JP5795699B2 - 人工免疫システム:作製および使用方法 - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は、統合された人工的なヒト組織を構築するための方法、そして詳細には、ワクチン、アジュバント、免疫療法候補物、化粧品、薬物、生物製剤および他の化合物のインビトロ試験のための統合されたヒト免疫系の構築に関する。この人工的な免疫系は、免疫系との物質の相互作用を評価するために有用であり、従って、ワクチン、薬物、生物製剤、免疫療法、化粧品、および化合物の開発を加速し、かつ正確性3092改善するために用いられ得る。
ヒトのワクチンの開発および生物学的試験は伝統的に、マウスおよびウサギのモデルのような小動物モデル、ついで非ヒト霊長類モデルに依拠してきた。しかし、このような小動物モデルは、高価であって、非ヒト霊長類モデルは高価かつ希少である。
本発明は、インビトロでワクチン、アジュバント、薬物、生物製剤、化粧品および他の化合物を試験するための、機能的に等価なヒト組織の統合型のシステムを提供する。本発明の1局面は、形態的に等価な構築物を製造するのではなく設計する青写真を用いて、機能的に等価な組織を構築するための方法に関する。ヒト免疫系に対する機能的な等価性は、モジュールの小型化された免疫バイオリアクター系に収容された、3つの操作された組織構築物(engineered tissue constructs)(ETC)を構築することによって達成される。
本発明の主な目的は、インビトロにおいて、ワクチン、免疫療法剤、アジュバント、薬物、生物製剤、化粧品および他の化合物を試験するために、組み込まれた(integrated)ヒト組織、組み込まれたヒト免疫系を提供することである。本発明の1局面は、適切なインビトロの細胞および組織構築物またはそれらの等価物を用いてヒトにおいてワクチンと相互作用する正常な組織を模倣する工程を包含する、組み込まれたヒト免疫系モデルを構築する方法に関する。ヒト組織のこのような組み込まれたプラットフォームによって、ワクチン開発ストラテジーの加速および免疫系と相互作用する薬物の試験が可能になる。さらに、動物試験の減少が可能になり、そして候補ワクチンを、動物研究およびヒトのトライアルの費用の一部で再操作して再試験することが可能になる。
(1)2D培養物においては、細胞は、人工的な支持体から天然ではない異方性の外部の合図を受けるが、3D培養物では、細胞はECM上で全ての次元に遊走できる;
(2)2D培養物においては、支持体(例えば、プラスチック、ガラス)は、天然に存在するECMよりもかなり剛直である;
(3)3D培養物で増殖した細胞は、アポトーシスに対してかなり耐性である、そして
(4)細胞に分泌されたタンパク質は、ECM周囲の3D培養物とさらに良好に相互作用し、かつそれによって組織化され得、そして細胞の挙動に影響し得る、
ということが挙げられる。
1.3つの基本的な、機能的な免疫学的組織:
a.皮膚および/または粘膜の等価物(ワクチン接種部位)、
b.リンパ組織等価物(lymphoid tissue equivalent)(LTE(リンパ節))、および
c.他の2つの組織を接続するリンパ管および血管の網目状構造等価物、
2.再生可能かつ反復可能な試験のための細胞供給源、ならびに
3.免疫学的組織を収容しかつ組み込み、そしてワクチンの有効性を評価しかつ試験するためのバイオリアクター、
を含む。
(a)血中単球および非単球樹状細胞(DC)前駆体の輸送を容易にして、人工的な皮膚3D組織操作された構築物内の成熟抗原提示細胞への自然な変換を支持するインビトロの皮膚および/または粘膜等価足場(ワクチン接種部位、VS)と;
(b)このワクチン接種部位から、成熟DC遊走のためのリンパ組織等価物(LTE)へのリンパ管様経路、およびワクチン接種部位(VS)への単球遊走のための血管様経路と;
(c)リンパ節の幾何学を模倣し、かつ適切なリンパ節細胞タイプを含む構造を有する組織操作された足場におけるリンパ節組織等価物と;
(d)内因性の組織に対して匹敵する特性を示す機能的に等価な組織構築物である上記の構築物と;
(e)モジュールのバイオリアクター系におけるこれらの免疫学的組織構築物の組み込みと;を含む。
(a)ワクチンまたは免疫療法が、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)およびB細胞の応答を誘導するように最適のレベルのヘルパーT細胞(TH1またはTH2)を促進するか否かを試験するために、同一平面上でDC、CD4+T、CD8+TおよびB細胞が出会うLTE中での場所を通じて;
(b)細胞外マトリックスを有する3D環境においてDC、T、およびB細胞が出会い、3つの細胞タイプが相互作用し得るリンパ節の環境を模倣する細胞を支持することを可能にする工程;
(c)補充および遊出の間に単球およびDCが内皮細胞と相互作用し得るような内皮の包含;
(d)内皮を横切って遊走しかつ局所組織シグナルへの応答が異なり得る(例えば、複数のDCサブタイプに対して示差的に発現される場合、TLR9(トール様レセプター9)リガンド対TLR−4リガンドの効果を識別する)細胞のさらに代表的な集団、およびそのような細胞の存在;
を通じて可能である。
1.新規な生体分子の徐放性ストラテジー(例えば、徐放性のマイクロスフェア、直接注射ナノシリンジ、二重機能性ナノゲル、指向性分解速度)の使用;
2.例えば、VS(成熟DC)からLTE(成熟DC、T細胞およびB細胞)への経内皮遊走(VS(単球)への細胞遊走経路を組織化する)に対する走化性または剪断力の影響を用いる、ETCから脈管ハイウェイへまたは脈管ハイウェイからの指向された細胞遊走の使用;
3.磁気マイクロビーズアプローチを用いるETCから脈管ハイウェイへまたは脈管ハイウェイからの指向された細胞遊走(磁気マイクロビーズおよび電磁場はまた、AISの区画間で細胞を動かすためにも用いられ得る);
4.リンパ節の幾何形状を模倣し、かつ適切なリンパ節細胞タイプ、サイトカインおよびケモカインを含む構造を有する3Dの足場におけるリンパ節様構造(LTE)の設計および構築;
5.LTEのデザインにおけるリンパ節のTゾーンのモデルを介する免疫応答の開始を研究するための、調節可能な微小環境を作製するためのアプローチの促進(逆オパール構造に類似の規則的な多孔性のヒドロゲル足場に対して、Tゾーンの細網線維芽細胞(FRC、Tゾーンの間質細胞)を移植する工程、ならびに合成および天然の細胞外マトリックス(ECM)物質の使用であって、リンパ球、および二次リンパ組織においてリンパ球によって期待される生化学的な合図(例えば、接着モチーフおよびケモカイン勾配)を含む、リンパ節の「オープンな(open)」細網の網目状構造を模倣する物理的構造を提供する3D構造を達成するための使用を包含する);
