JP5789073B2 - 変異誘発方法 - Google Patents
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Description
(a)親分子に対し1以上の変異を含有する変異誘発プライマーを鋳型核酸分子から合成し;
(b)1本鎖型変異誘発プライマーを分離し;
(c)1本鎖型変異誘発プライマーを1本鎖型親分子へアニーリングさせ;そして、
(d)変異誘発プライマーから相補鎖を合成して変異を含有する環状型核酸分子を作製する。
環状型分子(変異誘発反応の産物)は、共有結合的に閉じた環状DNA、好ましくは2重鎖DNAであることが最も好ましい。
本発明の方法では、アニーリング工程(c)の前に、1本鎖親分子を1本鎖プライマーへ加える別の工程が存在することが好ましい。より好ましくは、本発明の方法は、工程(c)の前に、1本鎖親分子を単離する工程を更に含む。
したがって、好ましい態様では、本発明の方法は、ヌクレオチドの修飾(例えばdUでdTを置換)を含む1本鎖親分子の使用を包含する。変異誘発プライマーからプライミングした相補鎖の合成は、そのような変異を含まない、新たに合成された変異鎖を産生する(例えば、合成反応ではdUTPよりもdTTPを用いることによって)。修飾されていない、新たに合成された変異鎖は、優先的に選択される(例えば、修飾されていない、新たに合成された変異鎖のみの複製を支持する宿主細胞をヘテロ2本鎖分子で形質転換することによって、又は親鎖を選択的酵素で消化することによって)。
(a)親分子に対して1以上の変異を含有する変異誘発プライマーを鋳型核酸分子から(好ましくはPCRによって)合成し;
(b)1本鎖型変異誘発プライマーを分離し;
(c)1本鎖型変異誘発プライマーを、1以上の選択可能な修飾を含有する1本鎖型親分子へアニーリングさせ;
(d)変異誘発プライマーの相補鎖を合成して修飾を含有しない環状型核酸分子を作製し;
(e)相補鎖が親分子よりも優先して選択されるように選択工程を行う。
これは、幅広いレパートリーの親分子及び/又は鋳型に、例えば幅広いレパートリーの親分子及び/又は鋳型を組み合わせるために用いることができるという利点を有する。好ましいレパートリーサイズは、少なくとも100の親分子及び/又は鋳型、より好ましくは少なくとも1000、更により好ましくは少なくとも2500である。
本発明の方法の好ましい応用には、ライブラリー、特に抗体ライブラリーのスクリーニング又は作製が含まれる。例えば、親分子は、抗体又は抗体ドメインの発現用ベクターでよい。変異を親分子へ導入することにより(例えば、抗体ドメインのライブラリーで構成される鋳型から変異誘発プライマーを作製することによって)、得られる変異親分子は好適な宿主中で発現し、適切な抗原に対してスクリーニングすることができる(更なる情報には、Vaughanら(1996)Nature Biotechnology、第14巻、第309−314頁;及びEdwardsら(2003)J.Mol.Biol、334、pp103−118頁を参照されたい)。抗体に関連した他の例には、免疫グロブリン受容体プラスミド、例えばIgG受容体プラスミドへの抗体ドメインのサブクローニングが含まれる(pEU IgG発現ベクターなど、Persicら(1997)Gene 187:9−18を参照されたい)。抗体という用語は免疫グロブリンを表し、天然型と合成型が含まれる。この用語は、抗体結合ドメインであるか又は実質的にこれと相同である抗体結合ドメインを有するポリペプチドを包含する。例として、Fab(VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、及びCH1ドメイン)、scFv((Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)3などのリンカーに連結されたVHドメイン及びVLドメイン、例えばBirdら(1988)Science、242、423−426;Hustonら(1988)PNAS USA、85、pp5879−5883)、Fv(単一抗体のVLドメインとVHドメイン)、Fd(VHドメインとCH1ドメイン);dAb(Holtら(2003)Trends in Biotech.21、pp484−490)及び2重特異性抗体(WO94/13804号)が挙げられる。
