JP5806110B2 - 中和プロタンパク質コンベルターゼズブチリシンケクシン９型（ｐｃｓｋ９）変形物及びその使用 - Google Patents

中和プロタンパク質コンベルターゼズブチリシンケクシン９型（ｐｃｓｋ９）変形物及びその使用 Download PDF

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Description

（関連出願）
本願は、２００８年４月２３日に出願された米国仮出願６１／１２５，３０４号（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）の優先権を主張する。
（発明の分野）
本発明は、プロタンパク質コンベルターゼズブチリシンケクシン９型の変形物（及びこれに関連する分子）及び様々な疾患を治療するために前記変形物（及びこれに関連する分子）を使用する方法に関する。
プロタンパク質コンベルターゼズブチリシンケクシン９型（ＰＣＳＫ９）は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質のレベルの制御に関与するセリンプロテアーゼである（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７；Ｓｅｉｄａｈ ａｎｄ Ｐｒａｔ， ２００７）。インビトロ実験は、ＨｅｐＧ２細胞へのＰＣＳＫ９の添加は細胞表面ＬＤＬＲのレベルを低下させることを示している（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４；Ｌａｇａｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００５；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。マウスを用いた実験は、ＰＣＳＫ９タンパク質レベルを増加させることが肝臓中のＬＤＬＲタンパク質のレベルを減少させる（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， ２００４；Ｌａｇａｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６；Ｍａｘｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００５；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， ２００４）が、ＰＣＳＫ９ノックアウトマウスは肝臓中のＬＤＬＲの増加したレベルを有する（Ｒａｓｈｉｄ ｅｔ ａｌ．， ２００５）ことを示した。さらに、血漿ＬＤＬの増加又は減少したレベルの何れかをもたらす様々なヒトＰＣＳＫ９変異が同定されている（Ｋｏｔｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００６；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， ２００６）。ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲタンパク質と直接相互作用し、ＬＤＬＲとともに細胞内に取り込まれ、エンドソーム経路全体を通じてＬＤＬＲと同時に免疫蛍光を発する（Ｌａｇａｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２００６）ことが示されている。ＰＣＳＫ９によるＬＤＬＲの分解は観察されておらず、細胞外ＬＤＬＲタンパク質レベルを低下させる機序は不明である。
ＰＣＳＫ９は、セリンプロテアーゼのズブチリシン（Ｓ８）ファミリー中のプロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼである（Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．， ２００３）。ヒトは、Ｓ８ＡとＳ８Ｂサブファミリーに分けることができる９つのプロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼを有する（Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ， ２００６）。フューリン、ＰＣ１／ＰＣ３、ＰＣ２、ＰＡＣＥ４、ＰＣ４、ＰＣ５／ＰＣ６及びＰＣ７／ＰＣ８／ＬＰＣ／ＳＰＣ７は、サブファミリーＳ８Ｂに分類される。マウスフューリン及びＰＣ１由来の異なるドメインの結晶及びＮＭＲ構造は、ズブチリシン様ｐｒｏドメイン及び触媒ドメイン並びに触媒ドメインのすぐＣ末端のＰドメインを明らかにする（Ｈｅｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ， ２００３；Ｔａｎｇｒｅａ ｅｔ ａｌ， ２００２）。このサブファミリー内のアミノ酸配列の類似性に基づいて、７つのメンバー全てが類似の構造を有すると予想される（Ｈｅｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２００５）。ＳＫＩ−１／Ｓ１Ｐ及びＰＣＳＫ９は、サブファミリーＳ８Ａに分類される。これらのタンパク質との配列比較は、ズブチリシン様ｐｒｏドメイン及び触媒ドメインの存在も示唆する（Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８；Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．， ２００３；Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ， １９９９）。これらのタンパク質では、触媒ドメインに対してＣ末端のアミノ酸配列は、より可変的であり、Ｐドメインの存在を示唆しない。
プロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼはチモーゲンとして発現され、多段階工程を経て成熟する。この過程におけるｐｒｏドメインの機能は２つある。まず、ｐｒｏドメインはシャペロンとして作用し、触媒ドメインの適切な折り畳みのために必要とされる（Ｉｋｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ， １９８７）。触媒ドメインが折り畳まれたら、ｐｒｏドメインと触媒ドメインの間で自己触媒が起こる。この最初の切断反応の後に、ｐｒｏドメインは触媒ドメインに結合された状態を保ち、その後、ｐｒｏドメインはそこで触媒活性の阻害剤として作用する（Ｆｕ ｅｔ ａｌ， ２０００）。状態が正しければ、ｐｒｏドメイン内の部位において、成熟は、第二の自己触媒現象とともに進行する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ， １９９７）。この第二の切断現象が起こった後に、ｐｒｏドメインと触媒ドメインは解離し、活性なプロテアーゼを与える。
ＰＣＳＫ９チモーゲンの自己触媒がＧｌｎ１５２とＳｅｒ１５３の間で起こり（ＶＦＡＱ／ＳＩＰ）（Ｎａｕｒｅｃｋｉｅｎｅ ｅｔ ａｌ， ２００３）、細胞からのその分泌のために必要とされることが示されている（Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ，２００３）。ＰＣＳＫ９のｐｒｏドメイン内の部位での第二の自己触媒現象は、観察されなかった。精製されたＰＣＳＫ９は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され得る２つの種（１７Ｋｄにｐｒｏドメイン及び６５Ｋｄに触媒＋Ｃ末端ドメイン）から構成される。ＰＣＳＫ９は、その阻害的ｐｒｏドメインなしに単離されておらず、ＰＣＳＫ９の触媒活性の測定は変動する（Ｎａｕｒｅｃｋｉｅｎｅ ｅｔ ａｌ， ２００３；Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ， ２００３）。
Ｈｏｒｔｏｎ他、２００７年 Ｓｅｉｄａｈ ａｎｄ Ｐｒａｔ、２００７年 Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ他、２００４年 Ｌａｇａｃｅ他、２００６年 Ｍａｘｗｅｌｌ他、２００５年 Ｐａｒｋ他、２００４年 Ｒａｓｈｉｄ他、２００５年 Ｋｏｔｏｗｓｋｉ他、２００６年 Ｚｈａｏ他、２００６年 Ｓｅｉｄａｈ他、２００３年 Ｒａｗｌｉｎｇｓ他、２００６年 Ｈｅｎｒｉｃｈ他、２００３年 Ｔａｎｇｒｅａ他、２００２年 Ｈｅｎｒｉｃｈ他、２００５年 Ｓａｋａｉ他、１９９８年 Ｓｅｉｄａｈ他、１９９９年 Ｉｋｅｍｕｒａ他、１９８７年 Ｆｕ他、２０００年 Ａｎｄｅｒｓｏｎ他、１９９７年 Ｎａｕｒｅｃｋｉｅｎｅ他、２００３年
幾つかの実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９変形物及び／又はその使用を含む。
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９変形物は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合するＰｒｏ／Ｃａｔドメイン又はその断片及びＬＤＬＲ活性に対して不活性なＶドメインを含み得る中和ＰＣＳＫ９変形物であり得る。不活性なＶドメインは、ＬＤＬＲの分解をもたらさない。
幾つかの実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９変形物（又は中和変形物）をコードする核酸分子を含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９変形物をコードする本明細書中に開示されている核酸分子を含む宿主細胞を含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、ＰＣＳＫ９変形物をコードする本明細書中に開示されている核酸分子を含むベクターを含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの中和ＰＣＳＫ９変形物（又は中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする核酸配列）と並びに医薬として許容される担体及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物を含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、患者中の上昇した血清コレステロールレベルと関連する症状を治療又は予防する方法を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に開示されている化合物（例えば、中和ＰＣＳＫ９変形物及び／又は中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする核酸配列を含む。）の少なくとも１つの有効量を、患者中の上昇した血清コレステロールレベルと関連する症状の治療又は予防を必要としている患者に投与することを含み得る。
幾つかの実施形態において、本発明は、患者中のＬＤＬＲへの内在性ＰＣＳＫ９の結合を阻害する方法を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に開示されている化合物（例えば、中和ＰＣＳＫ９変形物及び／又は中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする核酸配列を含む。）の少なくとも１つの有効量を、ＬＤＬＲへの内在性ＰＣＳＫ９の結合の阻害を必要としている対象に投与することを含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、対象中の上昇した血清コレステロールと関連する症状を治療又は予防する方法を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に開示されている化合物（例えば、中和ＰＣＳＫ９変形物及び／又は中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする核酸配列を含む。）の少なくとも１つの有効量を、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質の利用可能性を上昇させる因子と同時に又は順次に、上昇した血清コレステロールと関連する症状の治療又は予防を必要としている対象に投与することを含み得る。
幾つかの実施形態において、本発明は、対象中の血清コレステロールを低下させる方法を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に開示されている化合物（例えば、中和ＰＣＳＫ９変形物及び／又は中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする核酸配列を含む。）の少なくとも１つの有効量を、対象に投与することを含み得る。
幾つかの実施形態において、本発明は、対象中の血清コレステロールを低下させる方法を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、本明細書に開示されている化合物（例えば、中和ＰＣＳＫ９変形物及び／又は中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする核酸配列を含む。）の少なくとも１つの有効量を、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質の利用可能性を上昇させる因子と同時に又は順次に、対象に投与することを含み得る。
幾つかの実施形態において、本発明は、高コレステロール血症の治療用医薬の製造における、本明細書に開示されている化合物（例えば、中和ＰＣＳＫ９変形物及び／又は中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする核酸配列を含む。）の少なくとも１つの使用を含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に開示されている化合物（例えば、中和ＰＣＳＫ９変形物及び／又は中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする核酸配列を含む。）の少なくとも１つを含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、高コレステロール血症の治療において使用するための、本明細書に開示されている化合物（例えば、中和ＰＣＳＫ９変形物及び／又は中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする核酸配列を含む。）の少なくとも１つを含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合するＰｒｏ／Ｃａｔドメイン又はその断片及びＬＤＬＲ活性に対して不活性なＶドメインを含む医薬組成物を含む。不活性なＶドメインは、ＬＤＬＲの分解をもたらさない。医薬組成物は、医薬として許容される担体又は希釈剤をさらに含む。
幾つかの実施形態において、本発明は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合するＰｒｏ／Ｃａｔドメイン又はその断片及びＬＤＬＲ活性に対して不活性なＶドメインを含む医薬組成物を含む。不活性なＶドメインは、ＬＤＬＲの分解をもたらさない。ｐｒｏ／ｃａｔドメインは、コレステロール関連疾患の治療のために十分な量で存在する。
ＰＣＳＫ９の成熟形態のアミノ酸配列を図示しており、ｐｒｏドメインに下線が付されている。 ＰＣＳＫ９のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、ｐｒｏドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。 ＰＣＳＫ９のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、ｐｒｏドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。 ＰＣＳＫ９のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、ｐｒｏドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。 ＰＣＳＫ９のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、ｐｒｏドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。 様々な生物からのＰＣＳＫ９の配列に対する比較である。（図１Ｃから１Ｅ中の全ての「Ｏ」は、実際には「Ｑ」である。）。 図１Ｃの続きである。 図１Ｄの続きである。 別のＰＣＳＫ９タンパク質の別のＣａｔドメインとの、配列番号３のＰＣＳＫ９タンパク質のＣａｔドメインの並置である。 別のＰＣＳＫ９タンパク質の別のＣａｔドメインとの、配列番号３のＰＣＳＫ９タンパク質のＣａｔドメインの並置である。 別のＰＣＳＫ９タンパク質の別のＣａｔドメインとの、配列番号３のＰＣＳＫ９タンパク質のＣａｔドメインの並置である。 ＬＤＬＲのアミノ酸配列に対する並置及びコンセンサス配列である。 図１Ｉに示されているＬＤＬＲのアミノ酸配列に対する並置及びコンセンサス配列の続きである。 ＬＤＬＲのアミノ酸配列に対する並置及びコンセンサス配列である。 図１Ｋに示されているＬＤＬＲのアミノ酸配列に対する並置及びコンセンサス配列の続きである。 ＰＣＳＫ９タンパク質の一実施形態を図示する。 ＰＣＳＫ９タンパク質の一実施形態を図示する。 ＰＣＳＫ９タンパク質の一実施形態を図示する。 ＰＣＳＫ９タンパク質の一実施形態を図示する。 ＰＣＳＫ９タンパク質の一実施形態を図示する。 ＰＣＳＫ９タンパク質の一実施形態を図示する。 ＰＣＳＫ９タンパク質の一実施形態を図示する。 ＰＣＳＫ９タンパク質の一実施形態を図示する。 ＰＣＳＫ９タンパク質の一実施形態を図示する。 ＰＣＳＫ９タンパク質の一実施形態を図示する。 ＰＣＳＫ９タンパク質に対するコンセンサス配列の一実施形態を図示する。 ＰＣＳＫ９タンパク質に対するコンセンサス配列の一実施形態を図示する。 ヒトＰＣＳＫ９タンパク質の一実施形態を図示する。 ヒトＰＣＳＫ９タンパク質の一実施形態を図示する。 ａ）標識されていない完全長ＰＣＳＫ９、ｂ）ＰＣＳＫ９の標識されていない残基３１から４４７又はｃ）ＰＣＳＫ９の標識されていないＶドメイン（残基４５０から６９２）と競合した、ＬＤＬＲとビオチン標識された完全長ＰＣＳＫとの間の結合アッセイの結果を図示するグラフである。 ＬＤＬの取り込み対するＰＣＳＫ９の残基３１から４４７の活性の結果を図示するグラフである。 ＬＤＬの取り込み対するＰＣＳＫ９の残基３１から４４７の活性の結果を図示するグラフである。 ＬＤＬＲタンパク質レベル及びＰＣＳＫ９の取り込みに対する、完全長ＰＣＳＫ９対ＰＣＳＫ９の残基３１から４４７（Ｐｒｏ／Ｃａｔ断片）の効果を比較するウェスタンブロットの図示である。ゲルの左側に見ることができるように、完全長ＰＣＳＫ９（ＦＬＰＣ９）はＬＤＬＲの減少をもたらすのに対して、ＰＣＳＫ９の残基３１から４４７（中和ＰＣＳＫ９変形物として機能するＰｒｏ／Ｃａｔ断片）はＬＤＬＲの減少をもたらさない。 ＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲのＥＧＦａ部分の構造の図解である。 ＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲの構造モデルの図解である。 別の視点からのＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲの構造モデルの図解である。 ＬＤＬの取り込みに対するＰＣＳＫ９の残基３１から４４７のＤ３７４Ｙ変形物（Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインの別の変形物の一例）の活性の結果を図示するグラフである。 ＰＣＳＫ９の残基３１から４４７のＤ３７４Ｙ変形物を含んだ競合アッセイの結果を図示するグラフである。
プロタンパク質コンベルターゼズブチリシンケクシン９型（ＰＣＳＫ９）は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質のレベルの制御に関与するセリンプロテアーゼである。原型のＰＣＳＫ９はインビボにおいてＬＤＬＲに結合し、ＬＤＬＲの分解に関与していると考えられている。
利用可能なＬＤＬＲの低下はＬＤＬＲとＬＤＬ間でのより少ない結合をもたらし、次いで、これは、対象の血清中により多くのＬＤＬをもたらして、血清コレステロールの増加をもたらすので、これは問題であり得る。
完全長ＰＣＳＫ９タンパク質は、シグナル配列（一般に、アミノ酸１から３０）、Ｎ末端ｐｒｏドメイン（「Ｐｒｏ」ドメイン、一般に、アミノ酸３１から１５２）、ズブチリシン様触媒ドメイン（「Ｃａｔ」ドメイン、一般に、アミノ酸１５３から４４６）、ループ領域（一般に、アミノ酸４４７から４５３）及びＣ末端ドメイン（「Ｖ」ドメイン、一般に、アミノ酸４５４から６９２）を含む。
本発明の幾つかの実施形態は、ＰＣＳＫ９（又はその変形物）がＬＤＬＲに結合する能力は、ＰＣＳＫが利用可能なＬＤＬＲの量を効果的に分解又は低下する能力から分離できるという発見に関する。Ｐｒｏ及び／又はＣａｔドメインの一部はＰＣＳＫ９への結合に関与しているのに対して、ＶドメインはＬＤＬＲの効果的な分解にとって重要であることが発見された。さらに、Ｐｒｏ及び／又はＣａｔドメインの活性部分を含むＰＣＳＫ９の変形物は、原型のＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを遮断するために使用することができる。従って、幾つかの実施形態において、本発明は、原型のＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを遮断することができるが、それ自体はＬＤＬＲを効果的に分解しない中和ＰＣＳＫ９変形物に関する。幾つかの実施形態において、本発明は、活性なＰｒｏ／Ｃａｔドメインをなお含み、及び機能的なＶドメインを欠如する（従って、対象中で、ＬＤＬＲを効果的に低下させる能力を欠如する）ＰＣＳＫ９の変形物を含む。この変形物は、原型のＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを妨げるために又は低下させるために使用することができる。次いで、これは、対象中のＬＤＬＲのレベルを効果的に上昇させ、血清中のＬＤＬのより低いレベルをもたらすことができる。
本発明の幾つかの実施形態は、中和ＰＣＳＫ９変形物（例えば、活性なＰｒｏ／Ｃａｔドメイン及び不活性なＶドメインを含む変形物）を使用することによって、ＬＤＬＲがＬＤＬを囲い込むというその有益な役割を実行することを可能にしながら、原型のＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合し、ＬＤＬＲを分解するのを競合的に遮断及び妨害する中和ＰＣＳＫ９変形物がもたらされ得るという発見に関する。従って、ＰＣＳＫ９の中和変形物は対象中の血清ＬＤＬを低下させるために使用することができる。従って、幾つかの実施形態において、本発明は、ＬＤＬＲがＬＤＬに結合し、ＬＤＬに対して作用することをなお可能にしながら、ＬＤＬＲに結合し、原型のＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを妨げることができる中和ＰＣＳＫ９変形物（又はその使用）を含む。
本発明の幾つかの実施形態は、中和ＰＣＳＫ９変形物（例えば、活性なＰｒｏ／Ｃａｔドメイン及び不活性なＶドメインを含む変形物）を使用することによって、ＬＤＬＲのリサイクル（例えば、飲食作用によって細胞内へ取り込まれた後、形質膜へ戻される。）を可能にしながら、原型のＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合し、ＬＤＬＲを分解するのを競合的に遮断及び妨害する中和ＰＣＳＫ９変形物がもたらされ得るという発見に関する。従って、幾つかの実施形態において、本発明は、ＬＤＬＲのリサイクルをなお可能にしながら、ＬＤＬＲに結合し、原型のＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを妨げることができる中和ＰＣＳＫ９変形物（又はその使用）を含む。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＰＣＳＫ９のＰｒｏ及び／若しくはＣａｔドメインの一部若しくは全部を含み、ＰＣＳＫ９のＰｒｏ及び／若しくはＣａｔドメインの一部若しくは全部からなり、又はＰＣＳＫ９のＰｒｏ及び／若しくはＣａｔドメインの一部若しくは全部から実質的になる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物はＶドメインの一部又は全部を含まない。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、完全に機能的なＬＤＬＲ分解性Ｖドメインを有さない。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、不活性なＶドメインを有する。当業者によって理解されるように、これらの実施形態の幾つかは、高コレステロール血症におけるように、対象中の血清コレステロールを低下させることが望まれる状況において有益であり得る。中和ＰＣＳＫ９変形物は、上昇した血清コレステロールレベルを有する対象、上昇した血清コレステロールレベルのリスクを有する対象又は血清コレステロールレベルの低下が有益であり得る対象を治療するための様々な方法及び組成物において使用することができる。従って、血清コレステロールの増加を低下させ、維持し、又は妨げるための様々な方法及び技術も、本明細書中に記載されている。
典型的なヒトＰＣＳＫ９アミノ酸配列が、配列番号１及び３として挙げられている。典型的なヒトＰＣＳＫ９コード配列は、図１Ａ（下線が付されているタンパク質の「プロ」ドメインを図示する。）及び図１Ｂ（太字のシグナル配列及び下線が付されたｐｒｏドメインを図示する。）において、配列番号２として表されている。ＰＣＳＫのさらなる変形物（又はＰＣＳＫ９のＣａｔドメイン）が、図１Ｃから１Ｈに示されている。ＰＣＳＫ９タンパク質の構造は、２つのグループによって最近解決された（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２００７， ａｎｄ Ｐｉｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， １５：１−８，２００７）（何れも、参照により、全体が本明細書に組み込まれる。）。
便宜のため、以下の節は、本明細書において使用される用語の様々な意味を全般的に概観する。この論述に続いて、中和ＰＣＳＫ９変形物に関する一般的な態様が論述されており、その後に、具体的な例が論述されている。
定義及び実施形態
前記一般的な記述及び以下の詳細な説明は何れも例示的及び説明的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載されている本発明を限定するものではないことを理解しなければならない。本願において、単数形の使用は、特に別段の記載がなければ、複数形を含む。この開示において、「又は」の使用は、別段の記載がなければ、「及び／又は」を意味する。さらに、「含んでいる」という用語並びに「含む」及び「含まれた」などのその他の形式の使用は、限定的なものではない。また、「要素」又は「成分」などの用語は、特に別段の記載がなければ、一つのユニットを含む要素及び成分並びに２以上のサブユニットを含む要素及び成分の両方を包含する。また、「部分」という用語の使用は、構成部分の一部又は構成部分の全体を含み得る。
本明細書で使用される見出しは、整理を目的とするものに過ぎず、記載されている主題を限定するものと解釈すべきではない。特許、特許出願、論説、書物及び論文などの（但し、これらに限定されない。）、本願に引用されている全ての文献又は文献の一部は、あらゆる目的のために、その全体が、参照により、本明細書に明示的に組み込まれる。本開示において使用される場合、以下の用語は、別段の記載がなければ、以下の意味を有するものと理解しなければならない。
「プロタンパク質コンベルターゼズブチリシンケクシン９型」又は「ＰＣＳＫ９」という用語は、配列番号１及び／又は３に記載されているポリペプチド又はその断片、並びに対立遺伝子変形物、スプライス変形物、誘導体変形物、置換変形物及び／又は挿入変形物（Ｎ末端メチオニンの付加を含む。）、融合ポリペプチド及び種間相同体を含む（但し、これらに限定されない。）関連ポリペプチドを表す。関連するタンパク質の例は、図１Ｃから１Ｈに記載されている。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９ポリペプチドは、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基及び／又は融合タンパク質残基などの（但し、これらに限定されない。）末端残基を含む。「ＰＣＳＫ９」は、ＦＨ３、ＮＡＲＣ１、ＨＣＨＯＬＡ３、プロタンパク質コンベルターゼズブチリシン／ケクシン９型及び神経アポトーシス制御コンベルターゼ１とも称されている。ＰＣＳＫ９遺伝子は、分泌性スブチラーゼファミリーのプロテイナーゼＫサブファミリーに属するプロタンパク質コンベルターゼタンパク質をコードする。「ＰＣＳＫ９」という用語は、プロタンパク質及びプロタンパク質の自己触媒後に生成される産物の両方を表す。自己触媒された産物のみが引用されている場合には、タンパク質は、「切断された」又は「プロセッシングされた」ＰＣＳＫ９と称され得る。不活性形態のみが引用されている場合には、タンパク質は、ＰＣＳＫ９の「不活性」、「プロ型」又は「プロセッシングを受けていない」形態と称され得る。本明細書において使用されるＰＣＳＫ９という用語には、変異Ｄ３７４Ｙ、Ｄ３７４Ｈ、Ｓ１２７Ｒ、Ｆ２１６Ｌ、Ｒ４６Ｌ、Ｒ２３７Ｗ、Ｌ２５３Ｆ、Ａ４４３Ｔ、Ｈ５５３Ｒ及びその他などの天然に存在する対立遺伝子も含まれる（Ｋｏｔｏｗｓｋｉ ＩＫ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ＰＣＳＫ９ ａｌｌｅｌｅｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｐｌａｓｍａ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ， ＡｍＪ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００６；７８：４１０−４２２）。ＰＣＳＫ９という用語は、グリコシル化、ＰＥＧ化されたＰＣＳＫ９配列、そのシグナル配列が切断されたＰＣＳＫ９配列、触媒ドメインからそのｐｒｏドメインが切断されているが、触媒ドメインから隔てられていないＰＣＳＫ９配列（例えば、図１Ａ及び１Ｂ）など、ＰＣＳＫ９アミノ酸配列の翻訳後修飾を取り込んだＰＣＳＫ９分子も包含する。
「ＰＣＳＫ９活性」という用語は、ＰＣＳＫ９のあらゆる生物学的効果を含む。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、基質若しくは受容体と相互作用し、又は基質若しくは受容体に結合するＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）に結合するＰＣＳＫ９の能力によって表される。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲに結合し、ＬＤＬＲを含む反応を触媒する。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、ＬＤＬＲの利用可能性を変化させる（例えば、低下させる）ＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、対象中のＬＤＬの量を増加させるＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９活性は、ＬＤＬへの結合に利用可能なＬＤＬＲの量を減少させるＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態において、「ＰＣＳＫ９活性」は、ＰＣＳＫ９シグナル伝達から生じるあらゆる生物活性を含む。典型的な活性には、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合、ＬＤＬＲ又は他のタンパク質を切断するＰＣＳＫ９酵素活性、ＰＣＳＫ９作用を促進するＬＤＬＲ以外のタンパク質へのＰＣＳＫ９の結合、ＡＰＯＢ分泌を変化させるＰＣＳＫ９（Ｓｕｎ Ｘ−Ｍ ｅｔ ａｌ， “Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＰＣＳＫ９ ｏｎ ａｐｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｓ ｔｈｅ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｕｎｕｓｕａｌｌｙ ｓｅｖｅｒｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ”， Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４：１１６１−１１６９， ２００５ ａｎｄ Ｏｕｇｕｅｒｒａｍ Ｋ ｅｔ ａｌ， “Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ１００ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ−ｄｏｍｉｎａｎｔ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＰＣＳＫ９， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｅ Ｂｉｏｌ．２４：１４４８−１４５３， ２００４）、肝臓の再生及び神経細胞の分化におけるＰＣＳＫ９の役割（Ｓｅｉｄａｈ ＮＧ ｅｔ ａｌ， “Ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｎｅｕｒａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ １（ＮＡＲＣ−Ｉ）：Ｌｉｖｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”ＰＮＡＳ １００：９２８−９３３， ２００３）及び肝臓のグルコース代謝におけるＰＣＳＫ９の役割（Ｃｏｓｔｅｔ ｅｔ ａｌ．， “Ｈｅｐａｔｉｃ ＰＣＳＫ９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｕｓ ｖｉａ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １ｃ” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（１０）：６２１１−１８，２００６）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＣＳＫ９活性は、本明細書中に定義されている「活性なＰｒｏ／Ｃａｔドメイン」又は「不活性なＶドメイン」という用語とは異なり得る。