6.LTEでは、B細胞抗体生成のためのヘルパーT細胞のリンパ節様機能を提供すること(例えば、LTE内の別個のT細胞およびB細胞の領域は、デジタル印刷の組み合わせ作用(別個のゾーン内のT細胞およびB細胞の直接アセンブリ)によって、および徐放性の技術(例えば、それぞれ、T細胞およびB細胞の領域を維持するためにT細胞およびB細胞の誘引物質を遊離するマイクロスフェアを用いる)によって設計され得る);
7.LTE、BLC(Bリンパ球化学誘引物質、MV10kDa)、MIP−3β(マクロファージ炎症性タンパク質−3β、CCL19)およびSLC(二次リンパ組織ケモカイン)、LTEマトリックスでの徐放性のためのケモカインマイクロスフェアの自己組織化を補助すること;さらに、マイクロスフェアは、LTE足場(別の実施形態では、マイクロスフェアは、「Lincoln log」にかなり近い十字パターンで重合化の間にヒドロゲルマトリックスの「支柱(struts)」内に(例えば、ポリカプロラクトンを用いて)直接カプセル化され得る)にT細胞およびB細胞と同時に印刷されてもよい(さらに別の実施形態では、足場内への間質細胞ガイドT細胞局在化を仮定すれば、FRC移植T細胞領域が用いられてもよい);
8.特に3D構築物を作製するための微細な容積測定コントロールを備える、3DのETCを正確に製造し得るデジタル印刷BioAssembly Tool(BAT)の使用;
9.複数の免疫学的ETCを維持し得、かつヒト免疫系を模倣するために用いられ得る、操作された、細胞の微小流体の環境バイオリアクターの使用;
10.栄養付加された液体が免疫学的細胞を「給餌する(feed)」ためにそれを通してポンピングされる内部チャネルを有するミニチュアの3Dハウジングの使用。これらのチャネルの壁は、内皮細胞接着を可能にするように改変され、人工的な内皮を作製するか、または細胞の挙動を変えない生物学的に適合する物質から製造される。この構築物内の細胞は、一定の流速に依拠し、単に栄養についてだけでなく、全てが十分であってケモカインを介してそれらの機能を継続すべきであるシグナルとして依存する。栄養の流体は、種々の細胞が注入される前にこの系をプライムする(最初はシリンジを介する);次いで完全なAISは、栄養/酸素溶液について血流をシミュレーションするポンプに機能的に接続される。好ましい実施形態では、脈動ポンプ機構を用いて血管中でみられる状況をさらによく模倣する。ミニチュアサイズおよび透明な構造の実施形態で、顕微鏡下でインサイチュにおける組織構築成分の可視化が可能になる;
11.T細胞およびB細胞の適切なレパートリーを有するエキソビボ免疫系における高速のワクチンおよび免疫調節物質のスクリーニングのために、ワクチンアジュバント、ワクチン処方物および免疫療法剤のインビトロでの有効性を試験するためのAISの使用;
12.LTEにおいてB細胞を活性化することによるAISにおけるモノクローナル抗体の製造。
1.T細胞およびB細胞の接着のための適切な接着リガンド、例えばケモカインでマイクロキャリアをローディングする工程;このマイクロキャリアは、天然であっても合成であっても、高密度であっても多孔性であっても、そして所望の充填密度次第で種々のサイズであってもよい;
2.マイクロキャリア上のT細胞およびB細胞の培養;T細胞およびB細胞は、一緒に培養されてもよく(図1A)、またはそれぞれのマイクロキャリア上で別々に培養されてもよい(図1Bおよび1C);
3.一緒にT細胞およびB細胞の集中したマイクロキャリアを多孔性容器中で接触させる工程(「テニスボールのかご(tennis ball basket)」に類似);そして
4.このマイクロキャリアを、充填密度が細胞浸透を可能にするように「知的に(intelligently)」充填させる工程。
1.3つの基本的な機能的な生物学的組織、詳細には免疫学的組織、例えば:
a.皮膚および/または粘膜(ワクチン接種部位、VS)、
b.リンパ節(リンパ組織等価物、LTE)および
c.リンパ管および血管の網目状構造等価物
の形成を可能にする3D足場および細胞分化のカスケードの操作と、
2.再現可能でかつ反復可能な試験のための細胞供給源と、
3.免疫学的組織を収容しかつ組み込むための微小流体バイオリアクター。
血中の単球および非単球性の樹状細胞前駆体の輸送を促進し、それらの人工的皮膚3D構築物内の成熟抗原呈示樹状細胞への自然な変換を支持する、インビトロのVS足場と、
このワクチン接種部位(皮膚等価物)から樹状細胞遊走のためのリンパ組織等価物へのリンパ血管様経路と;同様に、ワクチン接種部位(皮膚等価物および/または粘膜等価物)への単球遊走のための血管壁様経路と、
リンパ節の幾何形状を模倣し、適切なリンパ節細胞タイプを含む構造を有する足場におけるリンパ組織等価物(LTE)と。
ワクチンの有効性は、ワクチン接種の部位での細胞との最初の相互作用の質をかなりの程度まで繁栄する(図3)。結果として、ワクチン接種の有用なモデルを作製するためには、インビトロにおいて人工的なワクチン接種部位を構築することが重要である。このようなワクチン接種部位は、皮膚、腸または粘膜と等価な組織として機能し、そして皮膚構築物(または粘膜組織、例えば、肺)を、血管およびリンパ節内皮および血液由来の造血細胞と一緒に包含する。この皮膚構築物は、インビトロの系への組み込みのために最適化された、複雑な供給源、例えば、死体のヒト皮膚、複雑さの低い供給源、例えば、市販の皮膚様生成物(EpiDerm,Episkin)または単純な皮膚様構造(ECMの多くの異なる調製物、ならびに皮膚線維芽細胞およびケラチノサイトの供給源を用いる)を含む多くの供給源に由来し得る。
ワクチンの最終的なアウトプットはリンパ組織に生じ、ここで抗原特異的なT細胞およびB細胞は、活性化されて、部分的に記憶細胞に変換され、これは周知のとおりインビトロでは検出することが困難である。インビトロで天然の免疫応答を模倣するためには、従って、リンパ組織等価物(図4)を構築すること、そしてこれを、リンパ管を介してワクチン接種部位と接続することが必須である。インビボでは、ワクチン由来抗原は、リンパ管に沿ったリンパ節細胞への拡散によって、または抗原を内部移行している成熟DCの流入領域リンパ節への遊走によって、リンパ節に輸送される。リンパ節では、DCは抗原特異的T細胞を活性化し、そしてヘルパーT細胞と組み合わされて、抗原特異的B細胞を活性化することを補助して免疫応答を誘発する。