本発明は、上記方法を実施するためのキットも提供する。例えば、そのようなキットは、1本鎖プライマー分子を鋳型分子から合成するのに好適な初期プライマー、1本鎖親分子、及び使用説明書を含むことができる。親分子は本明細書に記載のようにして修飾することができる。本明細書において参照するような好適な試薬及びバッファーも含めることができる。本発明の方法の態様のいずれかに規定されるような更なるキット成分を含めることもできる。
実施例
1. 方法の概説
最適化したVH領域とVL領域との組換えは、in vitroにおける抗体の親和性成熟のあいだの可能性増大をもたらすことが示されている(Osbournら(1996)Immunotechnology、第2巻、pp181−196)。この実施例では、本発明の変異誘発法を用いて、VHCDR3が任意抽出されている1つの変異体プールを、VLCDR3が任意抽出されている他の変異体プールと組み合わせる。2つの変異体プールは、VHCDR3及びVLCDR3内の短いランダム化領域を除き、同一のオリジナル抗体配列を含有する。ランダム化の後、VHプール及びVLプールは親和性を向上させるためにそれぞれ2ラウンドのファージディスプレイ選択を受けている。第2ラウンドの選択のVH産物とVL産物は、それぞれ推定105〜106の異なる変異体配列を含有するが、この実施例に記載の組換え法の開始点を形成する。
M13から単離したdU−1本鎖DNA鋳型は+鎖であり、変異誘発プライマーは+鎖に対して相補的である(即ち−鎖である)。フォワードプライマーをビオチン化することによって、ストレプトアビジン上で捕捉した後、−鎖を溶出させることができる。用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである(5’から3’):
Bio−PAMA−IN:ビオチン−GCGGCCCAGCCGGCCATGG
H−LINK:ACCGCCAGAGCCACCTCCGCC
3. 2本鎖プラスミドDNAとしてのVL産物の調製
1. pCantab6内のVLレパートリーのグリセロールストック(Vaughanら)100μlを、小さな三角フラスコ中の50mlの2×TYAに植菌した。
2. 培養物を300rpmにて37℃で2時間増殖させた。
3. 細胞を3200rpmで10分間の遠心により50mlファルコンチューブ中に沈殿させた。
4. キアゲンのハイスピードプラスミドミディキットのプロトコールを実施して2本鎖プラスミドDNAを1mlの水中に単離した。
5. DNA濃度をUV分光法又はアガロースゲルで確認した。
第3項の2本鎖プラスミドDNAを次に以下のプロトコールに用いた:
試薬:
pCantab6内のVLレパートリーのプラスミドミニプレップ(Vaughanら)
10mg/mlクロラムフェニコール(CAM)エタノール溶液、−20℃保存
0.25mg/mlウリジン(シグマU−6381)水溶液、4℃保存
2×TYAG(+10μg/ml CAM)プレート:(TYはSambrookら、上記に記載のもの+100μg/mlアンピシリン(A)及び2%グルコース(G)、クロラムフェニコール(CAM)のストック20μlを80μlのエタノールに加えてプレートに塗布する)。
1. 5mlの2×TY培地(+10μg/ml CAM)に大腸菌CJ236細胞(例えばバイオラッドによって供給)の1つのコロニーを植菌する。細胞を300rpmにて37℃で一晩増殖させた。CAMはCJ236中のF’エピソームを選択する。
2. 500mlの2×TYに5mlの一晩培養物を植菌し、37℃で振とうしながらインキュベーションした。
3. 600nmのODが0.9に達したときに培養物を4℃にて遠心し、集菌した(5分間、5,000rpm)。上清を流して捨て、細胞沈殿物の水気をきった。細胞を100mlの氷冷100mM MgCl2に穏やかに再懸濁させた。
4. 細胞を遠心により再度集菌し(4℃で遠心)、沈殿物の水気をきった。細胞を、滑らかな懸濁液が得られるまで20mlの冷100mM CaCl2に穏やかに再懸濁させた。200mlの冷100mM CaCl2を加えて混合した。細胞を氷上に30〜90分間置いた。
5. 細胞を低温で遠心して集菌し、沈殿物の水気をきった。細胞を20mlの冷85mM CaCl2及び15%グリセロールに再懸濁させた。