本明細書において使用される「高コレステロール血症」という用語は、コレステロールレベルが所望のレベルを上回って上昇している症状を表す。幾つかの実施形態において、これは、血清コレステロールレベルが上昇していることを表す。幾つかの実施形態において、所望のレベルは、当業者に公知である（及び、本明細書に記載され、又は引用されている）様々な「リスク因子」を考慮に入れる。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、一本鎖及び二本鎖ヌクレオチドポリマーの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチドの何れかの種類の修飾された形態であり得る。前記修飾には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾並びにホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホアニロチオアート、ホスホルアニラダート及びホスホロアミダートなどのヌクレオチド間結合修飾が含まれる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００又はそれ以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０から６０塩基の長さである。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０から４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異体遺伝子の構築において使用するために、一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために、放射性標識、蛍光標識、ハプテン又は抗原性標識などの標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマー又はハイブリッド形成プローブとして使用することができる。
「単離された核酸分子」は、単離されたポリヌクレオチドがその中に自然の状態で見出されるポリヌクレオチドの全部若しくは一部を伴っていない、又は自然の状態で連結されていないポリヌクレオチドに連結されているゲノムのＤＮＡ又はＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成起源又はこれらの幾つかの組み合わせを意味する。この開示において、あるヌクレオチド配列「を含む核酸分子」は完全な状態の染色体を包含しないことを理解すべきである。指定された核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、指定された配列に加えて、最大１０個の若しくは最大２０個の他のタンパク質若しくはその一部に対するコード配列を含むことができ、又は引用されている核酸配列のコード領域の発現を調節する作用可能に連結された制御配列を含むことができ、及び／又はベクター配列を含むことができる。
別段の記載がなければ、本明細書中に論述されているあらゆる一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手の方向が５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５‘から３’への付加の方向は、転写方向と称される。ＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’である、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称される。ＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’である、ＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
「調節配列」という用語は、調節配列が連結されているコード配列の発現及びプロセッシングに影響を及ぼすことができるポリヌクレオチド配列を表す。このような調節配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物に対する調節配列には、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列が含まれ得る。例えば、真核生物に対する調節配列には、転写因子に対する認識部位の１つ又は複数を含むプロモーター、転写強化配列及び転写終結配列が含まれ得る。「調節配列」には、リーダー配列及び／又は融合対配列が含まれ得る。
「ベクター」という用語は、宿主細胞中にタンパク質コード情報を伝達するために使用されるあらゆる分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を意味する。
「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、並びに核酸配列に作用可能に連結された１つ又はそれ以上の異種のコード領域の発現を（宿主細胞と一緒に）誘導し及び／又は調節する核酸配列を含有するベクターを表す。発現構築物には、転写、翻訳に影響を及ぼし又は調節し、イントロンが存在する場合には、作用可能に連結されているコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「作用可能に連結された」とは、この用語が適用される成分が、適切な条件下でその固有の機能を発揮できる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質のコード配列に「作用可能に連結された」ベクター中の調節配列は、調節配列の転写活性と適合的な条件下で、タンパク質コード配列の発現が達成されるように、タンパク質コード配列に連結されている。
「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されており、又は核酸配列で形質転換されることができ、これにより、目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は、目的の遺伝子が存在する限り、子孫が元の親細胞と形態的に同一であるかどうか、又は元の親細胞と遺伝的組成が同一であるかどうかを問わず、親細胞の子孫を含む。
「形質移入」という用語は、細胞による外来又は外因性ＤＮＡの取り込みを意味し、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に、細胞は「形質移入され」ている。多数の形質移入技術が本分野において周知であり、本明細書中に開示されている。例えば、「Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９７３， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、上記；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ， １９８１， Ｇｅｎｅ １３：１９７」を参照されたい。このような技術は、適切な宿主細胞中に１つ又はそれ以上の外因性ＤＮＡ部分を導入するために使用することができる。
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変化を表し、新しいＤＮＡ又はＲＮＡを含有するように修飾された場合に、細胞は形質転換されている。例えば、形質移入、形質導入又は他の技術を介して新しい遺伝物質を導入することによって、その固有状態から遺伝的に修飾されている場合に、細胞は形質転換されている。形質移入又は形質導入後に、細胞の染色体中に物理的に統合することによって、形質転換されているＤＮＡは細胞のＤＮＡと組み換えることができ、又は複製されずに、エピソーム要素として一過性に維持されることができ、又はプラスミドとして独立に複製することができる。形質転換されているＤＮＡが細胞の***とともに複製されるときに、細胞は、「安定に形質転換された」と考えられる。
「ポリペプチド」若しくは「タンパク質」という用語は、原型のタンパク質、すなわち、天然に存在する非組換え細胞によって産生されたタンパク質のアミノ酸配列を有する高分子を意味し、又は「ポリペプチド」若しくは「タンパク質」は、遺伝子操作された細胞若しくは組換え細胞によって産生され、原型のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子又は原型配列の１つ若しくはそれ以上のアミノ酸からの欠失、付加及び／又は置換を有する分子を含む。この用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が天然に存在する対応するアミノ酸及びポリマーの化学的類縁体であるアミノ酸ポリマーも含む。具体的には、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、ＰＣＳＫ９タンパク質又は変形物の１つ又はそれ以上のアミノ酸からの欠失、付加及び／又は置換を有する中和ＰＣＳＫ９変形物又は配列を具体的に包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、完全長の原型タンパク質と比べて、アミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失及び／又は内部欠失を有するポリペプチドを表す。このような断片は、原型のタンパク質と比べて、修飾されたアミノ酸も含有し得る。幾つかの実施形態において、断片は約５から５００アミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１０から１４、１４から２０、２０から５０、５０から７０、７０から１００、１００から１１０、１１０から１５０、１５０から２００、２００から２５０、２５０から３００、３００から３５０、３５０から４００又は４００から４５０アミノ酸長であり得る。
「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が（１）通常一緒に見出される少なくとも幾つかの他のタンパク質を含まない、（２）同じ源からの（例えば、同じ種からの）他のタンパク質を実質的に含まない、（３）異なる種からの細胞によって発現されている、（４）自然の状態で一緒に存在するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物又は他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）自然の状態で一緒に存在しないポリペプチドと、（共有又は非共有的相互作用によって）作用可能に結合されている、又は（６）自然の状態で存在しないことを意味する。典型的には、「単離されたタンパク質」は、ある試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％又は少なくとも約５０％を占める。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ若しくは合成起源の他のＲＮＡ又はこれらのあらゆる組み合わせが、このような単離されたタンパク質をコードし得る。好ましくは、単離されたタンパク質は、その治療的、診断的、予防的な研究又はその他の使用を妨害する、その天然環境中に見出されるタンパク質又はポリペプチド又は他のきょう雑物質を実質的に含まない。
「アミノ酸」という用語は、本分野におけるその通常の意味を含み、天然に存在するアミノ酸と天然に存在しないアミノ酸の両方を含む。
ポリペプチドの「変形物」（例えば、中和ＰＣＳＫ９変形物）は、別のポリペプチド配列と比べて、アミノ酸配列中に１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が挿入され、欠失され、及び／又は置換されているアミノ酸配列を含む。変形物は、融合タンパク質を含む。
「同一性」という用語は、配列を並置及び比較することによって決定される、２つ若しくはそれ以上のポリペプチド分子又は２つ若しくはそれ以上の核酸分子の配列間の関係を表す。「％同一性」とは、比較されている分子中のアミノ酸又はヌクレオチド間の同じ残基のパーセントを意味し、比較されている分子のうち最も小さなサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、ある種の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって、好ましくは、（ギャップが存在する場合）並置中のギャップが割り当てられる。並置された核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法には、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ． Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭＪ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３」に記載されているものが含まれる。
％同一性を計算する際には、比較されている配列は、配列間で最大の合致を与えるように通例並置される。％同一性を測定するために使用することができるコンピュータプログラムの一例は、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、％配列同一性を測定すべき２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドを併置するために使用される。配列は、それぞれのアミノ酸又はヌクレオチドの最適な合致が得られるように並置される（アルゴリズムによって決定される「合致したスパン」）。ギャップオープニングペナルティ（３×平均対角として計算される。「平均対角」は、使用されている比較行列の対角の平均である。「対角」は、この比較行列による各完全なアミノ酸の合致に対して割り当てられるスコア又は数である。）及びギャップ伸長ペナルティー（通常、ギャップオープニングペナルティの１／１０である。）並びにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２などの比較行列が、アルゴリズムとともに使用される。幾つかの実施形態において、標準的な比較行列も、アルゴリズムによって使用される（ＰＡＭ２５０比較行列に関して、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：３４５−３５２；ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列に関して、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９を参照）。
ＧＡＰプログラムを用いてポリペプチド又はヌクレオチド配列に対する％同一性を測定する際に使用することができるパラメータの例は、以下のとおりである。
・アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３
・比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，上記から得られるＢＬＯＳＵＭ６２
・ギャップペナルティー：１２（但し、末端ギャップに対するペナルティーはなし）
・ギャップ長ペナルティー：４
・類似性の閾値：０
２つのアミノ酸配列を並置するためのある種の並置スキームは、２つの配列の短い領域の合致のみをもたらす場合があり得、２つの完全長配列の間には有意な関係が存在しなくても、この小さな並置された領域は極めて高い配列同一性を有し得る。従って、標的ポリペプチドの連続するアミノ酸の少なくとも５０又は他の数値を包含する並置をもたらすことが所望されるのであれば、選択された並置法（ＧＡＰプログラム）を調整することができる。
本明細書において使用される、２０の慣用（例えば、天然に存在する）アミノ酸及びそれらの略号は、慣用的な用法に従う。「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ． Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ． Ｒ． Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））」（あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。２０の慣用アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α、α−二置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の非慣用アミノ酸などの非天然アミノ酸も、ポリペプチドに対する適切な成分であり得る。非慣用アミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書において使用されるポリペプチドの表記法では、標準的な用法と慣習に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
同様に、別段の記載がなければ、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手側末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向が５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５‘から３’方向への付加は、転写の方向と称される。ＲＮＡと同じ配列を有し、及びＲＮＡ転写物の５’末端に対して５’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称される。ＲＮＡと同じ配列を有し、及びＲＮＡ転写物の３’末端に対して３’であるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
保存的アミノ酸置換は、生物系内での合成ではなく、通例、化学的なペプチド合成によって通例取り込まれる天然に存在しないアミノ酸残基を包含することができる。これらには、ペプチド模倣物及びアミノ酸部分の他の逆転又は反転された形態が含まれる。
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、クラスに分類され得る。
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及び
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
例えば、非保存的置換は、これらのクラスの１つの一員を別のクラスの一員で交換することを含み得る。このような置換された残基は、例えば、非ヒトＰＣＳＫ９タンパク質と相同であるＰＣＳＫ９タンパク質の領域中に、又は分子の非相同領域中に導入することができる。
ＰＣＳＫ９タンパク質又はその変形物に対して変化を施す上で、ある種の実施形態に従えば、アミノ酸の疎水性親水性指数を検討し得る。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている。疎水性親水性指標は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）である。
タンパク質に対する相互作用性生物機能を付与する上での疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、本分野において理解されている。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。ある種のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸で置換され、なお類似の生物活性を保持できることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変化させる際には、幾つかの実施形態において、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。幾つかの実施形態において、±１以内であるアミノ酸の置換が含まれ、幾つかの実施形態において、±０．５以内であるアミノ酸の置換が含まれる。
類似アミノ酸の置換は、本事例のように、それによって作製される生物学的に機能的なタンパク質又はペプチドを免疫学的実施形態において用いることを意図する場合には特に、親水性に基づいて効果的に実施できることも当分野では理解されている。幾つかの実施形態においては、その隣接アミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の局所的な最大平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関がある。
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化させる際には、幾つかの実施形態において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、幾つかの実施形態において、±１以内であるアミノ酸の置換が含まれ、幾つかの実施形態において、±０．５以内であるアミノ酸の置換が含まれる。親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを特定することもできる。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも称される。
アミノ酸置換の例が表１に示されている。
Figure 0005806110
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「誘導体」という用語は、アミノ酸（又は核酸）の挿入、欠失又は置換以外の化学的修飾を含む分子を表す。幾つかの実施形態において、誘導体は、ポリマー、脂質又は他の有機若しくは無機部分との化学的結合などの（但し、これらに限定されない。）共有修飾を含む。幾つかの実施形態において、化学的に修飾された中和ＰＣＳＫ９変形物は、化学的に修飾されていない中和ＰＣＳＫ９変形物より大きな循環半減期を有することができる。幾つかの実施形態において、化学的に修飾された中和ＰＣＳＫ９変形物は、所望の細胞、組織及び／又は臓器に対する改善された標的誘導能力を有し得る。幾つかの実施形態において、誘導体中和ＰＣＳＫ９変形物は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなど（但し、これらに限定されない。）、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマー付着を含むように共有的に修飾される。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、米国特許第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、米国特許第４，６７０，４１７号、米国特許第４，７９１，１９２号及び米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい。幾つかの実施形態において、誘導体中和ＰＣＳＫ９変形物は、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース又は他の炭水化物をベースとするポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化されたポリオール（例えば、グリセロール）及びポリビニルアルコール並びにこのようなポリマーの混合物などの（但し、これらに限定されない。）１つ又はそれ以上のポリマーを含む。
幾つかの実施形態において、誘導体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニットで共有的に修飾されている。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーは、１つ又はそれ以上の特定の位置で、例えば、誘導体のアミノ末端で結合されている。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の水溶性ポリマーは、誘導体の１つ又はそれ以上の側鎖に無作為に付着されている。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物に対して治療能力を向上させるためにＰＥＧが使用される。幾つかの実施形態において、分子の治療能力を向上させるためにＰＥＧが使用される。ある種のこのような方法が、例えば、米国特許第６，１３３，４２６号（参照により、あらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。）に論述されている。
ペプチド類縁体は、テンプレートペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬として、医薬産業において一般的に使用されている。非ペプチド化合物のこれらの種類は、「ペプチド模倣物（“ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ”又は“ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｔｉｃｓ”」と称されている。「Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ＴＩＮＳ ｐ．３９２（１９８５）；及びＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．，３０：１２２９（１９８７）」（あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）。このような化合物は、しばしば、コンピュータ化された分子モデリングの助けを借りて開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣物は、類似の治療効果又は予防効果を生じさせるために使用し得る。一般に、ペプチド模倣物は、ヒト抗体などの模範ポリペプチド（すなわち、生化学的特性又は薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似するが、本分野で周知の方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合によって必要に応じて置換された１つ又はそれ以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の１つ又はそれ以上のアミノ酸を同種のＤ−アミノ酸で体系的に置換すること（例えば、Ｌ−リジンに代えてＤ−リジン）は、幾つかの実施形態において、より安定なペプチドを作製するために使用し得る。さらに、コンセンサス配列又は実質的に同一なコンセンサス配列変動を含む拘束されたペプチドは、本分野で公知の方法によって、例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、作製され得る（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）、参照により、あらゆる目的のために、本明細書に組み込まれる。）。
ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的物質に関連して本明細書を通じて使用される「天然に存在する」という用語は、自然の状態で見出される物質又は自然の状態で見出される物質の形態を表す。
「組換え中和ＰＣＳＫ９変形物」は、組換え技術を用いて、すなわち、本明細書中に記載されている組換え核酸の発現を通じて作製されたタンパク質である。組換えタンパク質を作製するための方法及び技術は、本分野において周知である。
「中和ＰＣＳＫ９変形物」という用語は、完全長ヒトＰＣＳＫ９と競合的にＬＤＬＲに会合及び／又は結合するＰＣＳＫ９変形物を表す。中和ＰＣＳＫ９変形物は、野生型ＰＣＳＫ９（例えば、配列番号３）と比べて、系からＬＤＬＲを分解又は除去する低下した能力も有する。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は完全に機能的なＬＤＬＲ分解性Ｖドメインを欠如する（例えば、ＰＣＳＫ９タンパク質は不活性なＶドメインを有する。）。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、完全に機能的なＶドメインを欠如する類似の変形物と比べて、ＬＤＬＲを分解し又は系からＬＤＬＲを排出する低下した能力を有する。別の方法で表現すると、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＬＤＬＲの分解を直接又は間接に低下させる能力を有し、従って、系内のＬＤＬＲレベルを維持又は増加させる。
「ｐｒｏ」又は「ｐｒｏドメイン」は、ＰＣＳＫ９のｐｒｏドメインの少なくとも一部を表すために使用される。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９のｐｒｏドメインは、（例えば、Ｃａｔドメインの適切な折り畳みを可能にすることによって直接又は間接的に）ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合に関与している。ｐｒｏドメインの正確な最初の残基及び最後の残基は具体的な実施形態に基づいて変動し得るが、ｐｒｏドメインは、配列番号３の残基６１から１５２及びその変形物を少なくとも含む。幾つかの実施形態において、ｐｒｏドメインは、配列番号３のアミノ酸３１から１５２又はその変形物を含む。ｐｒｏドメインの変形物は、配列番号３の対応するｐｒｏドメイン及び／又はコンセンサス配列（例えば、図１Ｃから１Ｅに示されている。）と５０％又はそれ以上の（例えば、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９８、９８から９９又は９９から１００パーセント同一であり得る。
「Ｃａｔ」又は「ｃａｔドメイン」は、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインの少なくとも一部を表すために使用される。幾つかの実施形態において、「ｃａｔドメイン」は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合に関与している。Ｃａｔドメインの正確な最初の残基及び最後の残基は具体的な実施形態に基づいて変動し得るが、Ｃａｔドメインは少なくとも残基１５３から３８１を含み、幾つかの実施形態において、配列番号３の少なくとも残基１５３から４５５及びその変形物を含む。Ｃａｔドメインの変形物は、配列番号３の対応するＣａｔドメインと５０％又はそれ以上（例えば、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９８、９８から９９又は９９から１００％）同一であり得る。幾つかの実施形態において、ｃａｔドメインは、配列番号３（及びその変形物）の残基１５３から始まり、配列番号３（及びその変形物）の残基４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２又は４５３の何れか１つで終わり得る。従って、Ｃａｔドメインは、配列番号３（及びその変形物）の残基１５３から４４７、１５３から４４８、１５３から４４９、１５３から４５０、１５３から４５１、１５３から４５２、１５３から４５３若しくは１５３から４５４及び／又は（例えば、図１Ｃから１Ｈ及び図１Ｒ１から１Ｒ２、配列番号９、１１、１３、１５及び３０（図１Ｆから１Ｈは、Ｃａｔドメインの例を示す。）に示されている）コンセンサス配列を含み得る。
