JP5789073B2 - 変異誘発方法 - Google Patents

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Description

本発明は、変異核酸分子の産生方法に関するものである。特に、本発明は、変異誘発反応に使用されるプライマー(変異誘発プライマー)自体が鋳型核酸分子から合成される方法に関するものである。変異誘発反応の産物は、例えば更なる修飾を必要とすることなく細菌を形質転換できる変異環状核酸分子である。好ましい態様では、当該方法は分子集団に、例えば分子集団の作製又はスクリーニングに適用することができる。当該方法は、複数の変異誘発プライマーを用いて複数の親分子を変異させる組み合わせ様式に用いることもできる。
分子生物学的技術に関与する工程の1つはベクターへの核酸の導入である。例えば、DNA断片又はDNA断片の集団は、消化され、連結反応によりベクターへ導入されることができる。例えば、DNA断片(又は断片集団)は、サブクローニングとして知られる工程で、消化され、第1のベクター(例えばプラスミド)から取り出されて第2のベクターへ導入されることができる。したがって、連結反応のための相補的突出末端を生ずるように、第1のベクターは第2のベクターと同一の制限酵素で消化される。次に、DNA断片と第2のベクターとがそれらの相補的突出末端により連結され、その結果が、DNA断片を含有する、宿主細胞(例えば細菌)において複製できる完成ベクターである。
したがって、さまざまな分子生物学的応用に使用するための大量のDNAを産生することができる。又は、DNAが導入されているベクターは、特定の目的を有することができる(例えば発現ベクターであり得る)。そのような発現ベクターにいったん導入されると、制限断片によってコードされるタンパク質が宿主細胞中のベクターから発現され得る。いったん発現すると、得られたタンパク質をその最終用途のために精製することができる。又は、特に当該方法がDNA断片の集団を発現ベクターへ組み込むために使用される場合、発現したタンパク質は(例えば標的分子への結合親和性によって)スクリーニングに用いることができる。
DNAへ変異を導入するさまざまな方法も公知である。Barikの研究から(Barik、Methods in Molecular Biology 第192巻:PCR Cloning Protocols、第2版、p189−196、B−Y Chen及びH.W Janes編、Humana Press社、トトワ、ニュージャージー州;Burke及びBarik、Methods in Molecular Biology 第226巻:PCR Protocols、第2版、p525−531、JMS Bartless及びD Stirling編、Humana Press社、トトワ、ニュージャージー州)、PCRに基づいたアプローチを用いて線状DNAに変異を導入することが知られている。これらの方法にしたがい、PCRにて線状鋳型へ変異を導入するためにいわゆるメガプライマーが用いられている。しかしながら、そのような方法は、例えばスケールアップやタンパク質発現のための複製型を産生するにはそれ自身を適切なベクターへサブクローニングする必要がある線状2重鎖DNA産物を生ずる。
Miyazakiは、全プラスミドのPCRを包含する方法を提唱した(Miyazaki、Methods in Molecular Biology:Directed Evolution Library Creation:Methods and Protocols. Eds Arnold及びGeorgiou、Humana Press社、トトワ、ニュージャージー州;BioTechniques 33:1033−1038)。この方法では、2重鎖プラスミドをPCRの鋳型として用い、そこへ、導入すべき変異を含有する2重鎖PCR産物をプライミングのために加える。しかしながら、プライマー及び鋳型の2重鎖性は、プライマー鎖及び鋳型鎖を、交差アニーリングよりも自己アニーリングさせ得るため、自己アニーリングを最小化させるにはプライマー対鋳型の特定比を用いる。
2重鎖鋳型から生ずる自己アニーリングの問題に加えて、2重鎖鋳型をPCRに用いる場合、更なる問題がある。指数関数的反応では、1ラウンドで導入されるエラーは、更なるラウンドのそれぞれに指数基底で繰り越されるため、導入されるエラーの最大量が大きい。更に、このPCR鋳型がベクター、例えばプラスミドのような大きな鋳型である場合、これは、導入されるエラーの見込みを更に増加させる。
合成オリゴヌクレオチドを用いてDNAを変異させることも知られている(Kunkelら、(1985)、PNAS USA、第82巻、pp488−492;Sidhuら、新規結合ペプチドを選択するためのファージディスプレイ)。しかしながら、化学合成できるオリゴヌクレオチドの長さには限界がある。更に、シンセサイザーのプログラムを作るためには、配列が公知であって、産生用のシンセサイザーに前もって入力する必要がある。
したがって、代替変異誘発法の必要性が存在する。特に、細菌を直接形質転換でき、発現スクリーニングにおけるような下流の使用の準備が整った(核酸を適切なベクターへ導入するための更なる消化工程や連結工程の必要性を回避しながら)産物を産生する方法に関し、必要性が存在する。高速で効率的な変異誘発方法や、例えばスクリーニングやライブラリーの作製のための集団の産生に使用するスケールアップに適した方法に対する必要性もある。
1つの側面では、本発明は、1以上の変異を核酸分子へ導入する方法を提供するものであり、当該方法は:鋳型核酸分子から合成し、親分子に対して1以上の変異を含有する1本鎖型変異誘発プライマーを親分子へアニーリングさせ;そして、変異誘発プライマーから相補鎖を合成して変異を含有する環状型核酸分子を作製することを含む。
1つの側面では、本発明は、1以上の変異を核酸分子へ導入する方法を提供するものであり、当該方法は以下の工程を含む:
(a)親分子に対し1以上の変異を含有する変異誘発プライマーを鋳型核酸分子から合成し;
(b)1本鎖型変異誘発プライマーを分離し;
(c)1本鎖型変異誘発プライマーを1本鎖型親分子へアニーリングさせ;そして、
(d)変異誘発プライマーから相補鎖を合成して変異を含有する環状型核酸分子を作製する。
このように、変異誘発プライマーは、鋳型核酸分子から、好適な酵素を用い、当該技術分野に公知の方法を用いて合成される。変異誘発プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づいた方法を用いて合成されることが好ましい。
鋳型分子と親分子は同一でもよく、変異誘発プライマーの合成の基礎を形成する同一配列を含有していてもよい。このように、ある態様では、変異誘発プライマー合成のための鋳型の配列は、親分子に見られるものと同一である。これらの態様では、鋳型分子から変異誘発プライマーを合成するあいだのエラーの導入によって、例えばエラープロンポリメラーゼによって変異を導入することができる。このように、ある態様では、変異誘発プライマーは、第1鎖から第2鎖が合成される際にエラーが導入される合成法、好ましくはエラープロンPCRによって合成される(当該技術分野に熟練した者には好適な方法が公知である。例えば、分子クローニング:実験室マニュアル:第2版、Sambrookら、1989、コールドスプリングハーバー研究所出版)。当該技術分野では、エラープロンPCRを実施するためのDiversify(BDBiosciences 63070)のようなさまざまなキットが利用可能である。他のアプローチでは、DNA配列にエラーを導入する大腸菌株を鋳型分子で形質転換することができる(当該技術分野において好適な株が利用可能である。例えばXL1−RED(ストラタジーン))。鋳型から作製する際に変異誘発プライマーへエラーを導入する他の方法は、当該技術分野に熟練した者には公知であろう。
鋳型と親分子は異なる分子でもよく、即ち、親分子と鋳型分子とのあいだにそれぞれ配列相違性がある領域を含有していてもよい。このように、変異誘発プライマーを鋳型から合成する際、変異誘発プライマーは親分子と比べて変異を含有する(この場合、エラーを導入する反応、例えばエラープロンPCRは必要ない)。
当該技術分野に熟練した者は、変異誘発プライマーを鋳型から合成するための好適な試薬や反応条件について知っている(例えば、分子クローニング:実験室マニュアル:第2版、Sambrookら、1989、コールドスプリングハーバー研究所出版を参照されたい)。変異誘発プライマーをポリメラーゼ連鎖反応にて合成する場合、当該技術分野に熟練した者によって、使用される鋳型を考慮しつつ好適なプライマーが選択される。変異誘発プライマーを作製するために用いられるプライマーを、本明細書において初期プラマーと称する。これらの初期プライマーは、フォワードプラマーとリバースプラマーで構成され、これらは通常、増幅すべき配列の末端、即ち変異誘発プライマーになる配列の末端に基づいている。初期プライマーは通常合成オリゴヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて標準法にて作製される。これらの初期プライマーは任意の好適な長さであり得、例えば長さおよそ15〜100ヌクレオチド、例えば長さおよそ15〜75ヌクレオチド、長さおよそ15〜50ヌクレオチド、通常、長さ18〜25ヌクレオチドである。熟練した者は、例えば鋳型分子の配列、得られる変異誘発プライマーの大きさ及び/又は当該方法の適用に応じて、好適な初期プラマーを選択又は設計することができる。