6. 細胞懸濁液を直ちに分注した(必要であればアリコートをドライアイス/エタノール中で凍結させることができる)。
1. 上記のCJ236 CaCl2コンピテント細胞を氷上で融解させた(そしてプロトコールを通して氷上に維持した)。
2. 第3項のVLレパートリーを含有する5μlのpCantab6プラスミドをPCRチューブ中で100μlのコンピテント細胞に加えた。
3. PCRマシーンブロック上で以下のプログラムを実行した:
0.1℃で30分、42℃で45秒、0.1℃で2分。
4. 細胞を0.5mlの2×TYの入った15mlファルコンチューブに移した。
5. 細胞を200rpmにて振とうさせながら37℃で45〜60分間インキュベーションした。
6. 0.5mlの細胞を2×TYAG(+10μg/ml CAM)プレートに蒔き、プレートを37℃で一晩インキュベーションした。
1. 上記工程6から生ずるCJ236形質転換体の菌叢をこすって1mlの2×TYに入れる。500μlを50mlの2×TYGAC(即ち2%グルコース、100μg/ml AMP、10μg/ml CAM)に植菌し、OD600=0.5〜1になるまで37℃にて300rpmでインキュベーションした。
2. 細胞濃度をOD測定値(OD6001=5×108細胞/ml)から計算し、野生型KO7ヘルパーファージ(アマシャムバイオサイエンスM13 KO7ヘルパーファージ)を、感染効率(MOI)ファージ10:細胞1(野生型KO7ストックは通常0.33μl中に1010ファージを含有する)を確保するように加えた。次に細胞を37℃で10分間インキュベーション(振とうなし)して感染させた。
3. 1mlの培養物を、25μg/ml KAN(KO7を選択するため)及び0.25μg/mlウリジン(ウラシル含有鋳型を合成させるため)を添加した30mlの2×TYACへ移した。これを37℃にて一晩、300rpmでインキュベーションした。
4. 細胞を2℃にて10分間、15000rpmでSS−34ローターにて遠心した。上清を新しいチューブへ移し、1/5容量のPEG−NaClを加えた(20%PEG8000、2.5M NaCl)。これを室温で5分間インキュベーションし、次に2℃にて10分間、10000rpmでSS−34ローターにて遠心した。
5. 小さな白いファージ沈殿物が生じた。上清を静かに捨て、チューブをティッシュペーパーの上に逆さにして水気をきった。ファージ沈殿物を0.5mlのPBSに再懸濁させた(管壁をリンスしてできる限り多くのファージを捕捉した)。ファージをエッペンドルフチューブへ移し、マイクロ遠心機にて15000rpmで5分間遠心し、残留不要物を沈殿させた。上清を新しいエッペンドルフチューブへ移した。
6. dU−1本鎖DNA鋳型を、キアゲンMPバッファー(Sidhuら、上記)の添加から始まってキアゲンのキアプレップスピンM13キットを用いて精製した。DNAを100μlの10mM Tris−HCl、pH8.0中に溶出させ、1%アガロースゲルで調べた。1本鎖DNAの調製物が異なるバンドとして2.5kbに泳動され、これを第6項の変異誘発反応に用いた。
さまざまなVH配列のレパートリーを代表する領域をpCantab6からオリゴヌクレオチドbio−PAMA−IN及びH−LINKを用いてPCRで増幅させた。第3項で調製したミディプレップ鋳型の希釈系列に標準のPCR条件を用いることができる。
Abgene (2×)マスターミックス 25μl
鋳型ミディプレップ 1μl[原液、10−1、10−2、10−3、10−4、10−5、10−6、なし]
Bio−PAMA−IN 1μl
H−LINK 1μl
水 22μl
5μlのPCR産物をそれぞれ1%アガロースゲルで泳動した(例えばこれは産物の大きさを裏付け、収率を示す)。
1. マイクロMACSカラム(Miltenyi Biotec:130−042−701)を磁気ラック中に置いた。
2. 250μlの1×結合バッファー(2×結合バッファー:10mM Tris pH7.5、2M NaCl、1mM EDTA、0.1%Tween 20)を貫流させた。
3. 45μlのPCR産物を、105μlのマイクロMACSストレプトアビジンビーズ(Miltenyi Biotec:130−074−101)及び150μlの2×結合バッファーと混合し、2分間インキュベーションした。