本発明は、VSおよびLTEへ、そしてVSおよびLTEからの、そしてVSとLTEとの間の細胞の遊走および遊出を促進する内皮の経路のためのデザイン(例えば、種々のマトリックス処方物、内皮細胞の供給源、および増殖条件を用いる)を提供する。インビトロの人工的免疫系集合体の模式図は、図5に示される。この人工的免疫系は、天然の免疫系とは機構的に異なるが機能に関しては同様である、一般的なバイオリアクターデザインを有し得る。好ましい実施形態では、3つの免疫学的ETCが、微小な操作された細胞環境のバイオリアクターに組み込まれる。このデザインは、2つの機能的に等価な膜を連続的な順序で使用し、機能的なVSおよび粒子上のまたは粒子周囲のT細胞およびB細胞の局所的な集積を行って、LTEとして機能する。重要なデザインの考慮は、生物学的機能を模倣すること、ゾーンの間の培地容積を最小化して細胞輸送の効率を増大させること、そして抗原性応答を評価する手段を提供することである。培地容積を組み込むことおよび最小化することによって、免疫学的ETC内のおよびETCの間の細胞遊走についての可能性は劇的に増強され、そして増大された免疫学的応答が提供され得る。
単球および他の血液由来細胞(PBMC)が血管ハイウェイへ注入される;
ケモカイン(VSに対して天然であるかまたは意図的に加えられるか)が、単球がVSに入ることを誘引する;
単球が未成熟のDC(iDC)に分化する;
iDCがVSにおけるワクチン接種に応答して成熟する;
ケモカインは成熟DCをリンパのハイウェイへ誘引する;
ケモカイン(LTEに対して天然であるかまたは意図的に加えられるか)が、成熟DCがLTEに入ることを誘引する;そして
LTE中の成熟DCが、T細胞およびB細胞を活性化する。
インビトロのAISデバイスは、T細胞、B細胞および抗原呈示細胞を最小限に有するべきであるが、好ましくは他の細胞成分、例えば、内皮を作製するための内皮細胞、ワクチン由来シグナルに応答するための好中球および肥満細胞、皮膚への特異的な病原体の最初の進入を媒介する線維芽細胞、または問題の感染における病原体である標的器官(例えば、肺)由来の細胞を含む。T細胞およびB細胞は主にLTEに局在し、血管およびワクチン接種部位中の単球/DC前駆体、ならびに血液およびリンパの内皮細胞は、それぞれ血液およびリンパのハイウェイにある。
組み込まれたAISバイオリアクターでは、免疫学的細胞を「給餌する(feed)」ために、3Dハウジング中の内部チャネルを通じて栄養富化液をポンピングする。これらのチャネルの壁は、内皮細胞接着を可能にするように改変され、内皮を形成するか、または細胞挙動を変更しない生物学的に適合する物質から製造される。
PLGA(ポリ(ラクチド−コ−グリコリド))マイクロスフェアは、カプセル化されたケモカインの定常的な制御された放出を提供する。図6Aは、蛍光色素標識したfMLPケモカイン(単球および未成熟のDCの化学誘引物質)をカプセル化するマイクロスフェアの顕微鏡写真の例を示す。図6Bは、低分子量のペプチドケモカインおよび10kDaの化学誘引物質であるMIP−3β(マクロファージ炎症性タンパク質−3β)の両方についての放出の反応速度論を示す。図7A〜7Dに示されるように、ヒト単球および樹状細胞は、インビトロの設定において、化学誘引物質fMLP(N−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン)を放出するマイクロスフェアに向かって動く。図8は、移植された細胞外マトリックス足場においてケモカインMIP−3βに対して誘引された単球についてのインビボのマウス免疫組織学的染色を示す。合成の逆オパール(inverse opal)ヒドロゲル足場を合成し、この足場は、T細胞遊走およびB細胞との相互作用を支持し(図8A)、そして高い細胞密度の接着および増殖を支持し、このことはリンパ節の微小環境を模倣するのにおける重要な特徴である(図8B)。
デザイナー足場構造は、細胞の生存度、細胞の移動度およびバイオリアクターのための栄養流を試験するように構築されて、コラーゲンゲルのための構築物安定性の関数として細胞の運動性を研究している。図64は、ナイロンメッシュ上のプロタサン/コラーゲンマトリックス上で増殖するHUVEC細胞を示す。ナイロン膜の高倍率のSEMおよび分散されたプロタサン/コラーゲンマトリックス物質は上の画像に示される。HUVEC細胞の初代の層の播種は、反転した膜上で達成され(左、1側)、次いで24時間後に、右の上側の位置にされて(右側、2側)、ここに第二の層が加えられた。HUVEC細胞の各々の平面の位相差画像は、真ん中の2つの下の画像に示され、ここでは左が第一の層であって、右が加えられた第二の層である。
予備的なハードウェアおよびソフトウェアのETC異種デジタル印刷の原型が開発されている。図9は、デジタル印刷されたリンパ節のモデルおよび血管の細網像を示す。このモデルのリンパ節は、6つの生体適合性ヒドロゲル層、4つの種々のパターンおよび3つの物質を含む。脈管画像は、100〜3,000μmにおよぶ特徴的なサイズを有する生分解性構築物質の複数の層で構築されている。この物体は各々3つの分注ノズルで製造された。
3Dの生物学は、免疫学的ETCの適切な機能を誘導するのに重要である。細胞プロセスを研究するための重要なアプローチは、インビトロで細胞を培養することである。これは代表的には、プラスチックまたはガラスの支持体上に細胞をプレートする工程を包含する。この適用では、固体またはフィルター支持体上で増殖された細胞は、2次元(2D)培養物と呼ばれる。多孔性支持体上のこのような2D培養物は、生物学の多くの局面を研究するために有用である。しかし、現在、かなり多くのインビトロ様の条件が3D培養物中で実現され得る。
VSデザインの信憑性のさらなる証明は、例えば、免疫刺激アッセイを用いて行なわれ得る。種々の送達デポによって送達される刺激を含む、種々の組成物の抗原が用いられてもよい。この系がインビボとして機能する場合、顆粒球を含む、より多様な白血球が、血管内皮を横切って、細菌のような病原体刺激の導入後に、このような刺激で活性化されない培養物と比較して、マトリックスに入る。ウイルスは種々の組成物の細胞浸潤を促進し得る。初代のDCおよび記憶T細胞は、第一の血管内皮を横切り、結合組織マトリックスに浸透してここで沈着された抗原を捕獲し得、次いでリンパ内皮を横切って移動して、完全な構築物を横切ると予想される。
本発明の別の実施形態では、多孔性のキトサン/コラーゲン足場を、ワクチン接種部位組織操作構築物で用いる。VSのための膜の足場は、血管およびリンパ管内皮細胞のコンフルエントな培養物と適合する好ましくは天然のバイオポリマー(生体高分子)を含む多孔性の膜を含み、単球の移動を未成熟の樹状細胞へのそれらの変換の間に提供するように十分に浸透可能なままである。