「Ｐｒｏ／Ｃａｔ」又は「Ｐｒｏ／Ｃａｔドメイン」という用語は、ＬＤＬＲへの結合に関与するＰＣＳＫ９の区画を表すために使用される。「Ｐｒｏ／Ｃａｔドメイン」は、ＰｒｏドメインとＣａｔドメインの両方を含むことは必要としない。特に、「Ｐｒｏ／Ｃａｔドメイン」と称される何らかの物は、ＣａｔドメインなしのＰｒｏドメイン又はＰｒｏドメインなしのＣａｔドメインを含み得る。この用語は、ＰｒｏドメインとＣａｔドメインの両方を含むＰＣＳＫ９タンパク質も包含するが、これらのドメインの両方が存在する必要があるときには、「Ｐｒｏドメイン及びＣａｔドメイン」という用語又は類似の用語が一般に使用される。幾つかの実施形態において、ｐｒｏ／ｃａｔドメインは、配列番号３（及びその変形物）の残基３１又は６１から始まり、配列番号３（及びその変形物）の残基４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２又は４５３の何れか１つで終わり得る。従って、幾つかの実施形態において、Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインは、配列番号３（及びその変形物）の残基３１から４４７、３１から４４８、３１から４４９、３１から４５０、３１から４５１、３１から４５２、３１から４５３、６１から４４７、６１から４４８、６１から４４９、６１から４５０、６１から４５１、６１から４５２及び６１から４５３並びに／又は配列番号４、５、６、７、８、２４から２９及び／若しくは３１並びに／又は（例えば、図１Ｃから１Ｅ及び１Ｒ１から１Ｒ２配列番号９及び３０（並びにＣａｔドメインに関して、ＦからＨ、配列番号１１、１３及び１５）に示されている）コンセンサス配列を含み得る。もちろん、「ｐｒｏ／ｃａｔ」ドメインは、上記されているｐｒｏ又はｃａｔ領域も単純に含み得る。幾つかの実施形態において、ｐｒｏ／ｃａｔドメインの変形物は、配列番号３の対応するｐｒｏ／ｃａｔドメインと５０％又はそれ以上（例えば、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９８、９８から９９又は９９から１００％）同一であり得る。幾つかの実施形態において、ｐｒｏ／ｃａｔドメインは、ｐｒｏ／ｃａｔドメインの保存された区画と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％又はそれ以上同一である。幾つかの実施形態において、（図１Ｃから１Ｅに示されている）１００％保存されたｐｒｏ／ｃａｔドメインの区画はｐｒｏ／ｃａｔ変形物中で保存されているのに対して、残りの位置は変化され得る。幾つかの実施形態において、これらの残りの位置の変化は、配列番号３の対応するｐｒｏ／ｃａｔドメインと５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９８、９８から９９又は９９から１００％同一であるｐｒｏ／ｃａｔ変形物をもたらし得る。幾つかの実施形態において、可変位置は、図１Ｃから１Ｅ及び図１Ｒ１から１Ｒ２では、コンセンサス配列中の空間若しくは間隙として、又は図１Ｆから１Ｈでは、（並びに／又は配列番号９、１１、１３、１５及び３０中の「Ｘａａ」として示されている）非特異的アミノ酸として示されている位置である。
当業者によって理解されるように、添付の図面（１Ｃから１Ｈ及び１Ｉから１Ｌ）に示されている配列の並置は、（様々な中和ＰＣＳＫ９変形物を含む）幾つかの実施形態において、機能的なＰｒｏ、Ｃａｔ、Ｐｒｏ／Ｃａｔ又はＬＤＬＲドメイン若しくはタンパク質を得るために保存され得る残基及び変化され得る残基（及び、どのようにしてそれらを変化させ得るか）を表している。幾つかの実施形態において、コンセンサス配列中の空間によって表される区画は保存が必要とされないアミノ酸であり、これらの位置では、あらゆるアミノ酸を使用することができ、又はアミノ酸を全く使用しないことができる（例えば、これらの位置では、変動は容易に許容され得る。）。幾つかの実施形態において、「＋」によって表される区画は、あらゆるアミノ酸を用いて同様に変化させることができる。幾つかの実施形態において、「＋」によって表される区画は、保存的置換であり又は配列表中の（又は配列並置に関する様々な生物中の）位置に対して注記されている置換である。本明細書に記載されているように、様々なコンセンサス配列が図１Ｃから１Ｌの中に開示されている。従って、図面中に明示的に特定されているコンセンサス配列の他のコンセンサス配列も本明細書中に開示されている。
「Ｖ」又は「Ｖドメイン」という用語は、ＬＤＬＲの効果的な分解に関わっているＰＣＳＫ９タンパク質の区画を表すために使用される。Ｖドメインの正確な最初の残基及び最後の残基は具体的な実施形態に基づいて変動し得るが、Ｖドメインは、配列番号３の残基４５５から６８２及びその変形物を少なくとも含む。幾つかの実施形態において、Ｖドメインは、残基４５７から６７９、４５４から６９２、４５７から６９２、４５７から６８２、４５５から６９２、４５５から６７９、４５４から６８２又は４５４から６７９を少なくとも含む。Ｖドメインの変形物は、配列番号３の対応するＶドメインと５５％又はそれ以上（例えば、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９８、９８から９９又は９９から１００％）同一であり得る。単にｐｒｏ／ｃａｔドメインのｃ末端上にアミノ酸配列が存在するという理由で、その配列はＶドメイン又は活性なドメインとならない。活性なＶドメインは、ＬＤＬＲに関して上記の機能も有する。当業者によって理解されるように、不活性なＶドメインは、活性なＶドメインより可能なドメイン、配列及び構造のより広い範囲を包含する。上記Ｖドメインの機能を達成しないあらゆるタンパク質又はＰＣＳＫ９タンパク質の欠如を、不活性なＶドメインとして特徴付けることができる。
「ループ」という用語は、ＶドメインとＣａｔドメインの間の区画を表すために使用される。この区画は、あらゆる実施形態において、明示的に動員される必要はない。ループの正確な最初の残基及び最後の残基は具体的な実施形態に基づいて変動し得るが、ループは、配列番号３の残基４４７から４５３及びその変形物を含み得る。ループの変形物は、配列番号３のループと０％又はそれ以上（例えば、０から１０、１０から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９８、９８から９９、９９％）同一であり得る。幾つかの実施形態において、ＣａｔドメインへＶドメインを接続するあらゆる構造又は区画をループ区画と考えることができる。幾つかの実施形態において、ループドメインは、ループドメインとして明示的に表記されておらず、単に、Ｃａｔドメイン又はＶドメインの何れかの一部である。
「ＬＤＬＲ分解性」という用語は、完全なＰＣＳＫ９タンパク質の一部のとき、Ｖドメイン（又はその準部分）がＬＤＬＲの分解を促進する能力を表す。本開示に照らして、当業者によって理解されるように、ＶドメインのＬＤＬＲ分解能力は直接的な役割である必要はない。特に、Ｖドメインを欠如するＰＣＳＫ９変形物によって、ＬＤＬＲが分解されることが可能であり得る。従って、ＶドメインのＬＤＬＲ「を分解する役割」又は「能力」は、ＰＣＳＫ９タンパク質のこの区画がＬＤＬＲの効果的な分解に関わっていることを表す。Ｖドメインの除去は、全ての可能な変数及び環境下で、全てのＬＤＬＲの分解を完全に妨げる必要はない（実施例中で以下に明記されているように、幾つかの環境では、完全には妨げない。）。
「完全に機能的なＬＤＬＲ分解性」又は「完全に機能的なＬＤＬＲ分解」という用語は、配列番号３のアミノ酸４５０の後に野生型Ｖドメインを有するＰＣＳＫ９タンパク質から生じるＬＤＬＲ分解の量を表す。従って、「完全に機能的なＬＤＬＲ分解性Ｖドメイン」は、野生型ＰＣＳＫ９（例えば、配列番号３）と等しい及び／又はこれより大きな速度でＬＤＬＲを分解する。ＬＤＬＲ分解に対して完全に機能的でない、不活性なＶドメインを有し、又は完全に機能的なＬＤＬＲ分解性Ｖドメインを欠如するタンパク質は、野生型ＰＣＳＫ９より低く効果的にＬＤＬＲを分解する。従って、例えば、野生型ＰＣＳＫ９の９０％効果的であるに過ぎないＰＣＳＫ９の変形物は、完全に機能的なＬＤＬＲ分解性Ｖドメインを欠如するものとして、又は不活性なＶドメインを有するものとして特定することができる。Ｖドメインを欠如するＰＣＳＫ９変形物は、完全に機能的なＬＤＬＲ分解性Ｖドメインを欠如するものとして又は不活性なＶドメインを有するものとして記載することもできる。完全に機能的なＬＤＬＲ分解性Ｖドメインを欠如し、不活性なＶドメインを有し、又はＶドメインを欠如するＰＣＳＫ９タンパク質は、野生型ＰＣＳＫ９（配列番号３）に比べて１００％未満効果的であり、例えば、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質の９９から９０、９０から８０、８０から７０、７０から６０、６０から５０、５０から４０、４０から３０、３０から２０、２０から１０、１０から５、５から１、１から０．１、０．１から０．０１、０．０１から０．００１、０．００１から０．０００１及び０．０００１から０％効果的であるＰＣＳＫ９タンパク質が含まれる。当業者によって理解されるように、ＶドメインがＬＤＬＲ分解に関して完全には機能的でない限り、中和ＰＣＳＫ９変形物はＶドメインの一部又は全部を含有することができる。Ｖドメインの機能性は、例えば、除去、点変異、挿入、欠失などの様々なアプローチによって調整することができる。
「活性なＰｒｏドメイン」、「活性なＰｒｏ／Ｃａｔドメイン」又は「活性なＣａｔドメイン」において使用される「活性な」という用語は、タンパク質がＬＤＬＲに結合することができることを表す。
「不活性なＶドメイン」において使用される「不活性な」という用語は、問題の分子が、野生型ＰＣＳＫ９中のＶドメインと同等に効果的にＬＤＬＲ分解において機能するＰＣＳＫ９Ｖドメインを有さないことを表す。不活性なＶドメインは、Ｖドメインの配列が存在することを必要としない。幾つかの実施形態において、Ｖドメインタンパク質配列を欠如していれば、中和ＰＣＳＫ９変形物は不活性なＶドメインを有する。
「不活性なＶドメインを有する」という用語は、何れかの区画が存在する場合、Ｖドメインの区画が完全長ＰＣＳＫ９タンパク質中のドメインと同程度にＬＤＬＲ分解において効果的ではないことを表す。これは、Ｖドメインの何れかの一部が実際に存在することを必要としない。従って、Ｖドメイン全体を欠如するＰＣＳＫ９タンパク質も、「不活性なＶドメインを有する」と特定することができる。上述のように、この定義は、不活性なＶドメインを有するタンパク質がＬＤＬＲ分解能の完全な不存在を呈することを要求しない。不活性なＶドメインを有するＰＣＳＫ９タンパク質は、野生型ＰＣＳＫ９（配列番号３）と比べて１００％未満効果的である。このような有効性のより低いレベルの例には、例えば、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質の９９から９０、９０から８０、８０から７０、７０から６０、６０から５０、５０から４０、４０から３０、３０から２０、２０から１０、１０から５、５から１、１から０．１、０．１から０．０１、０．０１から０．００１、０．００１から０．０００１及び０．０００１から０％効果的であるＶドメインを有するＰＣＳＫ９タンパク質が含まれる。不活性な又は不活化されたＶドメインの非限定的な例には、例えば、Ｖドメインを欠如するタンパク質（例えば、Ｖドメイン全体がＰＣＳＫ９タンパク質が存在しない。）、ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号３）の末端（ｃ末端）から１４又はそれ以上のアミノ酸が欠如しているタンパク質、Ｖドメインが不適切に折り畳まれたタンパク質（野生型ＰＣＳＫ９と比べて、例えば、Ｃ６７９Ｘ変異）が含まれる。
「アミノ酸＃＃＃から＃＃＃の全体を欠如する」という用語は、その中で規定されている正確なアミノ酸全体がタンパク質に存在しないことを表す。アミノ酸配列又は範囲の準部分が存在し得る。例えば、タンパク質が「配列番号Ｘのアミノ酸１０から１００の全体を欠如する」場合、配列番号Ｘのアミノ酸１０から９９又は１１から１００は存在し得るが、１０から１００は存在から除外されている。
「配列番号Ｘのアミノ酸＃＃＃に隣接して付着された」という用語は、付着されている（又はされていない）ものが特定のアミノ酸（＃＃＃）に直接隣接して付着されている（又はされていない）ことを表す。用語が否定的文脈（例えば、除外として）で使用されている場合には、前記用語は、アミノ酸＃＃＃が存在する場合、問題の項目がそれに隣接して付着されていないことを表す。しかしながら、この用語の使用は、その否定的文脈において使用された場合に、アミノ酸＃＃＃が実際に存在することを示唆又は要求するものではない。一例として、「配列番号Ｘのアミノ酸９に隣接して付着された配列番号Ｘのアミノ酸１０から１００の全体を欠如する」という用語は、配列番号Ｘのアミノ酸１０から１００の９１アミノ酸の全部が（アミノ酸９が存在する場合）配列番号Ｘのアミノ酸９に隣接する位置から喪失していることを表す。従って、アミノ酸１１から１００が存在し、アミノ酸９に隣接して付着されることができ、アミノ酸１０から９９が存在し、アミノ酸９に隣接して付着されることができ、又はアミノ酸１０から１００が存在し、配列番号３のアミノ酸８若しくは１１の何れかに付着させることができる。除外の上記種類に関しては、アミノ酸９が存在する必要はないことが注目される。従って、（アミノ酸９が存在せず、アミノ酸９に隣接するアミノ酸が存在し得ないので）配列番号Ｘのアミノ酸１から５も上記記述を充足する。さらに、明示的に記載されていなければ、特定のアミノ酸「に隣接する」位置は、表記されているアミノ酸より大きな位置のみである。従って、当該アミノ酸が９であれば、９に隣接する唯一の位置は１０である（従って、位置８は、この定義において、位置９に「隣接する」とは考えられない。）。換言すれば、隣接するとは、カルボキシ方向のアミノ酸にのみ適用され、アミノ方向には適用されない。
「変形物中の適切な位置における」という用語において使用される「適切な位置における」という用語は、変形物中に、適切な位置が存在することを表す。例えば、「中和ＰＣＳＫ９変形物は位置３０にシステインを有する」という用語は、その変形物が位置３０にアミノ酸を有していること、及びそれがシステインであることを表す。この用語が別の配列番号を参照して使用される場合、変形物が、その別の配列番号と、記載されている様式で類似している（又はしていない）ことを表す。この用語が除外として使用される場合、上の定義に記載されているように、その位置自体は変形物中に存在する必要はないが、存在しているのであれば、その位置は記載されている項目ではない。
「標的」という用語は、中和ＰＣＳＫ９変形物によって結合されることができる分子又は分子の一部を表す。
「中和ＰＣＳＫ９変形物」に関して使用される場合、「競合する」又は「競合的」という用語は、ＬＤＬＲに対するａ）原型のＰＣＳＫ９とｂ）ＰＣＳＫ９変形物間の競合を表す。ある中和ＰＣＳＫ９変形物が原型のＰＣＳＫ９と競合するかどうかを決定するために、競合的結合アッセイの多数の種類、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２−２５３参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ， １９８６， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ， １９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ， ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６−５５２参照）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２参照）を使用することができる。
本明細書において使用される「実質的に純粋な」とは、分子の記載されている種が存在している主要な種であること、すなわち、モル濃度ベースで、同じ混合物中の他の何れの個別の種よりも豊富に存在することを意味する。幾つかの実施形態において、実質的に純粋な分子は、対象種が存在する全ての高分子種の少なくとも５０％（モル濃度を基礎とする。）を占める組成物である。他の実施形態において、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％を含む。他の実施形態において、慣用の検出法によって、きょう雑種を組成物中に検出することができず、従って、組成物が単一の検出可能な高分子種からなる実質的均一状態になるまで対象種が精製される。
「因子」という用語は、本明細書において、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子又は生物学的材料から作製された抽出物を表すために使用される。
本明細書において使用される「標識」又は「標識された」という用語は、検出可能なマーカーの取り込みを表す。例には、放射線標識されたアミノ酸の取り込み又は印が付されたアビジン（例えば、光学的又は比色測定法によって検出できる蛍光マーカー又は酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出可能なビオチン部分のポリペプチドへの付着が含まれる。幾つかの実施形態において、標識又はマーカーは、治療用でもあり得る。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が本分野において公知であり、使用することが可能である。ポリペプチドに対する標識の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光性標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光物質）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。幾つかの実施形態において、立体障害の可能性を低減するために、標識は、様々な長さのスペーサーアームによって付着される。
本明細書において使用される「生物学的試料」という用語には、生物又は以前に生物であった物から得られる物質のあらゆる量が含まれるが、これらに限定されない。このような生物には、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ及び他の動物が含まれるが、これらに限定されない。このような物質には、血液、血清、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ節及び皮膚が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「薬剤組成物」（又は因子又は薬物）という用語は、患者に適切に投与された場合に、所望の治療効果を誘導することができる、化学的化合物、組成物、因子又は薬物を表す。薬剤組成物は、成分の２以上の種類を必ずしも必要としない。
「治療的有効量」という用語は、哺乳動物中の治療的応答を生じさせることが決定された中和ＰＣＳＫ９変形物の量を表す。このような治療的有効量は、当業者によって容易に確定される。
本明細書において使用される「調節物質」という用語は、分子の活性又は機能を変化又は改変させる物質である。例えば、調節物質は、調節物質の不存在下で観察される活性又は機能の規模と比べて、分子のある種の活性又は機能の規模の増加又は減少を引き起こすことができる。幾つかの実施形態において、調節物質は、分子の少なくとも１つの活性又は機能の規模を減少させる阻害剤である。分子のある種の典型的な活性及び機能には、結合親和性、酵素活性及びシグナル伝達が含まれるが、これらに限定されない。ある種の典型的な阻害剤には、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物又は小有機分子が含まれるが、これらに限定されない。ペプチボディは、例えば、米国特許第６，６６０，８４３号（国際特許公開ＷＯ０１／８３５２５に対応する。）に記載されている。
「患者」と「対象」という用語は互換的に使用され、ヒト及び非ヒト動物対象並びに以前に診断された疾患を有する対象、以前に認識された疾患を持たない対象、医学的な手当てを受けた対象、疾患を発症するリスクを有する対象などが含まれる。
「治療する」及び「治療」という用語は、治療的処置、予防的処置及び対象が疾患又は他のリスク因子を発症するリスクを低減する適用が含まれる。治療は、疾患の完全な治癒を必要とするものではなく、症候及び／又は伏在するリスク因子を低減させる実施形態を包含する。
「予防する」という用語は、事象の確率を１００％除去することを必要とするものではない。むしろ、「予防する」という用語は、化合物又は方法の存在下で、事象の発生の確率が低下されることを表す。
「原型のＦｃ」という用語は、単量体形態であれ又は多量体形態であれ、完全な抗体の消化から生じた非抗原結合断片の配列を含む分子又は配列を表す。原型のＦｃの元の免疫グロブリン源は、好ましくは、ヒト起源であり、あらゆる免疫グロブリンであり得るが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。原型のＦｃは、共有（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有会合によって二量体又は多量体形態へ連結され得る単量体ポリペプチドから構成される。原型のＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１から４の範囲である。原型のＦｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合された二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：４０７１−９）参照）。本明細書において使用される「原型のＦｃ」という用語は、単量体、二量体及び多量体形態を包括する。
「Ｆｃ変形物」という用語は、原型のＦｃから修飾されているが、サルベージ受容体ＦｃＲｎに対する結合部位をなお含む分子又は配列を表す。国際特許公開ＷＯ９７／３４６３１（１９９７年９月２５日に公開）及びＷＯ９６／３２４７８は、典型的なＦｃ変形物及びサルベージ受容体との相互作用を記載しており、参照により、本明細書に組み込まれる。従って、「Ｆｃ変形物」という用語は、非ヒトの固有のＦｃからヒト化された分子又は配列を含む。さらに、ＰＣＳＫ９の融合分子にとって必要とされない構造的な特徴又は生物学的活性を与えるので、原型のＦｃは除去可能な部位を含む。従って、「Ｆｃ変形物」という用語は、（１）ジスルフィド結合の形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞中での発現に際するＮ末端の不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合又は（７）抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼし、又はこれらに関与する１つ又はそれ以上の原型のＦｃ部位又は残基を欠如する分子又は配列を含む。Ｆｃ変形物は、本明細書の以下でさらに詳しく記載されている。
「Ｆｃドメイン」という用語は、上に定義されている原型のＦｃ及びＦｃ変形物分子及び配列を包含する。Ｆｃ変形物及び原型のＦｃと同様に、「Ｆｃドメイン」という用語は、単量体又は多量体形態の分子（完全な抗体から消化されたか、又は他の手段によって産生されたかを問わない。）を含む。幾つかの実施形態において、Ｆｃドメインは、（例えば、Ｆｃドメインと中和ＰＣＳＫ９変形物間の共有結合を介して）中和ＰＣＳＫ９変形物に会合され得る。
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に対して適用される「多量体」という用語は、共有的に、非共有的に、又は共有的相互作用と非共有的相互作用の両方によって会合された２つ又はそれ以上のポリペプチド鎖を有する分子を表す。ＩｇＧ分子は、典型的には、二量体を形成し、ＩｇＭは五量体、ＩｇＤは二量体、及びＩｇＡは単量体、二量体、三量体又は四量体を形成する。多量体は、Ｆｃの固有のＩｇ源の配列及び生じる活性を活用することによって、又はこのような原型のＦｃを（以下に定義されているように）誘導体化することによって形成することができる。
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に対して適用される「二量体」という用語は、共有的に又は非共有的に会合された２つのポリペプチド鎖を有する分子を表す。
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成及び組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）のための標準的な技術を使用することができる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、又は本分野で一般的に実施されるように、又は本明細書中に記載されているように実施することができる。前記技術及び手技は、本分野において周知の慣用の方法に従って、並びに本明細書を通じて引用及び論述されている様々な一般的な、及びより具体的な参考文献に記載されているように、一般に実施することができる。例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ．（１９８９））」（参照により、あらゆる目的のために本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。特別な定義が与えられていなければ、本明細書中に記載されている分析化学、合成有機化学並びに医学及び薬剤化学に関連して使用される命名法並びにこれらの研究手技及び技術は、本分野において周知であり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬の調製、製剤化及び送達及び患者の治療のための標準的な技術を使用することができる。
中和ＰＣＳＫ９変形物
幾つかの実施形態において、本明細書中に提供されている中和ＰＣＳＫ９変形物は、原型のＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを阻害することができる。幾つかの実施形態において、この遮断は、インビボでのＬＤＬＲの分解の減少をもたらし、これにより、対象中の血清ＬＤＬの低下をもたらす。
上述されているように、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲへ結合する能力及び野生型ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲを効果的に分解する能力は、ＰＣＳＫ９タンパク質の２つの異なる区画によるものであるように見受けられる。以下の実施例に記載されているように、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲを効果的に分解する能力はＰＣＳＫ９のＶドメインに連結されるように見受けられる。従って、幾つかの実施形態において、完全に機能的なＬＤＬＲ分解性Ｖドメインを欠如する（又は不活性なＶドメインを有する）ＰＣＳＫ９の変形物は、ＬＤＬＲ分解の量を有害に増加させずに系又は対象中に導入することができる。さらに、本明細書に記載されているように、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合はＰＣＳＫ９のＰｒｏ及び／又はＣａｔドメインの区画によって媒介される。従って、Ｐｒｏ及び／又はＣａｔドメインの十分な区画を含有する中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＬＤＬＲへなお結合し、ＬＤＬＲへの結合に関して原型のＰＣＳＫ９と競合することができる。幾つかの実施形態において、変形物が完全に機能的なＬＤＬＲ分解性Ｖドメインも欠如する（又は不活性なＶドメインを有する）場合には、ＰＣＳＫ９変形物は原型のＰＣＳＫ９を遮断するのみならず、ＬＤＬＲ分解を低下させ、これにより、ＬＤＬＲの利用可能性を増加させ、次いで、血清中のＬＤＬの量を減少させながら遮断する。従って、幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は活性なＰｒｏ／Ｃａｔドメイン及び不活性なＶドメインを有するＰＣＳＫ９タンパク質である。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＰＣＳＫ９のＰｒｏ及び／若しくはＣａｔドメインを含み、ＰＣＳＫ９のＰｒｏ及び／若しくはＣａｔドメインからなり、又はＰＣＳＫ９のＰｒｏ及び／若しくはＣａｔドメインから実質的になる。幾つかの実施形態において、変形物はシグナル配列（例えば、配列番号３のアミノ酸１から３０）を含む。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３のアミノ酸３１から４４７（又はアミノ酸３１から４４７の変形物）を含み、配列番号３のアミノ酸３１から４４７（又はアミノ酸３１から４４７の変形物）からなり、又は実質的に配列番号３のアミノ酸３１から４４７（又はアミノ酸３１から４４７の変形物）からなる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３のアミノ酸１５３から３７４（又はアミノ酸１５３から３７４の変形物）を含み、配列番号３のアミノ酸１５３から３７４（又はアミノ酸１５３から３７４の変形物）からなり、又は実質的に配列番号３のアミノ酸１５３から３７４（又はアミノ酸１５３から３７４の変形物）からなる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３のアミノ酸３１から３７４（又はアミノ酸３１から３７４の変形物）を含み、配列番号３のアミノ酸３１から３７４（又はアミノ酸３１から３７４の変形物）からなり、又は実質的に配列番号３のアミノ酸３１から３７４（又はアミノ酸３１から３７４の変形物）からなる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３のアミノ酸１５３から４５４（又はアミノ酸１５３から４５４の変形物）を含み、配列番号３のアミノ酸１５３から４５４（又はアミノ酸１５３から４５４の変形物）からなり、又は実質的に配列番号３のアミノ酸１５３から４５４（又はアミノ酸１５３から４５４の変形物）からなる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３のアミノ酸３１から４４９（又はアミノ酸３１から４４９の変形物）を含み、配列番号３のアミノ酸３１から４４９（又はアミノ酸３１から４４９の変形物）からなり、又は実質的に配列番号３のアミノ酸３１から４４９（又はアミノ酸３１から４４９の変形物）からなる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３のアミノ酸１５３から３８１（又はアミノ酸１５３から３８１の変形物）を含み、配列番号３のアミノ酸１５３から３８１（又はアミノ酸１５３から３８１の変形物）からなり、又は実質的に配列番号３のアミノ酸１５３から３８１（又はアミノ酸１５３から３８１の変形物）からなる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３のアミノ酸３１から３８１（又はアミノ酸３１から３８１の変形物）を含み、配列番号３のアミノ酸３１から３８１（又はアミノ酸３１から３８１の変形物）からなり、又は実質的に配列番号３のアミノ酸３１から３８１（又はアミノ酸３１から３８１の変形物）からなる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３のアミノ酸１５３から３８２（又はアミノ酸１５３から３８２の変形物）を含み、配列番号３のアミノ酸１５３から３８２（又はアミノ酸１５３から３８２の変形物）からなり、又は実質的に配列番号３のアミノ酸１５３から３８２（又はアミノ酸１５３から３８２の変形物）からなる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３のアミノ酸３１から３８２（又はアミノ酸３１から３８２の変形物）を含み、配列番号３のアミノ酸３１から３８２（又はアミノ酸３１から３８２の変形物）からなり、又は実質的に配列番号３のアミノ酸３１から３８２（又はアミノ酸３１から３８２の変形物）からなる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３の位置３１、６１若しくは１５３の何れかから始まり、及び配列番号３（又はその変形物の）位置３７４、３８１、３８２、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４若しくは４５５の何れかで終わるアミノ酸を含み、これらからなり、又は実質的にこれらからなる。幾つかの実施形態において、変形物は、配列番号３の関連する区画（例えば、上記されている区画の何れか）に対して、少なくとも５０％同一、例えば、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９８、９８から９９又はそれ以上同一であり得る。幾つかの実施形態において、変形物は、配列番号３の関連する区画に対して、少なくとも７０％の相同性、例えば、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９８、９８から９９又はそれ以上の相同性を有し得る。