4. DNA+ビーズをマイクロMACSカラムにかけて貫流させた。
5. カラムを2×1mlの1×結合バッファーで洗浄した。
6. DNAを200μlの0.1N NaOH(用事調製)でエッペンドルフチューブに溶出させた。
7. 溶出したDNAに20μlの酢酸ナトリウム pH5.2、550μlのエタノール、1μlのグリコーゲンを加えた。
8. これを−70℃で30分間インキュベーションした。
9. これを13000rpmで10分間遠心してDNAを沈殿させた。上清を除去し、500μlの70%エタノールで置換した。
10. これを13000rpmで更に5分間遠心し、上清を除去し、37℃の加熱ブロックにて2分間空気乾燥させた。DNAを50μlの水に再懸濁させた。
試薬:
TMバッファー(10×):500mM Tris−HCl、100mM MgCl2、pH7.5
10mM ATP:(1Mストックは0.6052gを1mlの水に溶解し、0.1M NaOHでpHを7.0に調整して作製した。ストックを1:100に希釈して10mM ATPを作製する。ストックは−70℃で保存することができる。)
100mM DTT:(1Mストックは0.1542gを1mlの0.01M酢酸ナトリウム(pH5.2)に溶解して作製した。ストックを1:10に希釈して100mM DTTを作製する。ストックは−20℃で保存することができる)。
酵素:ニューイングランドバイオラブス社(NEB)製のT4ポリヌクレオチドキナーゼ、T4 DNAリガーゼ、及びT7 DNAポリメラーゼ。
25mM dNTPs
キアゲン キアクイックPCR精製キット(キアゲン)
変異誘発プライマーのリン酸化
以下のものをエッペンドルフチューブに加えた:
1本鎖DNA変異誘発プライマー 1.0μg(1.0μg/132000ダルトン=7.6ピコモル)
TMバッファー(10×) 5.5μl
10mM ATP 5μl
100mM DTT 2.5μl
全量53μlになるまで水を加えた。2μl(20U)のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(10U/μl)を加え、37℃で1時間インキュベーションした。
以下のものをエッペンドルフチューブに加えた:
dU−1本鎖DNA鋳型(第4項より) 4.4μg(4.4μg/1,750,000ダルトン=2.5ピコモル)
リン酸化変異誘発プライマー 1.0μg(1.0μg/132000ダルトン=7.6ピコモル)
TMバッファー(10×) 25μl
容量250μlになるまで水を加えた。
変異誘発反応
アニーリングさせたオリゴ/鋳型混合物に以下のものを加えた:
10mM ATP 10μl
25mM dNTPs 10μl
100mM DTT 15μl
30Weiss unitsのT4 DNAリガーゼ(6U/μl)* 5μl
30ユニットのT7 DNAポリメラーゼ(10U/μl) 3μl
*酵素チューブ上に記された単位はWeiss unitsではない−6U/μlは酵素活性の正しい濃度である。
反応産物をそれぞれキアゲンのキアクイックPCR精製キットを用いて35μlの水へ親和性精製した。1μlの反応産物をそれぞれ1%アガロースゲルで泳動し、変異誘発プライマーの有無による反応の産物と比較した。「プライマーなし」のレーンで強い1本鎖DNAのバンド(pCantab6について2.5kb)が観察された。「プラマーあり」のレーンでは、この1本鎖DNAのバンドの強度は減少し、cccDNA(共有結合的に閉じた環状DNA)を表す1本以上の長いバンドに置き換わっていた(pCantab6について>3kb)。
以下のプロトコールにしたがい、新鮮なエレクトロコンピテントTG1細胞(ストラタジーン)を調製した:
1. 適当量の2×TY培地に、TG1最小培地プレートからの1つのコロニーを植菌した。細胞を25℃で一晩300rpmにて増殖させた。
2. それぞれ500mlの2×TYを含有する5本のフラスコに、10ml(フラスコあたり)の一晩培養物を植菌した。これを25℃にて300〜350rpmでOD600がおよそ0.5〜0.6になるまで増殖させた(これには通常およそ2〜3時間かかる)。
3. 500mlの遠心管6本とSorval SLA3000ローターを予め2℃まで冷却した。
