultivar of MS-3B and tan trait Greenleaf. The tan gene was mapped using the SSR marker and insertion / deletion marker (Figs. 1 and 2).
具体的には、まず、F5のRIL個体(組換え自殖系統(Recombinat
Inbred Line)、143個体)について、SSRマーカーを用いたラフマッピングの結果から、tan遺伝子が染色体6番に座乗していることを解明した。次いで、F3部分へテロ集団個体(1142個体)について、SSRマーカーSB3751からSB3764の間で組換えのある個体(63個体)を選抜し、圃場にてtan形質の調査を行い、tan遺伝子の存在領域を、約150kbpの領域に絞り込んだ。さらに、ソルガム品種BTx623の塩基配列情報に基づいて見出したCAPSマーカー、SNPマーカーを用いたマッピングを行い、tan遺伝子の存在領域を最終的に約29kbpの領域に絞り込んだ(図3)。
Specifically, first, F5 RIL individuals (recombinant inbred lines (Recombinat
Inbred Line) and 143 individuals), the results of rough mapping using SSR markers revealed that the tan gene sits on chromosome 6. Next, the terrorist groups individuals (1142 individuals) to F3 part, were selected individuals (63 individuals) with a recombination between SSR markers SB3751 of SB3764, performs a tan traits of investigation in the field, the existence region of the tan gene Was narrowed down to a region of about 150 kbp. Furthermore, mapping using the CAPS marker and SNP marker found based on the base sequence information of sorghum variety BTx623 was performed, and the tan gene existing region was finally narrowed down to a region of about 29 kbp (FIG. 3).
本発明者らが、絞り込んだ領域における遺伝子のアノテーションをデーターベースで調査したところ、この領域はトウモロコシのロイコアントシアニジンレダクターゼに相同性を持つ遺伝子がクラスターを作っていることが判明した。この絞り込んだ領域内には4つのトウモロコシのロイコアントシアニジンレダクターゼに相同性を持つ候補遺伝子が存在した。この4つの遺伝子の発現をRT-PCRにて調査したところ、候補遺伝子のうち、特定の候補遺伝子(Sb06g029550、以下、場合により「tan遺伝子」又は「感受性型tan遺伝子」とも称する)の発現パターンのみが、ソルガムが障害により紫色を呈するときに遺伝子の発現が増加することを見出した(図4)。また、残りの遺伝子の発現はRT-PCRでは見られなかった。このことから、この遺伝子が着色の原因遺伝子であると推測された。 When the present inventors investigated the annotation of the gene in the narrowed-down area | region in the database, it turned out that the gene which has the homology to the leucoanthocyanidin reductase of a corn has made the cluster in this area | region. Within this narrowed region were four candidate genes with homology to corn leucoanthocyanidin reductase. When the expression of these four genes was investigated by RT-PCR, only the expression pattern of a specific candidate gene (Sb06g029550, hereinafter also referred to as “ tan gene” or “sensitive tan gene”) among candidate genes However, it was found that gene expression increases when sorghum turns purple due to injury (FIG. 4). Moreover, the expression of the remaining genes was not observed by RT-PCR. From this, it was speculated that this gene is a causative gene of coloring.
tan遺伝子周辺の塩基配列を決定し、そのコードするアミノ酸配列を品種間で比較したところ、紫色を呈する品種の那系MS-3Bでは、タンパク質をコードする遺伝子領域がすでにゲノム塩基配列が明らかになっている品種、BTx623と完全に一致していた(図5)。しかしながら、Greenleafのtan遺伝子(以下、「抵抗性型tan遺伝子」とも称する)がコードするアミノ酸配列において、感受性型tan遺伝子がコードするアミノ酸配列と配列の異なる2つの箇所が見出された。その結果、tan形質のGreenleafでは、tan遺伝子がコードする正常なタンパク質が合成されないと推測された(図5)。 When the nucleotide sequence around the tan gene was determined and the amino acid sequences encoded were compared between varieties, the genome sequence of the gene region encoding the protein was already clarified in the purple MS-3B variety. The cultivar was BTx623 (Fig. 5). However, in the amino acid sequence encoded by Greenleaf's tan gene (hereinafter also referred to as “resistant tan gene”), two sites were found that differed in sequence from the amino acid sequence encoded by the sensitive tan gene. As a result, it was speculated that the normal protein encoded by the tan gene was not synthesized in Greenleaf of the tan trait (FIG. 5).
また、外的障害を受けたtan形質を示すソルガムにおいては、3-デオキシアントシアニジン(アピゲニニジン及びルテオリニジン)の代わりに、ルテオリン等が蓄積されていることが明らかになった(図6〜8)。さらに、抵抗性型tan遺伝子とすす紋病に対する抵抗性との相関が明らかになった(図10)。 In addition, in sorghum exhibiting a tan trait that had undergone external damage, it was revealed that luteolin and the like were accumulated instead of 3-deoxyanthocyanidins (apigenidin and luteolinidine) (FIGS. 6 to 8). Furthermore, a correlation between resistance type tan gene and resistance to soot disease was revealed (FIG. 10).
これらの事実から、tan遺伝子はソルガムの着色にかかわる遺伝子であり、その発現抑制や変異によって、本来の機能が発揮されず、3-デオキシアントシアニジンが合成されないないことにより、個体がtan形質を示すことが判明した。さらに、tan形質においては、外的障害を受けた際に、抗菌活性等を有するルテオリン等が蓄積することから、病原性糸状菌に対する抵抗性が発揮されることも判明した。 From these facts, the tan gene is a gene involved in sorghum coloration, and due to its expression suppression and mutation, the original function is not exhibited, and 3-deoxyanthocyanidin is not synthesized, indicating that the individual exhibits the tan trait There was found. Furthermore, in the tan trait, it was also found that resistance to pathogenic filamentous fungi is exhibited because luteolin or the like having antibacterial activity accumulates when receiving external damage.
以上の知見に基づいて、本発明者らは、同定されたtan遺伝子を標的として植物における病原性糸状菌に対する感受性または抵抗性を判定することが可能であり、さらに、見出された遺伝子が3-デオキシアントシアニジンの合成反応の最終段階を行っている酵素であることから、tan遺伝子の発現や機能を抑制することにより、植物にtan形質由来の抵抗性を付与することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。 Based on the above findings, the present inventors can determine the susceptibility or resistance to pathogenic filamentous fungi in plants by targeting the identified tan gene. -Deoxyanthocyanidin is an enzyme that performs the final stage of the synthesis reaction, and it has been found that by suppressing the expression and function of the tan gene, it is possible to confer resistance derived from the tan trait to plants. The present invention has been completed.
本発明は、より詳しくは、下記を提供するものである。
<1> 植物における3-デオキシアントシアニジン合成を抑制するタンパク質をコードする、下記(a)〜(c)のいずれかに記載のDNA。
(a)配列番号:6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:6に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
<2> 植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有するタンパク質をコードする、下記(a)〜(c)のいずれかに記載のDNA。
(a)配列番号:6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:6に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
<3> <1>または<2>に記載のDNAを含むベクター。
<4> <1>または<2>に記載のDNAが導入された植物細胞。
<5> <4>に記載の細胞を含む植物体。
<6> <5>に記載の植物体の子孫またはクローンである、植物体。
<7> <5>または<6>に記載の植物体の繁殖材料。
<8> 植物における下記(a)〜(c)のいずれかに記載のDNAの発現または機能を抑制することを特徴とする、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する方法。
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含み、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
<9> 植物に<2>に記載のDNAを導入し、該植物におけるtan対立遺伝子の双方を当該DNAにする工程を含む、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する方法。
<10> 植物に下記(a)〜(c)のいずれかに記載のRNAをコードするDNAを導入する工程を含む、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する方法。
(a)植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有し、かつ下記(i)〜(iii)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的な二重鎖RNA
(b)植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有し、かつ下記(i)〜(iii)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNA
(c)植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有し、かつ下記(i)〜(iii)のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNA
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(ii)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含み、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
<11> <2>に記載のDNA、または該DNAが挿入されたベクターを含み、植物におけるtan対立遺伝子の双方を前記DNAとすることによって、病原性糸状菌に対する抵抗性を付与するための薬剤。
<12> 下記(a)〜(c)のいずれかに記載のRNAをコードするDNA、または該DNAが挿入されたベクターを含む、病原性糸状菌に対する抵抗性を付与するための薬剤。
(a)植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有し、かつ下記(i)〜(iii)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的な二重鎖RNA
(b)植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有し、かつ下記(i)〜(iii)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNA
(c)植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有し、かつ下記(i)〜(iii)のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNA
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(ii)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含み、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
<13> 植物における病原性糸状菌に対する感受性または抵抗性を判定する方法であって、被検植物におけるtan遺伝子の塩基配列を解析し、当該塩基配列が下記(a)〜(c)のいずれかに記載のDNAの塩基配列である場合には、被検植物が病原性糸状菌に対する感受性を有する蓋然性が高いと判定し、請求項2に記載のDNAの塩基配列である場合には、被検植物が病原性糸状菌に対する抵抗性を有する蓋然性が高いと判定する方法。
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含み、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
<14> 植物における病原性糸状菌に対する感受性または抵抗性を判定する方法であって、被検植物における下記(a)〜(c)のいずれかに記載のDNAまたは<2>に記載のDNAの発現を検出することを特徴とする方法。
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含み、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
<15> 病原性糸状菌に対する抵抗性の植物を育種する方法であって、
(a)病原性糸状菌に対する抵抗性の植物品種と任意の植物品種とを交配させる工程、
(b)工程(a)における交配により得られた個体における病原性糸状菌に対する感受性または抵抗性を、<13>または<14>に記載の方法により判定する工程、および
(c)病原性糸状菌に対する抵抗性を有すると判定された品種を選抜する工程、を含む方法。
<16> <15>に記載の方法により育種された植物体。
<17> <16>に記載の植物体の子孫またはクローンである、植物体。
<18> <16>または<17>に記載の植物体の繁殖材料。
More specifically, the present invention provides the following.
<1> The DNA according to any one of the following (a) to (c), which encodes a protein that suppresses 3-deoxyanthocyanidin synthesis in a plant.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6
(B) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or 5
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
<2> The DNA according to any one of the following (a) to (c), which encodes a protein having an activity of imparting resistance to a pathogenic filamentous fungus to a plant.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6
(B) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or 5
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
<3> A vector comprising the DNA according to <1> or <2>.
<4> A plant cell into which the DNA according to <1> or <2> has been introduced.
<5> A plant comprising the cell according to <4>.
<6> A plant that is a descendant or clone of the plant according to <5>.
<7> Plant propagation material according to <5> or <6>.
<8> A method for imparting resistance to pathogenic filamentous fungi to a plant, which suppresses the expression or function of the DNA according to any one of the following (a) to (c) in the plant.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(B) DNA encoding a protein comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(C) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and has an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants. DNA encoding protein
<9> A method for imparting resistance to pathogenic filamentous fungi to a plant, comprising the step of introducing the DNA according to <2> into the plant and converting both of the tan alleles in the plant into the DNA.
<10> A method for imparting resistance to a pathogenic filamentous fungus to a plant, comprising a step of introducing a DNA encoding the RNA according to any one of (a) to (c) below into the plant.
(A) a double-stranded RNA having an activity of imparting resistance to a pathogenic filamentous fungus to a plant and complementary to the transcription product of DNA according to any one of (i) to (iii) below
(B) An antisense RNA having an activity to impart resistance to pathogenic filamentous fungi to a plant and complementary to the transcription product of DNA according to any of (i) to (iii) below
(C) RNA having an activity to confer resistance to pathogenic filamentous fungi on a plant and a ribozyme activity that specifically cleaves a transcription product of DNA according to any one of (i) to (iii) below
(I) a DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(Ii) DNA encoding a protein comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(Iii) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and has an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants. DNA encoding protein
<11> A drug for imparting resistance to pathogenic filamentous fungi, comprising the DNA according to <2> or a vector into which the DNA is inserted, and using both of the tan alleles in plants as the DNA. .
<12> A drug for imparting resistance to pathogenic filamentous fungi, comprising DNA encoding the RNA according to any one of the following (a) to (c), or a vector into which the DNA is inserted.
(A) a double-stranded RNA having an activity of imparting resistance to a pathogenic filamentous fungus to a plant and complementary to the transcription product of DNA according to any one of (i) to (iii) below
(B) An antisense RNA having an activity to impart resistance to pathogenic filamentous fungi to a plant and complementary to the transcription product of DNA according to any of (i) to (iii) below
(C) RNA having an activity to confer resistance to pathogenic filamentous fungi on a plant and a ribozyme activity that specifically cleaves a transcription product of DNA according to any one of (i) to (iii) below
(I) a DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(Ii) DNA encoding a protein comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(Iii) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and has an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants. DNA encoding protein
<13> A method for determining sensitivity or resistance to pathogenic filamentous fungi in a plant, wherein the base sequence of a tan gene in a test plant is analyzed, and the base sequence is any of the following (a) to (c): If the base sequence of the DNA according to claim 2 is determined, it is determined that the test plant has a high probability of having a susceptibility to pathogenic filamentous fungi. A method for determining that a plant has a high probability of having resistance to pathogenic filamentous fungi.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(B) DNA encoding a protein comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(C) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and has an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants. DNA encoding protein
<14> A method for determining sensitivity or resistance to pathogenic filamentous fungi in a plant, wherein the DNA according to any one of the following (a) to (c) in the test plant or the DNA according to <2> A method comprising detecting expression.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(B) DNA encoding a protein comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(C) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and has an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants. DNA encoding protein
<15> A method for breeding a plant resistant to pathogenic filamentous fungi,
(A) crossing a plant variety resistant to pathogenic filamentous fungi with any plant variety,
(B) determining the susceptibility or resistance to pathogenic filamentous fungi in the individual obtained by mating in step (a) by the method according to <13> or <14>; and (c) pathogenic filamentous fungi Selecting a variety that has been determined to have resistance to.
<16> A plant bred by the method according to <15>.
<17> A plant that is a descendant or clone of the plant according to <16>.
<18> The plant propagation material according to <16> or <17>.
