JP5792769B2 - ホルムアルデヒド−固定生物学的試料の成分のアルキルアミン改良検出 - Google Patents
ホルムアルデヒド−固定生物学的試料の成分のアルキルアミン改良検出 Download PDFInfo
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Description
100年超の間、病理学者は、通常、組織試料のような生物学的試料をホルムアルデヒドで固定することによって保存してきた。ホルムアルデヒド処理は、組織の細胞特性を保持するが、ホルムアルデヒド処理は、試料の生物学的成分の多くを、検出、定量及び特徴化にほとんど利用できないか又は利用できなくさせている化学的架橋をももたらしている。ホルムアルデヒドは、タンパク質中の第一級アミン基を、-CH2-結合によって、タンパク質又はDNA中の他の近くの窒素原子で架橋することによって、組織もしくは細胞を保持又は維持する。従って、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が生物学的試料中の核酸を検出し及び定量するために有用であるが、PCRは、一般的に、特に定量的結果が望まれる場合には、ホルムアルデヒド架橋試料中の核酸を分析するにはほとんど効果的でないか又は効果的でない。
本発明は、ホルムアルデヒド架橋生物学的試料の1以上の成分を分析するための方法を提供する。ある実施態様では、該方法は、該試料と、架橋成分の少なくとも1部分を放出させるために十分量のアルキルアミンとを接触させ、それによって分析用の1以上の成分の利用可能性を改善することを含む。ある実施態様では、生物学的試料は、動物由来の組織試料である。
「ホルムアルデヒド架橋生物学的試料」は、架橋がタンパク質中の窒素原子と他の窒素含有タンパク質及び/又は核酸との間で形成されるようにホルムアルデヒドで処理された生物学的試料を意味する。生物学的試料は、典型的には、細胞を含むことになる。生物学的試料は、例えば動物由来の組織試料である。多くのホルムアルデヒド-処理試料は、パラフィン中にそれを埋め込むことによって保存される。
I.導入
図1に示すように、ホルムアルデヒドは、核酸の第一級アミン、特に、タンパク質中のリジン及びアルギニンのようなアミノ酸への架橋をもたらす。架橋の結果として、ホルムアルデヒド固定試料中の様々な生物学的成分が現在の検出法には利用できない。本発明は、架橋を逆転させ、それによって、より多くの生物学的成分を検出に利用できるようにする方法を提供する。
本発明は、生物学的試料のホルムアルデヒド架橋成分を、該試料をアルキルアミンと接触させることによって検出に更に利用できるようにさせるための方法を提供する。該成分をより利用可能にさせるためのアルキルアミンの量は、異なった検出方法が異なった感度を有し、そのため多少の成分が利用可能であることを必要とするので、変動し、そして使用された特定のアルキルアミン、検出されるべき成分、及び使用されうる検出方法にある程度依拠し得る。
先に述べた架橋試料の成分を分析するために上記のアルキルアミン処理と組み合わせて任意の検出法が使用され得る。以下に更に詳細に記載するように、架橋が検出を妨害する試料の具体的な成分は、核酸及びタンパク質を含む。成分の検出は、特定の成分もしくは成分の一部(例えば、特定のタンパク質もしくは核酸配列)の存在又は非存在を単に決定することを含んでもよい。あるいは、検出は、成分の定量及び/又は成分の特徴付けを含んでもよい。特徴付けは、例えば、ペプチド又は核酸配列、及び/又は例えばグリコシル化、リン酸化等を含む転写後修飾又は転写修飾の決定を含んでもよい。
核酸を検出するために多数の方法は当該分野で知られている。DNA又はRNA(mRNA、rRNA等を含む)又はその両方が検出され得る。検出は、例えば、ヌクレオチドシークエンシング又は配列-特異的ハイブリダイゼーション技術(例えば、単一ヌクレオチド多形態(SNP)等を検出するために使用されるもの)による、特定の配列又はRNAの定量及び/又は核酸の特徴付けを含んでもよい。
試料のタンパク質成分は、アルキルアミンを用いる処理によっても検出され得る。多数のタンパク質検出及び特徴付け方法のいずれかは、本発明の方法に従って採用され得る。
本発明はまた、本発明の上記の方法を採用するために有用なキットを提供する。そのようなわけで、キットは、上記の1以上の試薬を含んでもよい。場合により、キットは、その使用のための教示書(紙)又は電子的な教示を含んでもよい。