4.いったん最適ODに達したら、細胞を遠心管中で氷上にて30分間冷却し、2℃にて4,000rpmで15分間遠心した。
5. 上清を注ぎ捨て、沈殿物を少量の氷冷オートクレーブMilliQ水に再懸濁させた。これを水でおよそ300mlにし、2℃にて4,000rpmで15分間遠心した。
6. 上清を注ぎ捨て、少量の残留水に再懸濁し、次いで300mlの水を加え、上記のように遠心した。
7. 50mlのファルコンチューブ8本を−20℃で予め冷却した。Sorvall卓上遠心機を2℃まで予め冷却した。
8. 上清を注ぎ捨て、沈殿物を残留水に再懸濁させた。
9. いったん再懸濁させたら、これをファルコンチューブにあけ、50mlになるまで水を加えた。これを3,200rpmsで10分間遠心した。
10. 上清を除去し、それぞれの沈殿物を少量の水に再懸濁し、細胞を1本の50mlのファルコンチューブ中で混ぜ合わせ、水で50mlにし、上記のように遠心した。
11. 上清を除去し、細胞を残留量の水に再懸濁させた。
電界強度2.5kV
抵抗200Ω
静電容量25μF
時定数およそ4.2ミリ秒。
この実施例は、リボソームディスプレイの産物のサブクローニングに関するものである。このサブクローニング法では、鋳型はscFvであり、親scFvと記載した。用いたプロトコールは実施例1の通りである。
得られたPCR産物を実施例1に記載のように1本鎖型へ分離して変異誘発プライマーを形成し、変異誘発反応に用いた。
変異誘発反応の産物は、エレクトロポレーションの後で>10000形質転換体を生じた。逆に、変異誘発プライマーも酵素もない対照は−10形質転換体を生じた。
変異誘発反応の前に実施例2の1本鎖親分子についてサイズ排除工程を行うことにより変異誘発効率を更に改善した。これは、変異誘発効率を1.5倍改善させた(配列解析、うまく変異した配列数の計数により測定)。
Claims (41)
- 以下の工程を含む、1以上の変異を核酸分子に導入する方法:
(a)親分子に対して1以上の変異を含有する変異誘発プライマーを、PCRに基づいた方法で鋳型核酸分子から合成し;
(b)変異誘発プライマーの一方の1本鎖を単離し;
(b−2)環状親分子の一方の1本鎖を単離し;
(c)1本鎖型変異誘発プライマーを1本鎖型環状親分子にアニーリングさせ;そして、
(d)変異誘発プライマーから、相補鎖を非PCR型の反応で合成して変異を含有する環状型核酸分子を作製する。 - アニーリング工程(c)の前に、1本鎖プライマーを1本鎖親分子と混合させる、請求項1に記載の方法。
- 分離媒体を使用して工程(b)の1本鎖プライマーを単離する、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)の前に1本鎖親分子について行われるサイズ排除工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 親分子が発現ベクター又はファージディスプレイベクターである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 環状型分子が共有結合的に閉じた環状DNAである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 変異核酸分子で宿主細胞を形質転換させる工程を更に含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- エレクトロポレーションで形質転換を行う、請求項7に記載の方法。
- 変異含有相補鎖が優先的に選択される条件下で行われる工程を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 親分子の優先的消化から相補鎖の優先的選択が起こる、請求項9に記載の方法。
- 相補鎖が優先的に選択されるように親分子が修飾を含有する、請求項9に記載の方法。
- 修飾を導入する工程を更に含む、請求項11に記載の方法。
- 修飾が、dTの代わりにdUを導入することである、請求項11又は12に記載の方法。
- 修飾がメチル化又は条件的致死遺伝子の導入である、請求項11又は12に記載の方法。