なお、本発明において、tan形質により抵抗性が付与される「病原性糸状菌」とは植物に病害をもたらす糸状菌であればよく、例えば、紋枯病をもたらすThanatephorus cucumeris、すす紋病をもたらすSetosphaeria
turcica、炭疽病をもたらすColletotrichum graminicolaが挙げられる。
In the present invention, the “pathogenic filamentous fungus” to which resistance is imparted by the tan trait may be a filamentous fungus that causes disease to plants, such as Thanatephorus cucumeris that causes blight, and soot disease. Setosphaeria
turcica , Colletotrichum graminicola which causes anthrax.
また、本発明において「病原性糸状菌に対する感受性」とは、植物が病原性糸状菌に感染する性質を意味する。また、本発明において「病原性糸状菌に対する抵抗性」とは、病原性糸状菌の感染に対する植物の抵抗性を意味する。この抵抗性により、植物において病原性糸状菌の感染症状の発症、あるいは、発生した症状の程度(例えば、病斑形成の程度)が抑制される。 In the present invention, “susceptibility to pathogenic filamentous fungi” means a property that a plant is infected with pathogenic filamentous fungi. In the present invention, “resistance to pathogenic filamentous fungi” means resistance of a plant to infection by pathogenic filamentous fungi. Due to this resistance, the onset of infection symptoms of pathogenic filamentous fungi in plants or the degree of symptoms (for example, the extent of lesion formation) is suppressed.
本発明によって、植物の病害虫等による外的障害に対する色素反応に関わり、病原性糸状菌に対する感受性をもたらす遺伝子 tan遺伝子(感受性型tan遺伝子)が同定され、該遺伝子の染色体上の位置および構造、ならびにtan形質、ひいては3-デオキシアントシアニン合成の機構や病原性糸状菌に対する抵抗性が発揮される機構が解明された。これにより、tan遺伝子やその近傍のマーカーを利用して、植物の病原性糸状菌に対する感受性および抵抗性を簡便に判定することが可能となった。また、感受性型tan遺伝子の発現や機能を抑制することにより、病原性糸状菌に対する抵抗性の植物品種を効率的に作出することが可能となった。本発明は、病原性糸状菌の病害による植物の収量低下の防止に大きく貢献するものである。 According to the present invention, a gene tan gene (susceptibility-type tan gene) that is involved in a pigment reaction to external damage caused by plant pests and the like and brings about susceptibility to pathogenic filamentous fungi is identified, and the position and structure of the gene on the chromosome, and The mechanism of tan trait, and thus the mechanism of 3-deoxyanthocyanin synthesis and the resistance to pathogenic filamentous fungi were elucidated. This makes it possible to easily determine the susceptibility and resistance of a plant to pathogenic filamentous fungi using the tan gene and markers in the vicinity thereof. Moreover, it became possible to efficiently produce plant varieties resistant to pathogenic filamentous fungi by suppressing the expression and function of the sensitive tan gene. The present invention greatly contributes to prevention of a decrease in plant yield due to pathogenic filamentous fungi.
<合成誘導型DNA、合成抑制型DNA、感受性型DNA、抵抗性型DNA>
本発明は、植物における3-デオキシアントシアニジン合成を誘導するタンパク質をコードするDNA(以下、「合成誘導型DNA」とも称する)を提供する。また、本発明は、植物に、病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA(以下、「感受性型DNA」とも称する)を提供する。本発明者らにより同定された、ソルガムの病虫害を受けた部位が紫色を示す品種であり、すす紋病等に対する感受性品種である那系MS-3B由来のtan cDNAの塩基配列を配列番号:1に、tanゲノムDNAの塩基配列を配列番号:2に、これらDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:3に示す。本発明の合成誘導型DNA又は感受性型DNA(以下、「感受性型DNA等」とも称する)の1つの態様は、配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA(典型的には、配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA)である。
<Synthesis-inducing DNA, synthesis-inhibiting DNA, sensitive DNA, resistant DNA>
The present invention provides a DNA encoding a protein that induces 3-deoxyanthocyanidin synthesis in plants (hereinafter also referred to as “synthesis-inducing DNA”). The present invention also provides a DNA encoding a protein having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants (hereinafter also referred to as “sensitive DNA”). The base sequence of tan cDNA derived from Na-type MS-3B, which is identified by the present inventors, is a cultivar showing purple in the sorghum disease-affected site, and is susceptible to soot disease etc. SEQ ID NO: 1 The base sequence of tan genomic DNA is shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence of the protein encoded by these DNAs is shown in SEQ ID NO: 3. One embodiment of the synthetic inducible DNA or sensitive DNA of the present invention (hereinafter also referred to as “sensitive DNA etc.”) is a DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 (typically DNA containing the coding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 or 2.
現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の感受性ソルガム品種(例えば、那系MS-3B)における感受性型DNA等の塩基配列情報が得られた場合、その塩基配列を改変し、そのコードするアミノ酸配列は異なるが、同じく合成誘導型又は感受性型であるDNAを取得することが可能である。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。従って、本発明は、那系MS-3Bにおけるtanタンパク質のアミノ酸配列(配列番号:3)において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、植物における3-デオキシアントシアニジン合成を誘導するタンパク質をコードするDNA又は植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNAをも含むものである。ここで「複数」とは、改変後のtanタンパク質が、植物において3-デオキシアントシアニジン合成を誘導できる範囲におけるアミノ酸の改変数、又は植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を維持する範囲におけるアミノ酸の改変数であり、通常、50アミノ酸以内、好ましくは30アミノ酸以内、さらに好ましくは10アミノ酸以内(例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内、2アミノ酸)である。 In the current state of the art, if a person skilled in the art obtains base sequence information such as sensitive DNA in a specific sensitive sorghum variety (for example, Na-type MS-3B), the base sequence is modified, Although the encoded amino acid sequence is different, it is also possible to obtain DNA that is also synthetically induced or sensitive. Also in nature, it is possible that the amino acid sequence of the encoded protein is mutated due to the mutation of the base sequence. Therefore, the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) of the tan protein in Na-type MS-3B. It also includes DNA that encodes a protein that induces 3-deoxyanthocyanidin synthesis or DNA that encodes a protein having an activity to confer susceptibility to pathogenic filamentous fungi on plants. The term “plurality” as used herein refers to the number of amino acid modifications within a range in which the modified tan protein can induce 3-deoxyanthocyanidin synthesis in the plant, or the range in which the activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to the plant is maintained. The number of amino acid modifications, usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 10 amino acids (eg, within 5 amino acids, within 3 amino acids, 2 amino acids).
さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の感受性ソルガム品種(例えば、那系MS-3B)から感受性型DNA等が得られた場合、その感受性型DNA等の塩基配列情報を利用して、他のソルガム品種や他の植物(例えば、イネ、トウモロコシ)から、同じく合成誘導型である相同遺伝子をコードするDNA又は感受性型である相同遺伝子をコードするDNAを取得することが可能である。従って、本発明は、那系MS-3BにおけるtanDNA(配列番号:1または2)とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであって、植物における3-デオキシアントシアニジン合成を誘導するタンパク質をコードするDNA又は植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNAをも含むものである。 Furthermore, in the current state of the art, if a person skilled in the art obtains sensitive DNA from a specific sensitive sorghum variety (for example, Na MS MS-3B), the base sequence information of the sensitive DNA, etc. It is possible to obtain DNA encoding a homologous gene that is also a synthetic induction type or a DNA encoding a homologous gene that is a sensitive type from other sorghum varieties and other plants (for example, rice, maize). It is. Accordingly, the present invention is a DNA that hybridizes under stringent conditions with tan DNA (SEQ ID NO: 1 or 2) in Na-type MS-3B, and encodes a protein that induces 3-deoxyanthocyanidin synthesis in plants. It also includes DNA or DNA encoding a protein having an activity to confer susceptibility to pathogenic filamentous fungi on plants.
こうして得られた変異DNAや相同DNAが、植物において3-デオキシアントシアニジン合成を誘導するタンパク質をコードするか否かは、例えば、これらDNAを導入した、病虫害を受けた部位が黄褐色を示すtan形質の品種に、病原性糸状菌を噴霧もしくは接種し、又は該品種の成葉にカッティングもしくはパンチを施し、その後、病原性糸状菌の感染部位、又は、カッティングもしくはパンチ部位が紫色を呈するか否かを検定することにより、判定することができる。(図1を参照のこと)。 Whether the mutant DNA or homologous DNA thus obtained encodes a protein that induces 3-deoxyanthocyanidin synthesis in plants, for example, the tan trait in which the sites affected by pests show a yellowish brown color. Whether or not the cultivar is sprayed or inoculated with pathogenic filamentous fungi, or adult leaves of the cultivar are subjected to cutting or punching, and then the infection site of the pathogenic filamentous fungus, or whether the cutting or punching site is purple Can be determined by testing. (See Figure 1).
また、こうして得られた変異DNAや相同DNAが、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば、これらDNAを導入した抵抗性品種に、病原性糸状菌を噴霧もしくは接種し、その後、感染症状を示すか否か、あるいは感染症状の程度を検定することにより、判定することができる。感染症状としては、例えば、病斑を形成することが挙げられる。また、非特許文献2に記載されているように、tan形質の品種に紋枯病菌を接種し、その後に発病した個体の割合(発病個体率)や病班高率を指標に判定することができる。なお、病班高率(RLH)は、例えば、個体別に葉鞘高(FH)と病班高(LH)とを測定し、「RLH(%)=LH/FH×100」の式で算出することによって得られる。 In addition, whether or not the mutant DNA or homologous DNA thus obtained encodes a protein having an activity that confers susceptibility to pathogenic filamentous fungi on plants, for example, to resistant cultivars introduced with these DNAs, It can be determined by spraying or inoculating a filamentous fungus and then examining whether or not it exhibits infection symptoms or the degree of infection symptoms. Examples of infectious symptoms include the formation of lesions. In addition, as described in Non-Patent Document 2, inoculation with blight fungus on tan traits varieties, and then using the ratio of diseased individuals (morbidity rate) and disease height rate as indicators Can do. Note that the lesion height ratio (RLH) is calculated by, for example, measuring the leaf sheath height (FH) and the lesion height (LH) for each individual and calculating the equation “RLH (%) = LH / FH × 100”. Obtained by.
本発明は、また、植物における3-デオキシアントシアニジン合成を抑制するタンパク質をコードするDNA(以下、「合成抑制型DNA」とも称する)を提供する。さらに、本発明は、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA(以下、「抵抗性型DNA」と称する)を提供する。本発明者らにより同定された、ソルガムの、tan形質を示し、すす紋病等に対する抵抗性品種である、Greenleaf由来のtan cDNAの塩基配列を配列番号:4に、tanゲノムDNAの塩基配列を配列番号:5に、これらDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号:6に示す。本発明の合成抑制型DNA又は抵抗性型DNA(以下、「抵抗性型DNA等」とも称する)の1つの態様は、配列番号:6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA(典型的には、配列番号:4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA)である。 The present invention also provides a DNA encoding a protein that suppresses 3-deoxyanthocyanidin synthesis in plants (hereinafter also referred to as “synthesis-inhibiting DNA”). Furthermore, the present invention provides a DNA encoding a protein having an activity to confer resistance to pathogenic filamentous fungi on plants (hereinafter referred to as “resistant DNA”). The base sequence of Greenleaf-derived tan cDNA, which shows the tan trait of sorghum identified by the present inventors and is a resistant cultivar against soot disease, is shown in SEQ ID NO: 4, and the base sequence of tan genomic DNA The amino acid sequence of the protein encoded by these DNAs is shown in SEQ ID NO: 6 in SEQ ID NO: 5. One embodiment of the synthesis-suppressing DNA or resistance-type DNA of the present invention (hereinafter also referred to as “resistance-type DNA”) is a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 (typically Is a DNA comprising the coding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 4 or 5.
本実施例において示されたように、Greenleaf由来のtan cDNAの塩基配列(配列番号:4)は、感受性品種那系MS-3B由来のtan cDNAの塩基配列(配列番号:1)と比較すると、755位と805位との塩基が相違する。このため、Greenleaf由来のtanタンパク質(配列番号:6)は、感受性品種那系MS3B由来のtanタンパク質(配列番号:3)と比較すると、C252YとI268Vの2つのアミノ酸置換が生じており(図5)、本来のtanタンパク質の機能が抑制されている。この機能の抑制が個体に3-デオキシアントシアニジン合成を抑制し、病原性糸状菌に対する抵抗性を付与していると考えられる。現在の技術水準においては、当業者であれば、特定の抵抗性ソルガム品種(例えば、Greenleaf)のtan DNAの塩基配列において、そのコードするタンパク質の3-デオキシアントシアニジン合成を抑制する機能、又は病原性糸状菌に対する抵抗性が維持されるような改変を行うことが可能である。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。従って、本発明は、Greenleafにおけるtanタンパク質のアミノ酸配列(配列番号:6)において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質からなり、植物における3-デオキシアントシアニジン合成を抑制するタンパク質をコードするDNA又は植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNAをも含むものである。ここで「複数」とは、改変後のtanタンパク質が、植物において3-デオキシアントシアニジン合成を抑制できる範囲におけるアミノ酸の改変数、又は植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有する範囲におけるアミノ酸の改変数である。ソルガムにおけるtanタンパク質が本来の機能を発揮しなければ、3-デオキシアントシアニジンの合成は抑制され、病原性糸状菌に対する抵抗性になると考えられるため、当該アミノ酸改変数は、本質的に制限はない。改変は、例えば、100アミノ酸以内、50アミノ酸以内、30アミノ酸以内(例えば、10アミノ酸以内、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内、2アミノ酸、1アミノ酸)である。 As shown in this Example, the base sequence of tan cDNA derived from Greenleaf (SEQ ID NO: 4) is compared with the base sequence of tan cDNA derived from sensitive cultivar MS-3B (SEQ ID NO: 1). The bases at positions 755 and 805 are different. Therefore, the Greenleaf-derived tan protein (SEQ ID NO: 6) has two amino acid substitutions, C252Y and I268V, compared to the tan protein derived from the sensitive cultivar MS3B (SEQ ID NO: 3) (FIG. 5). ) The function of the original tan protein is suppressed. It is considered that suppression of this function suppresses 3-deoxyanthocyanidin synthesis and imparts resistance to pathogenic filamentous fungi. In the current state of the art, those skilled in the art can suppress the 3-deoxyanthocyanidin synthesis of the protein encoded by the tan DNA base sequence of a specific resistant sorghum variety (for example, Greenleaf), or pathogenicity. Modifications can be made that maintain resistance to filamentous fungi. Also in nature, it is possible that the amino acid sequence of the encoded protein is mutated due to the mutation of the base sequence. Accordingly, the present invention comprises a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 6) of tan protein in Greenleaf. -DNA which codes the protein which suppresses deoxyanthocyanidin synthesis, or DNA which codes the protein which has the activity which provides the resistance with respect to a pathogenic filamentous fungus to a plant is also included. The term “plurality” as used herein means that the modified tan protein has a modified number of amino acids within the range that can suppress 3-deoxyanthocyanidin synthesis in the plant, or a range in which the plant has an activity to impart resistance to pathogenic filamentous fungi. The number of amino acid modifications. If the tan protein in sorghum does not exhibit its original function, the synthesis of 3-deoxyanthocyanidins is suppressed and resistance to pathogenic filamentous fungi is considered. Therefore, the number of amino acid modifications is essentially not limited. The modification is, for example, within 100 amino acids, within 50 amino acids, within 30 amino acids (eg, within 10 amino acids, within 5 amino acids, within 3 amino acids, 2 amino acids, 1 amino acid).
さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、特定のソルガム品種からtan DNAが得られた場合、そのDNAの塩基配列情報を利用して、他のソルガム品種や他の植物(例えば、イネ、トウモロコシ)から、合成抑制型又は抵抗性型である相同遺伝子をコードするDNAを取得することができる。従って、本発明は、Greenleafにおけるtan DNA(配列番号: 4または5)とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであって、植物における3-デオキシアントシアニジン合成を抑制するタンパク質をコードするDNA、又は植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNAが含まれる。 Further, in the current state of the art, if a person skilled in the art obtains tan DNA from a specific sorghum variety, using the nucleotide sequence information of the DNA, other sorghum varieties and other plants (for example, From rice and maize), DNA encoding a homologous gene that is a synthetic inhibitory type or a resistant type can be obtained. Accordingly, the present invention is a DNA that hybridizes with tan DNA (SEQ ID NO: 4 or 5) in Greenleaf under stringent conditions, and that encodes a protein that suppresses 3-deoxyanthocyanidin synthesis in a plant, or a plant DNA encoding a protein having an activity of imparting resistance to pathogenic filamentous fungi is included.
ソルガムのtan遺伝子に対応するイネの遺伝子としては、例えば、SALADデータベースにおけるOs04g0630300、Os04g0630400、Os04g0630600、Os04g0630800、Os04g0631000が挙げられ、ソルガムのtan遺伝子に対応するトウモロコシの遺伝子としては、例えば、GenBank
ACCESSION No. EU956420、EU966048が挙げられる。
The gene of rice which corresponds to tan gene sorghum, for example, Os04g0630300 in SALAD database, Os04g0630400, Os04g0630600, Os04g0630800, Os04g0631000. Examples of a gene for maize that correspond to the tan gene sorghum, e.g., GenBank
ACCESSION No. EU956420 and EU966048 are listed.
こうして得られた変異DNAや相同DNAが、植物における3-デオキシアントシアニジン合成を抑制するタンパク質をコードするか否かは、例えば、当該DNAで、病原性糸状菌に対する感受性品種のtan遺伝子を組換え、当該DNAをホモで保持する植物を作出し、病原性糸状菌を噴霧もしくは接種し、その後、感染症状を示すか否か、あるいは感染症状の程度を検定することにより、判定することができる。感染症状としては、例えば、感染部位において、3-デオキシアントシアニジンの合成が抑制されることにより、感染部位が黄褐色を呈することが挙げられる(図1を参照のこと)。または、当該DNAで、病原性糸状菌に対する感受性品種のtan遺伝子を組換え、当該DNAをホモで保持する植物を作出し、該品種の成葉にカッティングもしくはパンチを施し、その後、カッティングもしくはパンチ部位が黄褐色を呈するか否かを検定することにより、判定することができる。 Whether the mutant DNA or homologous DNA thus obtained encodes a protein that suppresses 3-deoxyanthocyanidin synthesis in plants is, for example, recombining the tan gene of a susceptible variety against pathogenic filamentous fungi, It can be determined by producing a plant that retains the DNA homozygously, spraying or inoculating with pathogenic filamentous fungi, and then examining whether or not it exhibits an infectious symptom or the degree of the infectious symptom. As an infectious symptom, for example, the site of infection exhibits yellowish brown color by suppressing the synthesis of 3-deoxyanthocyanidin at the site of infection (see FIG. 1). Alternatively, with the DNA, recombine the tan gene of a susceptible variety against pathogenic filamentous fungi, create a plant that retains the DNA homozygously, cut or punch the adult leaf of the variety, and then cut or punch the site It can be determined by testing whether or not the color of the material exhibits yellowish brown color.
また、こうして得られた変異DNAや相同DNAが、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有するタンパク質をコードするか否かは、例えば、当該DNAで、病原性糸状菌に対する感受性品種のtan遺伝子を組換え、当該DNAをホモで保持する植物を作出し、病原性糸状菌を噴霧もしくは接種し、その後、感染症状を示すか否か、あるいは感染症状の程度を検定することにより、判定することができる。感染症状としては、例えば、病斑の形成が挙げられる。また、非特許文献2に記載されているように、tan形質の品種に紋枯病菌を接種し、その後に発病した個体の割合(発病個体率)や病班高率を指標に判定することもできる。なお、病班高率(RLH)は、例えば、個体別に葉鞘高(FH)と病班高(LH)とを測定し、「RLH(%)=LH/FH×100」の式で算出することによって得られる。 In addition, whether the mutant DNA or homologous DNA thus obtained encodes a protein having an activity to confer resistance to pathogenic filamentous fungi on the plant, for example, whether the DNA is a cultivar susceptible to pathogenic filamentous fungi By recombining the tan gene, creating a plant that retains the DNA homozygously, spraying or inoculating pathogenic filamentous fungi, and then examining whether it exhibits infection symptoms or the degree of infection symptoms, Can be determined. Examples of infectious symptoms include the formation of lesions. In addition, as described in Non-Patent Document 2, inoculation with blight fungus on tan traits varieties, and then using the ratio of diseased individuals (morbidity rate) and disease height rate as indicators You can also. Note that the lesion height ratio (RLH) is calculated by, for example, measuring the leaf sheath height (FH) and the lesion height (LH) for each individual and calculating the equation “RLH (%) = LH / FH × 100”. Obtained by.
また、本発明の合成誘導型DNAは、その導入により、植物において3-デオキシアントシアニジン合成を誘導することが可能であるという意味において、植物における3-デオキシアントシアニジン合成を誘導するための薬剤である。一方、合成抑制型DNAは、その導入により、植物において3-デオキシアントシアニジン合成を抑制することが可能であるという意味において、植物における3-デオキシアントシアニジン合成を抑制するための薬剤である。 Further, the synthesis-inducing DNA of the present invention is a drug for inducing 3-deoxyanthocyanidin synthesis in plants in the sense that introduction thereof can induce 3-deoxyanthocyanidin synthesis in plants. On the other hand, synthesis-inhibited DNA is a drug for suppressing 3-deoxyanthocyanidin synthesis in plants in the sense that introduction thereof can suppress 3-deoxyanthocyanidin synthesis in plants.
さらに、本発明の感受性型DNAは、その導入により、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与することが可能であるという意味において、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与するための薬剤であり、一方、本発明の抵抗性型DNAは、その導入により、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与することが可能であるという意味において、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与するための薬剤である。 Furthermore, the sensitive DNA of the present invention is a drug for imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants in the sense that introduction thereof can impart susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants. On the other hand, the resistance-type DNA of the present invention is intended to impart resistance to pathogenic filamentous fungi to plants in the sense that introduction thereof can impart resistance to pathogenic filamentous fungi to plants. It is a drug.
なお、上記した変異DNAを作製するための、DNAへの人為的な変異の導入は、例えば、部位特異的変異誘発(site-directed mutagenesis)法(Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 154:350-367, 1987)により行うことができる。 In addition, artificial mutations introduced into DNA to produce the above-mentioned mutant DNA are, for example, site-directed mutagenesis method (Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol). 154: 350-367, 1987).
また、上記した相同遺伝子を単離するための方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション技術(Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, 98:503, 1975)やポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術(Saiki, R. K., et al. Science, 230:1350-1354, 1985、Saiki, R. K. et al. Science, 239:487-491, 1988)が挙げられる。相同遺伝子をコードするDNAを単離するためには、通常ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を例示できる。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用いれば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。単離されたDNAは、核酸レベルあるいはアミノ酸配列レベルにおいて、少なくとも50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上)の配列の同一性を有する。配列の相同性は、BLASTN(核酸レベル)やBLASTX(アミノ酸レベル)のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990)を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, 1993)に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore=100、wordlength=12とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore=50、wordlength=3とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。 Moreover, as a method for isolating the above-mentioned homologous gene, for example, hybridization technology (Southern, EM, Journal of Molecular Biology, 98: 503, 1975) or polymerase chain reaction (PCR) technology (Saiki, RK, et al. Science, 230: 1350-1354, 1985, Saiki, RK et al. Science, 239: 487-491, 1988). In order to isolate DNA encoding a homologous gene, a hybridization reaction is usually carried out under stringent conditions. Examples of stringent hybridization conditions include 6M urea, 0.4% SDS, 0.5xSSC conditions, or equivalent stringency hybridization conditions. Isolation of DNA with higher homology can be expected by using conditions with higher stringency, for example, 6M urea, 0.4% SDS, and 0.1xSSC. The isolated DNA is at least 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more) at the nucleic acid level or amino acid sequence level. ) Sequence identity. Sequence homology can be determined using BLASTN (nucleic acid level) and BLASTX (amino acid level) programs (Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). The program is based on the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993). Yes. When analyzing a base sequence by BLASTN, parameters are set to score = 100 and wordlength = 12, for example. When analyzing an amino acid sequence by BLASTX, parameters are set to, for example, score = 50 and wordlength = 3. When the amino acid sequence is analyzed using the Gapped BLAST program, it can be performed as described in Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known.
本発明のtanタンパク質をコードするDNAとしては、その形態に特に制限はなく、cDNAの他、ゲノムDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、ソルガムからゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー(ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BAC、PACなどが利用できる)を作製し、これを展開して、tan遺伝子(例えば、配列番号:1,2,4または5のいずれかに記載のDNA)の塩基配列を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、tan遺伝子に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行うことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、ソルガムから抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。 The DNA encoding the tan protein of the present invention is not particularly limited in its form, and includes cDNA, genomic DNA, and chemically synthesized DNA. Preparation of genomic DNA and cDNA can be performed by those skilled in the art using conventional means. For genomic DNA, for example, genomic DNA is extracted from sorghum to produce a genomic library (as vectors, plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc. can be used), expanded, and tan genes (for example, The DNA can be prepared by performing colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on the base sequence of DNA (SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5). It is also possible to prepare a primer specific for the tan gene and perform PCR using this primer. In addition, for example, cDNA is synthesized based on mRNA extracted from sorghum, inserted into a vector such as λZAP to create a cDNA library, developed, and colony hybridization as described above. Alternatively, it can be prepared by performing plaque hybridization or by performing PCR.
<感受性型tan遺伝子の発現を抑制するために用いるDNA>
また、本発明は、植物の感受性型tan遺伝子(感受性型DNA等)の発現を抑制するために用いるDNAを提供する。これらのDNAの導入により、植物における3-デオキシアントシアニジン合成を抑制し、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与することが可能である。この意味において、植物の感受性型tan遺伝子の発現を抑制するために用いるDNAは、植物における3-デオキシアントシアニジン合成を抑制するための薬剤であり、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与するための薬剤である。ここで「tan遺伝子の発現の抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制の双方が含まれる。また、「発現の抑制」には、発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
<DNA used to suppress the expression of sensitive tan genes>
The present invention also provides DNA used to suppress the expression of plant sensitive tan genes (such as sensitive DNA). By introducing these DNAs, it is possible to suppress the synthesis of 3-deoxyanthocyanidins in plants and to impart resistance to pathogenic filamentous fungi to plants. In this sense, the DNA used to suppress the expression of sensitive tan genes in plants is a drug for suppressing 3-deoxyanthocyanidin synthesis in plants, and imparts resistance to pathogenic filamentous fungi to plants. It is a drug. Here, “suppression of tan gene expression” includes both suppression of gene transcription and suppression of protein translation. Further, “suppression of expression” includes not only complete cessation of expression but also decrease of expression.
植物の感受性型tan遺伝子の発現を抑制するために用いるDNAの一つの態様は、上記した本発明の感受性型DNA等の転写産物と相補的なdsRNA(二重鎖RNA)をコードするDNAである。標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するdsRNAを細胞内に導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内因性遺伝子の発現がいずれも抑制される、RNAi(RNA干渉、RNA interference)と呼ばれる現象を引き起こすことができる。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼが、ATP存在下で、dsRNAを3'末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA(short interference RNA)が生じる。このsiRNAに、特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体(RISC:RNA-induced silencing complex)が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子の転写産物(mRNA)を切断する。また、この経路とは別にsiRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RsRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びダイサーの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。 One embodiment of the DNA used to suppress the expression of the sensitive tan gene in plants is a DNA encoding a dsRNA (double-stranded RNA) complementary to the transcription product of the above-described sensitive DNA of the present invention. . A phenomenon called RNAi (RNA interference), in which the expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene is both suppressed by introducing dsRNA having the same or similar sequence to the target gene into the cell. Can cause. When dsRNA of about 40 to several hundred base pairs is introduced into a cell, an RNase III-like nuclease called Dicer having a helicase domain is converted to about 21 to 23 base pairs from the 3 ′ end in the presence of ATP. Each one is cut out to generate siRNA (short interference RNA). A specific protein binds to this siRNA to form a nuclease complex (RISC: RNA-induced silencing complex). This complex recognizes and binds to the same sequence as siRNA, and cleaves the transcript (mRNA) of the target gene at the center of the siRNA by RNaseIII-like enzyme activity. In addition to this pathway, the antisense strand of siRNA binds to mRNA and acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RsRP) to synthesize dsRNA. There is also a possibility that this dsRNA becomes Dicer's substrate again to generate new siRNA and amplify the action.