この実施形態では、VS足場は、浸出(leaching)、アルカリゲル化および減圧乾燥によって調製した。プロタサン(Protasan)(0.5mg/ml)に加えてラット尾I型コラーゲン(3.6mg/ml)を、1.5mlの微量遠心管バイアル(200μlのコラーゲン(3.8mg/ml)に加えて約5μlの2%Protasan)に入れた。乾燥ポリスチレンビーズ((7μmのサイズ)を、重量で1:1に添加して、ペーストを得て、これを5000gで2〜3分間遠心分離した。このペレットを慎重に100μmの細孔サイズのナイロンメッシュ上に沈着させて60℃で風乾させた。次いでこのメッシュをゆっくり撹拌しながら、室温で2時間、エタノール/NaOH溶液に入れた。次いでこれをゆっくり撹拌しながら半時間、純粋なエタノール中で洗浄した。最後に、このメッシュを、ゆっくり撹拌しながら1時間テトラヒドロフラン(THF)に移した;次いでこれを純粋なエタノール中で洗浄して減圧乾燥した。足場の写真は図13に示す。
この実施形態では、VS足場は、連続のコラーゲン膜(ナイロンメッシュ上に沈着され凝固されるウシI型コラーゲンマトリックス)を含む。詳細には、酸性のウシコラーゲン(3mg/ml)を、氷上で水酸化ナトリウム(NaOH)を用いて中和し、100μmの細孔サイズのナイロンメッシュ上に沈着させ、ステンレス鋼のOリング中に積層して、これによってバイオリアクターに適合可能にさせた。この足場を37℃、95%RHで凝固させて、細胞培養培地に入れた。足場の写真は図14に示す。
この実施形態では、コンフルエントな内皮細胞をVS膜マトリックス上で増殖した。新鮮に増殖したヒト血管内皮細胞(HUVEC)を、多孔性Protasan/コラーゲン膜を含むナイロンメッシュストレーナーの底側に沈着させた。この工程のために、ストレーナーを培養ウェル中で逆さまにおいた。細胞懸濁液は約5×105細胞/mlを含んだ。細胞を固着させ適合させた後、HUVECの別の沈着をこの膜の反対の表面上で行い、このときストレーナーをその正常な位置に戻した。両側培養物をDMEM培地中で12日間維持した。足場の写真は図15に示す。
両側のHUVEC培養物の末梢血単球に対する浸透性を試験した。Protasan/コラーゲン多孔性マトリックス上で増殖した両側のHUVEC培養物の標本を、ヒトPBMCとともに、底面に位置する単球特異的なケモカインMCP−1の有無のもとで播種した。図16は、膜上の適用の30分後にMCP−1なし(左パネル)MCP−1あり(右側のパネル)でのチャンバの底の単球を示す。
ナイロンメッシュによって支持されるウシコラーゲン膜上で増殖されたコンフルエントなHUVEC培養物。細胞は、首尾よい(「適切な(happy)」)内皮培養物の特徴である、十分規定された多数の角の形状、および明確に視認できる細胞内接触部を示した。適切な播種条件下で、コンフルエンシーは24時間で達成された(図17)。
ヒト単球は、コラーゲンメッシュで支持されたマトリックス上のHUVEC培養物に浸透した(図18)。HUVEC単層(5×106/ml)上のヒトPBMCの沈着の1.5時間後、多数の単球がコラーゲンのクッションに入り、管腔から管腔を離れた方向に単層を移動する。この図は、表面のHUVEC細胞の20μm下の細胞とともにリングメッシュに結合されたコラーゲン中のトルイジンブルー染色された細胞を示す。
本発明のAISでは、皮膚上皮は、3D組織構築物に組み込まれ、その結果DC前駆体は、表皮に定着し得、そして正常な免疫生理学が保たれる。この実施形態では、皮膚が免疫の最も一般的な部位であるという事実に基づいて皮膚の重要な要素を含むようにワクチン接種部位の複雑性が増大される。実際、見込みがあると思われる最新のワクチン候補物のいくつかは実際には、表皮に適用された皮膚パッチである。
「皮膚等価物(skin equivalents)」中のランゲルハンス細胞の組み込みは取り組まれている(Regnierら、J.Invest.Dermatol.109:510〜512(1997);Franssonら、Br.J.Dermatol.139:598〜604(1998))。これらは、有望な説明であり、モデルの1つとして、ケラチノサイトが外因性のサイトカインの通常は追加なしのCD34+前駆体からのランゲルハンス細胞分化を支持し得ることが示された(Franssonら、前出(1998))。
VSは、本発明の人工的なリンパ節(LTE)と接続して配置され得る。このような直接接続は、このような接続を可能にするフローチャンバを含めるによって達成され得る。この実施形態については、デジタル印刷技術が所望され得る。
1.細胞のBAT取り扱い、
2.最適の足場細孔サイズおよびフレームワーク寸法、
3.各々の組織タイプについての足場特徴、
4.種々の組織タイプおよび液体/栄養経路のための接合(interfacing)/接続(connecting)足場、
5.他の組織タイプに対して考案された足場領域に対する細胞の接着を含む、所望されないバイオリアクター表面に対する細胞接着を妨げるための物質、
6.各々の組織タイプのための細胞播種密度、
7.細胞播種の順序(同時にまたは段階的に;そして最終のバイオリアクター構成において達成する方法)、ならびに
8.最終バイオリアクター構成への組み込みおよびデジタル印刷の方法。
BioAssembly Tool(BAT)は、走化性に対する実験における細胞の横向き運動の観察における使用のために改変されている。記載された設定によってケモカインおよび細胞マトリックスの迅速なスクリーニングが可能になる(代表的には、1つの実験で、約半時間〜1時間を要し得る)。
本実施例は、人工的なリンパ組織とも呼ばれるリンパ組織等価物(LTE)に関する。LTEは、ナイーブなおよび/または記憶Tリンパ球およびBリンパ球を含む人工的な(エキソビボ)免疫系の司令部である。T細胞およびB細胞は、感染した細胞を破壊すること、病原体をオプソニン化する抗体を生成すること、および他の免疫細胞中でエフェクター機能を誘導するサイトカインを分泌することによって適応免疫において重要な役割を果たす。ナイーブなリンパ球の活性化は、二次的なリンパ組織(リンパ節、パイエル板、脾臓を含む)内で生じる。T細胞は、末梢からリンパ節に遊走する樹状細胞によってクラスIおよびクラスIIMHC分子の間隙においてT細胞に対して提示された抗原性ペプチドによって活性化されるが、B細胞は、外来の分子とそれらの抗原レセプターとの直接結合および活性化T細胞との引き続く相互作用によって活性化される。