幾つかの実施形態において、Ｖドメインは、完全に除去され得る。幾つかの実施形態において、Ｖドメインの区画が除去又は改変され得る。前記区画は、中和ＰＣＳＫ９変形物が著しくＬＤＬＲを分解するのを妨げるのに十分であり得る。
幾つかの実施形態において、変形物はＶドメインの一部又は全部を欠如する。幾つかの実施形態において、Ｖドメインは不活性であり、ＬＤＬＲの分解の野生型レベルを許容しない。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、Ｖドメインを完全に欠如する。幾つかの実施形態において、変形物は、配列番号３の残基４４７から６９２、４４８から６９２、４４９から６９２、４５０から６９２、４５１から６９２、４５２から６９２、４５３から６９２又は４５４から６９２を欠如する。幾つかの実施形態において、上記喪失している区域の何れもが変形物中に存在し得るが、配列番号３の前に位置するアミノ酸と直接隣接して配置されていない。従って、例えば、配列番号３の４５３から６９２、４５４から６９２、４５０から６９２又は４４７から６９２は変形物中に存在することができるが、それぞれ、配列番号３のアミノ酸４５２、４５３、４４９又は４４６の後に位置しない。幾つかの実施形態において、少なくとも配列番号３のＣ末端から最後の１４アミノ酸が喪失しており（又は配列番号３中のアミノ酸と異なっており）、これにより、不活性なＶドメインを作出する。例えば、不活性なＶドメインを作製するために、１４から１６、１６から２０、２０から２５、２５から３０、３０から４０、４０から５０、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から１００、１００から１２０、１２０から１４０、１４０から１６０、１６０から２００、２００から２２０、２２０から２２５アミノ酸をＶドメインのＣ末端部分から欠失させることができる。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は点変異を含む。幾つかの実施形態において、点変異は、ＬＤＬＲへの増加した結合親和性を有するＤ３７４Ｙ点変異である。幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の他の点変異も、中和ＰＣＳＫ９変形物中に含まれる。例えば、Ｉ４７４Ｖ、Ｒ２７３Ｗ、Ｈ８７Ｎ、Ａ１０３Ｄ、Ｇ３０８Ｒ、Ｓ３７６Ｇ、Ｄ４８０Ｇ、Ｒ４９９Ｃ、Ｄ３７４Ｘ（Ｘは、Ｙ、Ａ、Ｈ、Ｒ、Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｌであり得る。）、Ｙ１４２Ｘ、Ｃ６７９Ｘ、Ｒ４６Ｌ、Ｌ２５３Ｆ、Ａ４４３Ｔ、Ａ５３Ｖ、Ｈ５５３Ｒ、Ｑ６１９Ｐ、Ｅ６７０Ｇ及び「Ｋｏｔｏｗｓｋｉ ＩＫ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００６；７８：４１０−４２２」（参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているものなど。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物を作製するために、上記ｐｒｏ及び／又はｃａｔドメイン中の上記変動（変異を含む。）の何れにも、Ｖドメインの上記変動（変異を含む。）及び長さの何れをも含め又は除外することができる。従って、例えば、中和変形物は、上記ｐｒｏ及び／又はｃａｔ領域の何れか１つ（例えば、配列番号３（又はその変形物）の３３１から４５４、３１から４４７、３１から４４９、１５３から３７４、１５３から４５４及び３１から３７４）をも有しながら、それぞれ、配列番号３の位置４５２、４５３、４４９又は４４６の次に位置した配列番号３（又はその変形物）の残基４５３から６９２、４５４から６９２、４５０から６９２又は４４７から６９２を欠如し得る。さらに、本明細書に開示されている中和ＰＣＳＫ９変形物の何れもが、（イソロイシンの代わりに）４７４にバリンを、（グルタミン酸の代わりに）６７０にグリシンを、及び／又は（グリシンの代わりに）６２０にグルタミン酸を含み得る。幾つかの実施形態において、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ配列ＮＭ １７４９３６に定義されている配列である。他のＳＮＰ変形物は、「Ｋｏｔｏｗｓｋｉ ＩＫ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００６；７８：４１０−４２２」に見出すことができ、Ｒ４６Ｌ、Ａ５３Ｖ、Ｌ２５３Ｆ、Ｒ２３７Ｗ、Ａ４４３Ｔ、Ｉ４７４Ｖ、Ｑ６１９Ｐ、Ｅ６７０Ｇ及びその他を含む。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９タンパク質の変形物は、保存されている位置及びＰＣＳＫ９配列間で変動する位置を決定するために、様々なＰＣＳＫ配列を互いに比較することによって選択される。幾つかの実施形態において、様々な生物間で保存されているｐｒｏ及び／又はｃａｔドメイン中のアミノ酸は保存されるのに対して、２つ又はそれ以上の種にわたって保存されていないアミノ酸は、変動させることができる。このような変形物は、結合に関して、原型のＰＣＳＫ９となお競合するｐｒｏ及び／又はｃａｔドメインをなお有し得る。様々な生物のＰＣＳＫ９タンパク質間の配列並置の例は、図１Ｃから１Ｅに見出すことができる。当業者によって理解されるように、コンセンサス配列中の空間は、対応する位置で比較される他のアミノ酸の何れかで、又は、幾つかの実施形態において、あらゆるアミノ酸で充填することができる。図１Ｆから１Ｈは、ｃａｔドメインのみの並置の別の系列を図示する（図中の上の配列は、配列番号３から得られたものである（（配列番号３の）アミノ酸１から１５３及び（配列番号３の）アミノ酸３２１から４５４）。当業者によって理解されるように、コンセンサス配列中の空間は、対応する位置で比較される他のアミノ酸の何れかで、又は、幾つかの実施形態において、あらゆるアミノ酸で充填することができる。図１Ｃから１Ｈ中の配列と配列番号３との間の類似性に鑑みれば、本発明は、上記ｐｒｏ及び／又はｃａｔドメインの何れもが、中和ＰＣＳＫ９変形物（同定されたコンセンサス配列の何れの１つをも含有する変形物を含む。）中で、所望されるとおりに機能できることを想定する。従って、幾つかの実施形態において、異なるＰＣＳＫ９配列間で変動する何れの位置も、中和ＰＣＳＫ９変形物において変化させることができる位置であり得る。幾つかの実施形態において、位置は、並置中で記載されている他のアミノ酸へ変化させる。幾つかの実施形態において、位置は、異なるアミノ酸へ変化される。図１Ｃから１Ｅ中のヒトＰＣＳＫ９配列は、配列番号３に似ているが、配列の末端に一連の余分なアミノ酸（グリシン、その後にプロリン、その後に、８個のヒスチジンなど）を含むことが注目される。様々な実施形態において、グリシン又はプロリンは存在することができ、又は存在しないことができるが、ヒスチジンは、ヒスチジンタグの単なる一部であり、並置の必要な一部ではなく、又は並置中のタンパク質の何れでもない。従って、コンセンサス配列は、その中のヒスチジンの何れをも有する必要がない（これらは、タンパク質の構造的要素ではないので、幾つかの実施例において、８つ全てが除去され得る。）。幾つかの実施形態において、図１Ｃから１Ｅ中のラット配列は、図１Ｅに示されている他の配列と全く同様に、その末端に、グリシン、その後にプロリン、その後に８つのヒスチジンを有する。ＰＣＳＫ９配列のさらなる実施形態が、図１Ｍ１から１Ｓ２、配列番号２５から３１に見出すことができる。
上述されているように、添付の図面（１Ｃから１Ｈ）中に示されているコンセンサス配列は、幾つかの実施形態において、機能的なＰｒｏ／Ｃａｔドメインを得るために保存され得る残基、及び変化させることができる残基（及び、それらをどのようにして変化させることができるか）を示している。幾つかの実施形態において、空間によって表されたコンセンサス配列中の区域は保存が必要とされないアミノ酸であり、これらの位置では、あらゆるアミノ酸を使用することができ、又はアミノ酸を全く使用しないことができる（例えば、これらの位置では、変動は容易に許容され得る。）。幾つかの実施形態において、「＋」によって表される区画は、あらゆるアミノ酸を用いて同様に変化させることができる。幾つかの実施形態において、「＋」によって表される区画は、保存的置換であり又は配列表中の（又は配列並置に関する様々な生物中の）位置に対して注記されている置換である。
図１Ｃから１Ｅでは、３つ以上のアミノ酸配列が並置されているので、コンセンサス配列は、Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインがその機能性を失うことなく変動させることができる各アミノ酸位置に空間を示していない。従って、この並置では、幾つかの実施形態に対して、明示的に表記されているコンセンサス配列中の特定のアミノ酸として表記されているアミノ酸でさえ変動させることが可能であり、機能的なＰｒｏ／Ｃａｔドメインをなおもたらし得る。例えば、幾つかの実施形態において、（図１Ｃから１Ｅ中の）コンセンサス中の特定のアミノ酸が割り振られているが、様々な生物間で変動するアミノ酸位置を改変することが可能である。従って、幾つかの実施形態において、（例えば、図１Ｃから１Ｅに示されているように）、生物間で保存されているアミノ酸位置が、中和ＰＣＳＫ９変形物中で保存されているが、他のアミノ酸位置（様々な生物間で異なるアミノ酸位置）は、コンセンサス配列の特定の位置に表記されているアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換することができる。幾つかの実施形態において、コンセンサス配列中のアミノ酸を置換するアミノ酸はあらゆるアミノ酸（又は不存在）であり、図１Ｃから１Ｅ中に示されている異なる配列中に出現するアミノ酸に限定する必要はない。幾つかの実施形態において、アミノ酸の変化は、示されている様々なアミノ酸配列中のその位置に示されているアミノ酸の少なくとも１つと同じであるアミノ酸に対する。幾つかの実施形態において、１つの位置に対して並置されたアミノ酸が異なるが、保存されていれば、コンセンサス配列中のアミノ酸位置は、保存された特性（例えば、極性）を有するあらゆるアミノ酸であり得る。幾つかの実施形態において、種の１つ又はそれ以上の間で同一であるアミノ酸が中和ＰＣＳＫ９変形物中に存在するのに対して、他の位置における他のアミノ酸の１つ又はそれ以上は変動する。幾つかの実施形態において、図１Ｃから１Ｅにおいて、様々な生物間で同一でない１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０又はそれ以上のアミノ酸を、他のあらゆるアミノ酸によって置換することができる。幾つかの実施形態において、図面中に挙げられている種の全てにわたって同一であるアミノ酸が同じに保たれているのに対して、他の位置のアミノ酸は変動させることが可能であり、これらのアミノ酸の最大０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％が別のアミノ酸へ変化される。幾つかの実施形態において、図面に示されている保存されたアミノ酸は、別のアミノ酸によって変化され、又は置換され得る。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物を作製する際に、様々な生物の様々なＰＣＳＫ９タンパク質間で保存されているＶドメイン中のアミノ酸は変化されるのに対して、１つ又はそれ以上の種にわたって保存されていないアミノ酸は保存され、これにより、Ｖドメインが活性でない（すなわち、不活性である）タンパク質を作製する。様々な動物から得られるＰＣＳＫ９間でのこの比較の例は、図１Ｃから１Ｅに見出すことができる。従って、幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物を作製するために、ｐｒｏ及び／又はｃａｔドメイン中の保存されたアミノ酸が維持され得るようにしながら、ＰＣＳＫ９のＶドメイン中の保存されたアミノ酸の何れをも変化させることができる。幾つかの実施形態において、アミノ酸は、並置中で記載されている他のアミノ酸へ変化される。幾つかの実施形態において、アミノ酸は異なるアミノ酸へ変化される。
幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合において重要である残基が、ｐｒｏ及び／又はｃａｔドメイン中で維持される。例えば、断片配列内に存在するのであれば、ＬＤＬＲとＬＤＬの間又はＬＤＬＲとＰＣＳＫ９の間の結合表面の一部として本明細書中で同定された残基又は結合表面の作製に関与している残基並びにＡｒｇ１９４及びＰｈｅ３７９など、「ＰＣＳＫ９によるＬＤＬの認識のための分子的基礎（ＰＮＡＳ、１０５：１８２０−１８２５，２００８）」に論述されている残基が維持される。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、少なくとも残基１９４から３７９を含む。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＰＣＳＫ９の１つ又はそれ以上の生物学的活性を阻害し、妨害し、又は調節することができる。一実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＬＤＬＲへの結合に関して、原型のＰＣＳＫ９と競合する。 幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＬＤＬＲへの原型のＰＣＳＫ９の結合を少なくとも１％の低下させる、例えば、ＬＤＬＲへの原型のＰＣＳＫの結合を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の低下させる。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、原型のＰＣＳＫ９のＬＤＬＲへの結合の遮断に関して、１μＭ未満、１０００ｎＭから１００ｎＭ、１００ｎＭから１０ｎＭ、１０ｎＭから１ｎＭ、１０００ｐＭから５００ｐＭ、５００ｐＭから２００ｐＭ、２００ｐＭ未満、２００ｐＭから１５０ｐＭ、２００ｐＭから１００ｐＭ、１００ｐＭから１０ｐＭ、１０ｐＭから１ｐＭのＩＣ５０を有する。このＩＣ５０は、ＬＤＬＲへの原型のＰＣＳＫ９とＬＤＬＲへの中和ＰＣＳＫ９変形物との間で測定することができる。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、Ｃ６７９Ｘ及び／又はＱ５５４Ｅ点変異を含まない。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物はＨｉｓタグを含まない。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物はＧＳＴタグを含まない。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、該変形物中の対応する位置に、配列番号３の残基４５３を含む。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９変形物は、タンパク質から除去された残基４５３から６９２の全体を有さない。例えば、幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、残基３１から４５３を含む。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３の４４７、４４８、４４９、４５０、４５１及び４５２（又はこれらの幾つかの組み合わせ）などの残基を欠如する。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、これらの位置において、一切のアミノ酸を欠如する。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３に関して上に特定されている特異的な位置において、対応するアミノ酸を欠如する。幾つかの実施形態において、明示的に述べられている場合、中和ＰＣＳＫ９変形物は、２００８年８月２２日に出願された米国特許出願第１２／１９７０９３号（参照により、その全体及び特に、抗原結合タンパク質及びＰＣＳＫ９タンパク質及びその変形物に関する開示に関して本明細書に組み込まれる。）に開示されているＰＣＳＫ９変形物を除外することができる。例えば、明示的に述べられている場合、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ｈｉｓタグあり又はなしに、ＰＣＳＫ９ ＰｒｏＣａｔ３１から４４９及び／又はＰＣＳＫ９ ＰｒｏＣａｔ３１から４５４などのＰＣＳＫ９タンパク質／変形物を除外することができる。幾つかの実施形態において、明示的に述べられている場合、中和ＰＣＳＫ９変形物は、（Ｈｉｓタグ又はＧＳＴタグを有する）残基１から４５２（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， “Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＰＣＳＫ９ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ＬＤＬＲ−Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ”に定義されているように配列を付番）、残基１から４５４及び１から６８１、２１９から６９２（「Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， “ＮＡＲＣ−１／ＰＣＳＫ９ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｍｕｔａｎｔｓ，”２７９：４８８６５−４８８７５， ２００４に定義されている配列の付番）；残基２１９から６９２「Ｂｅｎｈａｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，“Ｔｈｅ Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ（ＰＣ） ＰＣＳＫ９ ｉｓ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ Ｆｕｒｉｎ ａｎｄ／ｏｒ ＰＣ５／６Ａ，”２８１（４１）：３０５６１−３０５７２（２００６）」に定義されている配列の付番；残基１から４５２及び４２３から６９２（「Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，“Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｏｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＰＣＳＫ９ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ＬＤＬＲ−Ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，”４７：１６３１−１６３９ ２００８」に定義されている配列の付番）；残基１から４５５、１から４５４及び／又は残基３１から４５４（「Ｎａｓｓｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｆｆｉｃ，“Ｔｈｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ＰＣＳＫ９ ａｎｄ ｉｔｓ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ＬＤＬＲ，” ８：７１８−７３２， ２００７」によって定義されている配列の付番）；ＷＯ２００７／１２８１２１中のあらゆるＣ末端欠失；残基１から４５４（「Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ， “Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ＰＣＳＫ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”１０５：１３０４５−１３０５０， ２００８）」によって定義されている配列の付番）；残基１から４２５、１から４５３、１から６９４、３１から４５３及び１から５０７（「Ｎａｕｒｅｃｋｉｅｎｅ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ， “Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｒｃ１， ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ”， ４２０：５５−６７， ２００３」によって定義されている配列の付番）；残基３１から４５１及び／又は残基５３から４５１（以下のもの：Ｐ１５５Ｇ、Ｗ１５６Ｌ、Ｎ１５７Ｋ、Ｌ１５８Ａ、Ｉ１６１Ａ、Ｒ１９４Ａ、Ｄ２３８Ａ、Ｄ３７４Ｙ、Ｓ３８６Ａなど、Ｈｉｓタグあり又はなしのこれらの何れかの変形物を含む。）（「Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， “Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ ＰＣＳＫ９／ＥＧＦ−ＡＢ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ ＦＨ ｍｕｔａｎｔｓ，” ２８４：１３１３−２３， ２００８」に定義されている配列の付番）；５８アミノ酸の第８エキソンのフレーム内欠失、例えば、残基３９５から４５２の欠失（「Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，“Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓｐｌｉｃｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／Ｋｅｘｉｎ Ｔｙｐｅ ９”， ２７：１８３−１８９， ２００８」に記載されているように、１から３９４及び４５３から末端までを保持している。）；並びに／又は残基１から６９２（ヒト）、１から６９１（ラット）、１から３１６（ラット）、１から３９０（ラット）、１から３９０（Ｓ３８５Ａ、ラット）、１から４２５（ラット）、１から４５３（ラット）、１から５０７（ラット）、３１から６９１（ラット）、１４８から６９１（ラット）、１から６９１（ラット、場合によって存在する３１から１４７の欠失、場合によって存在する１４８から４２５の欠失、場合によって存在する２１９から３９５の欠失、ヒスチジン２２５−＞トリプトファン、セリン３８５−＞アラニン、又はヒスチジン２２５−＞トリプトファン、及びセリン３８５−＞アラニンを含む。）、１から１４２及び／若しくは１から６７９（「Ｂｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．， “Ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＮＡＲＣ１（＝ＰＣＳＫ９）， ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，”６９（１１）：１１２３−３１， ２００６」に定義されている配列の付番）からなるＰＣＳＫ９変形物を除外し得る。上記参考文献の各々の開示全体が、特に、様々なＰＣＳＫ９配列の開示及びその考察に関して、参照により、本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態において、上記変形物の何れか１つ又はそれ以上が、有用な中和ＰＣＳＫ９変形物の群内に包含される。幾つかの実施形態において、上記の何れか又は全てが、医薬として許容される担体とともに若しくはその中に組み合わされることができ、又は医薬の調製のために使用することができる。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＮＭ−１７４９３６又はｇｉ３１３１７３０６のｃＤＮＡ配列中のｐｒｏ／ｃａｔドメインと異なるｐｒｏ／ｃａｔドメインを有する。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、以下の位置：４７４、６２０又は６７０の少なくとも１つに点変異を含む。幾つかの実施形態において、点変異は、Ｖａｌ４７４Ｉｓｏ、Ｇｌｙ６７０Ｇｌｕ及び／又はＧｌｕ６２０Ｇｌｙである。
ビヒクル
「ビヒクル」という用語は、治療用タンパク質に共有的に又は非共有的に結合された場合に、分解を抑制し、及び／若しくは半減期を増加させ、毒性を低下させ、免疫原性を低下させ、又は治療用タンパク質の生物学的活性を増加させる分子を表す。典型的なビヒクルには、Ｆｃドメイン（例えば、原型のＦｃ、Ｆｃ変形物、Ｆｃドメイン、多量体及び二量体を含む。）；及び直鎖ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリジン、デキストランなど）；分岐鎖ポリマー（例えば、１９８１年９月１５日に、Ｄｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒ他に付与された米国特許第４，２８９，８７２号；１９９３年７月２０日にＴａｍに付与された米国特許第５，２２９，４９０号；１９９３年１０月２８日に公開されたＦｒｅｃｈｅｔ他によるＷＯ９３／２１２５９参照）；脂質；コレステロール基（ステロイドなど）；炭水化物若しくはオリゴ糖；又はサルベージ受容体に結合するあらゆる天然若しくは合成の、タンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドが含まれる。ビヒクルは、米国特許第６，６６０，８４３号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）中にさらに記載されている。幾つかの実施形態において、複数のビヒクルが使用される（例えば、各末端のＦｃ又は末端のＦｃ及び他方末端又は側鎖のＰＥＧ基）。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、上記ビヒクルの何れかの１つ又はそれ以上に、組み合わされ、会合され、混合され又は結合される。
別のビヒクルは、サルベージ受容体に結合することができる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片又は小分子（例えば、ペプチド模倣化合物）である。例えば、１９９８年４月１４日にＰｒｅｓｔａ他に付与された米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているポリペプチドをビヒクルとして使用することができる。ペプチドは、ＦｃＲｎサルベージ受容体への結合に関して、ファージディスプレイによっても選択することができる。このようなサルベージ受容体結合化合物も、「ビヒクル」の意味の中に含まれ、本発明の範囲に属する。このようなビヒクルは、（例えば、プロテアーゼによって認識される配列を回避することによる）増加した半減期及び（例えば、抗体のヒト化において発見されたように、非免疫原性配列を優先することによる）減少した免疫原性に関して選択されるべきである。
上述されているように、ポリマービヒクルも使用することができる。ビヒクルとして有用な化学的部分を付着するための様々な手段が現在利用可能であり、例えば、「Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」という名称の特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公開ＷＯ９６／１１９５３（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。このＰＣＴ公報は、とりわけ、タンパク質のＮ末端への水溶性ポリマーの選択的な付着を開示している。
幾つかの実施形態において、ポリマービヒクルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ基は、あらゆる都合のよい分子量のものであり得、直鎖又は分岐であり得る。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは、約２キロダルトン（「ｋＤ」）から約１００ｋＤａ、より好ましくは、約５ｋＤａから約５０ｋＤａの範囲である。ＰＥＧ基は、ＰＥＧ部分上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基）を通じた、本発明の化合物上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ又はエステル基）へのアシル化又は還元的アルキル化を介して、一般に、中和ＰＣＳＫ９変形物へ付着される。
幾つかの実施形態において、合成ペプチドのＰＥＧ化のための有用な戦略は、溶液中での共役結合の形成を通じて、ペプチドとＰＥＧ部分（それぞれ、他方に対して相互に反応性である特殊な官能性を有する。）を組み合わせることを含む。ペプチドは、旧来の固相合成を用いて容易に調製することができる。ペプチドは、特定の部位において、適切な官能基を用いて「予め活性化」される。前駆体は、ＰＥＧ部分と反応させる前に、精製され、完全に性質決定される。ＰＥＧとのペプチドの連結は、通常、水相内で行われ、逆相分析用ＨＰＬＣによって容易にモニターすることができる。ＰＥＧ化されたペプチドは、調製用ＨＰＬＣによって容易に精製し、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱離質量分析法によって性質決定することができる。
多糖ポリマーは、タンパク質修飾のために使用することができる水溶性ポリマーの別の種類である。デキストランは、α１から６結合によって主に結合されたグルコースの個々のサブユニットから構成された多糖ポリマーである。デキストラン自体は、多くの分子量範囲で入手可能であり、約１ｋＤから約７０ｋＤの分子量で容易に入手可能である。デキストランは、単独で又は別のビヒクル（例えば、Ｆｃ）と組み合わせてビヒクルとして使用するための適切な水溶性ポリマーである。例えば、ＷＯ０６／１１９５３及びＷＯ９６／０５３０９を参照されたい。治療用又は診断用免疫グロブリンに連結されたデキストランの使用は報告されており、例えば、欧州特許公開０３１５４５６号（参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。約１ｋＤから約２０ｋＤのデキストランを使用することができる。
別の実施形態において、ビヒクルは、治療用タンパク質の分解を抑制し、及び／若しくは半減期を増加させ、毒性を低下させ、免疫原性を低下させ、又は生物学的活性を増加させることが知られている又はこのように考えられている非Ｆｃペプチド又はポリペプチドである。このようなタンパク質ビヒクルの例には、トランスサイレチン又はＨＳＡタンパク質融合物が含まれる。これらのビヒクルは、ＰＣＳＫ９変形物へ融合することができる。
リンカー
全ての「リンカー」基は、場合によって存在する。存在する場合、リンカーは主としてスペーサーとしての役割を果たすので、リンカーの化学的構造は重要ではない。リンカーは、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸から構成され得る。従って、幾つかの実施形態において、リンカーは、ペプチド結合によって連結された１から２０個のアミノ酸から構成され、アミノ酸は天然に存在する２０のアミノ酸から選択される。当業者によって十分に理解されるように、これらのアミノ酸の幾つかはグリコシル化され得る。幾つかの実施形態において、１から２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリジンから選択される。幾つかの実施形態において、リンカーは、グリシン及びアラニンなど、立体的に妨害されないアミノ酸の大半から構成される。幾つかの実施形態において、リンカーは、ポリグリシン（特に、（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）及びポリアラニンである。リンカーの他の具体例は、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４；（Ｇｌｙ）３ＡＳｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２；（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４；及びＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙである。
上記命名法を説明するために、例えば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。ＧｌｙとＡｌａの組み合わせも好ましい。ここに示されているリンカーは例示であり、これよりずっと長くすることがであり、他の残基を含むことができる。