本発明のdsRNAをコードするDNAは、標的遺伝子の転写産物(mRNA)のいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスDNAと、該mRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスDNAを含み、該アンチセンスDNAおよび該センスDNAより、それぞれアンチセンスRNAおよびセンスRNAを発現させることができる。また、これらのアンチセンスRNAおよびセンスRNAよりdsRNAを作成することができる。 The DNA encoding the dsRNA of the present invention includes an antisense DNA encoding an antisense RNA for any region of a target gene transcription product (mRNA), and a sense DNA encoding a sense RNA for any region of the mRNA And antisense RNA and sense RNA can be expressed from the antisense DNA and the sense DNA, respectively. Moreover, dsRNA can be produced from these antisense RNA and sense RNA.
本発明のdsRNAの発現システムをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNAおよびセンスRNAを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNAとセンスRNAを発現させる場合がある。同一のベクターからアンチセンスRNAおよびセンスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスDNAおよびセンスDNAの上流にそれぞれpol
III系のような短いRNAを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスRNA発現カセットとセンスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入する構成である。
In the case where the dsRNA expression system of the present invention is held in a vector or the like, there are a case where antisense RNA and sense RNA are expressed from the same vector, and a case where antisense RNA and sense RNA are expressed from different vectors, respectively. is there. As a configuration for expressing antisense RNA and sense RNA from the same vector, for example, pol upstream of antisense DNA and sense DNA, respectively.
In this configuration, an antisense RNA expression cassette and a sense RNA expression cassette linked with a promoter capable of expressing a short RNA such as the III system are constructed, and these cassettes are inserted into the vector in the same direction or in the opposite direction.
また、異なる鎖上に対向するように、アンチセンスDNAとセンスDNAとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA(siRNAコードDNA)が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNAとセンスRNAとを発現し得るようにプロモーターを対向して備える。この場合には、センスRNAとアンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖(アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖)の3'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A(アデニン)塩基を4つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類は異なっていることが好ましい。 It is also possible to construct an expression system in which antisense DNA and sense DNA are arranged in opposite directions so as to face each other on different strands. In this configuration, one double-stranded DNA (siRNA-encoding DNA) in which an antisense RNA coding strand and a sense RNA coding strand are paired is provided, and antisense RNA and sense RNA are separated from each strand on both sides. A promoter is provided oppositely so that it can be expressed. In this case, in order to avoid adding extra sequences downstream of the sense RNA and antisense RNA, a terminator is added to the 3 'end of each strand (antisense RNA coding strand, sense RNA coding strand). It is preferable to provide. As this terminator, a sequence in which four or more A (adenine) bases are continued can be used. Further, in this palindromic style expression system, the two promoter types are preferably different.
また、異なるベクターからアンチセンスRNAおよびセンスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスDNAおよびセンスDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスRNA発現カセットとセンスRNA発現カセットとをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させる構成である。 In addition, as a configuration for expressing antisense RNA and sense RNA from different vectors, for example, antisense RNA expression in which a promoter capable of expressing a short RNA such as polIII is linked upstream of antisense DNA and sense DNA, respectively. A cassette and a sense RNA expression cassette are constructed, and these cassettes are held in different vectors.
本発明に用いるdsRNAとしては、siRNAが好ましい。「siRNA」は、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖RNAを意味する。標的tan遺伝子の発現を抑制することができ、かつ、毒性を示さなければ、その鎖長に特に制限はない。dsRNAの鎖長は、例えば、15〜49塩基対であり、好適には15〜35塩基対でり、さらに好適には21〜30塩基対である。 The dsRNA used in the present invention is preferably siRNA. “SiRNA” means a double-stranded RNA consisting of short strands in a range that is not toxic in cells. The chain length is not particularly limited as long as the expression of the target tan gene can be suppressed and it does not show toxicity. The dsRNA has a chain length of, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, and more preferably 21 to 30 base pairs.
本発明のdsRNAをコードするDNAとしては、標的配列のインバーテッドリピートの間に適当な配列(イントロン配列が望ましい)を挿入し、ヘアピン構造を持つダブルストランドRNA(self-complementary 'hairpin' RNA(hpRNA))を作るようなコンストラクト(Smith, N.A., et al. Nature, 407:319, 2000、Wesley, S. V. et al. Plant J. 27:581, 2001、Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29:E55, 2001)を用いることもできる。 As the DNA encoding the dsRNA of the present invention, an appropriate sequence (preferably an intron sequence) is inserted between inverted repeats of the target sequence, and a double-stranded RNA having a hairpin structure (self-complementary 'hairpin' RNA (hpRNA )) (Smith, NA, et al. Nature, 407: 319, 2000, Wesley, SV et al. Plant J. 27: 581, 2001, Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29 : E55, 2001) can also be used.
本発明のdsRNAをコードするDNAは、標的tan遺伝子の塩基配列と完全に同一である必要はないが、少なくとも70%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上(例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上)の配列の同一性を有する。配列の同一性は上述した手法(BLASTプログラム)により決定できる。 The DNA encoding the dsRNA of the present invention need not be completely identical to the base sequence of the target tan gene, but is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more). Sequence identity can be determined by the technique described above (BLAST program).
dsRNAにおけるRNA同士が対合した二重鎖RNAの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ(対応する塩基が相補的でない)、バルジ(一方の鎖に対応する塩基がない)などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においては、dsRNAにおけるRNA同士が対合する二重鎖RNA領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。 The part of the double-stranded RNA in which the RNAs in dsRNA are paired is not limited to a perfect pair, but mismatch (corresponding base is not complementary), bulge (no base corresponding to one strand) ) Or the like may include an unpaired portion. In the present invention, both bulges and mismatches may be included in the double-stranded RNA region where RNAs in dsRNA pair with each other.
植物の感受性型tan遺伝子の発現を抑制するために用いるDNAの他の態様は、上記した本発明の感受性型DNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA(アンチセンスDNA)である。アンチセンスDNAが標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などが挙げられる。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人, pp.319-347, 1993)。本発明で用いられるアンチセンスDNAは、上記のいずれの作用で標的tan遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、標的遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。 Another embodiment of the DNA used to suppress the expression of the sensitive tan gene in plants is a DNA (antisense DNA) encoding an antisense RNA complementary to the above-mentioned sensitive DNA transcription product of the present invention. . Antisense DNA suppresses target gene expression by inhibiting transcription initiation by triplex formation, suppressing transcription by hybridization with a site where an open loop structure is locally created by RNA polymerase, Inhibition of transcription by hybridization with certain RNA, suppression of splicing by hybridization at the junction of intron and exon, suppression of splicing by hybridization with spliceosome formation site, suppression of transition from nucleus to cytoplasm by hybridization with mRNA , Splicing suppression by hybridization with capping site and poly (A) addition site, translation initiation suppression by hybridization with translation initiation factor binding site, translation suppression by hybridization with ribosome binding site near initiation codon, translation of mRNA Area or poly Outgrowth inhibitory peptide chains by the formation of a hybrid with over arm binding sites, and the like gene silencing and the like by hybridization with interaction site between a nucleic acid and protein. They inhibit transcription, splicing, or translation processes and suppress target gene expression (Hirashima and Inoue, "Neurochemistry Experiment Course 2, Nucleic Acid IV Gene Replication and Expression", edited by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin , pp.319-347, 1993). The antisense DNA used in the present invention may suppress the expression of the target tan gene by any of the actions described above. In one embodiment, if an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 ′ end of the mRNA of the target gene is designed, it will be effective for inhibiting translation of the gene. However, sequences complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used. As described above, a DNA containing an antisense sequence of a non-translated region as well as a translated region of a gene is also included in the antisense DNA used in the present invention. The antisense DNA to be used is linked downstream of a suitable promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is linked on the 3 ′ side.
アンチセンスDNAは、本発明の感受性型DNA(例えば、配列番号:1に記載の塩基配列からなるDNA)の配列情報を基にホスホロチオネート法(Stein, Nucleic Acids Res., 16:3209-3221, 1988)などにより調製することが可能である。調製されたDNAは、後述する公知の方法で、植物へ導入できる。アンチセンスDNAの配列は、植物が持つ内因性の感受性tan遺伝子の転写産物と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上(例えば、95%、96%、97%、98%、99%以上)の相補性を有する。効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。 Antisense DNA is a phosphorothioate method (Stein, Nucleic Acids Res., 16: 3209-) based on the sequence information of the sensitive DNA of the present invention (for example, the DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1). 3221, 1988). The prepared DNA can be introduced into plants by a known method described later. The sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the endogenous sensitive tan gene transcript of the plant, but may not be completely complementary as long as the gene expression can be effectively inhibited. . The transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more) to the transcript of the target gene. In order to effectively inhibit the expression of the target gene, the length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, more preferably 500 bases or more. Usually, the length of the antisense DNA used is shorter than 5 kb, preferably shorter than 2.5 kb.
植物の感受性型tan遺伝子の発現を抑制するために用いるDNAの他の態様は、本発明の感受性型DNA等の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNAである。リボザイムには、グループIイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素, 35:2191, 1990)。 Another embodiment of the DNA used for suppressing the expression of the sensitive tan gene in plants is a DNA encoding an RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves a transcript such as the sensitive DNA of the present invention. Some ribozymes have a group I intron type and a size of 400 nucleotides or more like M1RNA contained in RNaseP, but some have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type ( Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzymes, 35: 2191, 1990).
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が9位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にAまたはUでも切断されることが示されている(Koizumi et. al., FEBS Lett. 228:225, 1988)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(Koizumi et. al., FEBS Lett. 239:285, 1988、小泉誠および大塚栄子,蛋白質核酸酵素,35:2191, 1990、Koizumi et. al., Nucleic. Acids. Res. 17:7059, 1989)。 For example, the self-cleaving domain of hammerhead ribozyme cleaves 3 ′ of C15 of G13U14C15, but it is important for U14 to form a base pair with A at position 9, and the base at position 15 is In addition to C, it has been shown to be cleaved by A or U (Koizumi et. Al., FEBS Lett. 228: 225, 1988). If the ribozyme substrate binding site is designed to be complementary to the RNA sequence near the target site, it is possible to create a restriction enzyme-like RNA-cleaving ribozyme that recognizes the UC, UU, or UA sequence in the target RNA. (Koizumi et.al., FEBS Lett. 239: 285, 1988, Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein Nucleic Acid Enzyme, 35: 2191, 1990, Koizumi et.al., Nucleic. Acids. Res. 17: 7059, 1989).
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(Buzayan, Nature 323:349, 1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19:6751, 1992、菊池洋,化学と生物 30:112, 1992)。標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186:1271, 1992)。このようなリボザイムを用いて標的となるtan遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。 Hairpin ribozymes are also useful for the purposes of the present invention. Hairpin ribozymes are found, for example, in the minus strand of satellite RNA of tobacco ring spot virus (Buzayan, Nature 323: 349, 1986). It has been shown that this ribozyme can also be designed to cause target-specific RNA cleavage (Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res. 19: 6751, 1992, Hiroshi Kikuchi, Chemistry and Biology 30: 112, 1992). A ribozyme designed to cleave the target is linked to a promoter such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter and a transcription termination sequence so that it is transcribed in plant cells. Such structural units can be arranged in tandem so that multiple sites in the target gene can be cleaved to further increase the effect (Yuyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186: 1271, 1992 ). Using such a ribozyme, the transcription product of the target tan gene can be specifically cleaved to suppress the expression of the gene.
<ベクター、形質転換植物細胞、形質転換植物体>
本発明は、また、上記本発明のDNA(合成誘導型DNA、合成抑制型DNA、感受性型DNA、抵抗性型DNA、感受性型tan遺伝子の発現を抑制するためのDNA)を含むベクター、上記本発明のDNAまたはそれを含むベクターが導入された植物細胞(例えば、ソルガム細胞、イネ細胞、トウモロコシ細胞)、該植物細胞を含む植物体(例えば、ソルガム、イネ、トウモロコシ)、該植物体の子孫またはクローンである植物体、および、これら植物体の繁殖材料を提供する。
<Vector, transformed plant cell, transformed plant body>
The present invention also provides a vector comprising the above-described DNA of the present invention (synthesis-inducing DNA, synthesis-suppressing DNA, sensitive DNA, resistant DNA, DNA for suppressing the expression of sensitive tan gene), Plant cells (for example, sorghum cells, rice cells, corn cells) into which the DNA of the invention or a vector containing the same has been introduced, plants (for example, sorghum, rice, corn) containing the plant cells, progeny of the plants or Provided are plants that are clones, and propagation materials for these plants.
本発明のベクターとしては、例えば、自律複製可能なベクターまたは染色体中に相同組換え可能なベクターを使用することができる。本発明のベクターは、植物細胞に導入した後、本発明のDNAが発現するように、通常、適当な発現プロモーターを含む。本発明に用いるプロモーターとして、例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来の35Sプロモーター、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーターを挙げることができる。ベクターは、選択マーカー、複製開始点、ターミネーター、ポリリンカー、エンハンサー、リボゾーム結合部位などを適宜含むことができる。一般に、該プロモーターの下流に、本発明のDNAが位置し、さらに該DNAの下流にはターミネーターが位置する。ターミネーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーターやノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーターを挙げることができる。 As the vector of the present invention, for example, an autonomously replicable vector or a vector capable of homologous recombination in a chromosome can be used. The vector of the present invention usually contains a suitable expression promoter so that the DNA of the present invention is expressed after introduction into a plant cell. Examples of promoters used in the present invention include cauliflower mosaic virus-derived 35S promoter and corn-derived ubiquitin promoter. The vector can appropriately include a selection marker, a replication origin, a terminator, a polylinker, an enhancer, a ribosome binding site, and the like. In general, the DNA of the present invention is located downstream of the promoter, and a terminator is located downstream of the DNA. Examples of the terminator include a terminator derived from a cauliflower mosaic virus and a terminator derived from a nopaline synthase gene.
上記ベクターを導入する植物細胞の形態としては、特に制限はなく、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルス、未熟胚、花粉などを例示することができる。上記ベクターを植物細胞中に導入し、植物体を再生させる方法としては、当該技術分野における常法を用いることができる。 The form of the plant cell into which the vector is introduced is not particularly limited, and examples thereof include suspension culture cells, protoplasts, leaf sections, callus, immature embryos, pollen and the like. As a method for introducing the vector into a plant cell and regenerating the plant body, a conventional method in this technical field can be used.