一次的な免疫応答におけるB細胞活性化の現在のモデルは、図27に図示される(Baumgarth、Immunol.Rev.176:171〜180(2000)より)。濾胞中のB細胞は最初に、リンパ管によってリンパ節に担持される可溶性抗原に結合し、これが濾胞の端部へのB細胞の遊走を誘発し、ここでB細胞は活性化されたCD4+ヘルパーT細胞に出会う。次いで活性化されたCD4+細胞は、CD40−CD40リガンド相互作用ならびにB細胞増殖およびアイソタイプ切り替えを促進するサイトカインという形態で「補助(help)」を提供する。
LTEは、ナイーブなT細胞およびB細胞の活性化の重要な場所として機能する。本発明は、LTEの設計において、リンパ節細胞外マトリックスのモデルの製造および種々の微小環境の合図(例えば、ケモカイン、サイトカイン、細胞(例えば、線維芽細胞性細網細胞))を提供するための多様なアプローチを包含する。LTEの特定の設計の検討材料としては以下が挙げられる:
1.リンパ節の細網の網目状構造「足場(scaffold)」のモデルとして、合成および/または天然のリンパECM由来ヒドロゲルマトリックスを用いること、
2.LTE内でのT細胞活性化およびDC生存/機能に対するマトリックス組成および支持リンパ間質細胞の存在の役割、
3.TゾーンおよびBゾーンの両方を含むLTE構造の製造。これらはいくつかの相補的なストラテジーを用いて組み立てられる。
b.マトリックス内の別個の位置内の操作された局所ケモカイン供給源の作成を介する、T細胞およびB細胞領域の自己組織化および維持。
以下の説明は、本発明のこれらの特徴の各々について実験的なおよびアプローチを詳細に示す。
マイクロビーズは、ピッツバーグ大学のStephen Baylak博士によって提供されたプロトコールを用いて調製されたブタのリンパの細胞外マトリックスから製造された。
本発明の別の実施形態では、LTEはケモカインおよびリンパ球でロードされたマイクロキャリアを含む。本発明の別の実施形態は、LTEを構築する方法に関する;この方法は、(1)マトリックスを提供する工程と;(2)ケモカインでこのマトリックスをロードする工程と;(3)このマトリックスとともにリンパ球を培養する工程と;を包含する。
細胞外マトリックスおよびリンパ節の間質細胞の両方が、二次的なリンパ器官において、T細胞、B細胞および樹状細胞の機能に重大な役割を果たすようである。リンパ節の細胞構築の見地から、Tゾーンの間質細胞は、サイトカインおよび/またはケモカインの産生を介して、T細胞活性化に、そしてTゾーンを通じてT細胞およびDCの遊走を支持するレセプターの発現に重要な役割を果たすようである。
B細胞抗体産生のためのT細胞補助のリンパ節機能を提供するために、本発明のLTE内の別個のT細胞およびB細胞領域を、デジタル印刷(別個のゾーン内のT細胞およびB細胞を直接アセンブリする)および/または徐放性技術(例えば、それぞれT細胞およびB細胞の領域を維持するようにT細胞およびB細胞の誘引物質を放出するマイクロスフェアを用いる)の組み合わせ作用によって製造する。マトリックスを製造するために用いられる物質と一緒になって、これによって、モデルのリンパの微小環境に対する空間的および一時的な制御で、細胞遊走および細胞間相互作用を適切に調節することが可能になる:接着リガンドおよびケモカインタイプ、空間的な位置、密度および時間による濃度は、リンパ球機能を最適化するために変えられてもよい。これらの変数の全てに対する完全な制御で、インビボの環境の最も完全な模倣が得られるが、モデルのLTE構造について上記されたデータで例示されるとおり、LTE中の接着分子、ケモカインおよび他の可溶性の因子の情報のいくつかの限られたサブセットは、これらのインビトロ構築物内で重要な機能を達成し得る。
Tリンパ球およびBリンパ球は高度に運動性であり、そしてLTEマトリックスの微小環境が遊走を支持する場合、LTEへの直接印刷によって作成されたT細胞およびB細胞領域は、培養物中で経時的に十分規定されないということが予期され得る。インビボでは、これらのゾーンは、二次リンパ組織内のそれぞれの区画へT細胞およびB細胞を局所的に誘引する局所ケモカイン勾配の作用によって維持されると考えられる(Cysterら、Immunol.Rev.176:181〜193(2000);Cyster,J.Exp.Med.189:447〜450(1999))(図34A)。LTEにおけるこれらの条件の規定されたシミュレーションを得るために、本発明のLTEの実施形態は、各々の細胞タイプについて重力の局所中心をそれらの局所ゾーンで得るようにデザインされた、ケモカイン放出マイクロスフェアとの細胞の同時沈着を含む(図34B)。
機能的なLTEを構築するためのさらなるアプローチ。上記実施形態は、哺乳動物、好ましくはヒトの二次的なリンパ組織の最小の機能的な模倣物を製造するアプローチを記載する。本発明の範囲内で考慮される他の実施形態がここで記載される。
1.マウス由来の小さい胸腺フラグメントを、Cell Foamディスク(多孔性マトリックス)の表面上で、12ウェルのプレート中で培養し、間質のコンフルエントな層がマトリックス全体にわたって形成されるまで、増殖培地中で14日間カバーした。
インビトロの免疫系を構成するために、単球、T細胞およびB細胞、内皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、間質細胞、ならびに好中球、肥満細胞および他の免疫細胞を含む多数の細胞が必要であり得る。1実施形態では、免疫細胞の準備された供給源は、末梢血(PBMC)であり、これはワクチン接種部位に、そしてLTEに必要な多くの細胞を提供する。別の実施形態では、ヒトサンプル由来の皮膚関連細胞(ワクチン接種部位の節で記載)が用いられ得る。さらに別の実施形態では、CD34+幹細胞からインビボで生成される造血細胞の供給源としてHuScidマウスを用いることが可能である。さらに、胚性幹(ES)細胞からこれらの細胞タイプの全てを生成するための方法論が開発されているので、本発明は、1つのES細胞株/系統由来の完全に適合した細胞を用いる工程を包含するとみなされる。
高処理能力の薬物スクリーニング技術との類似を描写すれば、迅速なワクチンまたは化合物のスクリーニングに適切なAISには、単回使用のために設計された、多数の低コストの使い捨て可能なバイオリアクターが必要である。各々のバイオリアクターは種々の抗原をチャレンジされ、そして免疫応答の活性化の際に、抗体、B細胞およびT細胞について回収される。微小流体バイオリアクターは、この目的を達成するために好ましく、そして、組織構築物を播種するにはより少ないわずかな細胞しか要しないというさらなる利点をもたらす。
