JP5777299B2 - Tissue stem cell proliferation method and tissue stem cell obtained therefrom - Google Patents
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本発明は、生物学、医学等の分野において有用な組織幹細胞の培養方法、それより得られる組織幹細胞に関するものである。 The present invention relates to a method for culturing tissue stem cells useful in fields such as biology and medicine, and tissue stem cells obtained therefrom.
医療技術の著しい発展により、近年、治療困難となった臓器を他人の臓器と置き換えようとする臓器移植が一般化してきた。しかしながら、未だにドナー数の少なさが問題にとり挙げられ、角膜移植を例にとると、国内だけでも角膜移植の必要な患者が年間約２万人出てくるのに対し、実際に移植治療が行える患者は約１／１０の２０００人程度でしかないといわれている。角膜移植というほぼ確立された技術があるにもかかわらず、ドナー不足という問題のため治療が患者全員へ行きわたらないのが現状である。 Due to the remarkable development of medical technology, in recent years, organ transplants that attempt to replace difficult-to-treat organs with other organs have become common. However, the small number of donors is still cited as a problem, and taking corneal transplantation as an example, about 20,000 patients who need corneal transplantation per year appear in Japan alone, but transplantation treatment can actually be performed It is said that there are only about 2000 patients, about 1/10. Despite the almost established technique of corneal transplantation, the current situation is that treatment is not available to all patients due to the lack of donors.
このような背景のもと、以前より、人工代替物や細胞を培養して組織化させたものをそのまま移植しようという技術が注目されている。その代表的な例として、人口皮膚及び培養皮膚があげられよう。ここで、合成高分子を用いた人口皮膚は拒絶反応等が生じる可能性があり、移植用皮膚としては好ましくない。一方、培養皮膚は本人の正常な皮膚の一部を所望の大きさまで培養したものであるため、これを使用しても拒絶反応等の心配がなく、最も自然なマスキング剤と言える。 Against this background, techniques for transplanting artificial substitutes or cells that have been cultured and organized have attracted attention. Representative examples include artificial skin and cultured skin. Here, artificial skin using a synthetic polymer may cause rejection and the like, and is not preferable as skin for transplantation. On the other hand, since the cultured skin is obtained by culturing a part of the normal skin of the person to a desired size, even if it is used, there is no concern about rejection or the like, and it can be said to be the most natural masking agent.
特許文献１には、ヒト新生児由来表皮角化細胞を、ケラチン組織の膜が容器表面上に形成される条件下で培養し、生成したケラチン組織膜を酵素によって分解し剥離させることを特徴とする移植可能な培養細胞膜を製造する方法が記載されている。具体的には、３Ｔ３細胞をフィーダーレイヤーとして用いることで、播種した表皮細胞は増殖し、しかもそのまま重層化してしまうというものである。ここでの３Ｔ３細胞の役割の一つは、培養した表皮細胞中の幹細胞の未分化性を維持しつつ増殖させることとされている。この方法は、今や表皮角化細胞を培養する方法の主流にまでなっている。しかしながら、この方法には欠点があり、すなわち上記３Ｔ３細胞がマウス由来の細胞である点がよく指摘される。一般的には、表皮角化細胞を培養している間にこの３Ｔ３細胞は消失すると言われているが、未だに１００％消失したことを証明することができていないのが現状である。
この点を解決すべく、これまでに種々の検討がなされてきた。例えば、別の培養基材上で３Ｔ３細胞を培養し、表皮角化細胞に有効な物質を培地中に出させ、その上清だけを表皮角化細胞を培養している系に移す方法があげられる（特許文献２、特許文献３）。しかしながら、この方法でも、異種動物の細胞自身の混入は防げても、異種動物細胞が産生するさまざまな蛋白質を分割している訳でなく、基本的に同様な問題が残されている。また、特許文献４では、培地中にシスタチン、及びそのスーパーファミリーを加えることで３Ｔ３細胞の代替とさせたり、特許文献５では、ヒト由来の細胞をフィーダーレイヤーとして利用しようとする試みもなされているが、未だに上記３Ｔ３細胞並みの活性を持った細胞が得られておらず、３Ｔ３細胞に代わる有効な技術が強く望まれていた。 In order to solve this problem, various studies have been made so far. For example, 3T3 cells are cultured on another culture substrate, a substance effective for epidermal keratinocytes is put into the medium, and only the supernatant is transferred to a system in which epidermal keratinocytes are cultured. (
一方、最近、組織幹細胞に関する研究が活発化し、組織幹細胞が生体内に存在する場であるニッシェについての研究も精力的に行われるようになってきた（非特許文献１、非特許文献２）。そのような中、例えば非特許文献３では、造血幹細胞にＣＤ６１が高発現しているのに対し、その細胞が分化した造血前駆細胞ではそのＣＤ６１の発現が弱まっていることが見出された。このことから、造血幹細胞の分化にＣＤ６１が係わっているものと推測される。また、このＣＤ６１は、造血幹細胞ではない角膜上皮幹細胞においても高発現していることも分かった（非特許文献４）。組織幹細胞に共通してＣＤ６１という分子が係わっていると予想はされるものの、そのＣＤ６１が係わる意味は、これまで全く解明されていなかった。そして、もしこのＣＤ６１が、組織幹細胞が幹細胞の状態で維持できるニッシェの機構に係わるものであれば、組織幹細胞を未分化な状態を維持しつつ増殖させられるものと期待される。組織幹細胞を未分化な状態を維持しつつ増殖させられるようになれば、再生医療等の医療分野において極めて重要な技術になるものと期待される。 On the other hand, recently, research on tissue stem cells has been activated, and research on niche, where tissue stem cells are present in the living body, has been energetically performed (Non-patent