ソルガムにおいては、例えば、アグロバクテリウム法やパーティクルガン法により、未熟胚やカルスに遺伝子導入して植物体を再生させる方法、超音波によって遺伝子導入した花粉を用いて受粉する方法が好適に用いられる(J. A. Able et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 37:341-348, 2001、A. M. Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11212-11216, 1993、V. Girijashankar et al., Plant Cell Rep 24:513-522, 2005、J. M. JEOUNG et al., Hereditas 137:20-28, 2002、V Girijashankar et al., Plant Cell Rep 24(9):513-522, 2005、Zuo-yu Zhao et al., Plant Molecular Biology 44:789-798, 2000、S. Gurel et al., Plant Cell Rep 28(3):429-444, 2009、ZY Zhao, Methods Mol Biol, 343:233-244, 2006、AK Shrawat and H Lorz, Plant Biotechnol J, 4(6):575-603, 2006、D Syamala and P Devi Indian J Exp Biol, 41(12):1482-1486, 2003、Z Gao et al., Plant Biotechnol J, 3(6):591-599, 2005)。 In sorghum, for example, a method of regenerating plants by introducing genes into immature embryos or callus by the Agrobacterium method or particle gun method, and a method of pollination using pollen that has been gene-transferred by ultrasound are preferably used. (JA Able et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 37: 341-348, 2001, AM Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212-11216, 1993, V. Girijashankar et al., Plant Cell Rep 24: 513-522, 2005, JM JEOUNG et al., Hereditas 137: 20-28, 2002, V Girijashankar et al., Plant Cell Rep 24 (9): 513-522, 2005, Zuo -yu Zhao et al., Plant Molecular Biology 44: 789-798, 2000, S. Gurel et al., Plant Cell Rep 28 (3): 429-444, 2009, ZY Zhao, Methods Mol Biol, 343: 233- 244, 2006, AK Shrawat and H Lorz, Plant Biotechnol J, 4 (6): 575-603, 2006, D Syamala and P Devi Indian J Exp Biol, 41 (12): 1482-1486, 2003, Z Gao et al . Plant Biotechnol J, 3 (6): 591-599, 2005).
イネにおいては、例えば、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法(Datta,S.K. In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.)pp66−74,1995)、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体を再生させる方法(Toki et al. Plant Physiol.100,1503−1507,1992)、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法(Christou et al. Bio/technology,9:957−962,1991)およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法(Hiei et al. Plant J.6:271−282,1994)など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。 In rice, for example, gene transfer to protoplasts using polyethylene glycol to regenerate plants (Datta, SK In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spanenberg Eds.) Pp 66-74, 1995), electric pulse A method of introducing a gene into a protoplast by regenerating a plant body (Toki et al. Plant Physiol. 100, 1503-1507, 1992), a method of directly introducing a gene into a cell by a particle gun method and regenerating a plant body (Christou) et al., Bio / technology, 9: 957-962, 1991) and Agrobacterium-mediated methods for regenerating plants (H . Ei et al Plant J.6: 271-282,1994), etc. Several techniques already established and widely used in the technical field of the present invention.
トウモロコシにおいては、例えば、Shillitoら(Bio/Technology, 7: 581, 1989)に記載された方法やGorden-Kammら(Plant Cell 2: 603, 1990)に記載された方法が挙げられる。 Examples of corn include the method described in Shillito et al. (Bio / Technology, 7: 581, 1989) and the method described in Gorden-Kamm et al. (Plant Cell 2: 603, 1990).
上記本発明のDNAは、外因性のDNAとして植物に導入することができるが、本発明のDNAを有する品種との交配によって植物に導入することもできる。本発明における「導入」には、これら双方の形態が含まれる。 The above DNA of the present invention can be introduced into a plant as exogenous DNA, but can also be introduced into a plant by crossing with a variety having the DNA of the present invention. “Introduction” in the present invention includes both forms.
一旦、染色体内に上記本発明のDNAが導入された植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料(例えば、カルス、プロトプラスト、花粉、種子、切穂等)を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、上記本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、ならびに該植物体、その子孫およびクローンの繁殖材料が含まれる。 Once a plant body in which the DNA of the present invention is introduced into the chromosome is obtained, offspring can be obtained from the plant body by sexual reproduction or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (for example, callus, protoplast, pollen, seed, cut ear, etc.) from the plant body, its progeny or clone, and mass-produce the plant body based on them. The present invention includes a plant cell into which the DNA of the present invention is introduced, a plant containing the cell, a progeny and clone of the plant, and a propagation material for the plant, its progeny and clone.
本発明の感受性型DNAが導入された植物体は、例えば、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与するための薬剤の開発(スクリーニング)や病原性糸状菌に対する感受性発症の機構の解明のための実験用植物として利用することができる。一方、本発明の抵抗性型DNAまたは本発明の感受性型tan遺伝子の発現を抑制するためのDNAが導入された植物体は、これらDNAが導入されていない感受性の植物体と比較して、その収量の増大が期待でき、より有用性の高い農作物あるいはバイオマスとして利用することができる。 Plants into which the sensitive DNA of the present invention has been introduced can be used, for example, for the development (screening) of drugs to confer resistance to pathogenic filamentous fungi on plants and for the elucidation of the mechanism of onset of susceptibility to pathogenic filamentous fungi. It can be used as an experimental plant. On the other hand, the plant into which the resistance type DNA of the present invention or the DNA for suppressing the expression of the sensitive type tan gene of the present invention is introduced is compared with the sensitive plant body into which these DNAs are not introduced. Increase in yield can be expected, and it can be used as a more useful crop or biomass.
<病原性糸状菌に対する抵抗性が付与された植物の作出方法>
本発明は、また、植物において、本発明の感受性型DNA(感受性型tan遺伝子)の発現または機能を抑制することを特徴とする、病原性糸状菌に対する抵抗性が付与された植物の作出方法を提供する。本発明において、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を「付与する」とは、病原性糸状菌に対する抵抗性を全く有しない品種に病原性糸状菌に対する抵抗性を持たせることのみならず、既に、一定の病原性糸状菌に対する抵抗性を有している品種における、病原性糸状菌に対する抵抗性を、さらに増大させることをも含む意である。
<Method for producing a plant with resistance to pathogenic filamentous fungi>
The present invention also provides a method for producing a plant imparted with resistance to pathogenic filamentous fungi, characterized by suppressing the expression or function of the sensitive DNA (sensitive tan gene) of the present invention in the plant. provide. In the present invention, “to impart” resistance to pathogenic filamentous fungi to plants is not only to give resistance to pathogenic filamentous fungi to varieties that have no resistance to pathogenic filamentous fungi. It is intended to include further increasing the resistance to pathogenic filamentous fungi in varieties having resistance to certain pathogenic filamentous fungi.
植物における本発明の感受性型DNAの発現または機能を抑制するための一つの態様は、植物に、上記本発明の抵抗性型DNAを導入することである。植物における病原性糸状菌に対する抵抗性は、単一劣性遺伝子支配であるため、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性の形質を付与するためには、通常、個体におけるtan対立遺伝子の双方を抵抗性型DNAにする必要がある。これにより個体中で抵抗性型DNAのみが発現し、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与することができる。植物染色体への本発明の抵抗性型DNAの導入は、例えば、交配や相同組換えにより行うことができる。抵抗性型DNAを導入することに代えて、植物染色体上の感受性型DNAに、特定のDNA配列を導入し、その機能を破壊してもよい。 One embodiment for suppressing the expression or function of the sensitive DNA of the present invention in a plant is to introduce the above-described resistant DNA of the present invention into the plant. Because resistance to pathogenic filamentous fungi in plants is dominated by a single recessive gene, in order to confer a trait of resistance to pathogenic filamentous fungi on plants, it is usually resistant to both tan alleles in individuals It needs to be a type DNA. As a result, only resistant DNA is expressed in the individual, and the plant can be given resistance to pathogenic filamentous fungi. Introduction of the resistant DNA of the present invention into a plant chromosome can be performed by, for example, mating or homologous recombination. Instead of introducing resistant DNA, a specific DNA sequence may be introduced into sensitive DNA on plant chromosomes to destroy its function.
植物における本発明の感受性型DNAの発現または機能を抑制するための他の一つの態様は、植物に上記本発明のtan遺伝子の発現を抑制するためのDNAを導入することである。これにより個体中の感受性型DNAから、感受性型の翻訳産物が生産されなくなるため、植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与することができる。 Another embodiment for suppressing the expression or function of the sensitive DNA of the present invention in a plant is to introduce the DNA for suppressing the expression of the tan gene of the present invention into the plant. As a result, no sensitive translation product is produced from the sensitive DNA in the individual, so that resistance to pathogenic filamentous fungi can be imparted to the plant.
植物における本発明の感受性型DNAの発現または機能を抑制するための他の態様としては、例えば、感受性型DNAの発現を抑制する薬剤や感受性型の翻訳産物に結合し、その機能を抑制する薬剤の利用も考えられる。 Other embodiments for suppressing the expression or function of the sensitive DNA of the present invention in plants include, for example, a drug that suppresses the expression of sensitive DNA or a drug that binds to a sensitive translation product and suppresses its function. The use of is also considered.
<植物における病原性糸状菌に対する感受性または抵抗性を判定する方法>
本発明は、また、植物における病原性糸状菌に対する感受性または抵抗性を判定する方法を提供する。本発明の判定方法の一つの態様は、植物におけるtan遺伝子の塩基配列を解析し、対照の塩基配列と比較することを特徴とする方法である。
<Method for determining sensitivity or resistance to pathogenic filamentous fungi in plants>
The present invention also provides a method for determining susceptibility or resistance to pathogenic filamentous fungi in plants. One embodiment of the determination method of the present invention is a method characterized by analyzing a base sequence of a tan gene in a plant and comparing it with a base sequence of a control.
tan遺伝子の塩基配列の解析に際しては、tan遺伝子をPCRにより増幅した増幅産物を用いることができる。前記PCRを実施する場合において、用いられるプライマーは、tan遺伝子を特異的に増幅できるものである限り制限はなく、tan遺伝子の配列情報(例えば、配列番号:1,2,4または5)に基づいて適宜設計することができる。好適なプライマーとしては、後述の表2に記載の、配列番号:17、18、25または26に記載の塩基配列からなるプライマーが挙げられる。これらプライマーを適宜組み合わせて、tan遺伝子の特定の塩基配列を増幅することができる。 In analyzing the base sequence of the tan gene, an amplification product obtained by amplifying the tan gene by PCR can be used. In case of carrying out the PCR, primers used are limited as long as it can specifically amplify the tan gene is no sequence information of tan gene (e.g., SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5) based on Can be designed as appropriate. A suitable primer includes a primer having the base sequence described in SEQ ID NO: 17, 18, 25 or 26 described in Table 2 below. A specific base sequence of the tan gene can be amplified by appropriately combining these primers.
被検植物におけるtan遺伝子の塩基配列と比較する「対照の塩基配列」は、典型的には、感受性型品種または抵抗性型品種におけるtan遺伝子の塩基配列である。決定したtan遺伝子の塩基配列と感受性型品種における塩基配列(例えば、配列番号:1,2)または抵抗性型品種における塩基配列(例えば、配列番号:4,5)とを比較することにより、被検植物におけるtan遺伝子が、抵抗性型であるか感受性型であるかを評価することができる。例えば、感受性型品種における塩基配列(例えば、配列番号:1,2)と比較して、蛋白質の機能を消失させる変異(例えば、ソルガムにおいては、C252Y、I268V)が存在する場合、被検植物におけるtan遺伝子は抵抗性型である蓋然性が高いと判定される。 The “control nucleotide sequence” to be compared with the nucleotide sequence of the tan gene in the test plant is typically the nucleotide sequence of the tan gene in the sensitive or resistant variety. By comparing the determined nucleotide sequence of the tan gene with the nucleotide sequence of the susceptible variety (for example, SEQ ID NO: 1, 2) or the resistant sequence (for example, SEQ ID NO: 4, 5), It can be evaluated whether the tan gene in the plant test is resistant or sensitive. For example, when there is a mutation (for example, C252Y, I268V in sorghum) that loses the function of the protein compared to the base sequence (eg, SEQ ID NO: 1, 2) in the sensitive variety, The tan gene is determined to have a high probability of being resistant.
被検植物におけるtan遺伝子の塩基配列が、対照の塩基配列と相違するか否かは、上記した直接的な塩基配列の決定以外に、種々の方法により間接的に解析することができる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造多型)法、制限酵素断片長多型(Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP)を利用したRFLP法やPCR-RFLP法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(denaturant gradient gel electrophoresis:DGGE)、アレル特異的オリゴヌクレオチド(Allele Specific Oligonucleotide/ASO)ハイブリダイゼーション法、リボヌクレアーゼAミスマッチ切断法が挙げられる。 Whether or not the base sequence of the tan gene in the test plant is different from the base sequence of the control can be indirectly analyzed by various methods other than the determination of the direct base sequence described above. Examples of such methods include PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) method, RFLP method using restriction fragment length polymorphism (RFLP), Examples include PCR-RFLP, denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE), allele specific oligonucleotide (ASO) hybridization, and ribonuclease A mismatch cleavage.
なお、本発明の判定方法における、被検植物からのDNAの調製は、常法、例えば、CTAB法を用いて行うことができる。DNAを調製するための植物としては、成長した植物体のみならず、植物の種子や幼植物体を用いることもできる。 In the determination method of the present invention, DNA from a test plant can be prepared using a conventional method, for example, the CTAB method. As a plant for preparing DNA, not only a grown plant body but also a plant seed or a young plant body can be used.
また、塩基配列の決定は、常法、例えば、ジデオキシ法やマキサム-ギルバート法などにより行なうことができる。塩基配列の決定においては、市販のシークエンスキットおよびシークエンサーを利用することができる。 The base sequence can be determined by a conventional method such as the dideoxy method or the Maxam-Gilbert method. In determining the base sequence, a commercially available sequence kit and sequencer can be used.
本発明の判定方法の他の一つの態様は、植物におけるtan遺伝子の発現または発現産物の分子量を検出することを特徴とする方法である。ここで「遺伝子の発現の検出」には、転写レベルにおける検出および翻訳レベルにおける検出の双方を含む意である。また、「発現の検出」には、発現の有無の検出のみならず、発現の程度の検出も含む意である。 Another embodiment of the determination method of the present invention is a method characterized by detecting the expression of a tan gene in a plant or the molecular weight of an expression product. Here, “detection of gene expression” includes both detection at the transcription level and detection at the translation level. In addition, “detection of expression” is intended to include not only detection of the presence or absence of expression but also detection of the degree of expression.