本発明はまた、反応混合物を提供する。具体的な反応混合物は、ホルムアルデヒド-固定試料、場合によりパラフィン、及び本明細書に記載のアルキルアミンを含む。反応混合物は、上記のアルキルアミンの濃縮物を含んでもよい。更に、反応混合物は、場合により上記の温度にある。反応混合物は、場合により、プロテアーゼ(例えば、プロテイナーゼK)を含んでもよい。
本実施例は、アルキルアミンを用いる核酸の架橋化学の逆転を説明する。
DNAの検出のための具体的なプロトコルは以下のとおりである。
ステップ1: 組織切断
Microtom RM2255を用いる20 μ組織部分を切断し、1.5 mLのエッペンドルフに該部分を入れ、キャップチューブを閉めた。
EDAを溶解試薬に500 mM/225 μLの最終濃度で加えた。200 μL溶解試薬/EDAを試料を含む各チューブに加えた。
98℃に設定したヒートブロック中で30分間、各試料をインキュベートした。最初の5分間の後、各試料をヒートブロックから除き、短時間ボルテックスした。ボルテックス後、20,817 rcf(例えば、エッペンドルフ5417C, 14,000 rpm)で5秒間遠心して、すべてのパラフィン及び組織を溶液に入れた。確実に、チューブの側面にはパラフィンも組織も残っていなかった。残りの25分間、ヒートブロックに戻した。
20 μLのPKを試料を含む各チューブに加えた。短時間ボルテックスし、次いで20,817 rcf(例えば、エッペンドルフ5417C, 14,000 rpm)で5秒間遠心して、すべてのパラフィン及び組織を溶液に入れた。確実に、チューブの側面にはパラフィンも組織も残っていなかった。
98℃に設定したヒートブロック中で各溶解試料を10分間インキュベートした。10分間のインキュベーション時間後に、98℃に設定したヒートブロックから各試料を直ちに取り出し、20,817 rcf(例えば、エッペンドルフ5417C, 14,000 rpm)で20分間遠心して、溶解物から残骸を除いた。溶解物を遠心前に過度に冷却できる場合には、パラフィン固化上層は形成せず、パラフィンは溶解物と共に除かれるだろう。好ましくは、パラフィンは固化上層を形成する。
各試料について好適な試料識別で1つの新しい1.5 mLスクリューキャップチューブを標識した。新しい1.5 mLチューブに溶解物を移した。パラフィン上層、及びチューブの底に見られたペレット中の残骸を除いた(avoid)。試料を更に浄化する必要があれば、溶解物を更に20,817 rcf(例えば、エッペンドルフ5417C, 14,000 rpm)で15分間遠心した。溶解物を新しく標識した1.5 mLチューブに移した。
100 μL溶解物を新しい標識した1.5 mLチューブに移したQIAquick(商標)PCR精製キット(QIAGEN Sciences)に従って処理した。100 μLの最終体積で試料を溶解した。
本実施例は、エチレンジアミンを用いるタンパク質-タンパク質の架橋化学の逆転を説明する。
Claims (5)
- ホルムアルデヒド架橋生物学的試料の1以上の成分を分析する方法であって:
(1) 該架橋成分の少なくとも1部分を放出するために、該試料を、エチレンジアミン、エタノールアミン及びプロピルアミンからなる群より選ばれるアルキルアミンの十分量と室温で接触させ、それによって分析用の1以上の成分の利用可能性を改善する段階;
(2) 検出段階の前に、該試料からアルキルアミンを実質的に除く段階;及び
(3) 該成分を検出する段階(但し、核酸プローブを用いたインサイチューハイブリダイゼーションによって該成分の存在を検出することを除く)、
を含み、ここで該成分が核酸であることを特徴とする、方法。 - アルキルアミンの量が、2 mM〜800 mMである、請求項1記載の方法。
- 分析のために利用できる核酸の部分が、前記接触段階が行われない場合に分析のために利用できる部分と比べて、少なくとも2倍に増加される、請求項1記載の方法。
- ホルムアルデヒド架橋生物学的試料の1以上の核酸成分の利用可能性を改善するためのキットであって、以下:
(1) エチレンジアミン、エタノールアミン及びプロピルアミンからなる群より選ばれるアルキルアミン;
(2) アルキルアミンを核酸含有生物学的試料から除去するためのカラム;及び
(3) 該核酸成分の検出又は検出改善のための試薬
を含む、キット。 - 分析用の1以上の成分の利用可能性を改善するための反応混合物の使用であって、該反応混合物が、
ホルムアルデヒド架橋生物学的試料;及び
架橋核酸成分の少なくとも1部分を放出するために、エチレンジアミン、エタノールアミン及びプロピルアミンからなる群より選ばれるアルキルアミンの十分な量
を含み、ここでアルキルアミンの量が2 mM〜800 mMである、使用。
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