本発明は、組織幹細胞を生体外で分化させることなく、未分化な状態を維持させながら増殖させる方法を提供することを課題とする。また、本発明では、その増殖方法を用いて得られる組織幹細胞を提供することも目的とする。従来、組織幹細胞を生体外で未分化な状態を維持させながら増殖させる技術がなかった。そのため、上皮系細胞を重層化培養する際には、上述したようなマウス由来の３Ｔ３細胞のような線維芽細胞を使わざるを得ないのが現状であった。本発明は、他の細胞を使わずに組織幹細胞を生体外で未分化な状態を維持させながら増殖させるという、極めて広範囲に応用、展開が可能な革新的な技術と考えられる。 An object of the present invention is to provide a method for proliferating tissue stem cells while maintaining an undifferentiated state without differentiating them in vitro. Another object of the present invention is to provide tissue stem cells obtained by using the proliferation method. Conventionally, there has been no technique for growing tissue stem cells while maintaining an undifferentiated state in vitro. Therefore, when epithelial cells are stratified and cultured, fibroblasts such as 3T3 cells derived from mice as described above must be used. The present invention is considered to be an innovative technology that can be applied and deployed in a very wide range, in which tissue stem cells are proliferated while maintaining an undifferentiated state in vitro without using other cells.
本発明者らは、上記課題を解決するために、造血幹細胞、並びに角膜上皮幹細胞に共通して高発現するＣＤ６１という物質の幹細胞に対する役割について詳細に検討した。そして、そのＣＤ６１の幹細胞に対する効果を見出し、その知見をもとに実際に生体外で幹細胞を未分化な状態を維持させながら増殖させられることを見出した。
すなわち、本発明は、トロンボポエチン存在下において、β−３インテグリンシグナルを誘導させることを特徴とする組織幹細胞の増殖方法を提供するものである。また、本発明はその増殖方法を用いた得られる造血幹細胞、並びに角膜上皮幹細胞を提供する。本発明は、組織幹細胞への生化学的な手法を適用するという世界に類のない新規な発想による細胞培養法で実現する極めて重要な発明と考えている。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
項１．トロンボポエチン存在下において、β−３インテグリンシグナルを誘導させることを特徴とする組織幹細胞の増殖方法。
項２．未分化性を維持させた、請求項１記載の組織幹細胞の増殖方法。
項３．β−３インテグリンシグナルを誘導させるものが、抗β３インテグリン抗体、ビトロネクチン、オステオポンチンのいずれか１つ、もしくは２つ以上を組み合わせたものである、請求項１、２のいずれか１項記載の組織幹細胞の増殖方法。
項４．組織幹細胞が造血幹細胞、または角膜上皮幹細胞である、請求項１〜３のいずれか１項記載の組織幹細胞の増殖方法。
項５．請求項１〜４のいずれか１項の方法で得られる、造血幹細胞。
項６．請求項１〜４のいずれか１項の方法で得られる、角膜上皮幹細胞。In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors examined in detail the role of a substance called CD61, which is highly expressed in common to hematopoietic stem cells and corneal epithelial stem cells, on stem cells. And the effect with respect to the stem cell of the CD61 was discovered, and it discovered that a stem cell was actually proliferated maintaining the undifferentiated state in vitro based on the knowledge.
That is, the present invention provides a method for proliferating tissue stem cells characterized by inducing a β-3 integrin signal in the presence of thrombopoietin. The present invention also provides hematopoietic stem cells and corneal epithelial stem cells obtained using the proliferation method. The present invention is considered to be a very important invention that can be realized by a cell culture method based on a novel concept unprecedented in the world to apply biochemical techniques to tissue stem cells.
That is, the present invention is as follows.
Item 6. Corneal epithelial stem cells obtained by the method according to any one of
本発明によれば、組織幹細胞を生体外で分化させることなく、未分化な状態を維持させながら増殖させられるようになる。また、本発明で提供される組織幹細胞の増殖方法であれば、例えばマウス３Ｔ３細胞のような異種の細胞と共に培養する必要もなくなり、培養した組織幹細胞の利用範囲が広くなる。 According to the present invention, tissue stem cells can be proliferated while maintaining an undifferentiated state without differentiating in vitro. In addition, the tissue stem cell proliferation method provided by the present invention eliminates the need for culturing with heterogeneous cells such as mouse 3T3 cells, and the range of use of cultured tissue stem cells is broadened.