非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）（ｓ＝２から２０）などのアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどのあらゆる非立体妨害基によってさらに置換され得る。典型的な非ペプチドリンカーは、ＰＥＧリンカーであり、１００から５０００ｋＤ、例えば、１００から５００ｋＤの分子量を有する。ペプチドリンカーは、上に記載されているのと同様の様式で、誘導体を形成するために変化させることができる。
誘導体
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物（及び／又はビヒクル）は誘導体化される。このような誘導体は、化合物の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善し得る。あるいは、この部分は、化合物のあらゆる望ましくない副作用などを除去又は減弱し得る。幾つかの実施形態において、前記部分は、全体としての分子にさらなる特性を付加することができる。典型的な誘導体は、本明細書中に提供されている。
中和ＰＣＳＫ９変形物又はその一部分は環状である。例えば、ペプチド部分は、ジスルフィド結合の形成によって環状化し得る、２つ又はそれ以上のＣｙｓ残基を（例えば、リンカー中に）含有するように修飾され得る。
中和ＰＣＳＫ９変形物は架橋され、又は分子間で架橋が可能なようにされる。例えば、ペプチド部分は、１つのＣｙｓ残基を含有するように修飾することができ、これにより、同様の分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができる。化合物は、そのＣ末端を通じて架橋することもできる。
１つ又はそれ以上のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］連結（結合）は、非ペプチジル連結によって置換される。典型的な非ペプチジル連結は、−ＣＨ２−カルバマート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホナート、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−第二級アミン及びアルキル化されたペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−（Ｒ６は、低級アルキルである。）］である。
Ｎ末端は、誘導体化される。典型的には、Ｎ末端は、アシル化され、又は置換されたアミンへ修飾され得る。典型的なＮ末端誘導体基には、−ＮＲＲ１（−ＮＨ２以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ４、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシンイミド又はベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）（Ｒ及びＲ１は、それぞれ独立に、水素又は低級アルキルであり、フェニル環はＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、クロロ及びブロモからなる群から選択される１から３個の置換基で置換され得る。）が含まれる。
遊離のＣ末端は、誘導体化される。典型的には、Ｃ末端は、エステル化又はアミド化される。例えば、中和ＰＣＳＫ９変形物に（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）２を付加するために、本分野において記載された方法を使用することができる。同様に、中和ＰＣＳＫ９変形物に、−ＮＨ２を付加するために、本分野で記載されている方法を使用することができる。典型的なＣ末端誘導体基には、例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２（Ｒ２は、低級アルコキシ又は−ＮＲ３Ｒ４（Ｒ３及びＲ４は、独立に、水素又はＣ１−Ｃ８アルキル（好ましくは、Ｃ１−Ｃ４アルキル）である。）が含まれる。
ジスルフィド結合は、別の（好ましくは、より安定な）架橋部分（例えば、アルキレン）と置換される。例えば、「Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）， Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９；Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ａｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．， ３５７−９８」を参照されたい。１つ又はそれ以上の各アミノ酸残基が修飾される。以下で詳しく記載されているように、様々な誘導体化剤が選択された側鎖又は末端残基と特異的に反応することが知られている。
リジン残基及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応させることができ、これはリジン残基の電荷を反転させる。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、メチルピコリンイミダート；ピリドキサルリン酸；ピリドキサル；クロロ水素化ホウ素（ｃｈｌｏｒｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシラートとのトランスアミナーゼ触媒された反応などのイミドエステルが含まれる。アルギニン残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンなどの、幾つかの慣用試薬のあらゆる１つ又は組み合わせとの反応によって修飾することができる。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａの故に、アルカリ条件で反応を行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基及びアルギニンのεアミノ基と反応させることができる。チロシン残基の特異的な修飾は広く研究されており、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によって、チロシン残基中にスペクトル標識を導入することに特に関心が持たれる。最も一般的には、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成するために、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンが使用される。カルボキシル側鎖基（アスパラギン酸又はグルタミン酸）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって、選択的に修飾され得る。さらに、アスパラギン酸及びグルタミン酸残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギン及びグルタミン残基へ転化され得る。グルタミン及びアスパラギン残基は、対応するグルタミン酸及びアスパラギン酸残基へ脱アミド化され得る。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。システイン残基は、ジスルフィド結合を除去するために、又は逆に架橋を安定化するために、アミノ酸残基又は他の部分によって置換され得る。例えば、「Ｂｈａｔｎａｇａｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）， Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９」を参照されたい。
二官能性因子での誘導体化は、ペプチド又はその機能的誘導体を架橋して、水に不溶性の支持体マトリックス又は他の高分子ビヒクルにするのに有用であり得る。一般的に使用される架橋剤には、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル）、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）などのジスクシンイミジルエステル及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドを含むホモ二官能性イミドエステルが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を与える。あるいは、臭化シアン活性化された炭水化物並びに米国特許第３，９６９，２８７号；米国特許第３，６９１，０１６号；米国特許第４，１９５，１２８号；米国特許第４，２４７，６４２号；米国特許第４，２２９，５３７号；及び米国特許第４，３３０，４４０号に記載されている反応性基質などの水に不溶性の反応性マトリックスが、タンパク質の固定化のために使用される。
炭水化物（オリゴ糖）基は、タンパク質中のグリコシル化部位であることが知られている部位へ付着させることができる。一般に、Ｏ結合型オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）又はスレオニン（Ｔｈｒ）残基へ付着されるのに対して、Ｎ結合型オリゴ糖は、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは、プロリンを除くあらゆるアミノ酸であり得る。）の一部である場合、アスパラギン（Ａｓｎ）残基に付着される。Ｘは、好ましくは、プロリン以外の天然に存在する１９のアミノ酸の１つである。Ｎ結合型及びＯ結合型オリゴ糖の構造並びにそれぞれの型に見出される糖残基は異なる。両者の上に一般に見出される糖の１つの種類は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と称される。）である。シアル酸は、通常、Ｎ結合型及びＯ結合型オリゴ糖の両者の末端残基であり、その負電荷のために、グリコシル化された化合物に酸性特性を付与し得る。このような部位は、中和ＰＣＳＫ９変形物のリンカー中に取り込まれることが可能であり、（例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳動物細胞中での）ポリペプチド化合物の組換え産生の間に、細胞によってグリコシル化され得る。しかしながら、このような部位は、本分野において公知の合成又は半合成手法によって、さらにグリコシル化することができる。
他の可能な修飾には、プロリン及びリジンの水酸化、セリン又はスレオニン残基の水酸基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が含まれる。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐｐ．７９−８６（１９８３）。
幾つかの実施形態において、ＰＥＧ化の部位として、中和ＰＣＳＫ９変形物中にシステイン、アルギニン及び／又はリジンを導入することができる。
中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＤＮＡレベルでも変化させることができる。化合物のあらゆる部分のＤＮＡ配列を、選択された宿主細胞とより適合的なコドンへ変化させることができる。制限部位を除去するために、又はサイレント制限部位を含めるためにコドンを置換することができ、これは選択された宿主細胞中でのＤＮＡのプロセッシングを補助することができる。前記配列変化の何れかを含めるために、ビヒクル、リンカー及びペプチドＤＮＡ配列を修飾することができる。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比べて、グリコシル化合部位の数及び／又は種類が変化を受けているグリコシル化を含む。幾つかの実施形態において、タンパク質変形物は、原型のタンパク質より多数の又は少数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘと表記されているアミノ酸残基は、プロリンを除くあらゆるアミノ酸残基であり得る。）によって特徴付けられる。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型炭水化物鎖を付加するための新たな候補部位を与える。あるいは、この配列を除去する置換は、既存のＮ結合型炭水化物鎖を除去する。１つ又はそれ以上のＮ結合型グリコシル化部位（典型的には、天然に存在するもの）が除去され、及び１つ又はそれ以上の新しいＮ結合型部位が作製されているＮ結合型炭水化物鎖の再構成も提供される。さらなる好ましい変形物には、親アミノ酸配列と比べて、１つ又はそれ以上のシステイン残基が欠失され、又は別のアミノ酸（例えば、セリン）に置換されているシステイン変形物が含まれる。システイン変形物は、原型のタンパク質より少ないシステイン残基を一般に有し、対を形成していないシステインから生じた相互作用を最小化するために、通例、偶数を有する。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は抗体の少なくとも一部と会合される。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は抗体融合タンパク質の一部である。当業者によって理解されるように、融合タンパク質は、様々な抗体配列を含むことができる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は完全長抗体に融合される。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物はＬＤＬＲに結合する抗体に融合されることによって、中和ＰＣＳＫ９変形物がその標的に誘導される可能性をさらに増加させる。非中和抗体融合物も、本発明の一態様を形成する。この実施形態において、ＰＣＳＫ９変形物に融合された非中和抗体は、ＰＣＳＫ９変形物の半減期を増加させるという機能を発揮し得る。
幾つかの実施形態において、上述されているように、中和ＰＣＳＫ９変形物は、Ｆｃドメインなどの抗体の断片に融合される。幾つかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインからなり、又は実質的にＦｃドメインからなる。幾つかの実施形態において、融合タンパク質は、原型のＦｃ領域を含み、原型のＦｃ領域からなり、又は実質的に原型のＦｃ領域からなる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物に付着又は融合される抗体又はその結合断片はＬＤＬＲに結合する。
幾つかの実施形態において、抗体融合物を含む本明細書中に開示されている中和ＰＣＳＫ９変形物の何れもが、このようなタンパク質配列をコードする核酸配列から作製され得る。従って、これらの化合物を含む核酸配列、ベクター及び細胞も、本明細書において想定される。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物はＬＤＬＲ変形物に結合する。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲの変形物は、ヒトＬＤＬＲと少なくとも５０％同一である。ＬＤＬＲの変形物は、当業者に公知であることが注目される（例えば、ＢｒｏｗｎＭＳ他、“Ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｇｅｓ， ａｃｉｄ ｂａｔｈｓ ａｎｄ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ” Ｎａｔｕｒｅ ３８８：６２９−６３０， １９９７）。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ヘテロ接合の家族性高コレステロール血症（ＬＤＬＲの機能喪失変形物が存在する。）中の有効ＬＤＬＲのレベルを上昇させることができる。３つの典型的なＬＤＬＲ配列が、図１Ｉから１Ｌに示されている（マウス、カニクイザル及びヒトアミノ酸配列）。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、図１Ｉから１Ｌ中の配列の少なくとも１つを含むタンパク質に結合する。幾つかの実施形態において、原型のＰＣＳＫ９変形物は、図１Ｉから１Ｌ中のコンセンサス配列を含み、図１Ｉから１Ｌ中のコンセンサス配列からなり、又は図１Ｉから１Ｌ中のコンセンサス配列から実質的になるＬＤＬＲ変形物に結合する。幾つかの実施形態において、ＬＤＬＲ変形物は、図１Ｉから１Ｌ中のコンセンサス配列中で特定されている保存されたアミノ酸残基の各々を含む。当業者によって理解されるように、コンセンサス配列中の空間は、対応する位置で比較される他のアミノ酸の何れかで、又は、幾つかの実施形態において、あらゆるアミノ酸で充填することができる。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＬＤＬＲに結合し、ＰＣＳＫ９の他の変形物に結合するのを遮断する。ＰＣＳＫ９のこれらの変形物は、図１Ａ中に図示されているＰＣＳＫ９の形態と、少なくとも５０％、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９９％又はそれ以上の％同一性である。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、位置４７４での変形物などのヒト変形物である。幾つかの実施形態において、４７４位のアミノ酸は（他のヒトにおけるように）バリン又は（カニクイザル及びマウスにおけるように）スレオニンである。
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の外側のアミノ酸を自由に変異させる一方、ＰＣＳＫ９の外側のアミノ酸を保存的に変化させるＰＣＳＫ９の変形物が想定される。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲ間の結合表面上の残基を変化させず、又は保存的にのみ変化させる一方、ＰＣＳＫ９表面の残り又は該タンパク質の内側の残基を自由に又は保存的に変化させるＰＣＳＫ９の変形物が想定される。様々な中和ＰＣＳＫ９変形物が、本明細書及び上記の節に論述されている。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３（及びその変形物）の残基３１又は６１から始まり、配列番号３（及びその変形物）の残基４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２及び４５３の何れか１つで終わる配列を有するタンパク質を含む。従って、幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、配列番号３（及びその変形物）の残基３１から４４７、３１から４４８、３１から４４９、３１から４５０、３１から４５１、３１から４５２、３１から４５３、６１から４４７、６１から４４８、６１から４４９、６１から４５０、６１から４５１、６１から４５２及び６１から４５３並びに／又は（例えば、図１Ｃから１Ｅ、図１Ｒ１から１Ｒ２（配列番号３０）及び図ＦからＨ（Ｃａｔドメインに関して）に示された）コンセンサス配列を含み得る。幾つかの実施形態において、変形物は、特定の配列長にわたって、配列番号３のｐｒｏ／ｃａｔドメインと５０％又はそれ以上（例えば、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９８、９８から９９又は９９から１００％）同一であり得る。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ｐｒｏ／ｃａｔドメインの保存された区画と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９％又はそれ以上同一である。幾つかの実施形態において、（例えば、図１Ｃから１Ｅに示されているように）１００％保存されている中和ＰＣＳＫ９変形物中のｐｒｏ／ｃａｔドメインの区画が存在するのに対して、残りの位置は変化され得る。幾つかの実施形態において、これらの残りの位置の変化は、配列番号３の対応するｐｒｏ／ｃａｔドメインと５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９８、９８から９９又は９９から１００％同一である中和ＰＣＳＫ９変形物中のｐｒｏ／ｃａｔ変形物をもたらし得る。
さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要である類似のポリペプチド中の残基を同定する構造−機能研究を検討することができる。このような比較に照らして、類似のタンパク質中の活性又は構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測された重要なアミノ酸残基に対して、化学的に類似のアミノ酸置換を選ぶことができる。
当業者は、三次元構造及びその構造に関連するアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報に照らして、当業者は、その三次元構造に関して、タンパク質断片のアミノ酸残基の並置を予測することができる。幾つかの実施形態において、タンパク質の表面上に存在すると予想されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関与し得るので、当業者は、このような残基に対して急激な変化が起こらないように選択することができる。さらに、当業者は、それぞれの所望されるアミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含有する変形物を作製し、検査することができる。次いで、当業者に公知の活性アッセイを用いて又は本明細書中に開示されている実施例に記載されているように、変形物をスクリーニングすることができる。このような変形物は、適切な変形物についての情報を収集するために使用することができる。例えば、あるアミノ酸残基への変化が、破壊された活性、望ましくないように低下された活性又は不適切な活性をもたらすことを発見した場合には、このような変化を有する変形物は避けることができる。換言すれば、このような定型的実験から収集された情報に基づいて、当業者は、単独で、又は他の変異と組み合わせて、さらなる置換が回避されるべきアミノ酸を容易に決定することができる。
多数の科学文献が、二次構造の予測をテーマとしている。「Ｍｏｕｌｔ Ｊ．， Ｃｕｒｒ．Ｏｐ． ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， ７（４）：４２２−４２７（１９９６）， Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．ＡｒｅａｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．， ２６：３６７−３８４（１９７９）」を参照されたい。さらに、二次構造の予測を補助するために、現在、コンピュータプログラムが利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性のモデル化に基づいている。例えば、３０％を上回る配列同一性を有する又は４０％を上回る類似性を有する２つのポリペプチド又はタンパク質は、しばしば、類似の構造的トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発展は、ポリペプチド又はタンパク質の構造内に存在する可能性がある折り畳みの数など、二次構造の増大した予測可能性をもたらした。「Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．， ２７（１）：２４４−２４７（１９９９）」を参照されたい。
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ， Ｄ．， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．， ７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌ ｅｔ ａｌ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ， Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．， １８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ， ８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））及び「進化的連関（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ，上記（１９９９）及びＢｒｅｎｎｅｒ， 上記（１９９７）参照）が含まれる。
ある種の実施形態によれば、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させるアミノ酸置換、（２）酸化に対する感受性を低下させるアミノ酸置換、（３）タンパク質複合体を形成させるために結合親和性を変化させるアミノ酸置換、（４）結合親和性を変化させるアミノ酸置換及び／又は（４）このようなポリペプチドに対して他の物理化学的若しくは機能的特性を付与若しくは修飾するアミノ酸置換である。ある種の実施形態によれば、単一又は複数のアミノ酸置換（幾つかの実施形態において、保存的なアミノ酸置換）は、天然に存在する配列中に（幾つかの実施形態において、分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分中に）作製され得る。幾つかの実施形態において、保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を典型的には実質的に変化させない場合があり得る（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に生じるヘリックスを切断する傾向がないようにすべきであり、又は親配列を特徴付ける二次構造の他の種類を崩壊させる傾向がないようにすべきである。）。本分野で認められるポリペプチド二次及び三次構造の例は、「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ （Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｅｄ．， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｃ． Ｂｒａｎｄｅｎ ＆ Ｊ． Ｔｏｏｚｅ， ｅｄｓ．， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５４：１０５（１９９１）」（それぞれ、参照により、本明細書中に組み込まれる。）中に記載されている。
幾つかの実施形態において、中度に厳格な又は厳格な条件下において、ある中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする核酸配列が配列番号３のタンパク質をコードする核酸配列の何れかに選択的にハイブリッド形成することができれば、中和ＰＣＳＫ９変形物（又はこれをコードする核酸配列）は変形物である。一実施形態において、適切な中度に厳格な条件は、５×ＳＳＣ；０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での事前洗浄、５０℃、−６５℃、５×ＳＳＣ、一晩でのハイブリッド形成、又は種間相同性の場合には、０．５×ＳＳＣを用いた４５℃でのハイブリッド形成、次いで、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×及び０．２×ＳＳＣの各々とともに、２０分間、６５℃で２回の洗浄を含む。このようなハイブリッド形成ＤＮＡ配列も、コード縮重のために、ハイブリッド形成ＤＮＡ配列によってコードされる変形物及びこれらの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と同様に、本発明の範囲に属する。幾つかの実施形態において、適切な高い厳格な条件が使用され、０．１×ＳＳＣ中における約６５℃でのハイブリッド形成を含む。幾つかの実施形態において、適切な高い厳格な条件には、６５℃で１５分間の０．１×ＳＳＰＥ及び０．２％ＳＤＳ中での洗浄が含まれる。幾つかの実施形態において、適切な高い厳格な条件には、４２℃の３１％ｖ／ｖから５０％ｖ／ｖホルムアミド及び０．０１Ｍから０．１５Ｍ塩及び６０℃で０．１×ＳＣＣ、０．５％ｗ／ｖＳＤＳの洗浄条件が含まれる。このようなハイブリッド形成ＤＮＡ配列も、コード縮重のために、ハイブリッド形成ＤＮＡ配列によってコードされる変形物及びこれらの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と同様に、本発明の範囲に属する。
この文脈において引用される「選択的にハイブリッド形成する」という用語は、検出可能に及び選択的に結合することを意味する。このようなポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びこれらの断片は、非特異的な核酸への検出可能な結合の多量を最小化するハイブリッド形成及び洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリッド形成する。本分野において公知であるように、及び本明細書に論述されているように、選択的なハイブリッド形成条件を達成するために、高い厳格度条件を使用することができる。一般に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び断片と目的の核酸配列との間の核酸配列相同性は、少なくとも８０％であり、より典型的には、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％及び１００％の増大する相同性を有する。２つのアミノ酸配列の間に部分的な又は完全な同一性が存在する場合には、２つのアミノ酸配列は相同的である。例えば、８５％の相同性は、最大の合致が得られるように、２つの配列が並置される場合にアミノ酸の８５％が同一であることを意味する。合致を最大化する上で（合致されている２つの配列の何れかの中に）ギャップが許容される。５又はそれ以下のギャップ長が好ましく、２又はそれ以下がさらに好ましい。これに代えて及び好ましくは、本明細書においてこの用語が使用される場合には、変異データマトリックス及び６又はそれ以上のギャップペナルティーを使用するプログラムＡＬＩＧＮを用いて、（標準偏差単位で）５より多くの並置スコアを有すれば、２つのタンパク質配列（又は少なくとも３０アミノ酸長の、これらから得られるポリペプチド配列）は相同である。「Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ． Ｏ．， ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｐｐ．１０１−１１０（Ｖｏｌｕｍｅ ５， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））及びこの巻に対する補遺２、ｐｐ．１から１０」を参照されたい。ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に並置された場合に、２つの配列又はその一部のアミノ酸が５０％超の又は５０％に等しい同一性であれば、２つの配列又はその一部は、より好ましく相同的である。本明細書において、「対応する」という用語は、参照ポリヌクレオチド配列の全て若しくは一部に対して、ポリヌクレオチド配列が相同的である（すなわち、同一であり、厳格に進化的に関連していない。）こと、又はポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するために使用される。これに対して、「相補的な」という用語は、本明細書において、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対して相同的であることを意味するために使用される。例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に対して相補的である。
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、当該位置のアミノ酸残基の極性又は電荷に対して殆ど又は全く効果が存在しないように、原型のアミノ酸残基を非原型の残基で置換することを含み得る。さらに、「アラニンスキャンニング突然変異導入」及び「アルギニンスキャニング突然変異導入」に関して以前に記載されているように、ポリペプチド中の何れの原型の残基もアラニン及び／又はアルギニンで置換され得る。
所望のアミノ酸置換（保存的であるか、又は非保存的であるかを問わない。）は、このような置換が所望される時点で、当業者によって決定することができる。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されているように、ＰＣＳＫ９の重要な残基を同定するために、又は中和ＰＣＳＫ９変形物の親和性を増加若しくは減少させるために、アミノ酸置換を使用することができる。
中和ＰＣＳＫ９変形物に対する抗体
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている配列又は中和ＰＣＳＫ９変形物の何れかに対する抗体を作製し、使用することができる。これらの抗体は、原型のＰＣＳＫ９より中和ＰＣＳＫ９変形物に対して選択的である。幾つかの実施形態において、抗体は、ＰＣＳＫ９のＰｒｏ／Ｃａｔドメインから実質的になる中和ＰＣＳＫ９変形物に結合する。幾つかの実施形態において、抗体は、野生型ＰＣＳＫ９よりこの中和ＰＣＳＫ９変形物に対して選択的である。