本発明の更なる利点は、変異誘発プライマーは鋳型核酸分子から合成されるため、変異誘発プライマーの配列が使用者にとって未知であり得るという事実に起因する。例えば、変異誘発プライマーを、鋳型の公知部分を対象とした初期プライマーを用いてPCRにて作製する場合、これら初期プライマーによって増幅された領域は未知であり得る。このように、ある態様では、変異誘発プライマーの配列は、アニーリングの前は未知である。これは、本発明の方法がライブラリーに適用される特定の応用を有する(以下で更に議論される)が、これらに限定されるものではない。サブクローニングでは特定配列は未知であるが、それが含有されるベクターの境界は知られている他の応用が数多く存在する(1例は「ショットガン」クローニングであろう)。熟練した者は、親分子に関する知識に基づいて好適な初期プライマーを選択することができる。
このように、工程(b)に規定される分子は、その相補鎖から単離された1本鎖変異誘発プライマーであり、分離及び単離という用語は1本鎖変異誘発プライマーに関して同義的に用いられる。1本鎖変異誘発プライマーのその相補鎖からの分離又は単離は、以下に記載のような分離媒体(ビーズや分離カラムなど)を用いて行われることが好ましい。この方法では、合成する際、結合部分を変異誘発プライマーの一方の鎖に導入することができ、したがって、変異誘発プライマーの一方の鎖を、例えば以下に記載するような捕捉工程において他方から単離することができる。
工程(b)に規定される1本鎖プライマーは、分離媒体の使用により分離することが好ましい。例えば、変異誘発プライマーを合成する工程は、変異誘発プライマーの+鎖又は−鎖に結合部分を導入することができ、したがって、変異誘発プライマーのその+鎖と−鎖への分離は、分離媒体上でその結合パートナーに結合している結合部分を介して行うことができる。分離媒体は、ビーズやカラムなどの好適な固相媒体(例えば結合パートナーが結合するビーズやカラム)であり得る。
より詳細には、結合部分は、変異誘発プライマーの+鎖に導入することができ(例えば結合部分を導入する変異誘発反応において初期フォワードプライマーを用いることによって)、したがって、変異誘発プライマーの−鎖は、+鎖が分離媒体に結合した後に溶離させることができる。結合部分はビオチンであり、結合パートナーはストレプトアビジンであることが好ましい。他の好適な結合部分と結合パートナーは、当該技術分野に熟練した者に公知であり、フルオレセインとジゴキシン、及び抗体(断片及び誘導体を含む)と抗原が含まれる。
熟練した者は、使用できる他の結合部分と結合パートナーについて熟知している。例えば、ストレプトアビジンに加えて、ビオチンに結合するアビジンやニュートラアビジンなどの他の結合パートナーが利用可能である。熟練した者は、好適な結合部分と結合パートナーを選択して、鎖分離に関与する捕捉工程に使用できる。更に、ビオチン及び/又はストレプトアビジンの類似体も使用できる(例えばJ Mol Biol(1994)Sep 30:242(4):559−65)を参照されたい)。ビオチンとストレプトアビジンが最も好ましい。
例えば、特定の抗原性部分を、上記のビオチンの例について記載したのと類似の方法で、合成中に変異誘発プライマーの一方の鎖へ組み込むことができる。次に、抗原に対する抗体を含有するカラムを用いて、一方の鎖を他方から分離できるであろう。
他のアプローチは、特異的DNA配列に結合するタンパク質を含有する分離システムを用いることである。例えば、当該技術分野では、HaeIIIメチラーゼは特異的5’DNA配列に結合し、特異的DNA配列に結合するタンパク質の他の例はP2Aであることが知られている。そのようなアプローチについての議論は、Bertschinger及びNeri、『Protein,Engineering,Design and Selection』(2004)、第17巻、第699頁を参照されたい。
結合パートナーと結合部分は、DNA鎖の分離に用いられる処置に耐えるための十分な親和性を有する必要がある。鎖分離には、高pH又は低pHを用いることができる。低pHを用いる場合、好ましくはpH3以下、より好ましくはpH2以下、更により好ましくはpH1以下である。塩酸やクエン酸は好ましい酸である。高pHがより好ましい。高pHを用いる場合、好ましくはpH11以上、より好ましくはpH12以上、更により好ましくはpH13以上である。好ましいアルカリ化剤には、水酸化ナトリウム、及びLiOHやKOHのような他の第I族水酸化物が含まれる。Be(OH)やBa(OH)は別として、第II族水酸化物も使用できるであろう。水酸化ナトリウム(例えば0.1N NaOH、pH13)を用いて鎖を分離することが最も好ましい。当該技術分野に熟練した者は、適切な薬剤や条件を選択することができる。最も好ましいのは、上で定義したようなビオチンやストレプトアビジン及び/又はそれらの類似体、並びに高pH鎖分離処置の使用である。
化学基を用いて、一方の鎖を支持体に化学的に結合させることもできるであろう。例えば、アミン基やチオール基などの特定の化学基を組み込むようにオリゴヌクレオチドを合成することが可能である。実際、そのようなオリゴヌクレオチドを供給業者から購入することができる。そのようなオリゴヌクレオチドを本発明の反応において一方の初期プライマーとして用いる場合、関連する化学基は、得られた変異誘発プライマーの関連する鎖に組み込まれるであろう。次に、これらの化学物質(すでにDNA鎖に組み込まれている)を、1例としてアミン連結剤又はチオール連結剤にカップリングさせることによって鎖分離を引き起こすことができ、当該技術分野に熟練した者には、好適な物質が利用可能である。
上記のようにして1本鎖型変異誘発プライマーを作製した後、親分子に導入し、アニーリング工程(c)を行う。このような方法で、1本鎖型変異誘発プライマーを親分子に加えてアニーリング反応に使用する。
工程(c)では、変異誘発プライマーと親分子とのアニーリングは、例えば変異誘発プライマーの大きさに応じて、好適な条件及び試薬を用いることができる。適切な条件の選択は、当該技術分野に熟練した者に理解される。1例として、変異誘発プライマー対鋳型のモル比3:1を用いることができる。好適な反応条件は、90℃で2分間、50℃で3分間、及び20℃で5分間のインキュベーションである。必要であれば当該技術分野に熟練した者によって条件を変更することができる。
また、工程(d)から生ずる環状型核酸分子は、本明細書において「変異誘発反応の産物」(又は、短く「産物」)と称する。反応の産物は複製可能であることが好ましく、これは、宿主細胞の形質転換の際、複製してそれ自体のコピーを産生できることを意味する。これは、変異誘発反応の産物で、更なる操作を必要とすることなく、例えば、核酸の関連部分を制限酵素で切り出して更なるプラスミドへ連結させる必要もなく、直接宿主細胞(核酸からタンパク質を発現させるための宿主細胞など)を形質転換することができるという利点を有する。
あるいは又は更に、変異誘発反応の産物は2重鎖であり、制限酵素による消化を可能にすることが好ましい。
環状型分子(変異誘発反応の産物)は、共有結合的に閉じた環状DNA、好ましくは2重鎖DNAであることが最も好ましい。
上述の通り、工程(d)は親分子から環状反応産物を産生する。そのような反応には、アニーリングした変異誘発プライマーからの相補鎖合成のプライミングが含まれ、得られる相補鎖が変異誘発プライマー由来の変異を含有する。一般に、反応混合物は、好適量のヌクレオチド塩基、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、及び適切なバッファー(実施例は好適量を提示する)を含有するであろう。これを、第2鎖合成を完成させる適切な条件下でインキュベーションする。そのような方法は当該技術分野に熟練した者に公知である。この反応は、連続的増幅サイクルを含まない非増幅型(例えば非PCR型反応)であることが好ましく、したがって、線状反応と表現されるであろう(即ち、1本の親分子鎖あたり1本の相補鎖を産生する)。例えば、本発明の反応では、1本鎖親分子上の変異誘発反応は、1本鎖親分子に対して反対向きの第2の1本鎖を産生する。このように、1本鎖親分子が+鎖である場合、変異誘発反応で合成される第2鎖は−鎖であろう。
変異誘発反応に1本鎖鋳型と1本鎖プライマーを用いることによって、自己アニーリングに関する問題が回避される。更に、変異誘発反応の産物は2本鎖であり、それ自体は、1本鎖分子よりも効率的に細菌を形質転換する。したがって、細菌宿主を形質転換する場合、変異2本鎖型は、1本鎖鋳型よりも優先して細菌を形質転換するであろう(非変異鋳型よりも変異型を有効に選択する)。
本発明の方法は、上記工程を含む(ここで、含む(comprise)という用語は包含する(include)の意味に用いられ、即ち、1以上の更なる特徴、例えば反応工程の存在を可能にする)。したがって、本発明の方法には、限定されるものではないが、本明細書のいずれかに記載の工程を含めた更なる工程を含めることができる。あるいは、本発明の方法は、上記工程、又は本明細書に記載の工程から成ることができる。反応の工程は、1つの反応容器で組み合わせることができ、それぞれの工程を別の容器で行う必要はない。例えば、変異誘発プライマーを親分子にアニーリングさせる工程と、相補鎖を合成する工程とを1つの容器で行うことができる。