本発明は、組織幹細胞を増殖させる方法に関するものである。その際に、使用される組織幹細胞は、生体組織中に存在する組織幹細胞であれば特に限定されるものではないが、例えば造血幹細胞、角膜上皮幹細胞が挙げられる。本発明で用いられる細胞は、生体組織から直接採取した細胞、直接採取し培養系等で分化させた細胞、或いは細胞株が挙げられるがその種類は、何ら制約されるものではない。これらの細胞の動物の由来は特に制約されるものではないが、例えば、ヒト、或いはラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等が挙げられるが、本発明の治療用細胞をヒトの治療に用いる場合はヒト、ブタ、チンパンジー由来の細胞を用いる方が望ましい。本発明における細胞培養のための培地は培養される細胞に対し通常用いられるものを用いれば特に制約されるものではない。 The present invention relates to a method for growing tissue stem cells. In this case, the tissue stem cells used are not particularly limited as long as they are tissue stem cells present in a living tissue, and examples thereof include hematopoietic stem cells and corneal epithelial stem cells. Examples of the cell used in the present invention include a cell directly collected from a living tissue, a cell directly collected and differentiated by a culture system, or a cell line, but the type is not limited at all. The origin of these cells is not particularly limited, and examples thereof include humans, rats, mice, guinea pigs, marmosets, rabbits, dogs, cats, sheep, pigs, chimpanzees, and immunodeficient animals thereof. However, when the therapeutic cells of the present invention are used for human therapy, it is desirable to use cells derived from humans, pigs, and chimpanzees. The medium for cell culture in the present invention is not particularly limited as long as it is a commonly used medium for cells to be cultured.
本発明はこれらの組織幹細胞を増殖させる方法であるが、その際には、培地中にトロンボポエチン（以下、ＴＰＯと略す場合がある。）を含まれていることが必要である。そのトロンボポエチンの培地中の濃度は特に限定されるものではないが、例えば１０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲が良く、通常使われる濃度は５０ｎｇ／ｍｌである。１０ｎｇ／ｍｌより少ない濃度であると本発明の効果は得られず、逆に１００ｎｇ／ｍｌより高い濃度にしても１０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度のときと効果は変わらないため好ましくない。 The present invention is a method for growing these tissue stem cells. In this case, it is necessary that the medium contains thrombopoietin (hereinafter sometimes abbreviated as TPO). The concentration of the thrombopoietin in the medium is not particularly limited, but for example, a range of 10 to 100 ng / ml is good, and a commonly used concentration is 50 ng / ml. If the concentration is less than 10 ng / ml, the effect of the present invention cannot be obtained. Conversely, even if the concentration is higher than 100 ng / ml, the effect is not different from the case of a concentration in the range of 10 to 100 ng / ml.
本発明では、さらに組織幹細胞内へβ−３インテグリンシグナルを誘導させることが必要である。そのβ−３インテグリンシグナルを誘導させる物質については特に限定されるものではないが、例えば、抗Ｂ−３インテグリン抗体、ビトロネクチン、オステオポンチンのいずれか、もしくはそれらを２種以上の組み合わせたものが挙げられる。それらの物質は、培地中に溶解させても、培養基材表面に被覆することでも良く、何ら限定されるものではない。 In the present invention, it is further necessary to induce β-3 integrin signal into tissue stem cells. The substance that induces the β-3 integrin signal is not particularly limited, and examples thereof include an anti-B-3 integrin antibody, vitronectin, osteopontin, or a combination of two or more thereof. . These substances may be dissolved in the medium or coated on the surface of the culture substrate, and are not limited at all.
本発明は、トロンボポエチン存在下において、β−３インテグリンシグナルを誘導させることを特徴とする組織幹細胞の増殖方法である。培地中に存在するトロンボポエチンが組織幹細胞のｃ−ｍｐｌ受容体に結合すると、それが引き金となって、幹細胞が***、分化し、同時に未分化の状態で再増殖する。その際に、β−３インテグリンシグナルが誘導されないと、幹細胞は***、分化する方が優先し、β−３インテグリンシグナルを誘導されると、幹細胞は未分化の状態で再増殖することの方が優先されることが分かった。すなわち、組織幹細胞をトロンボポエチン存在下において、β−３インテグリンシグナルを誘導させれば、幹細胞を未分化の状態で増殖させられることが分かった。 The present invention is a method of proliferating tissue stem cells, characterized by inducing a β-3 integrin signal in the presence of thrombopoietin. When thrombopoietin present in the medium binds to the c-mpl receptor of tissue stem cells, it triggers the stem cells to divide and differentiate, and at the same time re-grow in an undifferentiated state. At that time, if the β-3 integrin signal is not induced, the stem cell is preferred to divide and differentiate, and if the β-3 integrin signal is induced, the stem cell is more proliferated in an undifferentiated state. It turns out that priority is given. That is, it was found that if a tissue stem cell is induced in the presence of thrombopoietin and a β-3 integrin signal is induced, the stem cell can be proliferated in an undifferentiated state.