当業者によって理解されるように、中和ＰＣＳＫ９変形物に対する抗体を産生させ、次いで、原型のＰＣＳＫ９に結合しない（又は原型のＰＣＳＫ９に対する抗体と同じ程度には効果的に結合しない）抗体を同定することによって、前記抗体を作製することができる。幾つかの実施形態において、前記抗体は、ヒトＰＣＳＫ９に対する抗体のＫＤより少なくとも１、１から１０、１０から５０又は５０から１００％優れたＫＤで中和ＰＣＳＫ９変形物に結合する。幾つかの実施形態において、前記抗体は、原型のＰＣＳＫ９に対する抗体のＫＤより少なくとも２から５、５から１０、１０から５０、５０から１００、１００から１０００、１０００から１０，０００、１０，０００から１００，０００又は１００，０００から１０６優れたＫＤで中和ＰＣＳＫ９変形物に結合する。当業者によって理解されるように、中和ＰＣＳＫ９変形物は野生型ＰＣＳＫ９タンパク質と構造的に異なり得る（及び不存在でさえあり得る）不活性なＶドメインを有するので、このような選択的抗体は、本開示が与えられれば、容易に実現することができる。幾つかの実施形態において、上記抗体を作製するために、中和ＰＣＳＫ９変形物とともにアジュバントが使用される。
当業者によって理解されるように、前記抗体は、不注意に原型のＰＣＳＫ９も検出することなく、中和ＰＣＳＫ９変形物の量を選択的に観察するために使用することができる。
細胞株及び中和ＰＣＳＫ９変形物の発現
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は細胞株中で発現させることができる。幾つかの実施形態において、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために、特定の中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする配列を使用することができる。ある実施形態によれば、形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス中に（又はウイルスベクター中に）パッケージし、ウイルス（又はベクター）で又は米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，９１２，０４０号、米国特許第４，７４０，４６１号及び米国特許第４，９５９，４５５号（これらの特許は、あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）によって例示されているような、本分野において公知の形質移入手法によって宿主細胞を形質導入することを含む、宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入するためのあらゆる公知の方法により得る。幾つかの実施形態において、使用される形質転換手法は、形質転換されるべき宿主に依存し得る。哺乳動物細胞中に異種のポリヌクレオチドを導入するための方法は本分野において周知であり、デキストランによって媒介された形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンによって媒介される形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中のポリヌクレオチドの封入化及びＤＮＡの核内への直接的微量注入が含まれるが、これらに限定されない。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株が本分野において周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）及び多数の他の細胞株など（但し、これらに限定されない。）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化された細胞株が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、何れの細胞株が高い発現レベルを有するかを決定することを通じて、細胞株を選択することができる。哺乳動物宿主細胞のための適切な発現ベクターは周知である。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上のタンパク質セグメントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を発現させるために、様々な発現ベクター／宿主系の何れをも使用することができる。このような系には、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で形質移入された若しくは細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；又は動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、１つ若しくはそれ以上の中和ＰＣＳＫ９変形物を含むポリペプチドは、酵母中で組換え的に発現される。ある種のこのような実施形態は、製造業者の指示書に従って、市販の発現系、例えば、Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を使用する。幾つかの実施形態において、このような系は、分泌を誘導するために、プレプロα配列に依存する。幾つかの実施形態において、挿入物の転写は、メタノールによる誘導に際して、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の中和ＰＣＳＫ９変形物を含む分泌されたポリペプチドは、酵母増殖培地から精製される。幾つかの実施形態において、酵母増殖培地からポリペプチドを精製するために使用される方法は、細菌及び哺乳動物細胞上清からポリペプチドを精製するために使用される方法と同じである。
幾つかの実施形態において、１つ若しくはそれ以上の中和ＰＣＳＫ９変形物を含むポリペプチドをコードする核酸は、ｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのバキュロウイルス発現ベクター中にクローニングされる。幾つかの実施形態において、このようなベクターは、ｓＦ９無タンパク質培地中でスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を感染させ、組換えポリペプチドを作製するために、製造業者の指示（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に従って使用することができる。幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、ヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、このような培地から精製及び濃縮される。
幾つかの実施形態において、１つ若しくはそれ以上の中和ＰＣＳＫ９変形物を含むポリペプチドは、昆虫系中で発現される。ポリペプチド発現のためのある種の昆虫系が当業者に周知である。１つのこのような系において、スポドプテラ・フルギペルダ細胞中又はトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）の幼虫内で外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。幾つかの実施形態において、ポリペプチドをコードする核酸分子は、ウイルスの不可欠でない遺伝子中に、例えば、ポリヘドリン遺伝子内に挿入し、その遺伝子に対するプロモーターの制御下に置くことができる。幾つかの実施形態において、核酸分子を首尾よく挿入することによって、不可欠でない遺伝子は不活性になる。幾つかの実施形態において、その不活化は検出可能な特徴をもたらす。例えば、ポリヘドリン遺伝子の不活化は、外被タンパク質を欠如したウイルスの産生をもたらす。
幾つかの実施形態において、エス・フルギペルダ細胞又はトリコプルシアの幼虫を感染させるために、組換えウイルスを使用することができる。例えば、「Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ４６：５８４（１９８３）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）， ９１：３２２４−７（１９９４）」を参照されたい。
幾つかの実施形態において、細菌細胞中で作製された１つ若しくはそれ以上の中和ＰＣＳＫ９変形物を含むポリペプチドは、細菌中で、不溶性封入体として産生される。幾つかの実施形態において、このような封入体を含む宿主細胞は、遠心によって収集され、０．１５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭＥＤＴＡ中で洗浄され、室温で１５分間、０．１ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理される。幾つかの実施形態において、可溶化液は音波処理によって清澄化され、細胞破砕物は、１２，０００ラｇでの１０分間の遠心によって沈降される。幾つかの実施形態において、ポリペプチドを含有する沈降物は、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８及び１０ｍＭＥＤＴＡ中に再懸濁され、５０％グリセロールに重層され、６０００×ｇで３０分間遠心される。幾つかの実施形態において、その沈降物は、Ｍｇ＋＋及びＣａ＋＋を含まない標準的なリン酸緩衝化生理的食塩水溶液（ＰＢＳ）中に再懸濁され得る。幾つかの実施形態において、変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中に再懸濁された沈降物を分画することによって、ポリペプチドはさらに精製される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記参照）。幾つか実施形態において、タンパク質を可視化するために、０．４ＭＫＣｌ中にこのようなゲルを浸漬させることが可能であり、タンパク質は切り出され、ＳＤＳを欠如するゲル走行緩衝液中に電気溶出することができる。ある種の実施形態によれば、グルタチオン−Ｓ−転写酵素（ＧＳＴ）融合タンパク質は、細菌中で、可溶性タンパク質として産生される。幾つかの実施形態において、このようなＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製される。
幾つかの実施形態において、ある種のポリペプチド、例えば、１つ又はそれ以上の中和ＰＣＳＫ９変形物を含むポリペプチドを「再折り畳み」させることが望ましい。幾つかの実施形態において、このようなポリペプチドは、本明細書中に論述されているある種の組換え系を用いて作製される。幾つかの実施形態において、所望の三次構造を形成させるために、及び／又はジスルフィド結合を生成させるために、ポリペプチドは、「再折り畳みされ」及び／又は酸化される。幾つかの実施形態において、このような構造及び／又は結合は、ポリペプチドのある種の生物活性に関連している。幾つかの実施形態において、再折り畳みは、本分野において公知の多数の手法の何れを用いても達成される。典型的な方法には、カオトロピック剤の存在下で、典型的には７を上回るｐＨに、可溶化されたポリペプチド剤を曝露させることが含まれるがこれに限定されない。典型的なカオトロピック剤は、グアニジンである。幾つかの実施形態において、再折り畳み／酸化溶液は、還元剤及びその還元剤の酸化された形態も含有する。幾つかの実施形態において、還元剤及びその酸化された形態は、ジスルフィドシャフリングが起こることを可能にする特定の酸化還元電位を生成する比で存在する。幾つかの実施形態において、このようなシャフリングは、システイン架橋の形成を可能とする。典型的な酸化還元対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ及び２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、再折り畳みの効率を増加させるために、共溶媒が使用される。典型的な共溶媒には、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール及びアルギニンが含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の中和ＰＣＳＫ９変形物を含むポリペプチドは、実質的に精製される。ある種のタンパク質精製技術が、当業者に公知である。幾つかの実施形態において、タンパク質精製は、非ポリペプチド画分からポリペプチド画分を粗分画することを含む。幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、クロマトグラフィー技術及び／又は電気泳動技術を用いて精製される。典型的な精製法には、硫酸アンモニウムを用いた沈殿；ＰＥＧを用いた沈殿；免疫沈降；熱変性後の遠心；アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ−セファロース）、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー；ゲルろ過；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの（但し、これらに限定されない。）クロマトグラフィー；等電点電気泳動；ポリアクリルアミドゲル電気泳動並びにこのような技術及び他の技術の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって、又は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製される。幾つかの実施形態において、精製工程を変化させ、又はある種の工程を省略することが可能であるが、実質的に精製されたポリペプチドを調製するための適切な方法をなおもたらす。
幾つかの実施形態において、ポリペプチド調製物の精製度を定量する。精製度を定量するためのある種の方法が、当業者に公知である。ある種の典型的な方法は、調製物の特異的結合活性を測定すること及びＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって調製物内のポリペプチドの量を評価することを含むが、これらに限定されない。ポリペプチド調製物の精製の量を評価するためのある種の典型的な方法は、調製物の結合活性を計算すること、調製物の結合活性を当初抽出物の結合活性と比較することを含む。幾つかの実施形態において、このような計算の結果は、「精製倍数」と表現される。結合活性の量を表すために使用される単位は、実施される具体的なアッセイに依存する。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の中和ＰＣＳＫ９変形物を含むポリペプチドは、部分的に精製される。幾つかの実施形態において、部分的精製は、より少ない精製工程を使用することによって、又は同じ一般的な精製スキームの異なる形態を使用することによって達成することができる。例えば、幾つかの実施形態において、ＨＰＬＣ装置を用いて実施される陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、低圧クロマトグラフィー系を用いる同じ技術より大きな「精製倍数」を一般にもたらす。幾つかの実施形態において、より低い精製度をもたらす方法は、ポリペプチドの総回収において、又はポリペプチドの結合活性の維持において利点を有し得る。
ある種の事例では、ポリペプチドの電気泳動的移動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件とともに、（時に著しく）変動し得る。例えば、「Ｃａｐａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．， ７６：４２５（１９７７）」を参照されたい。異なる電気泳動条件下において、精製された又は部分的に精製されたポリペプチドの見かけの分子量は異なり得ることが理解される。
治療的使用及び医薬組成物の例
ある種の事例において、ＰＣＳＫ９活性は、多数のヒトの病状と相関する。例えば、ある種の事例において、高すぎる又は低すぎるＰＣＳＫ９活性は、高コレステロール血症などのある種の症状と相関する。従って、ある種の事例において、ＰＣＳＫ９活性を調節することは治療的に有用であり得る。
幾つかの実施形態において、少なくとも１つの原型のＰＣＳＫ９活性（例えば、ＬＤＬＲへの原型のＰＣＳＫ９の結合）を調節するために、中和ＰＣＳＫ９変形物が使用される。このような方法は、上昇した血清コレステロールレベルと関連する、又は上昇したコレステロールレベルが関連する疾患を治療し、及び／又は予防し、及び／又は疾患のリスクを低減することができる。
当業者によって理解されるように、本開示に照らして、変動したコレステロール、ＬＤＬ若しくはＬＤＬＲレベルと関連し、変動したコレステロール、ＬＤＬ若しくはＬＤＬＲレベルを伴い、又は変動したコレステロール、ＬＤＬ若しくはＬＤＬＲレベルによって影響を受け得る疾患は、中和ＰＣＳＫ９変形物の様々な実施形態によって対処することができる。中和ＰＣＳＫ９変形物は、様々な治療用途において使用することができる。例えば、幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、本明細書中にさらに記載されているように、高コレステロール血症などのコレステロール関連疾患（又は「血清コレステロール関連疾患」）など、ＰＣＳＫ９と関連する症状を治療するのに有用である。本明細書中に記載されている中和ＰＣＳＫ９変形物の幾つかは、ＰＣＳＫ９活性と関連する結果、症候及び／又は病変を治療する上で有用である。
幾つかの実施形態において、（「血清コレステロール関連疾患」を含む）「コレステロール関連疾患」には、例えば、上昇した総血清コレステロール、上昇したＬＤＬ、上昇したトリグリセリド、上昇したＶＬＤＬ及び／又は低ＨＤＬを呈し得る以下のもの：高コレステロール血症、心臓病、メタボリックシンドローム、糖尿病、冠状動脈性心臓病、卒中、心血管疾患、アルツハイマー病及び脂質異常症全般の何れか１つ又はそれ以上が含まれる。単独での、又は１つ若しくはそれ以上の他の薬剤と組み合わせた中和ＰＣＳＫ９変形物を用いて治療することができる原発性及び続発性脂肪異常症の幾つかの非限定的な例には、メタボリックシンドローム、糖尿病、家族性複合型高脂血症、家族性高トリグリセリド血症、家族性高コレステロール血症（ヘテロ接合型高コレステロール血症、ホモ接合型高コレステロール血症、家族性アポリポタンパク質Ｂ−１００欠損、多遺伝子性高コレステロール血症）；レムナント除去病（ｒｅｍｎａｎｔ ｒｅｍｏｖａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、肝リパーゼ欠乏症、以下のもの：暴食、甲状腺機能低下症、エストロゲン及びプロゲスチン療法を含む薬物、β遮断薬及びチアジド利尿薬；ネフローゼ症候群、慢性腎不全、クッシング症候群、原発性胆汁性肝硬変、糖原病、肝臓癌、胆汁鬱滞、末端肥大症、膵島細胞腫、成長ホルモン単独欠損症並びにアルコール誘発性高トリグリセリド血症の何れかに続発する脂肪異常症が含まれる。中和ＰＣＳＫ９変形物は、例えば、冠動脈性心臓病、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、卒中（虚血性及び出血性）、狭心症又は心血管疾患及び急性冠動脈症候群、心筋梗塞などのアテローム性動脈硬化疾患を予防又は治療する上でも有用であり得る。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、致命的でない心臓発作、致命的な及び致命的でない卒中、心臓手術のある種類、心不全のための入院、心臓病を有する患者における胸部痛及び／又は以前の心臓発作、以前の心臓手術など確立された心臓病による心血管現象及び／又は閉塞した動脈の徴候を有する胸部痛のリスクを低下させる上で有用である。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９の中和ＰＣＳＫ９変形物及び方法は、再発性の心血管現象のリスクを低下させるために使用することができる。
当業者に理解されるように、スタチンの使用を通じて一般に対処可能な（治療可能な又は予防可能な）疾病又は疾患にも、本発明の中和ＰＣＳＫ９変形物の適用が有益であり得る。さらに、幾つかの実施形態において、コレステロール合成の抑制又は増加したＬＤＬＲ発現が有益であり得る疾患又は疾病も、中和ＰＣＳＫ９変形物の様々な実施形態によって治療することができる。さらに、当業者によって理解されるように、中和ＰＣＳＫ９変形物の使用は、糖尿病の治療に特に有用であり得る。糖尿病は冠動脈性心疾患に対するリスク因子であるのみならず、インシュリンはＰＣＳＫ９の発現を増加させる。すなわち、糖尿病を有する人々は、（高いＰＣＳＫ９レベルと関連し得る）上昇した血漿脂質レベルを有し、血漿脂質レベルを低下させること又はそのレベルの活性を調節することが有益であり得る。これは、Ｃｏｓｔｅｔ ｅｔ ａｌ．（“Ｈｅｐａｔｉｃ ＰＣＳＫ９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｎｕｔｉｒｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｔｕｓ ｖｉａ Ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ Ｓｔｅｒｏｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １Ｃ”， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２８１：６２１−６２１８， ２００６）（これらの全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）中にさらに詳しく、一般的に論述されている。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、糖尿病、腹部大動脈瘤、アテローム性動脈硬化症及び／又は末梢血管疾患を有する者に、その血清コレステロールレベルをより安全な範囲まで低下させるために投与される。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、本明細書中に記載されている疾患の何れかを発症するリスクを有する患者に投与される。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、喫煙し、高血圧を有し、又は若年心臓発作の家族歴を有する対象に投与される。
幾つかの実施形態において、対象が２００４ＮＣＥＰ治療目標において中度のリスク又はそれより高いリスクを有する場合に、中和ＰＣＳＫ９変形物が投与される。幾つかの実施形態において、対象のＬＤＬコレステロールレベルが１６０ｍｇ／ｄＬより大きければ、中和ＰＣＳＫ９変形物が対象に投与される。幾つかの実施形態において、対象のＬＤＬコレステロールレベルが１３０より大きければ（及び、２００４ＮＣＥＰ治療目標に従って、対象が、中度のリスク又はやや高いリスクを有すれば）、中和ＰＣＳＫ９変形物が投与される。幾つかの実施形態において、対象のＬＤＬコレステロールレベルが１００より大きければ（及び、２００４ＮＣＥＰ治療目標に従って、対象が、高いリスク又は極めて高いリスクを有すれば）、中和ＰＣＳＫ９変形物が投与される。幾つかの実施形態において、対象のＬＤＬコレステロールレベルが、９０ｍｇ／ｄＬ未満又は８０ｍｇ／ｄＬ未満又は７０ｍｇ／ｄＬ未満の最終目標に到達しなければ、中和ＰＣＳＫ９変形物が投与される。幾つかの実施形態において、対象が他の脂質改変治療計画及び薬物に対して耐えられず、又は耐性を有する場合に、中和ＰＣＳＫ９変形物が投与される。
ある患者の個別の特性に応じて、医師は、適応症及び目標脂質レベルを基礎として、適切な治療を選択することができる。高脂血症の治療に指針を与えるための十分に受け入れられている１つの基準は、「成人の高い血液コレステロールの検出、評価及び治療に関する全米コレステロール教育プログラム（ＮＣＥＰ）専門部会の第三次報告」（成人治療パネルＩＩＩ）、最終報告、国立衛生研究所、ＮＩＨ公開番号０２−５２１５（２００２）（Ｔｈｉｒｄ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ （ＮＣＥＰ） Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｉｇｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ （Ａｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ＩＩＩ） Ｆｉｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ０２−５２１５ （２００２）」であり、その印刷された刊行物の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する中和ＰＣＳＫ９変形物は、異常に高いレベル又は正常なレベルからＰＣＳＫ９活性（ＰＣＳＫ９の分解）の量を減少させるために使用される。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に対する中和ＰＣＳＫ９変形物は、高コレステロール血症を治療若しくは予防するために、並びに／又は高コレステロール血症及び／若しくは他のコレステロール関連疾患（本明細書中に記載されているものなど）に対する医薬の調製において使用される。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＰＣＳＫ９活性が正常である高コレステロール血症などの症状を治療又は予防するために使用される。このような症状において、例えば、正常を下回るＰＣＳＫ９活性の低下は、治療効果を提供することができる。
幾つかの実施形態において、２以上の中和ＰＣＳＫ９変形物が、原型のＰＣＳＫ９活性を調節するために使用される。
幾つかの実施形態において、１つ又はそれ以上の中和ＰＣＳＫ９変形物の治療的有効量及び別の治療剤を投与することを含む、高コレステロール血症などのコレステロール関連疾患を治療する方法が提供される。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、単独で投与される。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、少なくとも１つの他の治療剤の投与前に投与される。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、少なくとも１つの他の治療剤の投与と同時に投与される。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、少なくとも１つの他の治療剤の投与後に投与される。他の実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、少なくとも１つの他の治療剤の投与前に投与される。（中和ＰＣＳＫ９変形物とは別の）治療剤には、少なくとも１つの他のコレステロール降下（血清及び／又は総身体コレステロール）剤が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、治療剤は、ＬＤＬＲの発現を増加させ、血清ＨＤＬレベルを増加させ、血清ＬＤＬレベルを低下させ、又はトリグリセリドレベルを低下させることが観察されている。典型的な薬剤には、スタチン（アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン）、ニコチン酸（ナイアシン）（ＮＩＡＣＯＲ， ＮＩＡＳＰＡＮ（徐放性ナイアシン）、ＳＬＯ−ＮＩＡＣＩＮ（徐放性ナイアシン））、フィブリン酸（ＬＯＰＩＤ（ゲムフィブロジル）、ＴＲＩＣＯＲ（フェノフィブラート）、胆汁酸封鎖剤（ＱＵＥＳＴＲＡＮ（コレスチラミン）、コレセベラム（ＷＥＬＣＨＯＬ）、ＣＯＬＥＳＴＩＤ（コレスチポール））、コレステロール吸収阻害剤（ＺＥＴＩＡ（エゼチミブ））、スタチンとニコチン酸の組み合わせ（ＡＤＶＩＣＯＲ（ＬＯＶＡＳＴＡＴＩＮ及びＮＩＡＳＰＡＮ）、吸収阻害剤とのスタチンの組み合わせ（ＶＹＴＯＲＩＮ（ＺＯＣＯＲ及びＺＥＴＩＡ）及び／又は脂質修飾剤が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＰＰＡＲα／γアゴニスト、スクアレン合成酵素阻害剤、ＣＥＴＰ阻害剤、降圧剤、抗糖尿病薬（スルホニル尿素、インシュリン、ＧＬＰ−１類縁体、ＤＤＰＩＶ阻害剤など）、ＡｐｏＢ調節物質、ＭＴＰ阻害剤及び／又は閉塞性動脈硬化症治療と組み合わされる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、スタチン、オンコスタチンＭのようなある種のサイトカイン、エストロゲン及び／又はベルベリンなどのある種の植物成分のような、対象中のＬＤＬＲタンパク質のレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、（ある種の抗精神病薬、ある種のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、高フルクトース、スクロース、コレステロール又はある種の脂肪酸などの食事性因子並びにＲＸＲ、ＲＡＲ、ＬＸＲ、ＦＸＲに対するある種の核受容体アゴニスト及びアンタゴニストなど）、対象中の血清コレステロールレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、スタチン及び／又はインシュリンなどの、対象中のＰＣＳＫ９のレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。２つの組み合わせは、中和ＰＣＳＫ９変形物によって、他の薬剤の望ましくない副作用を軽減させることを可能とし得る。当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、他の薬剤／化合物と組み合わされる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物及び他の薬剤は、同時に投与される。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物と他の薬剤は同時に投与されず、中和ＰＣＳＫ９変形物は薬剤が投与される前又は後に投与される。幾つかの実施形態において、対象は、予防の同じ期間、疾患の発症及び／又は治療の期間の間に、中和ＰＣＳＫ９変形物及び（ＬＤＬＲのレベルを増加させる）他の薬剤の両方を服用する。