1本鎖親分子は1本鎖環状DNAであることが好ましい。例えば、1本鎖親分子は、ファージ粒子から抽出される1本鎖環状DNAであり得る。
本発明の方法では、アニーリング工程(c)の前に、1本鎖親分子を1本鎖プライマーへ加える別の工程が存在することが好ましい。より好ましくは、本発明の方法は、工程(c)の前に、1本鎖親分子を単離する工程を更に含む。
変異誘発プライマーに関する工程及び親分子に関する工程の順序は、それぞれ連続的である必要はない。したがって、1本鎖型親分子を単離する前に1本鎖型変異誘発プライマーを分離することができる。または、1本鎖型変異誘発プライマーを分離する前に1本鎖型親分子を単離することができる。または、1本鎖変異誘発プライマーの分離と、1本鎖親分子の単離はそれぞれ、並列して又は同時に行うことができる。
本発明の方法は、工程(c)の前に1本鎖親分子について行われるサイズ排除工程を更に含むことが好ましい。例えば、小さな断片は樹脂に捕捉され、より大きな親分子は通過する多孔性樹脂に1本鎖親分子を通過させる。この工程は短い線状のDNA断片(鋳型とともに精製される分解産物であると思われる)を除去する。これら断片の除去は、変異を誘発しない短い断片のプライミングイベントを回避することによって変異誘発効率を向上させる。
親分子は、本発明の方法による産物の下流の使用に必要な配列要素を含有するであろう。親分子として使用するための好適なベクターは当該技術分野において利用可能であり、又は熟練した者によって慣用技術により構築することができる。そのようなベクターは、プロモーター配列、終止配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子などを含めた適切な調節配列を含む。ベクターは、好適な型、例えばプラスミド、ファージ、ファージミドなどであり得る。例えば、本発明の方法の産物をタンパク質発現に用いる場合(例えば、発現産物をスクリーニングするため)、親分子は、宿主細胞におけるタンパク質発現に必要な配列を含有するであろう。
好適な発現システムは当該技術分野に周知であり、さまざまな宿主細胞を用いることができる。これらには、細菌、酵母、昆虫、及び哺乳動物の細胞が含まれる(例えば、HeLa細胞、CHO細胞、又はBHK細胞)。細菌細胞が好ましく、大腸菌が最も好ましい。これらそれぞれの宿主に好適なベクターが当該技術分野で利用可能であり、又は所定の方法で構築することができる。バキュロウイルスシステムや植物ウイルス発現システムのようなウイルス発現システムを用いることもできる。DNAの操作技術は当該技術分野に周知である(例えば、クローニング、配列決定、発現、解析など)。公知の方法の更なる詳細は、例えば、『分子クローニング:実験室マニュアル』第2版、Sambrookら、1989、コールドスプリングハーバー研究所出版;又は『分子生物学の最新プロトコール』第2版、Ausubelら編、John Wiley&Sons、1992に見ることができる。
本発明の方法は、変異核酸分子で宿主細胞を形質転換する工程を更に含むことが好ましい。形質転換は、好適な方法でよく、これらは熟練した者に公知である。例として熱ショック法が含まれる。形質転換をエレクトロポレーションで行うことが好ましい。変異産物で形質転換する工程は、工程(d)の直後に行ってもよく、工程(d)と宿主細胞の形質転換とのあいだに中間工程が存在してもよい。以下に議論する好ましい態様では、非変異親分子よりも変異相補鎖を優先的に選択するために宿主細胞の形質転換を用いる。
本発明の方法は、変異を含有する相補鎖を優先的に選択する条件下で行われる工程を含むことができる。そのような相補鎖の優先的選択は、宿主細胞における親分子の優先的消化又は相補鎖の優先的残存から起こり得る。
親分子は、相補鎖が優先的に選択されるような修飾を含有することができる。本発明の方法は、修飾を導入する工程を更に含むことができる。好ましい態様では、親分子における修飾には、dTの代わりにdUを導入することが含まれる。本発明の方法がそのような変異を導入する工程を更に含む場合、これには、親分子がそのような修飾を最初に含有し、更なる修飾がこの工程で導入される態様、及び最初に修飾が全くなく、そのような修飾がこの工程によって導入される態様が含まれることが理解される。
dUでdTを置換する状況は、以下のように説明することができる。親分子を、ウラシルの導入を支持する大腸菌株、例えばCJ236のようなdut ung株(Kunkelら、(1985)PNAS USA、第82巻、488−492頁;Sidhuら、新規結合ペプチドを選択するためのファージディスプレイ、Methods in Enzymology 2000、第238巻、第333−363頁)中で増やす。これらのプロトコールによれば、親分子は大腸菌中にてファージミド型で増加する。ウラシル含有1本鎖DNAを標準法により抽出する(例えばキアゲンM13 Spin Prepキット)。変異誘発プライマーをウラシル含有1本鎖DNAへアニーリングさせた後、相補鎖を合成する(合成反応にはdUよりもdTが用いられる)。これは、一方の鎖(親鎖)がdU含有であって所望の変異を含有せず、第2鎖(工程(d)で合成される相補鎖)がdT含有であって変異を含有する、ヘテロ2本鎖DNA分子を生ずる。次に、得られた分子で、ウラシルの存在を支持しない大腸菌宿主、例えばJM101のようなdut ung宿主を形質転換する。したがって、変異を有する相補鎖は、変異を含有しない親鎖よりも優先して複製される(dU含有親鎖は、dut ung宿主内でウラシル−グリコシラーゼによって加水分解される)。
他の選択法にはメチル化の使用が含まれる。親分子はほとんど全ての大腸菌株でメチル化されるであろう。工程(d)では、メチル化しないin vitroで相補鎖を合成することができ、変異を含有しないメチル化親鎖と、変異を含有する非メチル化相補鎖とを含むヘテロ2本鎖を生ずる。次に、2本鎖DNAを5’−GmATC−3’部位で切断し、メチル化DNA又は半メチル化DNAに特異的なDpnI制限酵素でヘテロ2本鎖を消化する。したがって、親鎖は消化され、変異を含有する相補鎖は消化されない。例えばDpnI以外の代替酵素を用いてもよい。
選択法の更なる可能性として、条件的致死遺伝子を用いてもよい。1例はccdBであり、「細胞死制御」遺伝子としても知られている。この遺伝子は、親分子の、変異誘発反応の後に置換される領域へ挿入されるであろう。親分子は、この遺伝子に感受性でない大腸菌株から調製されるであろう。次に、変異誘発反応は、ccdB遺伝子を目的遺伝子に置換するであろう。それらの非変異親分子は、依然としてccdBを発現するが、大腸菌宿主を死滅させるであろう。このようにして、変異誘発反応から生ずる変異分子が選択される。
ヘテロ2本鎖の親鎖の選択的分解に関与する限り、他の好適なシステム及び選択的酵素を用いてもよい。例としてエンドヌクレアーゼ及びエンドグリコシラーゼが挙げられる。
したがって、好ましい態様では、本発明の方法は、ヌクレオチドの修飾(例えばdUでdTを置換)を含む1本鎖親分子の使用を包含する。変異誘発プライマーからプライミングした相補鎖の合成は、そのような変異を含まない、新たに合成された変異鎖を産生する(例えば、合成反応ではdUTPよりもdTTPを用いることによって)。修飾されていない、新たに合成された変異鎖は、優先的に選択される(例えば、修飾されていない、新たに合成された変異鎖のみの複製を支持する宿主細胞をヘテロ2本鎖分子で形質転換することによって、又は親鎖を選択的酵素で消化することによって)。
好ましい態様では、本発明は、非修飾相補鎖(新たに合成された非修飾変異鎖)に対して選択的な宿主細胞を工程(d)由来の環状型分子で形質転換することにより、優先的選択が行われる方法を提供する。
したがって、好ましい態様では、本発明は、1以上の変異を核酸分子へ導入する方法を提供するものであり、以下の工程を含む:
(a)親分子に対して1以上の変異を含有する変異誘発プライマーを鋳型核酸分子から(好ましくはPCRによって)合成し;
(b)1本鎖型変異誘発プライマーを分離し;
(c)1本鎖型変異誘発プライマーを、1以上の選択可能な修飾を含有する1本鎖型親分子へアニーリングさせ;
(d)変異誘発プライマーの相補鎖を合成して修飾を含有しない環状型核酸分子を作製し;
(e)相補鎖が親分子よりも優先して選択されるように選択工程を行う。
好ましい態様では、本発明の方法は、分子集団へ適用することができる。したがって、上記方法を用いて分子集団を変異させることができ、又はスクリーニング(例えば発現スクリーニング)のために配列集団を適切なベクターへ挿入することができる。
例えば、本発明の方法は、分子ライブラリーの作製に用いることができる。このような方法で、複数の変異誘発プライマーを用いて好適なベクターを変異させ、産物のライブラリーを作製できる。複数の変異誘発プライマーと複数の親分子とを用いた組み合わせ変異誘発を用いて、広範囲の置換を有するライブラリーを作製することもできる。例えば、分子の第1の位置に変異を有する複数の親分子を、変異誘発反応において、第2の位置に変異を導入する複数の変異誘発プライマーとともに用いることができ、それにより、第1の位置と第2の位置との変異の組み合わせ又は順列の結果として広範囲のライブラリーを作製する。これを実施例1に例示し、図6に図解する。