本発明において、培養基材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類など全て用いることができる。例えば、培養する細胞の基材への付着性を高める等の目的でコラーゲン、ラミニン、ポリ−Ｌ−リジン、マトリゲルなどが被覆されている培養基材を用いても良い。本発明における培養基材の形状は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、セルインサートのような形態のもの、或いは平膜状のものなどが挙げられる。 In the present invention, as the culture substrate, substances generally capable of giving form such as glass, modified glass, polystyrene, polymethylmethacrylate, etc., which are usually used for cell culture, such as polymers other than those mentioned above, are used. All compounds, ceramics, etc. can be used. For example, a culture substrate coated with collagen, laminin, poly-L-lysine, matrigel, or the like may be used for the purpose of increasing the adherence of cells to be cultured to the substrate. The shape of the culture substrate in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include dishes, multiplates, flasks, cell inserts, and flat membranes.
本発明において、その他の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知の幹細胞培養用因子（ＣＳＦ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。その際、これらの添加量も何ら限定されるものではない。 In the present invention, other culture conditions may be in accordance with conventional methods and are not particularly limited. For example, the medium to be used may be a medium to which a serum such as a well-known stem cell culture factor (CSF) or fetal calf serum (FCS) is added, or such a serum-free medium to which no serum is added. But you can. At that time, the amount of addition is not limited.
本発明の培養方法を利用すれば、組織幹細胞を未分化の状態で増殖させられる。この増殖方法を角膜上皮幹細胞に利用すれば、細胞培養している間、幹細胞を未分化の状態で維持させられ、上述したような異種動物の細胞を使わなくても細胞を重層化させることができるようになる。その重層化培養の際には、細胞を０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力の弱い温度域で培養しても良い。その温度とは通常、細胞を培養する温度である３７℃が好ましい。本発明に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、培養、剥離されるものが細胞であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。本発明に用いられる共重合のためのモノマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。 If the culture method of the present invention is used, tissue stem cells can be proliferated in an undifferentiated state. If this proliferation method is used for corneal epithelial stem cells, stem cells can be maintained in an undifferentiated state during cell culture, and cells can be stratified without using cells from different animals as described above. become able to. In the stratified culture, cells are cultured in a temperature range where the hydration power of the polymer is weak on a cell culture support whose surface is coated with a polymer whose hydration power changes in the temperature range of 0 to 80 ° C. May be. Usually, the temperature is preferably 37 ° C., which is a temperature for culturing cells. The temperature-responsive polymer used in the present invention may be either a homopolymer or a copolymer. Examples of such a polymer include polymers described in JP-A-2-21865. Specifically, for example, it can be obtained by homopolymerization or copolymerization of the following monomers. Examples of the monomer that can be used include a (meth) acrylamide compound, an N- (or N, N-di) alkyl-substituted (meth) acrylamide derivative, or a vinyl ether derivative. Two or more of these can be used. Furthermore, copolymerization with monomers other than the above monomers, grafting or copolymerization of polymers, or a mixture of polymers and copolymers may be used. Moreover, it is also possible to crosslink within a range that does not impair the original properties of the polymer. In this case, since the cells to be cultured and peeled are cells, separation is performed in the range of 5 ° C. to 50 ° C., and as the temperature-responsive polymer, poly-Nn-propylacrylamide (of a homopolymer) Lower critical solution temperature 21 ° C), poly-Nn-propylmethacrylamide (27 ° C), poly-N-isopropylacrylamide (32 ° C), poly-N-isopropylmethacrylamide (43 ° C), poly- N-cyclopropylacrylamide (at 45 ° C), poly-N-ethoxyethylacrylamide (at about 35 ° C), poly-N-ethoxyethylmethacrylamide (at about 45 ° C), poly-N-tetrahydrofurfurylacrylamide (at the same) About 28 ° C.), poly-N-tetrahydrofurfuryl methacrylamide (about 35 ° C.), poly-N, N-ethylmethyl acetate Ruamido (the 56 ° C.), poly -N, N-diethyl acrylamide (the 32 ° C.), and the like. As monomers for copolymerization used in the present invention, polyacrylamide, poly-N, N-diethylacrylamide, poly-N, N-dimethylacrylamide, polyethylene oxide, polyacrylic acid and salts thereof, polyhydroxyethyl methacrylate, Examples thereof include water-containing polymers such as polyhydroxyethyl acrylate, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, cellulose, carboxymethyl cellulose, and the like, but are not particularly limited.