このような微小流体バイオリアクターの製造には、最適の処理条件(例えば、レーザー流量および変換速度)を決定するために、生体適合性物質を用いた超短パルス加工トライアルが必要であり得る。本発明のデザインは、デバイスが組み立てられた後に、バイアまたはポートの追加のために、層状にされたデバイス(例えば、ガス透過性のポリマーの頂部層、BAT沈着された中間層、およびPDMSの底部層)のレーザー加工を可能にするのに十分に可塑性である。
免疫学は、いずれのヒトの系でもこの時点では観察できない事象の多くのカスケードを有する。詳細には、ワクチンが免疫学的組織内に入ることに関連する律速段階および免疫学的組織内での相互作用の結果として失敗する場合、ヒトでこのプロセスを測定する方法も改善する方法も現在はない。この問題に取り組むため、本発明のある実施形態は、インビトロの免疫学的プロセス/ワクチン接種プロセスのインサイチュの工程において光学的にモニターできるような方法でAISを構築する工程を包含する。
インビボの系を模倣する微小流体デバイスは、細胞の相互作用および生物学的プロセスのインビトロでの研究における価値を提供している。このようなデバイスは、小さいサンプルおよび試薬の容積、小さい廃棄容積、増大した表面積対容積比、低いレイノルド数(層流)、粒子分離のための速い沈殿、反応時間の短縮および携行性を含む、伝統的な大規模の液体アセンブリを上回るいくつかの利点を提供する。いくつかの微小流体デバイスはまた、ポンプ、バルブ、フィルター、ミキサー、電極および検出器を組み込む。整列の容易さおよびさらに短い反応時間によって、このアプローチを用いて可能なほぼリアルタイムの検出が行われる。
複雑な生存しているシステムを理解するには、細胞およびそれらの3Dの微小環境の相互作用の全体的な理解が必要である。それらの細胞を理解するには、全ての機能的な単位、シグナル伝達分子、構造的な足場および遺伝物質の統合された理解が必要である。
AISデバイスの例を図38に例示する。このデバイスは、微小流体バイオリアクターと、内蔵光導波管を備えるELISAチップと、デバイスを接続し交換を可能にするための微小流体バックプレーンと、外部ポンプおよびリザーバのための微小流体コネクターとを備える。このバイオリアクターは4つの外部ポートを有し、2つが各々組織構築物の上と下にある。3セットの2つのチャネルを有するELISAチップが図示されるが、他の実施形態ではより多いチャネルが同じフットプリントに組み込まれる。各々のセットでは、1チャネルが1つのサンプルアッセイのためであり、その他はサンプルなしのコントロールである。各々のセットを同じELISAインプットポートに接続し、これによって両方のチャネルを同時に調製することが可能になる;しかし、セット中の1つのチャネルのみがサンプルの液体に接続される。この液体は、微小流体バックプレーン中のチャネルを通じてバイオリアクターからELISAチップにポンピングされる。バルブは、各々のチャネルへのサンプル液体の添加を制御する。光ファイバーを通じてELISAチャネルに光をカップリングして、この伝達された光を検出器に接続された別のファイバーにカップリングさせる。この好ましい実施形態では、バイオリアクターおよびELISAチップは両方とも、2光子および共焦点顕微鏡検査のために光学的に透明である。この好ましい実施形態では、本実施例における全体的なアセンブリのフットプリントは約50×75mmである。
さらなる実施形態では、AISの機能を、磁気マイクロビーズまたはナノビーズ(磁気支援AIS、MaAIS)を用いて増強する。AISによって、区画(血液、皮膚、リンパ節)の間の単球およびDCの輸送を説明することが可能になるので、AIS中の免疫学的構築物へのそしてそれからの遊走のための生体模倣経路によって、ワクチンのデザインにおける新規な洞察およびAISの良好な予測力がもたらされる。2つの脈管ハイウェイは、VSおよびリンパ管に対して単球を動かして、VSからLTEへ成熟DCを動かす血液である。
1.インビトロのデバイスは、単一のユニットであって、好ましくは平坦で、その主要な要素は単独の隔離された容積に位置する単一ユニットのままである。
AISにおいて評価されるべき免疫応答の少なくとも2つのパラメーターがある:活性化されたB細胞によって産生された特定の抗体の力価、ならびに活性化されたヘルパーT細胞および細胞傷害性T細胞の総量および比(すなわち、CD4/CD8応答)。ある実施形態では、磁気ビーズをまた、この段階で用いて、迅速で、コンピューター制御され、そして磁気作動されるアッセイを得てもよい。
食作用は報告によれば、該当の粒子のサイズおよび表面特性に依存する。一般には、マイクロ粒子は約1〜約3μmのサイズ範囲において、さらに疎水性であるものであり;そして正の表面電荷を保有するマイクロ粒子は、囲まれる可能性が最も高いものである。約5μmより大きいかまたは約1μmより小さい粒子、親水性の高い粒子、そして負に荷電された表面を保有する粒子は、DCによって容易に囲まれない(Chenら、J.Colloid Interface Sci.190:118〜133(1998))。結果として、大きく適切にコーティングされた粒子を用いて、食作用を最小化するか、または効率的に停止し得る。DYNAL(Norway)によって生成された最大のDynabead粒子は約5μmである(Safarik & Safarikova,Rev.J,Chromatog.B722:33〜53(1999);DYNAL(Norway)http://www.dynalbiotech.com/)。かなり大きいビーズ(10μm以上)が、例えば、AGOWA(AGOWA GmbH(Germany)http://www.agowa.de/struktur/magneticbasis.html)から入手可能である。Dynal生成物に構造的に似ている、それより大きい磁気ビーズでさえ、キトサンから合成され得る(Banchereau & Steinman,Nature 392:245〜252,(1998))。図41は、種々のタイプおよびサイズの細胞に結合されたM450 Dynabeadsを図示する。成熟DCはほぼ、図の右側に捕捉された腫瘍細胞のサイズ、約30〜35μmである(Siebenら、Comparison of different particles and methods for magnetic isolation of circulating tumor cells)。結果として、約20μm以上のサイズだとしたらそのビーズをそれらが食菌し得ると期待することは困難である。図56は、単球による微小粒子の食作用を示す。
AISのデザインによって、インフルエンザ、CMVまたは破傷風毒素を含む、共通の病原体またはワクチン由来のペプチドまたはタンパク質の導入が可能になる。このような抗原は、インビトロのVSに直接注入されてもよい。さらに、生得的な免疫系の種々のアジュバントまたは刺激物質を導入して、樹状細胞および他の細胞が活性化されるように誘発させ、そして次にT応答およびB応答を誘導してもよい。