転写レベルにおける検出は、常法、例えば、RT-PCR(Reverse transcribed-Polymerase chain reaction)法やノーザンブロッティング法により実施することができる。前記PCRを実施する場合において用いられるプライマーは、tan遺伝子を特異的に増幅できるものである限り制限はなく、tan遺伝子の配列情報(例えば、配列番号:1,2,4または5)に基づいて適宜設計することができる。プライマーの好適な例は、上記表2に記載の、配列番号:17に記載の塩基配列からなるプライマーと配列番号:18に記載の塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである。 Detection at the transcription level can be carried out by a conventional method such as RT-PCR (Reverse transcribed-Polymerase chain reaction) or Northern blotting. Primers used in the case of carrying out the PCR are limited as long as it can specifically amplify the tan gene is no sequence information of tan gene (e.g., SEQ ID NO: 1, 2, 4 or 5) on the basis It can be designed as appropriate. A preferred example of the primer is a combination of the primer consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 17 and the primer consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 18 described in Table 2 above.
一方、翻訳レベルにおける検出は、常法、例えば、ウェスタンブロッティング法により、実施することができる。ウェスタンブロッティングに用いる抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、これら抗体の調製方法は、当業者に周知である。 On the other hand, detection at the translation level can be performed by a conventional method, for example, Western blotting. The antibody used for Western blotting may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and methods for preparing these antibodies are well known to those skilled in the art.
遺伝子発現の検出の結果、被検体において、感受性型tan遺伝子の発現量が感受性品種(例えば、ソルガムにおいては那系MS-3B)の発現量よりも有意に低ければ、また、感受性型tan遺伝子の発現産物の分子量が感受性品種(例えば、ソルガムにおいては那系MS-3B)における分子量と有意に異なれば、感受性型tan遺伝子の機能の発現が抑制されると考えられる。従って、この場合には、被検植物が病原性糸状菌に対する抵抗性を有する蓋然性が高いと判定される。 Result of the detection of gene expression in a subject, susceptible type tan gene expression level sensitive variety (e.g.,那系MS-3B in sorghum) if significantly lower than the expression level of, also, of susceptibility type tan gene If the molecular weight of the expression product is significantly different from the molecular weight in a sensitive variety (for example, Na-type MS-3B in sorghum), it is considered that the expression of the function of the sensitive tan gene is suppressed. Therefore, in this case, it is determined that the test plant has a high probability of having resistance to pathogenic filamentous fungi.
本発明の判定方法の他の一つの態様は、被検植物における、tan遺伝子と連鎖する分子マーカーの塩基配列を解析し、対照の塩基配列と比較することを特徴とする方法である。ここで「分子マーカー」とは、tan遺伝子と遺伝的に連鎖するDNA領域であって、他のDNA領域と識別可能なDNA領域をいう。分子マーカーは、tan遺伝子の近傍に位置する程、tan遺伝子と同時に遺伝しやすいため、本発明の判定方法において有用性が高い。有用性の高い本発明の分子マーカーは、通常、tan遺伝子のコード領域の両末端塩基から50kbp以内に存在するものであり、より好ましくは20kbp以内、さらに好ましくは10kbp以内に存在するものである。 Another embodiment of the determination method of the present invention is a method characterized by analyzing a base sequence of a molecular marker linked to a tan gene in a test plant and comparing it with a base sequence of a control. Here, the “molecular marker” refers to a DNA region that is genetically linked to the tan gene and can be distinguished from other DNA regions. Molecular markers, as located in the vicinity of the tan gene, for simultaneously easy genetic and tan gene, is highly useful in the determination method of the present invention. The highly useful molecular marker of the present invention is usually present within 50 kbp, more preferably within 20 kbp, and even more preferably within 10 kbp from both terminal bases of the coding region of the tan gene.
本発明の分子マーカーの好ましい態様は、挿入・欠失マーカー、SSR(単純反復配列)マーカー、CAPS(増幅切断多型)マーカーおよびSNP(一塩基多型)マーカーである。挿入・欠失マーカーは、塩基の挿入および/または欠失によって生じるDNA多型である。SSRマーカーは、2あるいは3塩基の単位(例えば、「CA」、「CG」、「TA」、「TC」、「AGG」、「CTT」、「CGC」、「GAG」など)が、数回から数百回反復する繰り返し配列である。この繰り返しの数が個体または系統によって異なっているため、この繰り返し数の違いはDNA多型として利用することができる。CAPSマーカーは、制限酵素の認識配列において、塩基の挿入、欠失、置換等によって生じるDNA多型である。SNPマーカーは、DNAの塩基配列中の塩基1個の置換によって生ずるDNA多型である。分子マーカーとなる塩基配列は、当業者であれば、例えば、品種間におけるtan遺伝子の塩基配列の比較を基に、適宜抽出することが可能である。 Preferred embodiments of the molecular marker of the present invention are insertion / deletion markers, SSR (simple repetitive sequence) markers, CAPS (amplified cleavage polymorphism) markers and SNP (single nucleotide polymorphism) markers. An insertion / deletion marker is a DNA polymorphism caused by insertion and / or deletion of a base. The SSR marker is a unit of 2 or 3 bases (for example, “CA”, “CG”, “TA”, “TC”, “AGG”, “CTT”, “CGC”, “GAG”, etc.) several times Is a repetitive sequence that repeats several hundred times. Since the number of repetitions varies depending on the individual or strain, this difference in the number of repetitions can be used as a DNA polymorphism. The CAPS marker is a DNA polymorphism caused by insertion, deletion, substitution, etc. of a base in a restriction enzyme recognition sequence. The SNP marker is a DNA polymorphism caused by substitution of one base in the DNA base sequence. A person skilled in the art can appropriately extract a base sequence serving as a molecular marker based on, for example, comparison of base sequences of tan genes between varieties.
挿入・欠失マーカーにおける塩基配列の解析は、直接的な塩基配列の決定を行う方法以外に、当該マーカー領域を含む塩基配列をプライマーを利用したPCRを行い、得られた増幅産物を電気泳動し、ゲル上におけるDNAバンドの位置の違いとして検出する方法で実施することができる。また、SSRマーカーにおける塩基配列の解析は、直接的な塩基配列の決定を行って、繰り返し配列の違いとして検出する方法以外に、当該繰り返し部分を含む塩基配列を増幅しうるプライマーを利用したPCRを行い、得られた増幅産物を電気泳動し、ゲル上におけるDNAバンドの位置の違いとして検出する方法で実施することができる。SNPマーカーにおける塩基配列の解析は、例えば、一塩基多型部分を含む塩基配列を増幅しうるプライマーを利用したPCRを行い、得られた増幅産物中の一塩基多型部分に取り込まれた塩基の種類を偏光蛍光分析器で特定する方法で実施することができる。 In addition to the method of directly determining the nucleotide sequence, the nucleotide sequence of the insertion / deletion marker is subjected to PCR using a primer containing the nucleotide sequence containing the marker region, and the obtained amplification product is electrophoresed. The method can be carried out by detecting the difference in the position of the DNA band on the gel. In addition, the analysis of the base sequence in the SSR marker is not limited to the method of directly determining the base sequence and detecting it as a difference in the repeat sequence, but also using PCR using a primer capable of amplifying the base sequence containing the repeat portion. The amplification product thus obtained can be electrophoresed and detected as a difference in the position of the DNA band on the gel. The analysis of the nucleotide sequence in the SNP marker is performed, for example, by performing PCR using a primer that can amplify the nucleotide sequence including the single nucleotide polymorphism part, and the nucleotide sequence incorporated into the single nucleotide polymorphism part in the obtained amplification product. The method can be carried out by specifying the type with a polarization fluorescence analyzer.
「対照の塩基配列」としては、tan遺伝子と連鎖する公知の分子マーカーの塩基配列を利用することができる。例えば、後述の表1に示す、配列番号:7に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号:8に記載の塩基配列からなるプライマーによって増幅されるソルガム6番染色体由来の領域に座乗しているSSRマーカー(SB25792)、配列番号:9に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号:10に記載の塩基配列からなるプライマーによって増幅されるソルガム6番染色体由来の領域に座乗しているCAPSマーカー、配列番号:11に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号:12に記載の塩基配列からなるプライマーによって増幅されるソルガム6番染色体由来の領域に座乗しているSNPマーカーが挙げられる。 As the “control base sequence”, a base sequence of a known molecular marker linked to the tan gene can be used. For example, it sits on a region derived from sorghum chromosome 6 amplified by a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 shown in Table 1 below. SPS marker (SB25792), CAPS seated in a region derived from sorghum chromosome 6 amplified by a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and a primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10 SNP markers located on a region derived from sorghum chromosome 6 amplified by a marker, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 12.
従って、配列番号:7に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号:8に記載の塩基配列からなるプライマーで増幅されるSSRマーカーは、増幅されたDNA断片の配列または鎖長により、感受性型であるか抵抗性型であるかを判別することができる。また、配列番号:9に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号:10に記載の塩基配列からなるプライマーで増幅されるCAPSマーカーは、増幅されたDNA断片が制限酵素DraIによって切断された場合には感受性型であり、増幅されたDNA断片が制限酵素DraIによって切断されない場合には抵抗性型であると判断することができる。さらに、配列番号:11に記載の塩基配列からなるプライマー及び配列番号:12に記載の塩基配列からなるプライマーで増幅されるSNPマーカーは、増幅されたDNA断片の塩基配列を解読することにより、後述の実施例に示す通り、感受性型であるか抵抗性型であるかを判別することができる。 Therefore, the SSR marker amplified with the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8 is sensitive depending on the sequence or chain length of the amplified DNA fragment. It is possible to determine whether it is a resistant type or not. In addition, the CAPS marker amplified with the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 and the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 10 is used when the amplified DNA fragment is cleaved by the restriction enzyme DraI. Can be determined to be resistant if the amplified DNA fragment is not cleaved by the restriction enzyme DraI. Furthermore, the SNP marker amplified with the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 and the primer consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12 is described later by decoding the base sequence of the amplified DNA fragment. As shown in the examples, it is possible to determine whether it is a sensitive type or a resistant type.
上記した通り、被検植物における分子マーカーの塩基配列と対照の塩基配列との比較は、直接的な塩基配列の比較以外に、塩基配列の違いを評価しうる他の指標(例えば、上記したPCRによる増幅産物の分子量など)の比較によって、実施することができる。 As described above, the comparison between the base sequence of the molecular marker in the test plant and the base sequence of the control is not limited to the direct base sequence comparison, but other indicators that can evaluate the difference in the base sequence (for example, the PCR described above). By comparison of the molecular weight etc. of the amplification products by
比較の結果、被検植物における分子マーカーの塩基配列が、感受性型分子マーカーと同じ型である場合、被検植物は感受性の蓋然性が高いと判定され、抵抗性型分子マーカーと同じ型である場合、被検植物は抵抗性の蓋然性が高いと判定される。 As a result of comparison, if the base sequence of the molecular marker in the test plant is the same type as the sensitive molecular marker, the test plant is determined to have a high probability of sensitivity, and the same type as the resistant molecular marker The test plant is determined to have a high probability of resistance.
<病原性糸状菌に対する抵抗性の植物を育種する方法>
本発明は、また、病原性糸状菌に対する抵抗性の植物を育種する方法を提供する。本発明の育種方法は、(a)病原性糸状菌に対する抵抗性の植物品種と任意の植物品種とを交配させる工程、(b)交配により得られた個体における病原性糸状菌に対する感受性または抵抗性を、上記本発明の判定方法により判定する工程、および(c)病原性糸状菌に対する抵抗性を有すると判定された品種を選抜する工程、を含む。
<Method of breeding plants resistant to pathogenic filamentous fungi>
The present invention also provides a method for breeding plants that are resistant to pathogenic filamentous fungi. The breeding method of the present invention comprises (a) a step of crossing a plant variety resistant to pathogenic filamentous fungi with an arbitrary plant variety, (b) sensitivity or resistance to pathogenic filamentous fungi in an individual obtained by the crossing. And (c) selecting a variety that has been determined to have resistance to pathogenic filamentous fungi.
病原性糸状菌に対する抵抗性の植物品種と交配させる「任意の植物品種」としては、例えば、感受性品種、感受性品種と抵抗性品種との交配により得られた個体が挙げられるが、これらに制限されない。本発明の育種方法を利用すれば、病原性糸状菌に対する抵抗性の植物を、種子や幼植物の段階で選抜することが可能となり、病原性糸状菌に対する抵抗性の形質を有する品種の育成を、従来よりも短期間で行うことが可能となる。 Examples of “arbitrary plant varieties” to be crossed with plant varieties resistant to pathogenic filamentous fungi include, but are not limited to, susceptible varieties and individuals obtained by crossing susceptibility varieties and resistant varieties. . By using the breeding method of the present invention, it becomes possible to select plants resistant to pathogenic filamentous fungi at the stage of seeds and seedlings, and breeding of varieties having a trait resistant to pathogenic filamentous fungi. It becomes possible to carry out in a shorter period than before.
従って、本発明は、病原性糸状菌に対する抵抗性の植物を育種するための前記方法によって育種された植物体(例えば、ソルガム、イネ、トウモロコシ)、該植物体の子孫又はクローンである植物体、及びこれら植物体の繁殖材料(例えば、カルス、プロトプラスト、花粉、種子、切穂等)をも提供する。 Accordingly, the present invention relates to a plant (eg, sorghum, rice, corn) bred by the method for breeding a plant resistant to pathogenic filamentous fungi, a plant that is a descendant or clone of the plant, And propagation materials (eg, callus, protoplast, pollen, seeds, cuttings, etc.) of these plants.
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、下記実施例は以下の通りに実験、解析を行った。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated more concretely based on an Example, this invention is not limited to a following example. Further, the following examples were tested and analyzed as follows.