上述の場合、上述の各ポリマーの基材表面への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、基材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。培養基材表面への温度応答性ポリマーの被覆量は、１．１〜２．３μｇ／ｃｍ２の範囲が良く、好ましくは１．４〜１．９μｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは１．５〜１．８μｇ／ｃｍ２である。１．１μｇ／ｃｍ２より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該ポリマー上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に２．３μｇ／ｃｍ２以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となる。このような場合、温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆すれば、基材表面の温度応答性ポリマー被覆量は２．３μｇ／ｃｍ２以上であっても良く、その際の温度応答性ポリマーの被覆量は９．０μｇ／ｃｍ２以下が良く、好ましくは８．０μｇ／ｃｍ２以下が良く、７．０μｇ／ｃｍ２以下が好都合である。温度応答性ポリマーの被覆量が９．０μｇ／ｃｍ２以上であると温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆しても細胞が付着し難くなり好ましくない。そのような細胞接着性タンパク質の種類は何ら限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５、マトリゲル等の単独、もしくは２種以上の混合物が挙げられる。また、これらの細胞接着性タンパク質の被覆方法は常法に従えば良く、通常、細胞接着性タンパク質の水溶液を基材表面に塗布し、その後その水溶液を除去しリンスする方法がとられている。本発明は、温度応答性培養皿を利用したなるべく細胞シートそのものを利用しようとする技術である。従って、温度応答性ポリマー層上の細胞接着性タンパク質の被覆量が極度に多くなっては好ましくない。温度応答性ポリマーの被覆量、並びに細胞接着性タンパク質の被覆量の測定は常法に従えば良く、例えばＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲを用いて細胞付着部を直接測る方法、あらかじめラベル化したポリマーを同様な方法で固定化し細胞付着部に固定化されたラベル化ポリマー量より推測する方法などが挙げられるがいずれの方法を用いても良い。In the case described above, the method for coating the surface of each polymer described above is not particularly limited. For example, the substrate and the monomer or polymer are irradiated with electron beam (EB), γ-ray irradiation, ultraviolet irradiation, plasma treatment. , Corona treatment, organic polymerization reaction, or physical adsorption such as coating and kneading. The coverage of the temperature responsive polymer to the culture substrate surface may have a range of 1.1~2.3μg / cm 2, preferably 1.4~1.9μg / cm 2, more preferably 1. 5 to 1.8 μg / cm 2 . When the coating amount is less than 1.1 μg / cm 2 , the cells on the polymer are difficult to peel off even when a stimulus is applied, and the working efficiency is remarkably deteriorated. Conversely, if it is 2.3 μg / cm 2 or more, it is difficult for cells to adhere to the region, and it becomes difficult to sufficiently attach the cells. In such a case, if the cell-adhesive protein is further coated on the temperature-responsive polymer coating layer, the temperature-responsive polymer coating amount on the substrate surface may be 2.3 μg / cm 2 or more. the coverage of the temperature responsive polymer good 9.0μg / cm 2 or less, preferably well 8.0μg / cm 2 or less, expediently 7.0μg / cm 2 or less. When the coating amount of the temperature-responsive polymer is 9.0 μg / cm 2 or more, even if the cell-responsive protein is further coated on the temperature-responsive polymer coating layer, it is not preferable because cells hardly adhere. Although the kind of such cell adhesion protein is not limited at all, For example, collagen, laminin,
本発明の方法において、培養した細胞を温度応答性基材から剥離回収するには、培養された細胞の付着した培養基材の温度を培養基材上の被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。 In the method of the present invention, in order to peel and recover the cultured cells from the temperature-responsive substrate, the temperature of the culture substrate to which the cultured cells are attached is equal to or higher than the upper critical solution temperature of the coating polymer on the culture substrate. It can be made to peel by making it below the critical solution temperature. In that case, it can be performed in a culture solution or in another isotonic solution, and can be selected according to the purpose. For the purpose of detaching and recovering cells faster and more efficiently, use a method of tapping or shaking the substrate, or a method of stirring the medium using a pipette, alone or in combination. May be. The culture conditions other than the temperature may be in accordance with conventional methods and are not particularly limited. For example, the medium to be used may be a medium to which serum such as known fetal calf serum (FCS) is added, or a serum-free medium to which such serum is not added.
以上のことを温度応答性ポリマーとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの基材表面に被覆、固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、基材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、基材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が基材表面に被覆、固定されているため、基材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できないほどの表面となり、培養中の細胞、もしくは細胞シートも冷却するだけで剥離させられることになる。上記方法に従えば、培養した幹細胞は培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けていないものである。そのため、基材から剥離された幹細胞は接着性蛋白質を有する。このことにより、移植時において患部組織と良好に接着することができ、効率良い移植を実施することができるようになる。 The above will be described by taking poly (N-isopropylacrylamide) as an example of a temperature-responsive polymer. Poly (N-isopropylacrylamide) is known as a polymer having a lower critical solution temperature at 31 ° C. In the free state, dehydration occurs in water at a temperature of 31 ° C. or more, and polymer chains aggregate and become cloudy. Conversely, at a temperature of 31 ° C. or lower, the polymer chain is hydrated and dissolved in water. In the present invention, this polymer is coated and fixed on the surface of a substrate such as a petri dish. Therefore, if the temperature is 31 ° C. or higher, the polymer on the substrate surface is similarly dehydrated. However, since the polymer chain is coated and fixed on the substrate surface, the substrate surface is hydrophobic. Become. Conversely, at a temperature of 31 ° C. or lower, the polymer on the substrate surface is hydrated, but the polymer chain is coated and fixed on the substrate surface, so that the substrate surface becomes hydrophilic. At this time, the hydrophobic surface is an appropriate surface on which cells can attach and proliferate, and the hydrophilic surface becomes a surface on which cells cannot attach, and the cells or cell sheet in culture are peeled off only by cooling. Will be allowed to. According to the above method, the cultured stem cells are not damaged by proteolytic enzymes represented by dispase, trypsin and the like at the time of culture. Therefore, the stem cells detached from the substrate have an adhesive protein. As a result, it is possible to adhere well to the affected tissue at the time of transplantation, and it is possible to carry out efficient transplantation.