本発明の方法を用いて、分子集団のスクリーニングを容易にすることもできる。例えば、変異誘発プライマーの集団は鋳型分子集団に由来することもできる。次にこの集団は、例えばスクリーニング用発現ベクターのような一般的ベクターへ導入することができる。これを実施例2に例示する。
このように、好ましい態様では、本発明の方法は、分子集団へ、分子集団のスクリーニング又は分子集団のサブクローニングにおいてライブラリーを作製するために応用される。したがって、複数の変異誘発プライマー、鋳型及び/又は親分子が存在し得る。そのような集団の大きさは、少なくとも1000分子、より好ましくは少なくとも10分子、より好ましくは少なくとも10分子、より好ましくは少なくとも10分子、より好ましくは少なくとも10分子、より好ましくは少なくとも10分子、より好ましくは少なくとも10分子、より好ましくは少なくとも1010分子、より好ましくは少なくとも1011分子、より好ましくは少なくとも1012分子、より好ましくは少なくとも1013分子であり得る。
本発明の方法を集団、特にライブラリーに応用することに関連した利点は、変異誘発プライマー配列はプロトコール開始時に公知であることを要しないという事実に部分的に基づいている。鋳型分子におけるある短い領域又は共通性を有する領域に関する知識(例えば、可変領域に隣接する公知配列又は鋳型分子を含有するベクターの公知配列)は、初期プライマーの設計を可能にする。したがって、これら初期プライマーを用いて、初期プライマーが指向する共通領域に加えて可変領域も有する分子集団全体を増幅させることができる。同様に、変異誘発プライマーと親分子とのあいだに相補性領域が存在することを条件に、発現スクリーニングなどのスクリーニングのために、分子集団を共通親分子(例えばベクター)へ挿入することができる。この相補性領域は、鋳型分子において初期プライマーが指向した領域と同一でも、部分的に同一でもよい。
したがって、本発明の方法では、複数の鋳型、又は鋳型の複数の型が存在し得る。例えば、鋳型は、ベクター、例えばプラスミド内に含有されたさまざまな分子のライブラリーであり得る。したがって、次に、工程(d)で相補鎖が合成される際、複数の変異誘発プライマーのそれぞれが異なる変異を親分子へ導入するため、そのようなライブラリーから作製された複数の変異誘発プライマーを用いて、多くの環状型変異産物を作製することができる。これら複数の産物で好適な宿主、例えば大腸菌などの細菌宿主を形質転換する場合、得られるコロニーはそれぞれ複数の変異誘発プライマーの1つから生ずる産物を含有する。
複数の異なる変異誘発プライマーをライブラリー、例えばプラスミドライブラリーから作製する場合、変異誘発プライマーの合成に用いられる初期プライマーは、ライブラリーに共通するベクター領域に相補的であるように選択される。したがって、複数の鋳型は、可変領域と、複数の鋳型間で共通する領域とを含むことができる。例えば、可変領域は、任意抽出されていない領域に隣接する、核酸の任意抽出領域であり得る。他の例では、同一基盤ベクターの複数の分子へ導入されている複数の挿入物を介して可変領域を作製することができる。したがって、初期プライマーは、可変領域の外側に存在する鋳型領域に相補的であるように、例えば、鋳型の任意抽出されていない領域の全部若しくは一部、又は基盤ベクターの一部に相補的であるように選択される。このようにして、複数の変異誘発プライマーを1つの合成反応にて同一初期プライマーを用いて作製することができる。
あるいは又は更に、複数の親分子が存在してもよい。したがって、工程(c)では、変異誘発プライマーを複数の異なる親分子へアニーリングさせることができる。先に記載したように複数の変異誘発プライマーが存在する場合、これらを複数の親分子へアニーリングさせることもできる。したがって、複数の変異誘発プライマーを複数の親分子へアニーリングさせ、変異誘発プライマーと親分子との組み合わせを生ずる組み合わせ効果をもたらすことができる。
したがって、本発明の方法は、複数の親分子及び/又は複数の変異誘発プライマー分子を包含することができる。
これは、幅広いレパートリーの親分子及び/又は鋳型に、例えば幅広いレパートリーの親分子及び/又は鋳型を組み合わせるために用いることができるという利点を有する。好ましいレパートリーサイズは、少なくとも100の親分子及び/又は鋳型、より好ましくは少なくとも1000、更により好ましくは少なくとも2500である。
組み合わせアプローチを用いることにより、例えばさまざまな親分子をさまざまな変異誘発プライマーと組み合わせた後で、幅広いレパートリーを作製することができ、少なくとも1000終局産物、より好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも10、より好ましくは少なくとも1010、より好ましくは少なくとも1011、より好ましくは少なくとも1012、より好ましくは少なくとも1013の終局産物が存在し得る。
本発明の方法によって導入され得る変異には、置換、欠失、及び付加が含まれる。変異は複数のヌクレオチドに存在し得る(しかし、単一ヌクレオチドのみに存在してもよい)。例えば、親分子内で変異誘発プライマーによって複数の置換をつくることができ、又は多くのヌクレオチドを欠失若しくは付加させてもよい。さまざまなタイプの変異の組み合わせも可能である。したがって、置換と欠失の組み合わせ、置換と付加の組み合わせ、付加と欠失の組み合わせ、又は付加、欠失、及び置換の組み合わせが存在し得る。
複数の変異領域、例えば、1以上のヌクレオチドが置換されており、(この間隙領域には変異誘発プライマーと親分子とのあいだに相補性があるため)変異誘発プライマーによって変異がつくられていない領域によって離れている2つの領域が存在してもよい。
更なる可能性には:1以上のヌクレオチドが置換されており、相補性領域によって離れている複数の領域;1以上のヌクレオチドが付加されており、相補性領域によって離れている複数の領域;1以上のヌクレオチドが欠失されており、相補性領域によって離れている複数の領域が含まれる。組み合わせも可能である。したがって、ヌクレオチドが置換されている1以上の領域と、ヌクレオチドが付加されており、相補性領域によって離れている1以上の領域;ヌクレオチドが置換されている1以上の領域と、ヌクレオチドが欠失されており、相補性領域によって離れている1以上の領域;ヌクレオチドが欠失されている1以上の領域と、ヌクレオチドが付加されており、相補性領域によって離れている1以上の領域;及びヌクレオチドが置換されている1以上の領域と、ヌクレオチドが付加されている1以上の領域と、ヌクレオチドが欠失されており、相補性領域によって離れている1以上の領域が存在し得る。
変異の性質と数は、親分子と変異誘発プライマーとのあいだのようなミスマッチの数と性質によって決定される。したがって、変異誘発プライマーに親分子と比較して1つのヌクレオチドに付加が存在する場合、1つのヌクレオチドは変異誘発反応によって付加されるであろう。変異誘発プライマーに親分子と比較してミスマッチの分散した領域が存在する場合(例えば上で設定したような付加、欠失、及び置換分散した領域)、これは、変異誘発反応の結果として対応する変異の分散した領域を生ずるであろう。変異誘発プライマーで親分子内のヌクレオチドのストレッチを置換することができる。例えば、変異誘発プライマーは、親分子に対して約70%相補性の領域を含有することができ、このような方法で、変異誘発反応の後、親分子内のこの領域を変異誘発プライマー由来の70%相補性領域で置換する。
変異誘発プライマーをアニーリングさせるには、変異誘発プライマーと親分子とのあいだにある程度の相補性が存在する必要がある。典型的には、変異誘発プライマーの末端に相補性が最小の領域が存在するであろう。変異誘発プライマーがPCRで作製されており、初期プライマー(上で定義)が親分子に対して相補性である場合、これらは変異誘発プライマーの末端に18〜25塩基対の相補性が最小の領域を提供する。
変異誘発プライマー全体に対する相補性の程度は、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%である。例として、少なくとも97%の相補性は、長さ830ヌクレオチドの変異誘発プライマーでは20のミスマッチに相当する(810が相補性)。少なくとも60%の相補性は、長さ730ヌクレオチドの変異誘発プライマーではミスマッチ領域に相当し、長さ830ヌクレオチドの変異誘発プライマーでは親分子に対して70%同一である(「70%領域」のいずれの端も親分子に対して完全に相補性である2端)。変異誘発プライマーの非限定的な例を図面に示す。
変異誘発プライマーは長さ100ヌクレオチド〜4000ヌクレオチドであり得、好ましくは200〜3000ヌクレオチド、より好ましくは300〜2000ヌクレオチド、より好ましくは400〜1500ヌクレオチド、より好ましくは400〜1000ヌクレオチド、更により好ましくは長さ400〜850ヌクレオチド又は長さ800〜1500ヌクレオチドであり得る。