DC後、T細胞およびB細胞を約1〜約7日間相互作用させて、細胞をLTEから抽出させてそれらの特性を詳細に評価し得る。さらに、LTEおよびVSの液相をサンプリングして、抗体の力価およびサイトカイン/ケモカインのレベルを測定してもよい。
(c)樹状細胞:樹状細胞は、免疫のおよそ数時間からおよそ数日後に単離されて、例えば、生存度、成熟マーカー発現および機能について試験され得る。DCは、内部ワクチン刺激に依存して、それらの特性を変化すると予測される。
LTE中で培養されたB細胞は、試験されたワクチンによるAISデバイスの免疫に応答して抗体(Abs)を産生すると期待される。免疫の抗原(例えば、オボアルブミン)でタグ化された磁気ビーズは、これらの抗体に結合するはずである。一次Absに対して惹起されて、酵素または蛍光のレポーティング基でタグ化された二次抗体を用いて、伝統的なELISAサンドイッチを形成し得、これによって一次Absのレベルの決定が可能になる(図43)。
T細胞上のCD4+およびCD8+マーカーの出現は、それらのDC誘導性活性化の結果判定法である。CD4/CD8アッセイのためのIMS−ELISAサンドイッチスキームを使用するために、活性化されたT細胞を磁気ビーズに対して固定することが重要である;これは、CD3またはCD2活性化マーカーを用いて達成され得る。しかし、これらのマーカーに対する抗体の結合自体が代表的には、T細胞活性の評価では望ましくないT細胞の活性化を開始することが公知である。他方では、CD3に対するAb固定を介してT細胞を活性化するのに必要な期間は、約2〜4日間である(E−Bioscience(San Diego,CA)(http://www.ebioscience.com/ebioscience/appls/AC145.htm#human))のT細胞の抗CD3活性化のプロトコール)。結果として、有意に短い時間で行われたアッセイでもやはり情報としてためになるようである。CD2またはCD3に対するビーズの結合を介して形成された磁気ビーズ/T細胞結合体は、特定の標識で、好ましくは蛍光基でタグ化された抗CD4および抗CD8抗体のための標的である(図44)。
例えば、生物戦争剤(biowarfare agents)、新興の感染性疾患、および現在の世界的な蔓延についてヒトワクチンの評価のためのさらに正確なインビトロのモデルが呈示される。以下の例は、AISが、ワクチンおよび他の免疫療法の有効性および機構を評価するために用いられ得る方法を例示している。
1.DC、CD4+T、CD8+TおよびB細胞を会合させるためのLTE中の場所を提供することによって、候補ワクチンがCTLおよびB細胞応答を誘導するためのT細胞の補助の最適のレベルを促進するか否かが決定され得る;
2.DC、T細胞およびB細胞を、細胞外マトリックスおよび支持細胞を有する3D環境で会合させることを可能にさせることによって、LTEはさらに現実的に、細胞のこの三つ組みがインビボで相互作用するリンパ節の環境を模倣する;
3.単球およびDCは、再循環および遊出の間に内皮細胞と相互作用するということを内皮の包含で確実にさせる;これらの相互作用には、免疫および内皮細胞の表面上の特定のタンパク質であって、そのいくつかがワクチン候補物に対して感受性であり得、従ってヒトでのワクチン有効性に影響し得るタンパク質の発現を要する;そして
4.さらに代表的な細胞の集団の存在、ならびに局所の組織シグナルに応答して内皮を横切って遊走し、分化するはずである細胞の存在は、さらに正確な結果をもたらす(例えば、TLR9(トール様レセプター9)リガンド対TLR4リガンドの効果を識別することができる、なぜならそれらは2D培養物には存在し得ない、そしてマウスにおいてそれらのTlr発現が相違していることが公知である複数のDCサブタイプで示差的に発現されるからである(Kadowakiら、J.Exp.Med.194:863〜869(2001))。
1.単球補充;
2.DCサブタイプの分化;
3.DC抗原ローディング;
4.DC成熟;
5.DC遊出;
6.内皮の活性化および機能;
7.リンパ節に到達するDCの反応速度論および数;
8.T細胞とDCとの間の相互作用の有効性;
9.B細胞とDCとの間の相互作用の有効性;
10.T細胞とB細胞とDCとの間の相互作用の有効性;ならびに
11.T細胞およびB細胞の活性化状態。
本発明のある実施形態では、アセンブルされたLTEを、種々の所望の生体分子(例えば、サイトカイン、タンパク質、抗体)を生合成する「バイオファクトリー(biofactory)」として用いる。例えば、抗原がB細胞に提示される場合、それらのB細胞はLTE中で抗体を生成し得る。潜在的に、生成された抗体はまた、B細胞のレパートリーおよびこのペプチドがB細胞にどのように提示されるかに依存してモノクローナルであってもよい。モノクローナル抗体(mAb)は、基本的な生物医学研究において、疾患の診断において、そして感染およびガンのような疾病の処置において広く用いられる。抗体は、多くの研究者らによって、彼らの研究において用いられる重要なツールであり、多くの医学上の進歩をもたらしている。
とりわけ天然のT細胞遊走、接着分子およびケモカインに影響する多様な要因は、有意な役割を果たし、そして逆オパールヒドロゲルLTEにおけるこれらの要因の正確なバランスの包含によって、インビボの細胞遊走と量的に同様のナイーブなT細胞運動が刺激されることが可能になる。1例として、蛍光的に標識された、成熟マウス樹状細胞(Inabaら、J.Exp.Med.,176:1693(1992)の方法によってC57BL/6マウスの骨髄から生成され、そしてLPSを用いた12時間の処置によって成熟された)、そしてOT−IIトランスジェニックマウスのリンパ節由来の標識されたナイーブなCD4+T細胞を、フィブロネクチンでコーティングされた逆オパール足場に加えた。成熟樹状細胞(例えば、CCL19)によって生成されたケモカイン、およびこれらの細胞の表面で発現された接着分子は、ナイーブなT細胞運動を促進することが想定される。コマ撮りの3Dビデオ顕微鏡検査を用いて2時間にわたって足場内で細胞の動態を記録した。T細胞は高度に活性であり、マウスリンパ節におけるT細胞遊走の生体内画像化研究によって観察された遊走挙動の「スタート−ストップ(start−stop)」遊走パターン連想が示された。図61に示されるように、T細胞は、垂直(図61A)および水平(図61B)の両方で、足場内の樹状細胞の表面にわたって空隙から空隙へ遊走し得る。細胞の通路および速度の定量(図62)によって、細胞が、ナイーブなT細胞についてインビボで報告された値に達する4.6μm/分の平均速度で動いたこと、そしてT細胞がインビボで示されるように、最大30μm/分までの速度の最大の「バースト(bursts)」を有したことが示された。ナイーブなT細胞は単独で、逆オパール足場においてリンパ節様の密度では、極性化も遊走もできず(図63)、これによって、細胞遊走を刺激するためにさらに完全なリンパ微小環境を必要とすることが示される。