本発明の培養方法を利用すれば、組織幹細胞を未分化の状態で増殖させられる。このことを利用すると生体外でさまざまな形態の細胞集合体が得られる。これらの技術は組織再生、細胞分化に係わる再生医療の技術として極めて有効なものと考えられる。 If the culture method of the present invention is used, tissue stem cells can be proliferated in an undifferentiated state. By utilizing this fact, various forms of cell aggregates can be obtained in vitro. These technologies are considered to be extremely effective as regenerative medicine technologies related to tissue regeneration and cell differentiation.
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but these do not limit the present invention in any way.
（本実施例の目的）
（ＣＤ３４−ＫＳＬ：ＣＤ３４−ｃ−ｋｉｔ＋ｓｃａ−１＋ｌｉｎｅａｇｅ−）
造血幹細胞（ＨＳＣ：Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）はＣＤ３４−ＫＳＬとして表記され、細胞表面抗原の発現様式はＣＤ３４陰性、ｃ−ｋｉｔ陽性、ｓｃａ−１陽性として知られている。また、ＣＤ６１（インテグリンβ３サブユニット）が高発現している造血幹細胞の集団が存在することが見出されていることが分かっている（図１）。
（ＣＤ３４＋ＫＳＬ：ＣＤ３４＋ｃ−ｋｉｔ＋ｓｃａ−１＋ｌｉｎｅａｇｅ−）
造血幹細胞（ＨＳＣ）は複数の段階（各種前駆細胞への分化）を経て最終分化へと至る。その段階にある細胞群を、造血前駆細胞（Ｈｅｍａｔｏｐｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ）と呼び、細胞表面抗原の発現様式はＣＤ３４陽性、ｃ−ｋｉｔ陽性、ｓｃａ−１陽性として表わされる。これら細胞群では、ＣＤ６１の発現様式が低く、造血幹細胞とは異なることが分かっている（図１）。
以上の知見より、ＣＤ６１の造血幹細胞における機能解析を目的とすることとした。
（検討結果）
野生型（Ｗｔ）あるいはＣＤ６１（ＣＤ６１−／−）欠損型Ｃ５７ＢＬ／６ ドナーマウス（細胞型Ｌｙ５．２；Ｌｙ５．２は細胞表面マーカーの種類）から、４０個のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞（造血幹細胞）を骨髄から採取・分離し、２ｘ１０５個の骨髄由来競合細胞（細胞型Ｌｙ５．１；ドナーマウスと異なる細胞表面マーカーをもつ）と共に、致死量放射線照射したレシピエントマウス（細胞型Ｌｙ５．１）に移植した（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（図２）。１２週後に移植マウスの末梢血を採取し、Ｌｙ５．２陽性細胞（ドナー細胞）の割合を調べた。その結果、移植した造血幹細胞のＣＤ６１の有無に関わらず、末梢血内にドナー由来の血球系細胞が約４０％の割合で検出された。その後、レシピエントマウスに再度致死量放射線を照射し、骨髄由来競合細胞（Ｌｙ５．１）を移植して、さらに１２週後に末梢血内のドナー由来細胞の割合を検出した（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）。その結果、野生型の造血幹細胞を移植されたレシピエントマウスでは、約５０％の割合でドナー由来の細胞が検出されるのに対し、ＣＤ６１欠損型の造血幹細胞を移植されたマウスでは、約２０％の割合でしか検出されなかった。ＣＤ６１は、造血幹細胞における増殖能の長期維持に関与していることが示された。
（まとめ）
図３にＣＤ６１（インテグリンβ３サブユニット）に会合する各キナーゼの種類を示す。ＣＤ６１は、ビトロネクチン、オステオポンチン等のリガンドが結合することにより活性化され、細胞内ドメインにシグナル伝達分子である各種キナーゼ群（キナーゼ：タンパク質分子内のチロシン残基をリン酸化する分子）を結合できるようになる。ＣＤ６１に結合・会合するシグナル伝達分子には、Ｆｙｎ、ｃ−Ｓｒｃ、Ｓｙｋといったキナーゼ群が知られている。Ｆｙｎキナーゼは、ＣＤ６１の７４７番目に相当するリン酸化されたチロシン残基を認識して結合したのち、Ｌｎｋ（リンパ球で発現されているアダプタータンパク質）のリン酸化を行い、細胞情報伝達を行う。また、ｃ−Ｓｒｃと呼ばれる癌原遺伝子産物もＣＤ６１に会合し（７４７番目のチロシン残基ではない部位）、Ｆｙｎキナーゼの標的であるＬｎｋ分子を活性化することで、シグナル伝達を行う。このようなシグナル伝達は、細胞増殖能に関与しているＲａｓ（癌原遺伝子から産出されるキナーゼで細胞増殖に深く関与している）の活性化、脂質ラフトの集積を行い、種々の生理活性を引き起こすものと考えている。(Purpose of this example)
(CD34 - KSL: CD34 - c -kit + sca-1 + lineage -)
Hematopoietic stem cells (HSC) are denoted as CD34 - KSL, and the cell surface antigen expression pattern is known as CD34 negative, c-kit positive, and sca-1 positive. In addition, it has been found that there is a population of hematopoietic stem cells in which CD61 (integrin β3 subunit) is highly expressed (FIG. 1).