変異誘発プライマーの大きさは親分子の大きさに依存することができる。例えば、親分子が5.5kbである場合、変異誘発プライマーは1kb以下であることが好ましい。したがって、変異誘発プライマーのヌクレオチドの長さは、好ましくは親分子の大きさのおよそ1/50〜1/5、より好ましくは1/25、より好ましくは親分子の大きさの3/10、最も好ましくは親分子の大きさのおよそ1/5である。
工程(c)における変異誘発プライマー対親分子のモル比はおよそ2:1〜5:1であることが好ましく、最も好ましくはおよそ3:1である。
本発明の方法の好ましい応用には、ライブラリー、特に抗体ライブラリーのスクリーニング又は作製が含まれる。例えば、親分子は、抗体又は抗体ドメインの発現用ベクターでよい。変異を親分子へ導入することにより(例えば、抗体ドメインのライブラリーで構成される鋳型から変異誘発プライマーを作製することによって)、得られる変異親分子は好適な宿主中で発現し、適切な抗原に対してスクリーニングすることができる(更なる情報には、Vaughanら(1996)Nature Biotechnology、第14巻、第309−314頁;及びEdwardsら(2003)J.Mol.Biol、334、pp103−118頁を参照されたい)。抗体に関連した他の例には、免疫グロブリン受容体プラスミド、例えばIgG受容体プラスミドへの抗体ドメインのサブクローニングが含まれる(pEU IgG発現ベクターなど、Persicら(1997)Gene 187:9−18を参照されたい)。抗体という用語は免疫グロブリンを表し、天然型と合成型が含まれる。この用語は、抗体結合ドメインであるか又は実質的にこれと相同である抗体結合ドメインを有するポリペプチドを包含する。例として、Fab(Vドメイン、Vドメイン、CLドメイン、及びCH1ドメイン)、scFv((Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)などのリンカーに連結されたVドメイン及びVドメイン、例えばBirdら(1988)Science、242、423−426;Hustonら(1988)PNAS USA、85、pp5879−5883)、Fv(単一抗体のVドメインとVドメイン)、Fd(VドメインとCH1ドメイン);dAb(Holtら(2003)Trends in Biotech.21、pp484−490)及び2重特異性抗体(WO94/13804号)が挙げられる。
したがって、好ましい態様では、親分子、鋳型、又は変異誘発プライマーは、抗体可変ドメインをコードする配列を含む。抗体可変ドメインはVドメインでもVドメインでもよい。親分子はscFvを含むことが好ましい。
抗体又は抗体ドメインがベクターなどの核酸との関連で本明細書において言及される場合、その抗体又はドメインをコードする核酸配列について言及していることが理解される。
本発明の方法を用いて抗体ドメインを入れ換え、抗体レパートリーを作製することもできる。したがって、親分子は抗体Vドメインを含有して変異誘発プライマー分子は抗体Vドメインを含有してもよく、又は親分子は抗体Vドメインを含有して変異誘発プライマー分子は抗体Vドメインを含有してもよい。抗体Vドメインのライブラリーは、抗体Vドメインのライブラリーと組み合わせ(入れ換え)てもよく、その逆もまた同様である。したがって、2つのライブラリーのうち一方を鋳型として用いて複数の変異誘発プライマーを形成し、他方のライブラリーは複数の親分子のライブラリーとして存在してもよい。
したがって、本発明は、親分子が抗体Vドメイン及び抗体Vドメインを含有し、変異誘発プライマー分子が親分子のVドメインを変異させるための抗体Vドメインを含有する方法を提供するものである。また、本発明は、親分子が抗体Vドメイン及び抗体Vドメインを含有し、変異誘発プライマー分子が親分子の抗体Vドメインを変異させるための抗体Vドメインを含有する方法を提供する。このようにして、抗体Vドメインのライブラリーを抗体Vドメインのライブラリーと組み合わせ(入れ換え)てもよく、その逆もまた同様である。
親分子のVドメインとVドメインのうちの一方のみが変異されることが望まれてもよく、親分子のVドメインとVドメインが共に変異されることが望まれてもよい。例えば構築体がVドメインを含有し(しかしVドメインはない)、VドメインはV変異誘発プライマーによって変異するか、例えば構築体がVドメインを含有し(しかしVドメインはない)、VドメインはV変異誘発プライマーによって変異する単一ドメインシステムも想定される。本発明は、これら全ての可能性を提供する。
したがって、本発明は、親分子のVドメイン及びVドメインがこれらドメインのそれぞれを含有する変異誘発プライマーによって変異されるであろう状況を包含する。したがって、V変異誘発プライマーは親分子のVドメインを変異させ、V変異誘発プライマーは親分子のVドメインを変異させるであろう。これらドメインをともに含有する単一変異誘発プライマーを用いることもできるであろう。
したがって、本発明は、第1及び第2の変異誘発プライマーを用いて親分子を変異させ、第1の変異誘発プライマーは親分子のVドメインを変異させるための抗体Vドメインを含有し、第2の変異誘発プライマーは親分子のVドメインを変異させるための抗体Vドメインを含有する方法を提供する。第1及び第2の変異誘発プライマーは、第1及び第2の変異誘発プライマーが別個の変異誘発反応に任意の順序で関与し得る別個の変異誘発反応工程に用いてもよい(即ち、第1の変異誘発プライマーを、第2の変異誘発プライマーを包含する変異誘発反応に先行するか又は後続の変異誘発反応に用いることができるであろう)。他の可能性は、第1及び第2の変異誘発プライマーを同一の変異誘発反応工程に用いることである。
本発明の方法を、抗体との関連でVドメインのライブラリーをVドメインのライブラリーと組み合わせる(入れ換える)ために用いる上記側面は、ドメインの組み合わせの入れ換えが望ましい、一般に免疫グロブリンやマルチドメインタンパク質に関連する他の分子のような他のシステムへ応用できるであろう。したがって、本発明は、抗体の側面に関して上に記載したように、第1のドメインのライブラリーを第2のドメインのライブラリーと組み合わせる方法を提供する(第1のドメインはVドメインであって第2のドメインはVドメインであり、逆もまた同様である)。
ある好ましい態様では、親分子はscFvをコードする核酸を含む。
本発明は、上記方法を実施するためのキットも提供する。例えば、そのようなキットは、1本鎖プライマー分子を鋳型分子から合成するのに好適な初期プライマー、1本鎖親分子、及び使用説明書を含むことができる。親分子は本明細書に記載のようにして修飾することができる。本明細書において参照するような好適な試薬及びバッファーも含めることができる。本発明の方法の態様のいずれかに規定されるような更なるキット成分を含めることもできる。
上述のように、本発明の方法及びキットには以下を含めた多くの適用がある。本発明の方法はサブクローニングに用いることができ、例えば核酸のある領域を核酸の消化と連結の必要性を回避しながら工程(a)によって作製し、適切なベクターへ変異誘発反応によって導入することができる。例えば、標的抗原は発現ベクターへクローン化することができる。本発明の方法は、上記のようにライブラリーの作製及びスクリーニングに応用することができる。より特定の用途は以下に概説する。
本明細書に記載の方法を用いて、1本鎖Fv(scFv)断片(単一ペプチドとしてリンカーを介して連結されたVドメイン及びVドメイン)をIgG分子へ変換することができる。したがって、Vドメイン及びVドメインをIgG受容体プラスミド及びIgG受容体プラスミドへ導入することができる。いわゆる一般的オリゴヌクレオチドである初期プラマーを用いて、scFvを含有するベクターの非可変部分か又は2つのドメイン間のリンカーへ指向させる(例えば、それぞれのドメインの上流又は下流の配列を指向する第1の初期プライマーと、2つのドメイン間のリンカーを指向する第2の初期プライマー)。例えばVaughanらに記載のscFvを用いる場合、初期プライマーの一方はpCantab6内のVドメインの上流配列を指向し、他方はリンカーを指向するであろう(即ち(Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)をコードする配列部分を指向する)。
本発明の方法を用いて未感作ライブラリー(即ち、非免疫ヒトドナー由来のライブラリー)を作製することもできる。現在、非免疫ヒトドナー由来の未感作抗体のV領域とV領域とについてPCRを行い、続いて制限消化と受容体プラスミドへの連結によってこれらを作製している。本発明の方法を用いて、変異誘発プライマーを、非免疫ドナー由来のこれらPCR産物から分離することができる。また、上記方法の使用により、制限消化と連結の必要性が取り除かれる。好適なプライマーは、重鎖の両端及び軽鎖の両端の配列に基づくことができる(例えばVaughanら、上記を参照されたい)。
本発明の側面及び態様を、実施例により添付の図面を参照して説明する。
実施例
最適化したV領域とV領域とを組換えるための変異誘発方法
1. 方法の概説