医薬組成物は、組み合わせ療法において（すなわち、他の薬剤と組み合わせて）投与することができる。幾つかの実施形態において、組み合わせ療法は、少なくとも１つの抗コレステロール剤と組み合わせた、中和ＰＣＳＫ９変形物を含む。薬剤には、インビトロで合成的に調製された化学的組成物、抗体、抗原結合領域並びにこれらの組み合わせ及び連結物が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、薬剤は、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック調節物質又はトキシンとして作用することができる。幾つかの実施形態において、薬剤は、その標的（例えば、受容体又は酵素の活性化又は阻害）を阻害又は刺激するように作用することにより、ＬＤＬＲの増加した発現を促進し、又は血清コレステロールレベルを減少させることができる。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、コレステロール低下（血清及び／又は総コレステロール）剤を用いた治療前、同時に及び後に投与することができる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、高コレステロール血症、心臓病、糖尿病及び／又はコレステロール関連疾患の何れかの開始を予防又は軽減するために、予防的に投与することができる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、既存の高コレステロール血症症状の治療のために投与することができる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、疾患及び／又は疾患に伴う症候の開始を遅延させる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、コレステロール関連疾患の何れか１つの何れかの症候又はその一部を欠如する対象に提供される。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、高コレステロール血症などの様々なコレステロール関連疾患を治療するための特定の治療剤とともに使用される。幾つかの実施形態において、症状及び治療の所望されるレベルに照らして、２つ、３つ又はそれ以上の薬剤を投与することができる。幾つかの実施形態において、同じ製剤中に含めることによって、このような薬剤を一緒に与えることができる。幾つかの実施形態において、このような薬剤及び中和ＰＣＳＫ９変形物は、同じ製剤中に含めることによって一緒に与えることができる。幾つかの実施形態において、このような薬剤は、別々に調合し、治療キット中に含めることによって一緒に与えることができる。幾つかの実施形態において、このような薬剤及び中和ＰＣＳＫ９変形物は、別々に調合し、治療キット中に含めることによって一緒に与えることができる。幾つかの実施形態において、このような薬剤は別々に与えることができる。幾つかの実施形態において、遺伝子療法によって投与された場合に、タンパク質剤及び／又は中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする遺伝子を同じベクター中に含めることができる。幾つかの実施形態において、タンパク質剤及び／又は中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする遺伝子は、同じプロモーター領域の調節下であり得る。幾つかの実施形態において、タンパク質剤及び／又は中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする遺伝子は、別々のベクター中に存在し得る。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物を含む医薬組成物は、医薬として許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び／又は補助剤と組み合わされる。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物及び少なくとも１つのさらなる治療剤の治療的有効量を含む医薬組成物は、医薬として許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び／又は補助剤と一緒に組み合わされる。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、少なくとも１つの炎症用治療剤とともに使用することができる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、少なくとも１つの免疫疾患用治療剤とともに使用することができる。炎症及び免疫疾患用の典型的な治療剤には、シクロオキシゲナーゼ１型（ＣＯＸ−１）及びシクロオキシゲナーゼ２型（ＣＯＸ−２）阻害剤、３８ｋＤａ***促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８−ＭＡＰＫ）の小分子調節物質、炎症経路に関与している細胞内分子の小分子調節物質（このような細胞内分子が、ｊｎｋ、ＩＫＫ、ＮＦ−κＢ、ＺＡＰ７０及びｌｃｋが含まれるが、これらに限定されない。）が含まれるが、これらに限定されない。ある種の典型的な炎症用治療剤は、例えば、「ＣＡ．Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ＆ Ｌ．Ｌ．Ｍｏｌｄａｗｅｒ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ａ Ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （２００１） Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ， ＣＡ」中に記載されている。
幾つかの実施形態において、薬剤組成物は、２以上の異なる、中和ＰＣＳＫ９変形物を含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、２以上の中和ＰＣＳＫ９変形物を含み、前記中和ＰＣＳＫ９変形物は２以上のエピトープを結合する。幾つかの実施形態において、様々な中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＰＣＳＫ９への結合に関して、互いに競合しない。
幾つかの実施形態において、許容される製剤材料は、好ましくは、使用される投薬量及び濃度で服用者に対して有毒でない。幾つかの実施形態において、製剤材料は、皮下及び／又は静脈内投与用である。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、匂い、組成物の無菌性、安定性、溶解又は放出、吸着又は浸透の速度を修飾し、維持し、又は保持するための製剤材料を含有することができる。幾つかの実施形態において、適切な製剤材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝液（ボラート、バイカーボナート、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、シトラート、ホスファート又は他の有機酸）；増量剤（マニトール又はグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色剤、着香剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（ベンズアルコニウムクロリド、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マニトール又はソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど）；安定性増強剤（スクロース又はソルビトールなど）；等張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウム又はカリウム、マニトールソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は医薬補助剤が含まれるが、これらに限定されない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９５））。
上述されているように、幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物及び／又は治療用分子は、本分野において公知の半減期延長ビヒクルに連結される。このようなビヒクルには、ポリエチレングリコール、グリコーゲン（例えば、中和ＰＣＳＫ９変形物のグリコシル化）及びデキストランが含まれるが、これらに限定されない。このようなビヒクルは、例えば、米国特許出願第０９／４２８，０８２号（現在、米国特許第６，６６０，８４３号）及び国際特許公開ＷＯ９９／２５０４４号（これらは、あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
幾つかの実施形態において、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式及び所望の投薬量に応じて、当業者により決定され得る。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記」を参照されたい。幾つかの実施形態において、このような組成物は、ＰＣＳＫ９変形物の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度及びインビボ除去の速度に影響を及ぼし得る。
幾つかの実施形態において、医薬組成物中の主要なビヒクル又は担体は、水性又は非水性であり得る。例えば、幾つかの実施形態において、非経口投与用の組成物中で一般的な他の材料を補充することが可能な、適切なビヒクル又は担体は、注射用水、生理的食塩水溶液又は人工脳脊髄液であり得る。幾つかの実施形態において、生理的食塩水は、等張のリン酸緩衝化生理的食塩水を含む。幾つかの実施形態において、中性の緩衝化された生理的食塩水又は血清アルブミンと混合された生理的食塩水は、さらなる典型的なビヒクルである。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、約ｐＨ７．０から８．５のＴｒｉｓ緩衝液又は約ｐＨ４．０から５．５の酢酸緩衝液を含み、これらは、ソルビトール又は適切なその代替物を含み得る。幾つかの実施形態において、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥されたケーキ又は水溶液の形態の、場合によって使用される製剤化剤（Ｒｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記）と混合することによって、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、中和ＰＣＳＫ９変形物を含む組成物を保存のために調製することができる。さらに、幾つかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、中和ＰＣＳＫ９変形物を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて、凍結乾燥物質として調合され得る。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、非経口送達のために選択することができる。幾つかの実施形態において、組成物は、吸入又は経口などの消化管を通じた送達のために選択され得る。医薬として許容されるこのような組成物の調製は、当業者の能力の範疇に属する。
幾つかの実施形態において、製剤成分は、投与の部位に許容され得る濃度で存在する。幾つかの実施形態において、生理的ｐＨに又は僅かにこれより低いｐＨに、典型的には、約５から約８のｐＨ範囲内に組成物を維持するために、緩衝液が使用される。
幾つかの実施形態において、非経口投与が想定されている場合には、治療的組成物は、医薬として許容されるビヒクル中に、さらなる治療剤を加えて又は加えずに、所望の中和ＰＣＳＫ９変形物を含む、非経口的に許容される無発熱物質水溶液の形態であり得る。幾つかの実施形態において、非経口注射用ビヒクルは、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、中和ＰＣＳＫ９変形物が適切に防腐された無菌等張溶液として調合されている無菌蒸留水である。幾つかの実施形態において、調製物は、注射可能な微小球体、生物腐食可能な粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸又はポリグリコール酸など）、ビーズ又はリポソームなど、産物の制御放出又は徐放（産物は、その後、デポ注射を介して送達され得る。）を与えることができる因子を加えた所望の分子の製剤を含むことができる。幾つかの実施形態において、ヒアルロン酸を使用することも可能であり、循環中での持続的な期間を促進するという効果を有し得る。幾つかの実施形態において、所望の分子を導入するために、インプラント可能な薬物送達装置を使用することができる。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、吸入のために調合することができる。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、中和ＰＣＳＫ９変形物は、乾燥した吸入用粉末として調合することができる。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、中和ＰＣＳＫ９変形物を含む吸入溶液は、エアロゾル送達のための噴射剤とともに調合することができる。幾つかの実施形態において、溶液は霧状化され得る。経肺投与は、化学的に修飾されたタンパク質の経肺送達を記載するＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５中にさらに記載されている。
幾つかの実施形態において、製剤は経口的に投与できることが想定される。幾つかの実施形態において、この様式で投与される、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えた又は加えない、中和ＰＣＳＫ９変形物は、錠剤及びカプセルなどの固体剤形の配合において慣用される担体とともに又は担体なしに調合され得る。幾つかの実施形態において、カプセルは、生物学的利用可能性が最大化され、及び前全身分解が最小化されるときに、消化管内の地点で製剤の活性な部分を放出するように設計することができる。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物及び／又はあらゆるさらなる治療剤の吸収を促進するために、少なくとも１つの更なる因子を含めることができる。幾つかの実施形態において、希釈剤、着香剤、低融点の蝋、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も使用し得る。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、錠剤の製造に適した無毒の賦形剤との混合物中に、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、中和ＰＣＳＫ９変形物の有効量を含むことができる。幾つかの実施形態において、無菌水又は別の適切なビヒクル中に錠剤を溶解させることによって、単位投薬形態で溶液を調製することができる。幾つかの実施形態において、適切な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若しくは重炭酸ナトリウム、ラクトース若しくはリン酸カルシウムなどの不活性な希釈剤、又はデンプン、ゼラチン若しくはアラビアゴムなどの結合剤、又はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸若しくはタルクなどの潤滑剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。
徐放又は制御送達製剤中に、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、中和ＰＣＳＫ９変形物を含む製剤など、さらなる医薬組成物が当業者に自明である。幾つかの実施形態において、リポソーム担体、生体内分解性微粒子又は多孔性ビーズ及びデポ注射などの様々な他の徐放又は制御送達手段を調合するための技術も当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達用の多孔性ポリマー微粒子の制御放出について記載しているＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照。幾つかの実施形態において、徐放調製物は、成型された製品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。徐放マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許第０５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）及びＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，上記）又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が含まれ得る。幾つかの実施形態において、徐放組成物は、リポソームも含み得、これは、本分野で公知の幾つかの方法の何れによっても調製することが可能である。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；欧州特許第０３６，６７６号；欧州特許第０８８，０４６号及び欧州特許第１４３，９４９号を参照されたい。
インビボ投与のために使用されるべき医薬組成物は、通例、無菌である。幾つかの実施形態において、これは、無菌ろ過膜を通じたろ過によって達成することができる。幾つかの実施形態において、組成物が凍結乾燥される場合には、この方法を用いた無菌化は、凍結乾燥及び再構成の前又は後の何れかにおいて実施し得る。幾つかの実施形態において、非経口投与用組成物は、凍結乾燥された形態で、又は溶液中に保存し得る。幾つかの実施形態において、非経口組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器中に、例えば、皮下注射針によって突き刺すことが可能なストッパーを有する静脈内溶液袋又は容器中に配置される。幾つかの実施形態において、医薬組成物は無菌である。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、原型のＰＣＳＫ９のある量がインビボにおいて、ヒトの中で結合するのを低下させるために、少なくとも中和ＰＣＳＫ９変形物の十分量を含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、「コレステロール関連疾患」（「血清コレステロール関連疾患を含む。」の症候を低減するために、少なくとも中和ＰＣＳＫ９変形物の十分量を含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの原型のＰＣＳＫ９活性（例えば、ＬＤＬＲへの原型のＰＣＳＫ９の結合）を調節するために、少なくとも中和ＰＣＳＫ９変形物の十分量を含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に開示されているコレステロール関連疾患の何れか１つ又はそれ以上を治療するために十分な中和ＰＣＳＫ９変形物のある量を少なくとも含む。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、成体男性及び／又は女性のコレステロール関連疾患の症候を治療するのに十分な中和ＰＣＳＫ９変形物のある量を少なくとも含む。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物の前記量は、１０と２５０ｋｇの間の重量の成体男性を治療する（例えば、その症候を低減する）のに少なくとも十分である。幾つかの実施形態において、前記量は、コレステロール関連疾患の少なくとも何れか１つの症候を弱めるために、対象中のＬＤＬＲのレベルを上昇させるために、又は対象中のＬＤＬのレベルを低下させるために、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５又は２００ｋｇの対象を治療するのに少なくとも十分である。幾つかの実施形態において、医薬組成物中に存在する中和ＰＣＳＫ９変形物の量は、ある検出可能な量によって、対象中のＬＤＬＲのレベルを上昇するのに少なくとも十分である。幾つかの実施形態において、対象中のＬＤＬＲのレベルは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００％上昇される。幾つかの実施形態において、対象中のＬＤＬＲのレベルは、治療されていない健康な対象に比べて、及び／又はコレステロール関連疾患を有する治療されていない対象に比べて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００倍増加される。さらに別の実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、所望のレベルで、対象中のＬＤＬＲのレベルを維持するのに十分である。適切なレベルは、対象の保健医療従事者によって決定され得、対象の身体的状態並びに健康上の問題及び関心事の具体的な側面を考慮に入れることができる。
幾つかの実施形態において、医薬組成物中に存在する中和ＰＣＳＫ９変形物の量は、インビボで原型のＰＣＳＫ９の活性の有意な量を遮断するのに少なくとも十分である。幾つかの実施形態において、前記量は、原型のＰＣＳＫ９の活性の少なくとも１％を遮断するのに十分であり、例えば、原型のＰＣＳＫ９の少なくとも１、１から１０、１０から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９８、９８から９９、９９から１００％が、医薬組成物中に存在するＰＣＳＫ９の前記量によって遮断される。
幾つかの実施形態において、医薬組成物中に存在する中和ＰＣＳＫ９変形物の前記量は、対象中の血清ＬＤＬを低下させるのに少なくとも十分である。幾つかの実施形態において、前記量は、対象中の血清ＬＤＬの前記量を血清ＬＤＬの固有のレベルの少なくとも１％（例えば、前記対象に対する、コレステロール関連疾患を有する対象に対する又は健康な対象に対する血清ＬＤＬのレベルの少なくとも１、１から１０、１０から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から９５、９５から９８、９８から９９、９９から１００％）低下させるのに十分である。
幾つかの実施形態において、医薬組成物中に存在する中和ＰＣＳＫ９変形物の量は有意な量である。幾つかの実施形態において、対象に与えられるべき医薬の用量中に存在する中和ＰＣＳＫ９変形物の量は、少なくとも１ｎｇであり、例えば、前記量は少なくとも１、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、１０，０００、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０又は１０１１ナノグラム（前記数字のあらゆる２つの間に定義されるあらゆる量及び前記数字の何れかを上回るあらゆる量を含む。）である。幾つかの実施形態において、前記量は単一の丸薬中に存在する。幾つかの実施形態において、前記量は複数の丸薬中に存在する。幾つかの実施形態において、投与される中和ＰＣＳＫ９変形物の量は、約１から５００ｍｇ、５０から４００ｍｇ又は１００から３００ｍｇである。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、錠剤又は丸薬などの固体形態中に含まれる。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物の前記量は、少なくとも１時間、本明細書中に記載されている最終目標（又は量）の何れかを達成するのに十分な投薬量である。幾つかの実施形態において、前記量は、少なくとも１時間、例えば、１、２、３、４、５，６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４時間、コレステロール関連疾患を治療するのに十分である。幾つかの実施形態において、存在する中和ＰＣＳＫ９変形物の前記量は、少なくとも１日間、本明細書中に記載されている最終目標の何れかを達成するのに十分である。従って、幾つかの実施形態において、投薬量は１日１回量である。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は相対的に純粋である。幾つかの実施形態において、医薬として許容される担体又は希釈剤及び中和ＰＣＳＫ９変形物を別にして、組成物中には、他に何も存在しない。幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物を含む化合物は、少なくとも０．０１％の中和ＰＣＳＫ９変形物（対重量）である。幾つかの実施形態において、化合物の少なくとも１×１０−８、１×１０−７、１×１０−６、１×１０−５、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％が中和ＰＣＳＫ９変形物である。幾つかの実施形態において、前記パーセントは、前記％の何れか２つの間に定義される範囲である。
当業者によって理解されるように、存在する中和ＰＣＳＫ９変形物の前記量を記載する上記パラメータの何れもが、他のパラメータの何れかと組み合わせることができる。例えば、インビボで遮断される原型のＰＣＳＫ９の％に関するパラメータの何れもが、対象に対して供給される具体的な重量の何れに対しても組み合わせることができる。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、対象に対して有害である成分を含まない。
幾つかの実施形態において、医薬組成物は、５０ｍＭリン酸ナトリウム及び／又は５０ｍＭ塩化ナトリウムを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、リン酸ナトリウム及び／又は塩化ナトリウムを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は細胞可溶化液を含有しない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は細胞培地を含有しない。幾つかの実施形態において、医薬組成物はＢＳ３（ビス［スルホスクシンイミジル］スベラート）を含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物はギ酸カリウムを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物はＰＥＧ３３５０を含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は０．２Ｍギ酸カリウムを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は２０％ＰＥＧ３３５０を含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は５０ｍＭＴｒｉｓを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は４ｍＭＥＤＴＡを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は０．０１から２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は０．５デオキシコール酸ナトリウムを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は０．１から２％ドデシル硫酸ナトリウムを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は１０から２０％グリセロールを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は１ＭＮＤＳＢを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は１から２０ｍＭ塩化カルシウムを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物はＫＨ２ＰＯ４／ＮａＯＨを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物はクエン酸及びリン酸ナトリウムを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物はＮａ２ＨＰＯ４及びＮａＯＨを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、上記成分の２つ又はそれ以上の組み合わせを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、上記成分の３つ又はそれ以上の組み合わせを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、上記成分の４つ又はそれ以上の組み合わせを含まない。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、上記成分の１つ又はそれ以上を含む。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物は、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で作製されない。幾つかの実施形態において、本明細書中に開示されている中和ＰＣＳＫ９変形物の何れもが、自己プロセッシングされた又は自己切断されたタンパク質である。幾つかの実施形態において、本明細書中に開示されている中和ＰＣＳＫ９変形物の何れもが、プロセッシングされた又は切断されたタンパク質である。
幾つかの実施形態において、医薬組成物が調合された後、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、又は脱水若しくは凍結乾燥された粉末として、無菌容器中に保存され得る。幾つかの実施形態において、このような製剤は、即時使用形態で、又は投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥された）形態の何れかで保存し得る。
幾つかの実施形態において、単回投薬投与単位を製造するためのキットが提供される。幾つかの実施形態において、キットは、乾燥されたタンパク質を有する第一の容器と、水性製剤を有する第二の容器の両方を含有し得る。幾つかの実施形態において、単一及び／又は複数チャンバーの予め充填された注射器（例えば、液体注射器及び凍結乾燥注射器（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが含まれる。
幾つかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、中和ＰＣＳＫ９変形物を含む医薬組成物の治療的に使用されるべき有効量は、例えば、治療的な文脈及び目的に依存する。従って、当業者は、ある種の実施形態に従って、分子が送達された際に、少なくとも１つの追加の治療剤を加えて又は加えずに中和ＰＣＳＫ９変形物が使用されている適応症、投与の経路及びサイズ（体重、体表面又は臓器サイズ）及び／又は患者の症状（年齢及び一般的な健康）に一部依存して、治療用の適切な投薬レベルが変動することを理解する。幾つかの実施形態において、医師は、最適な治療効果を得るために、投薬量を滴定し、投与の経路を修飾し得る。幾つかの実施形態において、典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であり得る。幾つかの実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇ又は１μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇ又は５μｇ／ｋｇから最大約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
幾つかの実施形態において、投薬の頻度は、使用される製剤中の中和ＰＣＳＫ９変形物及び／又は何れかのさらなる治療剤の薬物速度学的パラメータを考慮に入れる。幾つかの実施形態において、医師は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで、組成物を投与する。幾つかの実施形態において、従って、組成物は、単回用量として、経時的に２つ若しくはそれ以上の用量（所望の分子の同じ量を含有してもよく、含有しなくてもよい。）として、又はインプラント装置若しくはカテーテルを介した連続注入として投与され得る。適切な投薬量をさらに精密化することは、当業者によって日常的に行われており、当業者によって日常的に行われる作業の範疇に属する。幾つかの実施形態において、適切な投薬量は、適切な用量応答データの使用を通じて確認し得る。幾つかの実施形態において、投与の量及び頻度は、取得されるべき所望のコレステロールレベル（血清及び／又は総）及び対象の現在のコレステロールレベル、ＬＤＬレベル及び／又はＬＤＬＲレベルを考慮に入れることができ、これらの全ては当業者に周知の方法によって取得することができる。
幾つかの実施形態において、医薬組成物の投与経路は、公知の方法に従い、例えば、経口的に、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈内、又は病変内経路による注射を通じて、徐放系によって又はインプラント装置によって行われる。幾つかの実施形態において、組成物は、ボーラス注射によって、又は注入により連続的に、又はインプラント装置によって投与され得る。幾つかの実施形態において、組成物は、これらの経路の何れかを介した投与のために設計される。
幾つかの実施形態において、組成物は、その上に所望の分子が吸収又は封入されている膜、スポンジ又は別の適切な材料の移植を介して、局所的に投与することができる。幾つかの実施形態において、インプラント装置が使用される場合、装置は、何れかの適切な組織又は臓器中に移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、時間指定放出型大量瞬時投与又は継続的投与を介して行われ得る。
幾つかの実施形態において、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、中和ＰＣＳＫ９変形物を含む医薬組成物をエキソビボ様式で使用することが望ましい場合があり得る。このような事例では、患者から取り出された細胞、組織及び／又は臓器は、少なくとも１つのさらなる治療剤を加えて又は加えずに、中和ＰＣＳＫ９変形物を含む医薬組成物に曝露され、この後、細胞、組織及び／又は臓器は、続いて、患者中に戻されて移植される。
幾つかの実施形態において、中和ＰＣＳＫ９変形物及び／又は何れかのさらなる治療剤は、ポリペプチドを発現及び分泌するために、本明細書に記載されている方法などの方法を用いて、遺伝子操作されたある種の細胞を移植することによって送達することができる。幾つかの実施形態において、このような細胞は、動物又はヒトの細胞であり得。自己、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）又は異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。幾つかの実施形態において、細胞は不死化され得る。幾つかの実施形態において、免疫学的応答の確率を減少させるために、細胞を封入して、周囲組織の浸潤を回避することができる。幾つかの実施形態において、典型的には、封入材料は、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系によって又は周囲組織由来の他の有害な因子によって、細胞の破壊を妨げる生態適合性の半透性ポリマー性封鎖又は膜である。