(CD34 + KSL: CD34 + c -kit + sca-1 + lineage -)
Hematopoietic stem cells (HSCs) reach final differentiation through a plurality of stages (differentiation into various progenitor cells). The group of cells at that stage is called hematopoietic progenitors, and the expression mode of cell surface antigen is expressed as CD34 positive, c-kit positive, and sca-1 positive. In these cell groups, the expression pattern of CD61 is low and is known to be different from hematopoietic stem cells (FIG. 1).
Based on the above findings, the purpose was to analyze the function of CD61 in hematopoietic stem cells.
(Study results)
40 CD34 − KSL cells (hematopoietic stem cells) from wild type (Wt) or CD61 (CD61 − / − ) deficient C57BL / 6 donor mice (cell type Ly5.2; Ly5.2 is a type of cell surface marker) Recipient cells irradiated with lethal dose (cell type Ly5.1) together with 2 × 10 5 bone marrow-derived competitor cells (cell type Ly5.1; having cell surface markers different from donor mice) (Primary Transplantation) (FIG. 2). After 12 weeks, peripheral blood of the transplanted mice was collected, and the proportion of Ly5.2 positive cells (donor cells) was examined. As a result, regardless of the presence or absence of CD61 in the transplanted hematopoietic stem cells, donor-derived hematopoietic cells were detected in the peripheral blood at a rate of about 40%. Thereafter, the recipient mice were again irradiated with a lethal dose of radiation, transplanted with bone marrow-derived competitor cells (Ly5.1), and the proportion of donor-derived cells in the peripheral blood was detected after 12 weeks (Secondary Transplantation). As a result, in recipient mice transplanted with wild-type hematopoietic stem cells, donor-derived cells were detected at a rate of about 50%, whereas in mice transplanted with CD61-deficient hematopoietic stem cells, about 20%. % Was only detected. CD61 has been shown to be involved in long-term maintenance of proliferative capacity in hematopoietic stem cells.
(Summary)
FIG. 3 shows the types of kinases associated with CD61 (integrin β3 subunit). CD61 is activated by the binding of ligands such as vitronectin and osteopontin so that various kinase groups (kinases: molecules that phosphorylate tyrosine residues in protein molecules) that are signaling molecules can bind to intracellular domains. become. Kinase groups such as Fyn, c-Src, and Syk are known as signaling molecules that bind to and associate with CD61. Fyn kinase recognizes and binds to a phosphorylated tyrosine residue corresponding to position 747 of CD61, and then phosphorylates Lnk (an adapter protein expressed in lymphocytes) to transmit cell information. In addition, a proto-oncogene product called c-Src also associates with CD61 (site that is not the 747th tyrosine residue), and activates the Lnk molecule that is the target of Fyn kinase, thereby performing signal transduction. Such signal transduction activates Ras (a kinase produced from an proto-oncogene and deeply involved in cell proliferation) that is involved in cell proliferation ability, accumulates lipid rafts, and has various physiological activities. I think that causes.