最適化したV領域とV領域との組換えは、in vitroにおける抗体の親和性成熟のあいだの可能性増大をもたらすことが示されている(Osbournら(1996)Immunotechnology、第2巻、pp181−196)。この実施例では、本発明の変異誘発法を用いて、VCDR3が任意抽出されている1つの変異体プールを、VCDR3が任意抽出されている他の変異体プールと組み合わせる。2つの変異体プールは、VCDR3及びVCDR3内の短いランダム化領域を除き、同一のオリジナル抗体配列を含有する。ランダム化の後、Vプール及びVプールは親和性を向上させるためにそれぞれ2ラウンドのファージディスプレイ選択を受けている。第2ラウンドの選択のV産物とV産物は、それぞれ推定10〜10の異なる変異体配列を含有するが、この実施例に記載の組換え法の開始点を形成する。
この実施例の方法では、5’端にビオチン化PAMA−INオリゴヌクレオチドを、3’端にH−LINKオリゴヌクレオチドを用いてVプールをPCRで増幅する(図2を参照されたい)。ストレプトアビジンビーズ上で捕捉した後、非ビオチン化鎖を溶離させ、これが変異誘発プライマーを形成する。
バクテリオファージ粒子をdutung大腸菌株CJ236から取り出した後Vプールを1本鎖プラスミドとして調製する。変異誘発プライマーをコードするVを、Vプールを代表する1本鎖プラスミドと一緒にすることによって、V領域とV領域との組換えが生ずる。
2. オリゴの設計
M13から単離したdU−1本鎖DNA鋳型は+鎖であり、変異誘発プライマーは+鎖に対して相補的である(即ち−鎖である)。フォワードプライマーをビオチン化することによって、ストレプトアビジン上で捕捉した後、−鎖を溶出させることができる。用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである(5’から3’):
Bio−PAMA−IN:ビオチン−GCGGCCCAGCCGGCCATGG
H−LINK:ACCGCCAGAGCCACCTCCGCC
3. 2本鎖プラスミドDNAとしてのV産物の調製
1. pCantab6内のVレパートリーのグリセロールストック(Vaughanら)100μlを、小さな三角フラスコ中の50mlの2×TYAに植菌した。
2. 培養物を300rpmにて37℃で2時間増殖させた。
3. 細胞を3200rpmで10分間の遠心により50mlファルコンチューブ中に沈殿させた。
4. キアゲンのハイスピードプラスミドミディキットのプロトコールを実施して2本鎖プラスミドDNAを1mlの水中に単離した。
5. DNA濃度をUV分光法又はアガロースゲルで確認した。
4. dU−1本鎖DNA鋳型の調製
第3項の2本鎖プラスミドDNAを次に以下のプロトコールに用いた:
試薬:
pCantab6内のVレパートリーのプラスミドミニプレップ(Vaughanら)
10mg/mlクロラムフェニコール(CAM)エタノール溶液、−20℃保存
0.25mg/mlウリジン(シグマU−6381)水溶液、4℃保存
2×TYAG(+10μg/ml CAM)プレート:(TYはSambrookら、上記に記載のもの+100μg/mlアンピシリン(A)及び2%グルコース(G)、クロラムフェニコール(CAM)のストック20μlを80μlのエタノールに加えてプレートに塗布する)。
CaClコンピテントCJ236の調製
1. 5mlの2×TY培地(+10μg/ml CAM)に大腸菌CJ236細胞(例えばバイオラッドによって供給)の1つのコロニーを植菌する。細胞を300rpmにて37℃で一晩増殖させた。CAMはCJ236中のF’エピソームを選択する。
2. 500mlの2×TYに5mlの一晩培養物を植菌し、37℃で振とうしながらインキュベーションした。
3. 600nmのODが0.9に達したときに培養物を4℃にて遠心し、集菌した(5分間、5,000rpm)。上清を流して捨て、細胞沈殿物の水気をきった。細胞を100mlの氷冷100mM MgClに穏やかに再懸濁させた。
4. 細胞を遠心により再度集菌し(4℃で遠心)、沈殿物の水気をきった。細胞を、滑らかな懸濁液が得られるまで20mlの冷100mM CaClに穏やかに再懸濁させた。200mlの冷100mM CaClを加えて混合した。細胞を氷上に30〜90分間置いた。
5. 細胞を低温で遠心して集菌し、沈殿物の水気をきった。細胞を20mlの冷85mM CaCl及び15%グリセロールに再懸濁させた。
6. 細胞懸濁液を直ちに分注した(必要であればアリコートをドライアイス/エタノール中で凍結させることができる)。
鋳型によるCJ236の形質転換
1. 上記のCJ236 CaClコンピテント細胞を氷上で融解させた(そしてプロトコールを通して氷上に維持した)。
2. 第3項のVレパートリーを含有する5μlのpCantab6プラスミドをPCRチューブ中で100μlのコンピテント細胞に加えた。
3. PCRマシーンブロック上で以下のプログラムを実行した:
0.1℃で30分、42℃で45秒、0.1℃で2分。
4. 細胞を0.5mlの2×TYの入った15mlファルコンチューブに移した。
5. 細胞を200rpmにて振とうさせながら37℃で45〜60分間インキュベーションした。
6. 0.5mlの細胞を2×TYAG(+10μg/ml CAM)プレートに蒔き、プレートを37℃で一晩インキュベーションした。
CJ236からのファージの回収とDNAの調製
1. 上記工程6から生ずるCJ236形質転換体の菌叢をこすって1mlの2×TYに入れる。500μlを50mlの2×TYGAC(即ち2%グルコース、100μg/ml AMP、10μg/ml CAM)に植菌し、OD600=0.5〜1になるまで37℃にて300rpmでインキュベーションした。
2. 細胞濃度をOD測定値(OD6001=5×10細胞/ml)から計算し、野生型KO7ヘルパーファージ(アマシャムバイオサイエンスM13 KO7ヘルパーファージ)を、感染効率(MOI)ファージ10:細胞1(野生型KO7ストックは通常0.33μl中に1010ファージを含有する)を確保するように加えた。次に細胞を37℃で10分間インキュベーション(振とうなし)して感染させた。
3. 1mlの培養物を、25μg/ml KAN(KO7を選択するため)及び0.25μg/mlウリジン(ウラシル含有鋳型を合成させるため)を添加した30mlの2×TYACへ移した。これを37℃にて一晩、300rpmでインキュベーションした。
4. 細胞を2℃にて10分間、15000rpmでSS−34ローターにて遠心した。上清を新しいチューブへ移し、1/5容量のPEG−NaClを加えた(20%PEG8000、2.5M NaCl)。これを室温で5分間インキュベーションし、次に2℃にて10分間、10000rpmでSS−34ローターにて遠心した。
5. 小さな白いファージ沈殿物が生じた。上清を静かに捨て、チューブをティッシュペーパーの上に逆さにして水気をきった。ファージ沈殿物を0.5mlのPBSに再懸濁させた(管壁をリンスしてできる限り多くのファージを捕捉した)。ファージをエッペンドルフチューブへ移し、マイクロ遠心機にて15000rpmで5分間遠心し、残留不要物を沈殿させた。上清を新しいエッペンドルフチューブへ移した。
6. dU−1本鎖DNA鋳型を、キアゲンMPバッファー(Sidhuら、上記)の添加から始まってキアゲンのキアプレップスピンM13キットを用いて精製した。DNAを100μlの10mM Tris−HCl、pH8.0中に溶出させ、1%アガロースゲルで調べた。1本鎖DNAの調製物が異なるバンドとして2.5kbに泳動され、これを第6項の変異誘発反応に用いた。
5. Vレパートリーからの1本鎖DNA変異誘発プライマーの調製
さまざまなV配列のレパートリーを代表する領域をpCantab6からオリゴヌクレオチドbio−PAMA−IN及びH−LINKを用いてPCRで増幅させた。第3項で調製したミディプレップ鋳型の希釈系列に標準のPCR条件を用いることができる。
Abgene (2×)マスターミックス 25μl
鋳型ミディプレップ 1μl[原液、10−1、10−2、10−3、10−4、10−5、10−6、なし]
Bio−PAMA−IN 1μl
H−LINK 1μl
水 22μl
5μlのPCR産物をそれぞれ1%アガロースゲルで泳動した(例えばこれは産物の大きさを裏付け、収率を示す)。
1. マイクロMACSカラム(Miltenyi Biotec:130−042−701)を磁気ラック中に置いた。
2. 250μlの1×結合バッファー(2×結合バッファー:10mM Tris pH7.5、2M NaCl、1mM EDTA、0.1%Tween 20)を貫流させた。
3. 45μlのPCR産物を、105μlのマイクロMACSストレプトアビジンビーズ(Miltenyi Biotec:130−074−101)及び150μlの2×結合バッファーと混合し、2分間インキュベーションした。
4. DNA+ビーズをマイクロMACSカラムにかけて貫流させた。
5. カラムを2×1mlの1×結合バッファーで洗浄した。
6. DNAを200μlの0.1N NaOH(用事調製)でエッペンドルフチューブに溶出させた。
7. 溶出したDNAに20μlの酢酸ナトリウム pH5.2、550μlのエタノール、1μlのグリコーゲンを加えた。
8. これを−70℃で30分間インキュベーションした。
9. これを13000rpmで10分間遠心してDNAを沈殿させた。上清を除去し、500μlの70%エタノールで置換した。
10. これを13000rpmで更に5分間遠心し、上清を除去し、37℃の加熱ブロックにて2分間空気乾燥させた。DNAを50μlの水に再懸濁させた。
6. 変異誘発反応
試薬:
TMバッファー(10×):500mM Tris−HCl、100mM MgCl、pH7.5
10mM ATP:(1Mストックは0.6052gを1mlの水に溶解し、0.1M NaOHでpHを7.0に調整して作製した。ストックを1:100に希釈して10mM ATPを作製する。ストックは−70℃で保存することができる。)
100mM DTT:(1Mストックは0.1542gを1mlの0.01M酢酸ナトリウム(pH5.2)に溶解して作製した。ストックを1:10に希釈して100mM DTTを作製する。ストックは−20℃で保存することができる)。
酵素:ニューイングランドバイオラブス社(NEB)製のT4ポリヌクレオチドキナーゼ、T4 DNAリガーゼ、及びT7 DNAポリメラーゼ。
25mM dNTPs
キアゲン キアクイックPCR精製キット(キアゲン)
変異誘発プライマーのリン酸化
以下のものをエッペンドルフチューブに加えた:
1本鎖DNA変異誘発プライマー 1.0μg(1.0μg/132000ダルトン=7.6ピコモル)
TMバッファー(10×) 5.5μl
10mM ATP 5μl
100mM DTT 2.5μl
全量53μlになるまで水を加えた。2μl(20U)のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(10U/μl)を加え、37℃で1時間インキュベーションした。
変異誘発プライマーの鋳型への3:1の比でのアニーリング
以下のものをエッペンドルフチューブに加えた:
dU−1本鎖DNA鋳型(第4項より) 4.4μg(4.4μg/1,750,000ダルトン=2.5ピコモル)
リン酸化変異誘発プライマー 1.0μg(1.0μg/132000ダルトン=7.6ピコモル)
TMバッファー(10×) 25μl
容量250μlになるまで水を加えた。
250μlを、90℃で2分間、50℃で3分間、20℃で5分間インキュベーションし、変異誘発プライマーを鋳型へアニーリングさせた。
変異誘発反応
アニーリングさせたオリゴ/鋳型混合物に以下のものを加えた:
10mM ATP 10μl
25mM dNTPs 10μl
100mM DTT 15μl
30Weiss unitsのT4 DNAリガーゼ(6U/μl) 5μl
30ユニットのT7 DNAポリメラーゼ(10U/μl) 3μl
酵素チューブ上に記された単位はWeiss unitsではない−6U/μlは酵素活性の正しい濃度である。
反応混合物を20℃で3時間インキュベーションした。
反応産物をそれぞれキアゲンのキアクイックPCR精製キットを用いて35μlの水へ親和性精製した。1μlの反応産物をそれぞれ1%アガロースゲルで泳動し、変異誘発プライマーの有無による反応の産物と比較した。「プライマーなし」のレーンで強い1本鎖DNAのバンド(pCantab6について2.5kb)が観察された。「プラマーあり」のレーンでは、この1本鎖DNAのバンドの強度は減少し、cccDNA(共有結合的に閉じた環状DNA)を表す1本以上の長いバンドに置き換わっていた(pCantab6について>3kb)。
7. 大腸菌TG1へのエレクトロポレーション
以下のプロトコールにしたがい、新鮮なエレクトロコンピテントTG1細胞(ストラタジーン)を調製した:
1. 適当量の2×TY培地に、TG1最小培地プレートからの1つのコロニーを植菌した。細胞を25℃で一晩300rpmにて増殖させた。
2. それぞれ500mlの2×TYを含有する5本のフラスコに、10ml(フラスコあたり)の一晩培養物を植菌した。これを25℃にて300〜350rpmでOD600がおよそ0.5〜0.6になるまで増殖させた(これには通常およそ2〜3時間かかる)。
3. 500mlの遠心管6本とSorval SLA3000ローターを予め2℃まで冷却した。
4.いったん最適ODに達したら、細胞を遠心管中で氷上にて30分間冷却し、2℃にて4,000rpmで15分間遠心した。
5. 上清を注ぎ捨て、沈殿物を少量の氷冷オートクレーブMilliQ水に再懸濁させた。これを水でおよそ300mlにし、2℃にて4,000rpmで15分間遠心した。
6. 上清を注ぎ捨て、少量の残留水に再懸濁し、次いで300mlの水を加え、上記のように遠心した。
7. 50mlのファルコンチューブ8本を−20℃で予め冷却した。Sorvall卓上遠心機を2℃まで予め冷却した。
8. 上清を注ぎ捨て、沈殿物を残留水に再懸濁させた。
9. いったん再懸濁させたら、これをファルコンチューブにあけ、50mlになるまで水を加えた。これを3,200rpmsで10分間遠心した。
10. 上清を除去し、それぞれの沈殿物を少量の水に再懸濁し、細胞を1本の50mlのファルコンチューブ中で混ぜ合わせ、水で50mlにし、上記のように遠心した。
11. 上清を除去し、細胞を残留量の水に再懸濁させた。
エレクトロポレーションのため、細胞の希釈系列(細胞のみ)を用いて好適な濃度を決定した(例えば細胞の希釈100%、80%、60%、及び50%)。細胞のみの対照を2×TYAGプレートに蒔き、コンピテント細胞調製物中にアンピシリン耐性細胞がないことを確認する。
合計35μlの変異誘発反応完了物を、1本のキュベット中の400μlのエレクトロコンピテントTG1細胞へ、以下の設定を用いて直接エレクトロポレーションした(バイオラッド大腸菌パルサーキュベット 電極ギャップ0.2cm;カタログ番号165−2086):
電界強度2.5kV
抵抗200Ω
静電容量25μF
時定数およそ4.2ミリ秒。
エレクトロポレーション直後、1mlの2×TYGをキュベットに加え、細胞を50mlのファルコンチューブに移した。更に1mlの2×TYGでキュベットをリンスし、キュベットの底からファルコンチューブへ(細長いP200ピペットチップで)細胞を移した。これを37℃、約150〜250rpmのインキュベーターへ移し、細胞を1時間回復させた。
それぞれのライブラリーの希釈系列(それぞれのファルコンチューブ)を小さな2×TYAGプレートに捲いてライブラリーの大きさを推定し、残っている細胞を大きな2×TYAGプレーとに蒔いた。ラージプレートに蒔く前に、残留細胞を遠心し(3200rpmで10分)、1mlの2×TYGに再懸濁させた。プレーとを30℃で一晩インキュベーションした。
次にライブラリーをラージプレートから掻き取って5mlの2×TYに入れ、次いで2.5mlの50%グリセロールを添加した。1:100希釈のOD600を調べて細胞濃度を計算した(OD600 1=5×10細胞/ml)。保存のため、それぞれのライブラリーの複数のアリコートを−70℃で保存した。それぞれのアリコートはライブラリーの大きさに対して10倍過剰の細胞を含有している。ライブラリーをファージとして救済するため、例えば親和性結合によるファージの選択のため、次に1本のアリコートを融解し、500ml培養に加えることができる(Hawkinsら(1992)J.Mol.Biol、226、pp889−896)。
この方法の結果は以下の通りであり、図4にも示す:
Figure 0005789073
リボソームディスプレイ産物のサブクローニング
この実施例は、リボソームディスプレイの産物のサブクローニングに関するものである。このサブクローニング法では、鋳型はscFvであり、親scFvと記載した。用いたプロトコールは実施例1の通りである。
リボソーム・ディスプレイ・ライブラリーの産物(即ちRT−PCR産物)について、初期プライマーを用いて変異誘発プライマーを産生する初期PCR工程を実施する(Jermutusら(2001)PNAS、98(1)、75−80を参照されたい)。初期PCRプライマーとして用いたオリゴヌクレオチドを図3に示す。
このように、リボソームディスプレイの産物に由来するさまざまなscFv配列のレパートリー(Jermutusら、P.N.A.S、2001、98、pp75−80)を、Vの初めでアニーリングしているビオチン化フォワードプライマーと、Vの末端のすぐ下流にあるmycタグにプライム化しているリバースプライマーmycRestoreとを用いてPCRで増幅させた(図3を参照されたい)。
重鎖の初めのアミノ酸配列に応じて、Bio−EVQ又はBio−QVQを用いた。標準のPCR条件を用いた(詳細は実施例1を参照されたい)。
得られたPCR産物を実施例1に記載のように1本鎖型へ分離して変異誘発プライマーを形成し、変異誘発反応に用いた。
変異誘発反応の親分子はpCantab6中の1本鎖scFvである(Vaughanら(1996)Nature Biotechnology、14、pp309−314)。この実施例では唯一の配列scFv親pCantab6を用いた。したがって、単一親分子が複数の変異誘発プライマーによって変異され、それによりリボソームディスプレイからの複数の産物を親プラスミドへサブクローニングする。
1本鎖親分子の調製、変異誘発反応及び細胞の形質転換のプロトコールは実施例1の通りである。
変異誘発反応の産物は、エレクトロポレーションの後で>10000形質転換体を生じた。逆に、変異誘発プライマーも酵素もない対照は−10形質転換体を生じた。
上記実施例の結果は以下の通りであった:
Figure 0005789073
上で参照する変異誘発プライマーを図面に示す。比較すると、合成オリゴヌクレオチドを変異誘発反応に用いる場合(典型的には18塩基のミスマッチの両端に18相補性塩基)、平均変異誘発効率は64%である(n=350配列)。
サイズ排除法