Cytoporeアリコート(0.4ml、堅く沈降した)をヘパリンで処理して、徹底的に洗浄し、種々の濃度のBLCを含む3ml PBS/BSA中でインキュベートして洗浄した。後に、溶液中に残るBLCおよびCytopore/ヘパリンによって吸着されたBLCを別々に決定した。図67に示されるとおり、Cytopore/ヘパリンの吸着曲線は十分に直線で出現した。結果として、用いられた条件は、BLCケモカインによるCytoporeの飽和とはかなり離れているようであった。これによって上記のようにヘパリンで飽和されたCytoporeが潜在的に、本実施例の実験においてよりもケモカインのかなり高い(約10倍以上)の負荷を担持し得ることが示唆される。
図57に示されるように、B細胞およびT細胞を、ランダムウォークする能力を与えられた物体として2D空間でモデル化して、お互いと特定の時間、物理的に接触させた。合理的に高濃度で、例えば約3×107細胞/mlで、周囲をランダムウォークするB細胞およびT細胞の自己集中の中心としてマイクロキャリアを含むLTEモデルは、無作為に分布され同時培養されたB細胞およびT細胞のモデルに対して利点を有することが見出された:T細胞は、LTEモデルにおいてB細胞と接触するのに十分に高い確率を有した。この利点は細胞濃度をさらに増大させることで徐々に減少し、細胞の濃密なスラリーに対応する約3×108細胞/mlの濃度ではごくわずかになる(図57)。この計算結果は、濃縮されたB細胞(天然のリンパ節の胚中心を模倣する)およびルーズに遊走しているT細胞の領域を含むLTEデザインを支持する状況証拠であるとみなされる。
Claims (20)
- インビトロの隣り合う2つの培養細胞系であって:
末梢血単核球(PBMC)の集団を受容して該末梢血単核球の集団の中に存在する樹状細胞前駆体を細胞培養培地中で成熟させるために、細胞培養培地、平面のマトリックス、該第一のマトリックスに接着したヒト血管内皮細胞(HUVECs)からなる複数の細胞、並びに標的の外来抗原を含み、且つ
前記平面のマトリックスが、異種移植片細胞外マトリックス(ECM)シート、自然に重合化したヒト羊膜結合組織、再構成されたコラーゲンマトリックスおよびキトサン/コラーゲン膜の足場からなる群より選択され、且つ
前記複数の細胞が前記平面のマトリックス上に血管内皮を形成する、
ワクチンが接種される部位と等価な培養物Aと;
B細胞及びT細胞を含む複数のリンパ球、並びに合成及び/又は天然のリンパECM由来物質を含むヒドロゲルマトリックスを含み、且つ
前記ヒドロゲルマトリックスがリンパ節の網目状足場を形成し、且つB細胞、T細胞、及び成熟樹状細胞の相互作用を支持する、
前記培養物A中の成熟樹状細胞を受容するための、三次元の、リンパ組織と等価な培養物Bと;
を含む2つの培養細胞系。 - 前記複数の細胞が前記平面のマトリックスの両側上に血管内皮を形成する、請求項1に記載の2つの培養細胞系。
- 前記複数の細胞が前記平面のマトリックスの片側に血管内皮を形成し、そして皮膚上皮細胞が前記平面のマトリックスのもう一方の側に上皮を形成する、請求項1に記載の2つの培養細胞系。
- 前記培養物Aにおける前記複数の細胞がヒト細胞を含む、請求項1に記載の2つの培養細胞系。
- 前記培養物Aにおける前記複数の細胞がヒト皮膚由来血管細胞および内皮細胞を含む、請求項1に記載の2つの培養細胞系。
- 前記平面のマトリックスが、無細胞ヒト真皮を含む、請求項1に記載の2つの培養細胞系。
- 前記複数のリンパ球がさらに樹状細胞を含む、請求項1に記載の2つの培養細胞系。
- 前記ヒドロゲルマトリックスが隔離されたT細胞およびB細胞ゾーンを含む、請求項1に記載の2つの培養細胞系。
- 前記T細胞ゾーンがナイーブなT細胞および膠原線維を含む、請求項8に記載の2つの培養細胞系。
- 前記膠原線維がコラーゲンI、コラーゲンIIIまたはフィブロネクチンを含む、請求項9に記載の2つの培養細胞系。
- 前記T細胞ゾーンが細網線維芽細胞を含む、請求項8に記載の2つの培養細胞系。
- 前記隔離されたT細胞およびB細胞のゾーンが、化学誘引物質の制御放出によって作られる、請求項8に記載の2つの培養細胞系。
- 前記培養物Bがケモカインを含む、請求項1に記載の2つの培養細胞系。
- 前記ケモカインが、CXCL−13、CCL−21およびMIP3からなる群より選択される、請求項13に記載の2つの培養細胞系。
- 前記複数のリンパ球が、末梢血リンパ球からネガティブに選択されたB細胞およびT細胞を含む、請求項1に記載の2つの培養細胞系。
- 請求項1に記載のインビトロの隣り合う2つの培養細胞系を用いる方法であって、該方法は:
前記培養物Aに末梢血単核球(PBMC)の集団を導入する工程と;
該末梢血単核球の集団の中に存在する樹状細胞前駆体の刺激を促進する条件下で、前記培養物A及び標的抗原を培養する工程と;
刺激された樹状細胞前駆体を成熟樹状細胞に変換させる工程と;
前記培養物Aにおいて成熟した樹状細胞を前記培養物Bに移動させる工程と;
前記培養物Bにおける前記複数のリンパ球の、前記成熟樹状細胞による刺激を促進する条件下で、前記培養物Bを培養する工程と;
該成熟樹状細胞による刺激後に該複数のリンパ球からの応答を測定する工程と;
を包含する、方法。 - 前記標的抗原が、ワクチン、アジュバント、薬物、生体分子、化合物および化粧品からなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記成熟樹状細胞による刺激後の前記複数のリンパ球からの応答が、リンホカインの存在を検出する工程またはリンホカインのレベルを測定する工程によって決定される、請求項16に記載の方法。
- 前記成熟樹状細胞による刺激後の前記複数のリンパ球からの応答が、複数のリンホカインの存在を検出することまたは複数のリンホカインのレベルを測定することによって決定される、請求項16に記載の方法。
- 前記培養物A及び前記培養物Bが抗原特異的なリンパ球の免疫応答を解析するときに連続して使用される、請求項1に記載の2つの培養細胞系。
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