- 相補的非修飾鎖に選択的な宿主細胞を工程(d)の環状型分子で形質転換することにより優先的選択が行われる、請求項9〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 第1鎖から第2鎖を合成する際にエラーを導入する合成法により、変異誘発プライマーを合成する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 合成法がエラープロンPCRである、請求項16に記載の方法。
- 変異誘発プライマー合成のための鋳型配列が、親分子に見られるものと同一である、請求項16又は17に記載の方法。
- 変異誘発プライマーを合成する工程が、変異誘発プライマーの+鎖か−鎖に結合部分を導入し、分離媒体上の結合パートナーに結合している結合部分を介して分離が行われる、請求項3に記載の方法。
- 結合部分が変異誘発プライマーの+鎖に導入され、変異誘発プライマーの−鎖は分離媒体から溶離される、請求項19に記載の方法。
- 結合部分がビオチンであり、結合パートナーがストレプトアビジンである、請求項19又は20に記載の方法。
- 変異に置換が含まれる、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 変異に欠失が含まれる、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 変異に付加が含まれる、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 変異が、複数のヌクレオチドにおける変異である、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 変異誘発プライマーが、親分子と少なくとも80%の相補性を有する、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 変異誘発プライマーが、親分子と少なくとも90%の相補性を有する、請求項26に記載の方法。
- 変異誘発プライマーが、親分子と少なくとも95%の相補性を有する、請求項27に記載の方法。
- 変異誘発プライマーの大きさが100〜4000ヌクレオチドである、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(c)において、親分子に対する変異誘発プライマーのモル比が約3:1である、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 複数の親分子及び/又は複数の変異誘発プライマー分子が存在する、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 親分子、鋳型、又は変異誘発プライマーが、抗体可変ドメインを含有する、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 抗体可変ドメインが抗体VLドメインである、請求項32に記載の方法。
- 抗体可変ドメインが抗体VHドメインである、請求項32に記載の方法。
- 親分子が抗体VHドメイン及び抗体VLドメインを含有し、変異誘発プライマー分子が親分子のVLドメインを変異させるための抗体VLドメインを含有する、請求項32に記載の方法。
- 親分子が抗体VLドメイン及び抗体VHドメインを含有し、変異誘発プライマー分子が親分子のVHドメインを変異させるための抗体VHドメインを含有する、請求項32に記載の方法。
- 第1及び第2の変異誘発プライマーを用いて親分子を変異させ、第1変異誘発プライマーは親分子上のVHドメインを変異させるための抗体VHドメインを含有し、第2変異誘発プライマーは親分子上のVLドメインを変異させるための抗体VLドメインを含有する、請求項35又は36に記載の方法。
- 別個の変異誘発反応工程に第1及び第2の変異誘発プライマーを用いる、請求項37に記載の方法。
- 同一の変異誘発反応工程に第1及び第2の変異誘発プライマーを用いる、請求項38に記載の方法。
- VH及びVLドメインを含有する単一変異誘発プライマーを用いて親分子上のVH及びVLドメインを変異させる、請求項35又は36に記載の方法。
- 親分子がscFvをコードする核酸を含む、請求項31〜40のいずれか1項に記載の方法。
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