変異誘発反応の前に実施例2の1本鎖親分子についてサイズ排除工程を行うことにより変異誘発効率を更に改善した。これは、変異誘発効率を1.5倍改善させた(配列解析、うまく変異した配列数の計数により測定)。
図1は、本発明の方法に用いる変異誘発プライマーを示す。いずれの場合も、数字は適切な塩基数であり、ミスマッチ領域はグレーで示す。図1aは、実施例1で用いた変異誘発プライマー1を示す(V/V組換え)。図1bは、VCDR3変異体用に実施例2で用いた変異誘発プライマー2aを示す(リボソームディスプレイサブクローニング)。図1cは、VCDR3変異体用に実施例2で用いた変異誘発プライマー2bを示す。図1dは、V変異体又はV変異体を産生するための変異誘発プライマーを示す。グレーの領域は、実施例2の鋳型と約70%同一である。図1eは、IgG受容体プラスミドへクローニングするための変異誘発プライマーを示す。図1fは、未感作ライブラリーを作製用のV受容体プラスミド及びV受容体プラスミドへクローニングするための変異誘発プライマーを示す。 図2は、V/V組換え態様(例えば実施例1)に用いる変異誘発プライマーを合成するための初期プライマーの位置を示す。AとBはそれぞれフォワードプライマーとリバースプライマーを示す。 図3は、リボソームディスプレイ側面(例えば実施例2)に用いる変異誘発プライマーを合成するための初期プライマーの位置を示す。AとBはそれぞれフォワードプライマーとリバースプライマーを示す。 図4は、実施例1の変異誘発法の結果を示す。 図5は、本発明の変異誘発法を示す概略図である。概略図では、VCDR3内に特定の変異を含有する(星印で示す)scFv含有プラスミド由来のVCDR3をPCRで増幅し、PCRでプライマーによって導入されるビオチンにより1本鎖型へ分離する。VCDR3内に特定の変異を含有する(やはり星印で示す)scFV含有プラスミドから1本鎖DNAを精製する。VCDR3変異を含有する1本鎖PCR産物とVCDR3変異を含有する1本鎖プラスミドとのあいだの変異誘発反応において2つの変異が組み合わされて両変異を含有するscFv含有プラスミドを生ずる。 図6は、本発明の組み合わせ態様を示す。図面上部に変異a、b、及びcを含有する複数の鋳型分子を示す。変異を含有するこれら分子の領域をPCRで増幅し、ビオチンを用いて複数の1本鎖変異誘発プライマーへ分離する。図面下部に、変異x、y、及びzを含有する複数の親分子を示す。1本鎖DNAは、それぞれ変異x、y、又はzを含有する複数の親分子を生ずるようにこれらの分子から産生される。変異誘発反応では、変異a、b、及びcを含有する変異誘発プライマーを用いて複数の親分子を変異させる。これは、図面の右に示す産物の組み合わせを生ずる。

Claims (41)

  1. 以下の工程を含む、1以上の変異を核酸分子に導入する方法:
    (a)親分子に対して1以上の変異を含有する変異誘発プライマーを、PCRに基づいた方法で鋳型核酸分子から合成し;
    (b)変異誘発プライマーの一方の1本鎖を単離し;
    (b−2)環状親分子の一方の1本鎖を単離し;
    (c)1本鎖型変異誘発プライマーを1本鎖型環状親分子にアニーリングさせ;そして、
    (d)変異誘発プライマーから、相補鎖を非PCR型の反応で合成して変異を含有する環状型核酸分子を作製する。
  2. アニーリング工程(c)の前に、1本鎖プライマーを1本鎖親分子と混合させる、請求項1に記載の方法。
  3. 分離媒体を使用して工程(b)の1本鎖プライマーを単離する、請求項1に記載の方法。
  4. 工程(c)の前に1本鎖親分子について行われるサイズ排除工程を更に含む、請求項に記載の方法。
  5. 親分子が発現ベクター又はファージディスプレイベクターである、請求項1〜のいずれか1項に記載の方法。
  6. 環状型分子が共有結合的に閉じた環状DNAである、請求項1〜のいずれか1項に記載の方法。
  7. 変異核酸分子で宿主細胞を形質転換させる工程を更に含む、請求項1〜のいずれか1項に記載の方法。
  8. エレクトロポレーションで形質転換を行う、請求項に記載の方法。
  9. 変異含有相補鎖が優先的に選択される条件下で行われる工程を含む、請求項1〜のいずれか1項に記載の方法。
  10. 親分子の優先的消化から相補鎖の優先的選択が起こる、請求項に記載の方法。
  11. 相補鎖が優先的に選択されるように親分子が修飾を含有する、請求項に記載の方法。
  12. 修飾を導入する工程を更に含む、請求項11に記載の方法。
  13. 修飾が、dTの代わりにdUを導入することである、請求項11又は12に記載の方法。
  14. 修飾がメチル化又は条件的致死遺伝子の導入である、請求項11又は12に記載の方法。
  15. 相補的非修飾鎖に選択的な宿主細胞を工程(d)の環状型分子で形質転換することにより優先的選択が行われる、請求項14のいずれか1項に記載の方法。
  16. 第1鎖から第2鎖を合成する際にエラーを導入する合成法により、変異誘発プライマーを合成する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
  17. 合成法がエラープロンPCRである、請求項16に記載の方法。
  18. 変異誘発プライマー合成のための鋳型配列が、親分子に見られるものと同一である、請求項16又は17に記載の方法。
  19. 変異誘発プライマーを合成する工程が、変異誘発プライマーの+鎖か−鎖に結合部分を導入し、分離媒体上の結合パートナーに結合している結合部分を介して分離が行われる、請求項3に記載の方法。
  20. 結合部分が変異誘発プライマーの+鎖に導入され、変異誘発プライマーの−鎖は分離媒体から溶離される、請求項19に記載の方法。
  21. 結合部分がビオチンであり、結合パートナーがストレプトアビジンである、請求項19又は20に記載の方法。
  22. 変異に置換が含まれる、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
  23. 変異に欠失が含まれる、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
  24. 変異に付加が含まれる、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
  25. 変異が、複数のヌクレオチドにおける変異である、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
  26. 変異誘発プライマーが、親分子と少なくとも80%の相補性を有する、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
  27. 変異誘発プライマーが、親分子と少なくとも90%の相補性を有する、請求項26に記載の方法。
  28. 変異誘発プライマーが、親分子と少なくとも95%の相補性を有する、請求項27に記載の方法。
  29. 変異誘発プライマーの大きさが100〜4000ヌクレオチドである、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
  30. 工程(c)において、親分子に対する変異誘発プライマーのモル比が約3:1である、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
  31. 複数の親分子及び/又は複数の変異誘発プライマー分子が存在する、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
  32. 親分子、鋳型、又は変異誘発プライマーが、抗体可変ドメインを含有する、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
  33. 抗体可変ドメインが抗体Vドメインである、請求項32に記載の方法。
  34. 抗体可変ドメインが抗体Vドメインである、請求項32に記載の方法。
  35. 親分子が抗体Vドメイン及び抗体Vドメインを含有し、変異誘発プライマー分子が親分子のVドメインを変異させるための抗体Vドメインを含有する、請求項32に記載の方法。
  36. 親分子が抗体Vドメイン及び抗体Vドメインを含有し、変異誘発プライマー分子が親分子のVドメインを変異させるための抗体Vドメインを含有する、請求項32に記載の方法。
  37. 第1及び第2の変異誘発プライマーを用いて親分子を変異させ、第1変異誘発プライマーは親分子上のVドメインを変異させるための抗体Vドメインを含有し、第2変異誘発プライマーは親分子上のVドメインを変異させるための抗体Vドメインを含有する、請求項35又は36に記載の方法。
  38. 別個の変異誘発反応工程に第1及び第2の変異誘発プライマーを用いる、請求項37に記載の方法。
  39. 同一の変異誘発反応工程に第1及び第2の変異誘発プライマーを用いる、請求項38に記載の方法。
  40. 及びVドメインを含有する単一変異誘発プライマーを用いて親分子上のV及びVドメインを変異させる、請求項35又は36に記載の方法。
  41. 親分子がscFvをコードする核酸を含む、請求項3140のいずれか1項に記載の方法。
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