（以下の実施例に示されているように）ＰＣＳＫ９活性を著しく中和する中和ＰＣＳＫ９変形物の能力に基づいて、これらの中和ＰＣＳＫ９変形物は、高コレステロール血症などのＰＣＳＫ９によって媒介される活性から生じる症候及び症状を治療及び予防する上で治療効果を有する。
（実施例）
実施される実験及び達成された結果を含めて、以下の実施例は、例示の目的でのみ提供されるものであり、本発明を限定するものと解釈してはならない。
ＬＤＬ受容体への中和ＰＣＳＫ９変形物の結合の実証−ＬＤＬＲ競合アッセイ
本実施例は、ＬＤＬＲへの結合に関して、中和ＰＣＳＫ９変形物が完全長ＰＣＳＫ９と競合する能力に関する。
緩衝液Ａ（１００ｍＭカコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．４）中に希釈されたヤギ抗ＬＤＬ受容体抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の２μｇ／ｍＬで、透明な９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を一晩被覆した。緩衝液Ａでプレートを完全に洗浄し、次いで、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ中の１％ミルク）で２時間ブロッキングした。洗浄後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭＣａＣｌ２が補充された緩衝液Ｂ）中に希釈されたＬＤＬ受容体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の２．０μｇ／ｍＬとともに、プレートを１．５時間温置した。この温置と同時に、緩衝液Ｃ中に希釈された、ビオチン化された野生型ヒトＰＣＳＫ９（ｈＰＣＳＫ９）１００ｎｇ／ｍＬを、同じく緩衝液Ｃ中に希釈されたビオチン化されていない競合タンパク質（例えば、ＰＣＳＫ９の３１から４４７（配列番号３）、完全長ＰＣＳＫ９及びＰＣＳＫ９のＶドメイン、残基４５０から６９２）の様々な濃度とともに又は緩衝液Ｃのみ（対照）とともに温置した。ＬＤＬ受容体を含有するプレートを洗浄した。ビオチン化されたＰＣＳＫ９／競合タンパク質混合物をプレートに移し、室温で１時間温置した。緩衝液Ｃ中の５００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、続いて、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）とともに温置することによって、ＬＤＬ受容体へのビオチン化されたＰＣＳＫ９の結合を検出した。６５０ｎｍでの吸光度を測定した。
結果が、図２に示されている。中和ＰＣＳＫ９変形物（配列番号３のアミノ酸３１から４４７）及び完全長ＰＣＳＫ９（ｆｌＰＣＳＫ９）の両方が、固定化されたＬＤＬＲへの結合に関して、ビオチン標識された完全長ＰＣＳＫ９に対して競合した。Ｖドメインタンパク質は、競合しなかった。このデータは、ＬＤＬＲへの結合のために、（配列番号３の）アミノ酸３１から４４７のみが必要とされることを示している。
細胞のＬＤＬ取り込みに対する中和ＰＣＳＫ９変形物の効果
本実施例は、ある中和ＰＣＳＫ９変形物がＬＤＬの取り込みに影響を及ぼす能力に関する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が補充されたＤＭＥＭ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ， Ｉｎｃ）中に、５ｘ１０５細胞／ウェルの濃度で、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）にＨｅｐＧ２細胞を播種し、３７℃（５％ＣＯ２）で、一晩温置した。翌日、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。野生型ＰＣＳＫ９又は中和ＰＣＳＫ９変形物（配列番号３の３１から４４７）の１：２系列希釈を作製し（１．６μｇ／ｍＬから５０μｇ／ｍＬの範囲にわたる。）、細胞に添加した。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＤＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の６μｇ／ｍＬの添加及び３７℃（５％ＣＯ２）での３時間の温置後、ＰＢＳで、細胞を完全に洗浄した。最後に、４８０から５２０ｎｍ（励起）及び５２０から６００ｎｍ（発光）で、Ｓａｆｉｒｅ （ＴＥＣＡＮ）によって、細胞に付随する蛍光シグナルを検出した。
異なる日に実施された同じデザインの２つの別個の実験に相当する結果が、図３Ａ及び３Ｂに示されている。図から観察できるとおり、培地に添加されたＰＣＳＫ９レベルの増加に伴って、細胞からの蛍光が減少することから明らかなように、（Ｈ８ヒスチジン精製タグを有する）完全長ＰＣＳＫ９は、培養された細胞中への標識されたＬＤＬの取り込みを遮断した。これに対して、中和ＰＣＳＫ９変形物は、細胞にＬＤＬを取り込ませる。
中和ＰＣＳＫ９変形物の細胞効果のウェスタンブロット分析
本実施例は、中和ＰＣＳＫ９変形物の存在の細胞効果に関する。
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭ培地中に、３７℃で、集密状態になるまで、６ウェルプレート中のＨｅｐＧ２細胞を増殖させる。エンドソームの酸性化を阻害するために、１００μＭクロロキンで、幾つかの細胞を３０分間前処理した。次いで、３７℃で４時間、１％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ７５０μＬ中の、ビヒクル（ＰＢＳ、５０μＬ未満）、完全長ＰＣＳＫ９（５０μｇ／ｍＬ、０．６５μＭ）又は中和ＰＣＳＫ９変形物（配列番号３の３１から４４７）（３０μｇ／ｍＬ、０．６５μＭ）で、細胞を処理した。ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、溶解緩衝液（１２５ｍＭＴｒｉｓ、２ｍＭＣａＣ１２、１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ８．５）を用いて、完全細胞可溶化液を調製した。ＳＤＳＰＡＧＥによって、細胞上清タンパク質５０μｇを分離し、ウサギ抗ヒトＬＤＬＲポリクローナル抗体（ＲＤＩ−ＰＲＯ６１０９９， Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）を用いて、ＬＤＬＲレベルを測定した。ＰＣＳＫ９の約１４ｋＤａｐｒｏドメインを検出する抗ヒトＰＣＳＫ９モノクローナル抗体によって、細胞に付随する組換えＰＣＳＫ９を検出した。シグナルを検出するために、ＨＲＰが連結された二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）及びＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。（Ｖｅｈ＝ビヒクル（ＰＢＳ）、ＦＬ＝完全長、ＰＣ９＝ＰＣＳＫ９）。
結果が、図４に示されている。図から明らかなように、完全長ＰＣＳＫ９とは異なり、中和ＰＣＳＫ９変形物（配列番号３の３１から４４７）は、細胞に付随したが、ＬＤＬＲの分解を引き起こさなかった。
当業者によって理解されるように、上記実施例から得られたデータは、中和ＰＣＳＫ９変形物（例えば、配列番号３の３１から４４７）はＬＤＬＲに結合できるが、ＬＤＬの結合及び細胞によるＬＤＬの取り込みを抑制せず、ＬＤＬＲの分解を引き起こさないことを示している。さらに、中和ＰＣＳＫ９変形物（配列番号３の３１から４４７）は、ＬＤＬＲのリサイクルを可能にし、ＬＤＬＲの正常な機能を抑制する。
本結果に鑑みれば、中和ＰＣＳＫ９変形物は、細胞表面のＬＤＬＲに結合して、ＬＤＬＲとの完全長（野生型）ＰＣＳＫ９の相互作用を抑制することができることが明らかである。中和ＰＣＳＫ９変形物は正常なＬＤＬＲ機能を保持しているので、内在性の完全長ＰＣＳＫ９の効果からＬＤＬＲを保護する治療薬として作用する。
コレステロール関連疾患を治療するための中和ＰＣＳＫ９変形物の使用
（（血清コレステロールなどの）コレステロールの低下が有益であり得る）コレステロール関連疾患を呈するヒト患者に、中和ＰＣＳＫ９変形物の治療的有効量を投与する。治療の間の定期的な時点で、疾患の症候が沈静化したかどうかを測定するために、患者をモニターする。治療後に、中和ＰＣＳＫ９変形物を用いた治療を受けている患者は、治療をされていない患者と比べて、低下した血清コレステロールレベルを有することが見出される。
高コレステロール血症を治療するための中和ＰＣＳＫ９変形物の使用
高コレステロール血症の症候を呈するヒト患者に、中和ＰＣＳＫ９変形物の治療的有効量を投与する。治療の間の定期的な時点で、血清コレステロールレベル（総コレステロールとして、またはより特異的にＬＤＬコレステロールとして）が低下したかどうかを測定するために、ヒト患者をモニターする。治療後に、中和ＰＣＳＫ９変形物を用いた治療を受けている患者は、治療を受けていない関節炎患者と比べて、低下した血清コレステロールレベルを有することが見出される。
冠動脈心疾患及び／又は再発性心血管現象を予防するための中和ＰＣＳＫ９変形物の使用
冠動脈心疾患を発症するリスクを有するヒト患者を特定する。単独で、スタチン（例えば、シンバスタチン）と同時に又は順次に、中和ＰＣＳＫ９変形物の治療的有効量を患者に投与する。治療の間の定期的な時点で、患者の総血清コレステロールレベルが変化するかどうかを測定するために、ヒト患者をモニターする。予防的治療を通じて、中和ＰＣＳＫ９変形物を用いた治療を受けている患者は、治療を受けていない患者と比べて、低下した血清コレステロールを有しており、これにより、冠動脈心疾患又は再発性心血管現象に対するリスクを低減することが見出される。
高コレステロール血症を予防するための中和ＰＣＳＫ９変形物の使用
家族歴分析及び／又はライフスタイル及び／又は現在のコレステロールレベルを介して、高コレステロール血症を発症するリスクを呈するヒト患者を同定する。中和ＰＣＳＫ９変形物の治療的有効量を対象に定期的に（例えば、週１回）投与する。治療の間の定期的な時点で、血清コレステロールレベルが減少したかどうかを測定するために、患者をモニターする。治療後に、中和ＰＣＳＫ９変形物を用いた予防的治療を受けている対象は、治療されていない対象と比べて、低下した血清コレステロールレベルを有することが見出される。
ＰＣＳＫ９に対するマウスモデル
本実施例は、様々な中和ＰＣＳＫ９変形物を検査するためのマウスモデルをどのようにして作製するかについて記載する。ヒトＰＣＳＫ９を過剰発現するマウスを作製するために、尾静脈投与を介して、３週齢のＷＴＣ５７Ｂ１／６マウスにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の様々な濃度を注射し、ヒトＰＣＳＫ９を発現するように組換え的に修飾して、マウス中のＬＤＬ−コレステロールの測定可能な増加を与える正確な力価を測定した。ヒトＰＣＳＫ９を発現するこの特定のウイルスを用いて、ウイルスの４．５×１０１２ｐｆｕが循環血液中に約４０ｍｇ／ｄＬのＬＤＬコレステロールレベル（ＷＴマウス中のＬＤＬの正常なレベルは、約１０ｍｇ／ｄＬである。）をもたらすことが測定された。これらの動物中のヒトＰＣＳＫ９レベルは、約１３μｇ／ｍＬであることが見出された。この注射基準を用いて、マウスの集団を作製した。
注射から１週後に、ＬＤＬコレステロールレベルに関して、マウスを評価した。
様々な中和ＰＣＳＫ９変形物を検査して、それらがどの程度有効であり、何れの変形物がインビボで機能するかを測定するために、実施例８から得られたマウスを使用することができる。
単回瞬時大量注射で尾静脈注射を介して、又はＡＡＶによって誘導される過剰発現によって、中和ＰＣＳＫ９変形物を投与することができる。次いで、中和ＰＣＳＫ９変形物投与から２４及び４８時間後に、動物の亜群（ｎ＝６から７）を安楽死させ得る。次いで、ＬＤＬレベルを調べ、様々な対照（例えば、野生型ＰＣＳＫ９、水又は無関係のタンパク質注射、及びｐｒｏ／ｃａｔドメイン）と場合によって比較することができる。より低い血清ＬＤＬレベルを有するマウスをもたらす完成したＰＣＳＫ９変形物が、血清ＬＤＬレベルを低下させる上で有効であり得る変形物である。
ＬＤＬＲＥＧＦａドメインは、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインに結合する
本実施例は、２．９オングストロームの分解能で（以下の実施例に記載されている条件）、ＬＤＬＲＥＧＦａドメイン（２９３から３３４）に結合したＰＣＳＫ９Ｐｒｏ／Ｃａｔ（３１から４５４）の解明された結晶構造を示す。
ＥＧＦａに結合されたＰＣＳＫ９の構造の図解が図５に示されている。結晶構造（及び図５中のその図解）は、ＬＤＬＲのＥＧＦａドメインがＰＣＳＫ９の触媒ドメインに結合することを明らかにする。さらに、ＰＣＳＫ９とＥＧＦａの相互作用は、図５に図解されている構造中の残基Ｄ３７４とＳ１５３の間であるＰＣＳＫ９の表面を横切って起こるように見受けられる。
ＬＤＬＲＥＧＦａドメインとの相互作用界面の特異的なコアＰＣＳＫ９アミノ酸残基は、ＥＧＦａドメインの５オングストローム以内にあるＰＣＳＫ９残基と定義された。コア残基は、以下のとおりである。Ｓ１５３、Ｉ１５４、Ｐ１５５、Ｒ１９４、Ｄ２３８、Ａ２３９、Ｉ３６９、Ｓ３７２、Ｄ３７４、Ｃ３７５、Ｔ３７７、Ｃ３７８、Ｆ３７９、Ｖ３８０及びＳ３８１。
ＬＤＬＲＥＧＦａドメインとの相互作用界面の境界ＰＣＳＫ９アミノ酸残基は、ＥＧＦａドメインから５ないし８オングストロームにあるＰＣＳＫ９残基と定義した。境界残基は、以下のとおりである。Ｗ１５６、Ｎ１５７、Ｌ１５８、Ｅ１５９、Ｈ１９３、Ｅ１９５、Ｈ２２９、Ｒ２３７、Ｇ２４０、Ｋ２４３、Ｄ３６７、１３６８、Ｇ３７０、Ａ３７１、Ｓ３７３、Ｓ３７６及びＱ３８２。下線が付されている残基は、ＰＣＳＫ９の中に殆ど又は完全に埋もれている。
当業者によって理解されるように、本実施例から得られる結果は、ＰＣＳＫ９とＥＧＦａがどこで相互作用するかを示す。従って、これらの残基の何れかと相互作用し、又はこれらの残基の何れかを封鎖する中和ＰＣＳＫ９変形物は、原型のＰＣＳＫ９とＬＤＬＲのＥＧＦａドメイン（及び／又は全般的にＬＤＬＲ）との間の相互作用を阻害するのに有用であり得る。幾つかの実施形態において、ＰＣＳＫ９に結合されたときに、上記残基の何れかと相互作用し、若しくは上記残基の何れかを封鎖する中和ＰＣＳＫ９変形物又は上記残基の１５から８、８、８から５又は５オングストローム以内にある中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合の有用な阻害を与えると想定される。
ＬＤＬＲとＰＣＳＫ９の構造的相互作用
ＰＣＳＫ９ Ｐｒｏ／Ｃａｔ３１から４５４／ＥＧＦａ複合体構造を用いて、ＬＤＬＲの完全長の状態に結合された完全長ＰＣＳＫ９タンパク質のモデルを作製した。完全長ＰＣＳＫ９の構造（Ｐｉｐｅｒ， Ｄ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＰＣＳＫ９：ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ＬＤＬ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １５， ５４５−５２ （２００７））を複合体由来のＰＣＳＫ９ Ｐｒｏ／Ｃａｔ３１から４５４上に重ね合わせ、低ｐＨ立体構造でのＬＤＬＲの構造（Ｒｕｄｅｎｋｏ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＬＤＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ａｔ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｐＨ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８， ２３５３−８（２００２））を複合体由来のＥＧＦａドメイン上に重ね合わせた。モデルの図解は、図６及び７に示されている。ＰＣＳＫ９ Ｐｒｏ／Ｃａｔ３１から４５４／ＥＧＦａ複合体由来のＥＧＦａドメインが、枠内に囲まれている。図は、ＰＣＳＫ９に近接して横たわる直近のＥＧＦａ結合ドメインの外側にあるＬＤＬＲの領域を示している。
タンパク質試料の発現及び精製
本実施例は、ＰＣＳＫ９タンパク質／変形物の様々な実施形態を作製し、精製する幾つかの方法を記載する（ＬＤＬＲＥＧＦａドメインを含む。）。Ｎ末端ミツバチメリチンシグナルペプチド、その後にＨｉｓ６タグを有するＰＣＳＫ９タンパク質／変形物（例えば、ＰＳＣＫ９３１−６９２Ｎ５３３Ａ、ＰＣＳＫ９ ４４９ＴＥＶ及びＰＣＳＫ９ Ｐｒｏ／Ｃａｔ３１−４５４）を、バキュロウイルスに感染したＨｉ−５昆虫細胞中で発現させた。ニッケルアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって、ＰＣＳＫ９タンパク質を精製した。ＴＥＶプロテアーゼを用いた切断による精製の間に、メリチン−Ｈｉｓ６タグを除去した。ＰＣＳＫ９ Ｐｒｏ／Ｃａｔ（３１から４４９及びＶドメイン（４５０から６９２）試料）を作製するために、構築物ＰＣＳＫ９ ４４９ＴＥＶを使用した。この構築物は、ＰＣＳＫ９残基４４９と４５０の間に挿入されたＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有していた。
ＧＳＴ融合タンパク質として、イー・コリ中で、ＬＤＬＲＥＧＦａドメイン（２９３から３３４）を発現させた。イオン交換クロマトグラフィー、グルタチオンセファロースアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって、ＥＧＦａドメインを精製した。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを用いた切断によって、精製の間に、ＧＳＴタンパク質を除去した。
複合体の形成及び結晶化
本実施例は、上記構造調査の実施例において使用された複合体及び結晶をどのようにして作製したかを記載する。
ＥＧＦａドメインの１．２モル濃度過剰をＰＣＳＫ９ ３１−４５４と混合することによって、ＰＣＳＫ９ ３１−４５４／ＥＧＦａ複合体を作製した。ＰＣＳＫ９ ３１−４５４／ＥＧＦａドメイン複合体を０．２Ｍギ酸カリウム、２０％ＰＥＧ３３５０中に結晶化した。
データ収集及び構造決定
本実施例は、データの組みをどのようにして収集し、上記構造調査実施例に関してどのようにして構造を決定するかを記載する。
ＰＣＳＫ９ ３１−４５４／ＥＧＦａデータの組みは、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ ｂｅａｍｌｉｎｅ５．０．２において収集した。全てのデータの組みは、ｄｅｎｚｏ／ｓｃａｌｅｐａｃｋ又はＨＫＬ２０００（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ， Ｚ．， Ｂｏｒｅｋ， Ｄ．， Ｍａｊｅｗｓｋｉ， Ｗ． ＆ Ｍｉｎｏｒ， Ｗ． Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｌｉｎｇ ｏｆ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ａ ５９， ２２８−３４ （２００３））を用いて処理した。
単位セルサイズａ＝ｂ＝７０．６、ｃ＝３２１．８オングストロームを有する空間群Ｐ６５２２中で、ＰＣＳＫ９／ＥＧＦａドメインの結晶を成長させ、２．９オングストロームの解像度になるように回折した。ＰＣＳＫ９ Ｐｒｏ／Ｃａｔを最初の検索モデルとして使用し、プログラムＭＯＬＲＥＰを用いた分子置換によって、ＰＣＳＫ９／ＥＧＦａドメインの構造を解明した。電子密度地図の分析は、ＥＧＦａドメインに対する明瞭な電子密度を示した。ＬＤＬＲＥＧＦａドメインを手動でフィッティングし、Ｑｕａｎｔａによるモデル構築及びｃｎｘによる精緻化を複数回行って、モデルを改善した。
コア相互作用界面アミノ酸は、ＰＣＳＫ９対タンパク質から５オングストローム未満又は５オングストロームに等しい少なくとも１つの原子を有する全てのアミノ酸残基として決定された。ファンデルワールス半径＋水によって媒介される可能な水素結合内の原子を考慮するためのコア領域カットオフ距離として５オングストロームを選択した。境界相互作用界面アミノ酸は、ＰＣＳＫ９対タンパク質から８オングストローム未満又は８オングストロームに等しいが、コア相互作用リスト中に含まれない少なくとも１つの原子を有する全てのアミノ酸残基として決定された。８オングストローム未満又は８オングストロームに等しいものが、伸長したアルギニンアミノ酸の長さを考慮するための境界領域カットオフ距離として選択された。これらの距離の基準に合致するアミノ酸は、プログラムＰｙＭＯＬを用いて計算された（ＤｅＬａｎｏ， Ｗ．Ｌ． Ｔｈｅ ＰｙＭＯＬ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ２００２））。
上記実施例に論述されている結晶構造に対する座標が、２００８年１月９日に出願された米国仮特許出願第６１／０１０６３０号（参照により、その全体が組み込まれる。）の表３５．２に示されている。図面中に図示されたＰＣＳＫ９の構造の関連する領域若しくは残基（ＥＧＦａがＰＣＳＫ９と相互作用する場所から１５、１５から８、８、８から５、５オングストローム又はそれ以下の領域又は残基を含む。）及び／又は前記座標から得られる前記構造上の対応するそれらの位置と相互作用する中和ＰＣＳＫ９変形物も想定される。
さらなる中和ＰＣＳＫ９変形物
この実施例は、細胞のＬＤＬ取り込みを変化させ（図８）、ＬＤＬＲへの結合に関して完全長ＰＣＳＫ９と競合する（図９）中和ＰＣＳＫ９変形物（配列番号３の３１から４４７）中のＤ３７４Ｙ点変異の能力を記載する。
従ったプロトコールは、完全長Ｄ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９、Ｄ３７４Ｙ点変異を有する中和ＰＣＳＫ９変形物（配列番号３のアミノ酸３１から４４７）及び完全長野生型ｈＰＣＳＫ９を使用したことを除き、中和ＰＣＳＫ９変形物（配列番号３のアミノ酸３１から４４７）の存在下でのＬＤＬの取り込みに関して上に概述されているプロトコールと一般的に類似していた。結果が、図８に示されている。
上記実験の他に、ＬＤＬＲは、ＬＤＬＲ抗体（２μｇ／ｍＬ）を介して、ＥＬＩＳＡプレート中でも捕捉された。この後に、ビオチン−ＷＴ ＰＣＳＫ９（１００ｎｇ／ｍＬ）及びビオチン化されていない完全長Ｄ３７４ＹＰＣＳＫ９、Ｖドメイン（Ｖドメイン）及びＤ３７４ＹＰｒｏ／Ｃａｔ（３１−４４７）の様々な濃度をプレートに添加した。結合されたビオチン−ＰＣＳＫ９をストレオプトアビジン−ＨＲＰによって検出した。結果が図９に示されており、ＬＤＬＲへの結合に関して、Ｄ３７４ＹＰｒｏ／Ｃａｔドメイン及びＤ３７４Ｙ完全長ＰＣＳＫ９が完全長ＷＴＰＣＳＫ９と競合する能力を示す。
図８及び９に示されている結果から明らかなように、中和ＰＣＳＫ９変形物は、ＰＣＳＫ９の他の形態の存在下で起こる取り込みに関して、ＬＤＬの取り込みの量を増加させるようにも働く。
参照による組み込み
特許、特許出願、論文、教科書など、本明細書中に引用されている全ての参考文献及びそれらの中に引用されている参考文献の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた参考文献中に与えられている定義又は用語の何れもが本明細書に与えられている用語及び論述と異なる程度まで、本発明の用語及び定義が優越する。
均等物
前記明細書は、当業者が本発明の実施を可能にするのに十分であると考えられる。前述の記載及び実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態を詳述する。しかしながら、前記述が本文中でどれほど詳細に記載されているとしても、本発明は、多くの様式で実施され得ることが理解される。

Claims (47)

  1. 低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合するＰｒｏ／Ｃａｔドメイン又はその断片；及び
    ＬＤＬＲの分解をもたらさない、ＬＤＬＲ活性に対して不活性なＶドメイン、
    を含む、中和ＰＣＳＫ９変形物であって、中和ＰＣＳＫ９変形物が配列番号３のアミノ酸４５３〜６９２を欠如する、中和ＰＣＳＫ９変形物。
  2. Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインが配列番号３のアミノ酸６１〜３７４を含み、及び中和ＰＣＳＫ９変形物が、配列番号３のアミノ酸４５３〜アミノ酸６９２に規定されたタンパク質配列を欠如する、請求項１に記載の中和ＰＣＳＫ９変形物。
  3. Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインが配列番号３のアミノ酸３１〜３７４を含む、請求項１に記載の中和ＰＣＳＫ９変形物。
  4. Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインが配列番号３のアミノ酸６１〜４４６を含む、請求項１に記載の中和ＰＣＳＫ９変形物。
  5. Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインが配列番号３のアミノ酸３１〜４４９を含み、及びＶドメインが少なくとも配列番号３の最後の１４のアミノ酸を欠如する、請求項１に記載の中和ＰＣＳＫ９変形物。
  6. 請求項１〜５の何れか一項に記載の中和ＰＣＳＫ９変形物をコードする核酸分子。
  7. 前記核酸分子が調節配列に作用可能に連結されている、請求項６に記載の核酸分子。
  8. 請求項６に記載の核酸分子を含むベクター。
  9. 請求項６に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
  10. 請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
  11. 請求項１〜５の何れか一項に記載の少なくとも１つの中和ＰＣＳＫ９変形物の有効量と、医薬として許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
  12. さらなる活性因子をさらに含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 前記さらなる活性因子が、放射性同位体、放射性核種、毒素又は治療基及び化学療法基からなる群から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 上昇した血清コレステロールを伴う症状を治療又は予防するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
  15. 前記症状が高コレステロール血症である、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
  17. 低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質の利用可能性を上昇させる因子と同時に又は順次に提供される、上昇した血清コレステロールを伴う症状を治療又は予防するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
  18. ＬＤＬＲタンパク質の利用可能性を上昇させる因子がスタチンを含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. スタチンが、アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 血清コレステロールを低下させるための、請求項１１に記載の医薬組成物。
  21. 低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質の利用可能性を上昇させる因子と同時に又は順次に提供される、血清コレステロールを低下させるための、請求項１１に記載の医薬組成物。
  22. 高コレステロール血症の治療用医薬の製造における、請求項１〜５の何れか一項に記載の中和ＰＣＳＫ９変形物の使用。
  23. 医薬として使用するための、請求項１〜５の何れか一項に記載の中和ＰＣＳＫ９変形物。
  24. 高コレステロール血症の治療において使用するための、請求項１〜５の何れか一項に記載の中和ＰＣＳＫ９変形物。
  25. 中和ＰＣＳＫ９変形物に連結された抗体又はその断片をさらに含む、請求項１に記載の中和ＰＣＳＫ９変形物。
  26. 抗体又はその断片が抗体のＦｃドメインを含む、請求項２５に記載の中和ＰＣＳＫ９変形物。
  27. 抗体の断片が抗体のＦｃドメインからなる、請求項２６に記載の中和ＰＣＳＫ９変形物。
  28. 請求項１〜５、２３及び２４〜２７の何れか一項に記載の少なくとも１つの中和ＰＣＳＫ９変形物を含み、前記中和ＰＣＳＫ９変形物が、コレステロール関連疾患を治療するのに有効な量で存在する、医薬組成物。
  29. 有効な量がヒト中のＬＤＬのレベルを低下させるのに有効な量を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
  30. 有効な量がヒト中での低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質の利用可能性を上昇させる量を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
  31. 上昇が少なくとも５％である、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 上昇が少なくとも２０％である、請求項３０に記載の医薬組成物。
  33. 上昇が少なくとも５０％である、請求項３０に記載の医薬組成物。
  34. 上昇が少なくとも１００％である、請求項３０に記載の医薬組成物。
  35. 上昇が少なくとも３００％である、請求項３０に記載の医薬組成物。
  36. ヒトが１００ｋｇの男性である、請求項３０に記載の医薬組成物。
  37. ヒトが５０ｋｇの男性である、請求項３０に記載の医薬組成物。
  38. 低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合するＰｒｏ／Ｃａｔドメイン又はその断片、及びＬＤＬＲ活性に対して不活性なＶドメイン〔前記不活性なＶドメインは、ＬＤＬＲの分解をもたらさない〕を含む中和ＰＣＳＫ９変形物；及び
    医薬として許容される担体又は希釈剤
    を含む医薬組成物であって、前記中和ＰＣＳＫ９変形物が配列番号３のアミノ酸４５３〜アミノ酸６９２に規定された配列を欠如する、医薬組成物。
  39. Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインが配列番号３のアミノ酸６１〜３７４を含み、及び中和ＰＣＳＫ９変形物が、配列番号３のアミノ酸４５３〜アミノ酸６９２に規定されたタンパク質配列を欠如する、請求項３８に記載の医薬組成物。
  40. Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインが配列番号３のアミノ酸３１〜３７４を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
  41. Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインが配列番号３のアミノ酸６１〜４４６を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
  42. Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインが配列番号３のアミノ酸３１〜４４９を含み、及びＶドメインが少なくとも配列番号３の最後の１４のアミノ酸を欠如する、請求項３８に記載の医薬組成物。
  43. Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインが配列番号３のアミノ酸３１〜４４７からなる、請求項３８に記載の医薬組成物。
  44. 低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）に結合するＰｒｏ／Ｃａｔドメイン又はその断片、及びＬＤＬＲ活性に対して不活性なＶドメインを含み、前記不活性なＶドメインがＬＤＬＲの分解をもたらさず、前記ｐｒｏ／ｃａｔドメインがコレステロール関連疾患の治療に十分な量で存在する、請求項３８に記載の医薬組成物。
  45. Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインが配列番号９又は３０中のＰｒｏ／Ｃａｔドメインのアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の医薬組成物。
  46. Ｃａｔドメインが配列番号９、１１、１３、１５又は３０のアミノ酸配列の少なくとも１つのＣａｔドメインのアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の医薬組成物。
  47. Ｐｒｏ／Ｃａｔドメインが配列番号９又は３０中のＰｒｏ／Ｃａｔドメインのアミノ酸配列からなる、請求項４４に記載の医薬組成物。
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