[実施例1]
<ソルガムのtan遺伝子の存在領域の絞り込み>
ソルガムで病障害により紫色を示す品種
那系MS-3Bとtan形質の品種Greenleafとの大規模な交配集団(F3-F5)において、ソルガムのSSRマーカーおよび挿入・欠失マーカーを利用して、tan遺伝子のマッピングを行った(図1、図2、図3)。なお、マッピングに用いた実験方法等については下記の通りである。
[Example 1]
<Narrowing down the sorghum tan gene region>
In large breeding population from the product shows a purple by illness disorders sorghum那系MS-3B and tan trait varieties Greenleaf (F3-F5), by using the SSR markers and insertion and deletion markers sorghum, tan Gene mapping was performed (FIGS. 1, 2, and 3). The experimental method used for the mapping is as follows.
(tan形質の検定)
tan形質の検定は、温室内ではパンチによる葉色の変化により行った。また、圃場で前記品種のソルガムを栽培することによって自然発生的に発生する病斑や障害、虫害による葉色の変化により検定を行った。また、那系MS-3Bは種子の穎の色が濃紫色であり、Greenleafは赤褐色であることから、この点も指標としてtan形質の検定を行った。
(Test of tan character)
The tan trait was tested by changing the leaf color due to punching in the greenhouse. In addition, the test was performed based on changes in leaf color due to lesions, damage, and insect damage that occur spontaneously by cultivating the sorghum of the varieties in the field. Moreover, since the seed cocoon color is deep purple and greenleaf is reddish brown, the tan character was tested using this point as an index.
(PCR)
ソルガムの葉からのDNAの抽出は一般的なc-TAB法や破砕による抽出法を用いた。また、多型マーカーを含む塩基配列を増幅するためのPCRにおいては、PCR試薬(GoTaq(登録商標)Green Master Mix)を5μl、蒸留水を4.4μl、DNA(20ng/μl)を0.1μl、プライマー(10p)を0.5μl含む、計10μlの反応液を調製した。そして、1反応当たり、そのうち9.5μlを使用し、94度で2分、「94度で1分→55℃で1分→72度で2分」を35サイクル、72度で10分の条件でPCR反応を行った。また、後述のマッピングに用いたCAPSマーカー及びSNPマーカーを解析するためのプライマーの情報を表1に示す。なお、表1に記載の「SB25792」は解析対象のSSRマーカーの名称であり、「Sb06g029510.1 」及び「Sb06g029530.1」は解析対象のCAPSマーカー及びSNPマーカーが各々座乗している遺伝子の名称である。
(PCR)
Extraction of DNA from sorghum leaves was performed using general c-TAB method or extraction method by crushing. In PCR to amplify a nucleotide sequence containing a polymorphic marker, 5 μl of PCR reagent (GoTaq (registered trademark) Green Master Mix), 4.4 μl of distilled water, 0.1 μl of DNA (20 ng / μl), primers A total of 10 μl of a reaction solution containing 0.5 μl of (10p) was prepared. Then, 9.5 μl is used per reaction, 94 ° C for 2 minutes, 94 ° C for 1 minute → 55 ° C for 1 minute → 72 ° C for 2 minutes, 35 cycles, 72 ° C for 10 minutes. PCR reaction was performed. In addition, Table 1 shows information on primers for analyzing the CAPS marker and SNP marker used for mapping described below. In Table 1, “SB25792” is the name of the SSR marker to be analyzed, and “Sb06g029510.1” and “Sb06g029530.1” are the genes of the CAPS marker and SNP marker that are to be analyzed. It is a name.
(各マーカーによる解析)
後述のラフマッピングには、Yonemaru J,ら、DNA Res、2009年、16巻、187〜193ページの記載のSSRマーカーを用いた。また、前述の通り、表1に示したプライマーを用いて、CAPSマーカー及びSNPマーカーの解析を行った。
(Analysis by each marker)
For the rough mapping described later, the SSR marker described in Yonemaru J, et al., DNA Res, 2009, Vol. 16, pp. 187-193 was used. Further, as described above, CAPS markers and SNP markers were analyzed using the primers shown in Table 1.
すなわち、CAPSマーカーによる解析においては、前記PCR反応にて増幅した産物5ulを制限酵素DraIで処理し、3%アガロースゲルにて電気泳動を行った。そして、那系MS-3Bゲノム由来の増幅産物はDraIで消化されるため、バンドサイズから多型を判別した。 That is, in the analysis using the CAPS marker, 5 ul of the product amplified by the PCR reaction was treated with the restriction enzyme DraI and electrophoresed on a 3% agarose gel. And since the amplification product derived from Na-type MS-3B genome is digested with DraI, the polymorphism was discriminated from the band size.
また、SNPマーカーによる解析に関して、前記PCR反応にて増幅した産物をダイレクトシーケンスに供し、その塩基配列を解読した。結果、解読した塩基配列において、那系MS-3BではいずれもT(チミン)であり、GreenleafにおいてはC(シトシン)とG(グアニン)となっている、2ヶ所のSNPがあることを見出し、これらのSNPを指標として、後述のマッピングを行った。 In addition, regarding the analysis using the SNP marker, the product amplified by the PCR reaction was subjected to a direct sequence, and the base sequence was decoded. As a result, in the decoded base sequence, it is found that there are two SNPs that are T (thymine) in Na-based MS-3B and C (cytosine) and G (guanine) in Greenleaf, The mapping described below was performed using these SNPs as indices.
先ず、F5のRIL個体(143個体)について、SSRマーカーを用いたラフマッピングを行い、tan遺伝子が染色体6番に座乗していることを解明した。次いで、F3部分へテロ集団個体(1142個体)について、SSRマーカーSB3751からSB3764の間で組換えのある個体(63個体)を選抜し、圃場にてtan形質の検定(調査)を行い、tan遺伝子の存在領域を、約150kbpの領域に絞り込んだ。 First, R5 individuals (143 individuals) of F5 were subjected to rough mapping using SSR markers, and it was clarified that the tan gene was located on chromosome 6. Next, the terrorist groups individuals (1142 individuals) to F3 part, were selected individuals (63 individuals) with a recombination between SSR markers SB3751 of SB3764, it performs a tan traits of the test (research) in the field, tan gene The existence region was narrowed down to a region of about 150 kbp.
さらに、ソルガム品種BTx623の塩基配列情報に基づいて見出したCAPSマーカー、SNPマーカーを用いたマッピングを行い、tan遺伝子の存在領域を最終的に約29kbpの領域に絞り込んだ(図3)。 Furthermore, mapping using the CAPS marker and SNP marker found based on the base sequence information of sorghum variety BTx623 was performed, and the tan gene existing region was finally narrowed down to a region of about 29 kbp (FIG. 3).
[実施例2]
<Greenleaf及び那系MS-3B間のtan遺伝子の比較>
次に、本発明者らは、前記絞り込んだ領域における遺伝子のアノテーションをデーターベースで調査したところ、この領域はトウモロコシのロイコアントシアニジンレダクターゼに相同性を持つ遺伝子がクラスターを作っていることが判明した。すなわち、この絞り込んだ領域内にはトウモロコシのロイコアントシアニジンレダクターゼに相同性を持つ4つの候補遺伝子が存在していた。そして、この4つの遺伝子の発現をRT-PCRにて調査したところ、候補遺伝子のうち、特定の候補遺伝子(以下、「tan遺伝子」と称する)の発現パターンのみが、ソルガムが病障害により紫色を呈するときに遺伝子の発現が増加することを見出した(図4)。なお、残りの遺伝子の発現はRT-PCRでは確認されなかった。このことから、この遺伝子が着色の原因遺伝子であると推測された。なお、RT-PCRは、Kikuchi R.ら、Plant Physiol、2009年、149巻、1341〜1353ページ、及びShimada S.ら、Plant J.、2009年、58巻、668〜681ページの記載に沿って行った。また、RT-PCRに用いたプライマー(配列番号:13〜24に記載の塩基配列からなるプライマー)の配列は表2に示す。
[Example 2]
<Comparison of tan genes between Greenleaf and Nasal MS-3B>
Next, the present inventors investigated the gene annotations in the narrowed region in a database, and found that genes having homology to maize leucoanthocyanidin reductase form a cluster in this region. That is, four candidate genes having homology to maize leucoanthocyanidin reductase existed in this narrowed region. Then, when the expression of these four genes was investigated by RT-PCR, only the expression pattern of a specific candidate gene (hereinafter referred to as “ tan gene”) among the candidate genes became purple due to disease disorder. It was found that gene expression increases when present (FIG. 4). The expression of the remaining genes was not confirmed by RT-PCR. From this, it was speculated that this gene is a causative gene of coloring. RT-PCR was performed using Kikuchi R.K. Et al., Plant Physiol, 2009, 149, 1341-1353, and Shimada S. et al. Et al., Plant J. et al. 2009, Vol. 58, pages 668-681. In addition, Table 2 shows the sequences of primers (primers consisting of the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 13 to 24) used for RT-PCR.
さらに、tan遺伝子周辺の塩基配列を決定し、そのコードするアミノ酸配列を品種間で比較したところ、紫色を呈する品種の那系MS-3Bは、タンパク質をコードする遺伝子領域のゲノム塩基配列が既に分かっている品種、BTx623と完全に一致していた(図5)。一方、Greenleafにおいては、那系MS-3Bと異なるアミノ酸配列が該領域内に2箇所あることが見出された。そして、これらの結果から、tan形質のGreenleafでは、tan遺伝子がコードするタンパク質、すなわち正常な機能を有するロイコアントシアニジンレダクターゼ様タンパク質が合成されていないことが推測された(図5)。なお、前記塩基配列及びアミノ酸配列のアライメント及び比較は、ソフトウェアGENETYX、CrastalW(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)を用いて行った。 Furthermore, when the nucleotide sequence around the tan gene was determined and the amino acid sequences encoded were compared between varieties, the varieties of purple-colored cultivar MS-3B already had the genomic nucleotide sequence of the gene region encoding the protein. The cultivar was BTx623 (Fig. 5). On the other hand, in Greenleaf, it was found that there are two amino acid sequences in the region that are different from those of Na-type MS-3B. From these results, it was speculated that the protein encoded by the tan gene, that is, the leucoanthocyanidin reductase-like protein having a normal function, was not synthesized in Greenleaf of the tan trait (FIG. 5). The alignment and comparison of the base sequence and amino acid sequence was performed using software GENETYX, CrastalW (http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html).
[実施例3]
<Greenleaf及び那系MS-3Bの葉におけるアントシアニンの生成誘導についての分析>
那系MS-3B及びGreenleafの葉を5mm幅に細断し、水寒天の上で26℃でインキュベートした。そして、インキュベート開始時、インキュベート開始してから2日目、4日目、6日目に前記葉を各々回収した。次いで、得られた葉(生重量0.01g)から、1mlのメタノールにて4℃で24時間かけて抽出液を得た。そして、該抽出液の吸光度(波長493nm)を測定した。得られた結果を図6に示す。
[Example 3]
<Analysis of the induction of anthocyanin production in Greenleaf and naso MS-3B leaves>
Nasal MS-3B and Greenleaf leaves were shredded to 5 mm width and incubated at 26 ° C. on water agar. At the start of incubation, the leaves were collected on the second, fourth and sixth days after the start of incubation. Next, an extract was obtained from the obtained leaves (fresh weight 0.01 g) with 1 ml of methanol at 4 ° C. for 24 hours. Then, the absorbance (wavelength 493 nm) of the extract was measured. The obtained result is shown in FIG.
図6に示した結果から明らかなように、那系MS-3Bの葉においては細断を受け、アントシアニンの生成が誘導されているのに対し、Greenleafの葉においては誘導されていなかった。 As is clear from the results shown in FIG. 6, the leaves of the nacelle MS-3B were shredded and the production of anthocyanins was induced, whereas the greenleaf leaves were not.
[実施例4]
<Greenleaf、那系MS-3B及びBTx623の葉における、3-デオキシアントシアニジン生成についての分析>
病斑を示したBTx623、那系MS-3B及びGreenleafの葉1gから各々0.01%塩酸メタノールにて色素を抽出した。得られた色素を2N塩酸にて100℃、1時間かけ、加水分解した後、酢酸エチルにて脂質を除去し、イソアミルアルコールで色素を抽出した。抽出した色素を風乾させた後、メタノールに溶解して、TLCシートにスポッティングした。なお、薄層クラマトグラフィー(TLC)の展開は、酢酸/水/塩酸 溶媒(酢酸:水:塩=30:10:3 v/v(体積比))を用いて行った。また、TLCシートはMerck社製、TLCcelluloseFを用い、アントシアニン(アピゲニニジン、ルテオリニジン)の標準品は、Fluka社製のものを用いた。得られた結果を図7に示す。
[Example 4]
<Analysis of 3-deoxyanthocyanidin production in the leaves of Greenleaf, Naseki MS-3B and BTx623>
The pigments were extracted from 1 g of leaves of BTx623, Naskei MS-3B and Greenleaf showing lesions with 0.01% hydrochloric acid methanol. The obtained dye was hydrolyzed with 2N hydrochloric acid at 100 ° C. for 1 hour, lipids were removed with ethyl acetate, and the dye was extracted with isoamyl alcohol. The extracted pigment was air-dried, dissolved in methanol, and spotted on a TLC sheet. Thin layer chromatography (TLC) was developed using an acetic acid / water / hydrochloric acid solvent (acetic acid: water: salt = 30: 10: 3 v / v (volume ratio)). The TLC sheet used was Merck and TLCcellulose F, and the standard anthocyanin (apigenidin and luteolinidine) was Fluka. The obtained results are shown in FIG.
図7に示した結果から明らかなように、病斑を示した那系MS-3Bの葉ではアピゲニニジン、ルテオリニジンの両方が生成しているが、Greenleafの葉ではいずれの色素も生成されていなかった。しかしながら、図には示さないが、Greenleafの葉の抽出物を展開したTLCのレーンにUVを当てることにより、スポットが観察された。このことから、Greenleafにおいても、可視光では存在を確認できないが、アントシアニンと挙動を共にしうる色素であるフラボノイド等が生成されていることが推測された。 As is clear from the results shown in FIG. 7, both apigeninidine and luteolinidine were produced in the leaves of Naseki MS-3B that showed lesions, but neither pigment was produced in the leaves of Greenleaf. . However, although not shown in the figure, spots were observed by applying UV to the TLC lane where the leaf extract of Greenleaf was developed. From this, it was speculated that flavonoids and the like, which are pigments that can behave together with anthocyanins, were generated even in Greenleaf, although the presence could not be confirmed with visible light.
[実施例5]
<外的障害を受けたGreenleafの葉に蓄積される色素の同定>
実施例4において示唆された、外的障害を受けたGreenleafの葉において生成される色素の同定を試みた。すなわち、前記同様に、カットしたGreenleafの葉を水寒天の上でインキュベートした。そして、3日間のインキュベーションにおいて誘導された色素をメタノールで抽出し、HPLC-MSを用いて分析した。得られた結果を図8に示す。
[Example 5]
<Identification of pigments accumulated in leaves of externally damaged Greenleaf>
Attempts were made to identify the pigments produced in externally impaired Greenleaf leaves suggested in Example 4. That is, as described above, the cut Greenleaf leaves were incubated on water agar. The dyes induced in the 3-day incubation were extracted with methanol and analyzed using HPLC-MS. The obtained result is shown in FIG.
なお、HPLCの条件は、移動相の濃度(3%酢酸:メタノール)を70:30から50:50に20分かけてグラジエントに変化させた後、10分間維持した。また、分析には、カラムはコスモシール 5C18-AR-II(ナカライテスク株式会社製)を用いた。さらに、MSの検出はAPI-ES positiveモードにて行った。また、標準品は、CAYMAN CHEMICAL社製の標品を用いた。 The HPLC conditions were maintained for 10 minutes after changing the mobile phase concentration (3% acetic acid: methanol) from 70:30 to 50:50 in a gradient over 20 minutes. In the analysis, Cosmo Seal 5C 18 -AR-II (manufactured by Nacalai Tesque Co., Ltd.) was used as the column. Furthermore, MS was detected in API-ES positive mode. As a standard product, a standard product manufactured by CAYMAN CHEMICAL was used.
図8に示す通り、カットしてインキュベーションしたGreenleafの葉からの抽出液においては、約18.2分にピークが見られ、このピークは、標準品との比較及びMS分析の結果から、ルテオリン由来のものであることが明らかとなった。 As shown in FIG. 8, in the extract from Greenleaf leaves that had been cut and incubated, a peak was observed at about 18.2 minutes. This peak was derived from luteolin from the results of comparison with a standard product and MS analysis. It became clear that.
なお、MS分析によって得られたその他のピークについては不明である。また、非特許文献4において、tan形質を示すソルガムではアピゲニンが蓄積していると記載されていたが、今回の分析では確認されなかった。 The other peaks obtained by MS analysis are unknown. Further, in Non-Patent Document 4, it was described that apigenin was accumulated in sorghum showing tan character , but this was not confirmed in this analysis.
また、図には示さないが、ソルガムのアントシアニン合成経路(図9 参照)において、各反応段階において作用する酵素をコードする遺伝子の発現をRT-PCRにて検出したところ、那系MS-3B及びGreenleaf共に、各段階の反応を触媒する酵素をコードする遺伝子はいずれも発現していることが明らかとなった。 Although not shown in the figure, expression of a gene encoding an enzyme acting in each reaction step in the sorghum anthocyanin synthesis pathway (see FIG. 9) was detected by RT-PCR. Together with Greenleaf, it was revealed that all genes encoding enzymes that catalyze reactions at each stage were expressed.
これらの結果から、那系MS-3Bにおいては、アントシアニン合成の最終段階である3デオキシアントシアニジンレダクターゼ(3-DANS)は正常な活性を保持しているため、アピゲニニジン及びルテオニジンが合成され、葉の外的障害を受けた部位は紫色等に着色される。一方、Greenleafでは3-DANSが機能していないため、この最終反応が起きないと考えられ、その代わりにFNSII酵素の作用でルテオリンが蓄積することが推測される。 From these results, in the Na-based MS-3B, 3deoxyanthocyanidin reductase (3-DANS), which is the final stage of anthocyanin synthesis, retains normal activity, so apigeninidine and luteonidin are synthesized, and they are outside the leaves. The part that has received a physical disorder is colored purple or the like. On the other hand, since 3-DANS does not function in Greenleaf, it is considered that this final reaction does not occur. Instead, it is presumed that luteolin accumulates by the action of the FNSII enzyme.
さらに、外的障害を受けたGreenleafの葉においては、前述の通り、3-デオキシアントシアニジンの代わりに少なくともルテオリンが蓄積していることが明らかになった。また、ルテオリンは抗酸化活性や抗菌活性を有していることから、tan形質を示すソルガムの葉においては、この色素が蓄積することにより、病原性糸状菌等に対する抵抗性が発揮されていると推測される。 Furthermore, it was revealed that at least luteolin was accumulated instead of 3-deoxyanthocyanidin in Greenleaf leaves that were externally damaged as described above. In addition, since luteolin has antioxidant and antibacterial activities, the resistance to pathogenic filamentous fungi and the like is exhibited by the accumulation of this pigment in sorghum leaves exhibiting the tan character. Guessed.
[実施例6]
<tan形質と病原性糸状菌等に対する抵抗性との相関についての検証>
前述の通り、変異型のtan遺伝子を有するtan形質と病原性糸状菌等に対する抵抗性との相関を確認するため、QTL解析を行った。すなわち、那系MS-3BとGreenleafとを交配して得られたF5のRILのうち、染色体6番が部分ヘテロとなっているRIL 112を選択し、各々の植物個体から前記同様、DNAを抽出し、SSRマーカーを用いてこの領域のタイピングを行った。
[Example 6]
<Verification of correlation between tan traits and resistance to pathogenic fungi>
As described above, QTL analysis was performed to confirm the correlation between the tan trait having a mutant tan gene and resistance to pathogenic filamentous fungi and the like. That is, out of F5 RIL obtained by crossing Nasal MS-3B and Greenleaf, RIL 112 with chromosome 6 being partially heterozygous is selected, and DNA is extracted from each individual plant as described above. This region was then typed using SSR markers.
また、すす紋病については2010年に、信州大学伊那キャンパス圃場にて、2番草に発病するすす紋病の罹病程度を観察した。その結果、図には示さないが、tan形質を持つ個体では明らかにすす紋病に対して抵抗性を示すことが確認された。 As for soot disease, we observed the extent of the soot disease that occurs in the second grass at the Ina Campus field in Shinshu University in 2010. As a result, although not shown in the figure, it was confirmed that the individual with the tan trait showed resistance to soot disease.
これらの結果から、図10に示す通り、すす紋病に抵抗性を示す遺伝子領域を示すQTLの領域は2MBにまで絞り込まれ、この領域はtan遺伝子(または、その遺伝子座)が含まれていることから、tan形質がすす紋病等の抵抗性を高める可能性があることが強く示唆された。 From these results, as shown in FIG. 10, the QTL region indicating the gene region resistant to soot disease is narrowed down to 2 MB, and this region contains the tan gene (or its locus). This strongly suggested that the tan trait may increase resistance to soot disease.
以上の結果から、tan形質を示すソルガムにおいては、tan遺伝子が変異しているため、この遺伝子がコードするロイコアントシアニジンレダクターゼ様タンパク質、すなわち3デオキシアントシアニジンレダクターゼ(3-DANS)の機能が不活化している。そのため、外的障害を受けた部位においては、3-デオキシアントシアニジン(アピゲニニジン及びルテオニジン)が合成されず、代わりに抗菌活性等を有しているルテオリン等が蓄積されることにより、tan形質において、病原性糸状菌に対する抵抗性が発揮されていることが明らかになった。 From the above results, since the tan gene is mutated in sorghum exhibiting the tan character , the function of the leucoanthocyanidin reductase-like protein encoded by this gene, ie, 3-deoxyanthocyanidin reductase (3-DANS) is inactivated. Yes. Therefore, in the portion receiving the external fault, 3- deoxy anthocyanidin (Apigeninijin and Ruteonijin) is not synthesized by luteolin like to have antimicrobial activity and the like is stored in place, the tan trait, pathogenic It became clear that the resistance to the filamentous fungus was exhibited.
本発明により、植物の病原性糸状菌に対する感受性および抵抗性に関わるtan遺伝子が同定され、tan形質の発症の機構が明らかとなった。植物の病原性糸状菌に対する感受性および抵抗性を判定する場合、従来は、病原菌の感染試験を行う必要があったが、tan遺伝子をマーカーとして用いれば、病原菌の接種検定などを行うことなく、また、種子あるいは幼植物の段階においても、簡易に判定が可能であり、ひいては抵抗性品種を効率的に育種することが可能である。育種される抵抗性品種は、病原性糸状菌による被害軽減に貢献する他、バイオマスの生産量の向上や高品質の飼料作成が期待される。tan遺伝子は、3-デオキシアントシアニジンの合成における利用も考えられる。 According to the present invention, the tan gene involved in the susceptibility and resistance of plants to pathogenic filamentous fungi has been identified, and the mechanism of the onset of tan traits has been clarified. In order to determine the susceptibility and resistance of a plant to pathogenic filamentous fungi, it was conventionally necessary to conduct an infection test for the pathogenic fungus. However, if the tan gene is used as a marker, the inoculation test for the pathogenic fungus is not performed. Even at the seed or seedling stage, it is possible to easily determine, and thus it is possible to efficiently breed resistant varieties. Resistant varieties that are bred contribute to the reduction of damage caused by pathogenic filamentous fungi, and are expected to improve biomass production and produce high-quality feed. The tan gene may be used in the synthesis of 3-deoxyanthocyanidins.
配列番号7〜26
<223> 人工的に合成されたプライマーの塩基配列
SEQ ID NOs: 7-26
<223> Base sequence of artificially synthesized primer
Claims (18)
(a)配列番号:6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:6に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA The DNA according to any one of the following (a) to (c), which encodes a protein that suppresses 3-deoxyanthocyanidin synthesis in plants.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6
(B) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or 5
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
(a)配列番号:6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:4または5に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA
(c)配列番号:6に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA The DNA according to any one of the following (a) to (c), which encodes a protein having an activity of imparting resistance to a pathogenic filamentous fungus to a plant.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6
(B) DNA containing the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or 5
(C) DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含み、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA A method for imparting resistance to pathogenic filamentous fungi to a plant, comprising suppressing the expression or function of the DNA according to any one of the following (a) to (c) in the plant.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(B) DNA encoding a protein comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(C) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and has an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants. DNA encoding protein
(a)植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有し、かつ下記(i)〜(iii)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的な二重鎖RNA
(b)植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有し、かつ下記(i)〜(iii)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNA
(c)植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有し、かつ下記(i)〜(iii)のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNA
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(ii)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含み、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA A method for imparting resistance to pathogenic filamentous fungi to a plant, comprising a step of introducing a DNA encoding the RNA according to any one of (a) to (c) below to the plant.
(A) a double-stranded RNA having an activity of imparting resistance to a pathogenic filamentous fungus to a plant and complementary to the transcription product of DNA according to any one of (i) to (iii) below
(B) An antisense RNA having an activity to impart resistance to pathogenic filamentous fungi to a plant and complementary to the transcription product of DNA according to any of (i) to (iii) below
(C) RNA having an activity to confer resistance to pathogenic filamentous fungi on a plant and a ribozyme activity that specifically cleaves a transcription product of DNA according to any one of (i) to (iii) below
(I) a DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(Ii) DNA encoding a protein comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(Iii) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and has an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants. DNA encoding protein
(a)植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有し、かつ下記(i)〜(iii)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的な二重鎖RNA
(b)植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有し、かつ下記(i)〜(iii)のいずれかに記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNA
(c)植物に病原性糸状菌に対する抵抗性を付与する活性を有し、かつ下記(i)〜(iii)のいずれかに記載のDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNA
(i)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(ii)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含み、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(iii)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA A drug for imparting resistance to pathogenic filamentous fungi, comprising DNA encoding the RNA according to any one of the following (a) to (c), or a vector into which the DNA is inserted.
(A) a double-stranded RNA having an activity of imparting resistance to a pathogenic filamentous fungus to a plant and complementary to the transcription product of DNA according to any one of (i) to (iii) below
(B) An antisense RNA having an activity to impart resistance to pathogenic filamentous fungi to a plant and complementary to the transcription product of DNA according to any of (i) to (iii) below
(C) RNA having an activity to confer resistance to pathogenic filamentous fungi on a plant and a ribozyme activity that specifically cleaves a transcription product of DNA according to any one of (i) to (iii) below
(I) a DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(Ii) DNA encoding a protein comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(Iii) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and has an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants. DNA encoding protein
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含み、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA A method for determining sensitivity or resistance to pathogenic filamentous fungi in a plant, wherein the base sequence of a tan gene in a test plant is analyzed, and the base sequence is any one of the following (a) to (c): If it is a DNA base sequence, it is determined that the test plant has a high probability of being susceptible to pathogenic filamentous fungi. If the DNA base sequence is the DNA base sequence according to claim 2, the test plant is a pathogen. A method of determining that there is a high probability of having resistance to sexual filamentous fungi.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(B) DNA encoding a protein comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(C) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and has an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants. DNA encoding protein
(a)配列番号:3に記載のアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(b)配列番号:1または2に記載の塩基配列のコード領域を含み、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号:3に記載のアミノ酸配列において1〜10のアミノ酸が置換、欠失、付加、および/または挿入されたアミノ酸配列からなり、植物に病原性糸状菌に対する感受性を付与する活性を有するタンパク質をコードするDNA A method for determining sensitivity or resistance to pathogenic filamentous fungi in a plant, wherein the expression of the DNA according to any one of (a) to (c) below or the DNA according to claim 2 is detected in a test plant. A method characterized by:
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(B) DNA encoding a protein comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 2 and having an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants
(C) It consists of an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are substituted, deleted, added, and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and has an activity of imparting susceptibility to pathogenic filamentous fungi to plants. DNA encoding protein
(a)病原性糸状菌に対する抵抗性の植物品種と任意の植物品種とを交配させる工程、
(b)工程(a)における交配により得られた個体における病原性糸状菌に対する感受性または抵抗性を、請求項13または14に記載の方法により判定する工程、および
(c)病原性糸状菌に対する抵抗性を有すると判定された品種を選抜する工程、を含む方法。 A method for breeding a plant resistant to pathogenic filamentous fungi, comprising:
(A) crossing a plant variety resistant to pathogenic filamentous fungi with any plant variety,
(B) a step of determining the sensitivity or resistance to pathogenic filamentous fungi in the individual obtained by the mating in step (a) by the method according to claim 13 or 14, and (c) resistance to pathogenic filamentous fungi. Selecting a variety determined to have sex.
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