野生型（Ｗｔ）あるいはＣＤ６１機能不全型（Ｙ７４７Ａ；７４７番目のチロシン残基をアルギニンに置換させた変異型）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｌｙ５．２）をドナーとして、それぞれ４０個のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞（造血幹細胞）を骨髄から採取・分離した（図４）。分離した細胞群を２ｘ１０５個の骨髄由来競合細胞（Ｌｙ５．１）と共に致死量放射線照射したレシピエントマウス（Ｌｙ５．１）に移植した（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）。１２週後に移植マウスの末梢血を採取し、Ｌｙ５．２陽性細胞（ドナー細胞）の割合を調べた結果、野生型ドナーマウス由来の細胞は４０％の割合で認められたのに対し、機能不全型ドナーマウス由来の細胞は２０％前後しか認められなかった。またレシピエントマウスに再度致死量放射線を照射し、さらに１２週後に末梢血内のドナー由来細胞の割合を検出した（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）。その結果、野生型ドナーマウス由来の細胞は約５０％認められるのに対し、機能不全型ドナーマウス由来の細胞は約１０％しか認められなかった。ＣＤ６１を介したシグナル伝達が造血幹細胞の増殖に重要であることが分かった。Wild type (Wt) or CD61 dysfunctional type (Y747A; mutant in which 747th tyrosine residue is substituted with arginine) C57BL / 6 mice (Ly5.2) as donors, each with 40 CD34 - KSL cells ( Hematopoietic stem cells) were collected and separated from the bone marrow (FIG. 4). The separated cell group was transplanted into a recipient mouse (Ly5.1) irradiated with a lethal dose together with 2 × 10 5 bone marrow-derived competitor cells (Ly5.1) (Primary Transplantation). Twelve weeks later, peripheral blood of the transplanted mice was collected, and the proportion of Ly5.2 positive cells (donor cells) was examined. As a result, 40% of the cells were derived from wild-type donor mice, whereas dysfunction was observed. Only about 20% of cells derived from type donor mice were observed. Recipient mice were again irradiated with a lethal dose of radiation, and after 12 weeks, the proportion of donor-derived cells in the peripheral blood was detected (Secondary Transplantation). As a result, about 50% of cells derived from wild-type donor mice were observed, whereas only about 10% of cells derived from dysfunctional donor mice were observed. Signal transduction via CD61 was found to be important for hematopoietic stem cell proliferation.
幹細胞因子（ＳＣＦ；Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）およびトロンボポエチン（ＴＰＯ：濃度５０ｎｇ／ｍＬ）存在下でＬｙ５．１マウス由来ＣＤ３４−ＫＳＬ細胞（造血幹細胞）を２ｘ１０５個の競合細胞［Ｌｙ５．２］と共に、５日間ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、それら細胞群の増殖能を評価した（図５）。その結果、ＳＣＦおよびＴＰＯ非存在下では、１０％程度のＬｙ５．１陽性細胞しか認められなかったのに対し、ＳＣＦおよびＴＰＯ存在下では５０％の割合でＬｙ５．１陽性細胞が認められた。ＳＣＦおよびＴＰＯがｉｎ ｖｉｔｒｏでの造血幹細胞の増殖能に関与していることが分かった。Ly5.1 mouse-derived CD34-KSL cells (hematopoietic stem cells) in the presence of stem cell factor (SCF; Stem cell factor) and thrombopoietin (TPO:
また、ＳＣＦおよびＴＰＯ存在下でＣＤ６１活性化抗体（２Ｃ９．Ｇ２）を添加し、造血幹細胞の細胞増殖能を評価した（図６）。４０個のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞（造血幹細胞）を、野生型（Ｗｔ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｌｙ５．１）の骨髄から採取・単離し、２Ｃ９．Ｇ２存在下あるいは非存在下で５日間培養し、２ｘ１０５個の競合細胞（Ｌｙ５．２）細胞と共に、致死量放射線照射したレシピエントマウス（Ｌｙ５．２）に移植した。１２週後に移植マウスから末梢血を採取し、Ｌｙ５．１陽性細胞（ドナー由来細胞）の割合を検出した。その結果、陰性対照である新鮮培地のみで培養した細胞群では、１５％程度しかドナー細胞が検出されなかったのに対し、ＳＣＦおよびＴＰＯ存在下で２Ｃ９．Ｇ２抗体を添加した細胞群では約５０％、コントロールＩｇＧ抗体を添加した細胞群が約４０％の割合であることが示された。さらに、ＳＣＦおよびＴＰＯ存在下で２Ｃ９．Ｇ２を添加して５日間培養した造血幹細胞のうち、１０個、５０個、１００個、あるいは５００個の細胞を２ｘ１０５個の競合細胞（Ｌｙ５．２）細胞と共に、致死量放射線照射したレシピエントマウス（Ｌｙ５．２）に移植した。１２週間後にドナー細胞を移植したマウスうち、何匹のマウスでドナー細胞が検出されたかを解析した結果、移植細胞数に依存してドナー由来細胞が検出可能なマウス数が増加した。Ｅｘ ｖｉｔｒｏでも造血幹細胞を増殖でき、その機能にＣＤ６１が関与していることが分かった。以上の結果を図７にまとめる。Further, CD61 activating antibody (2C9.G2) was added in the presence of SCF and TPO to evaluate the cell proliferating ability of hematopoietic stem cells (FIG. 6). 40 CD34-KSL cells (hematopoietic stem cells) were collected and isolated from the bone marrow of wild type (Wt) C57BL / 6 mice (Ly5.1), and 2C9. The cells were cultured in the presence or absence of G2 for 5 days, and transplanted to 2 × 10 5 competitor cells (Ly5.2) cells into recipient mice (Ly5.2) irradiated with a lethal dose of radiation. After 12 weeks, peripheral blood was collected from the transplanted mice, and the proportion of Ly5.1 positive cells (donor-derived cells) was detected. As a result, in the cell group cultured only with the fresh medium as a negative control, only about 15% of the donor cells were detected, whereas 2C9. It was shown that about 50% of the cell group to which the G2 antibody was added and about 40% of the cell group to which the control IgG antibody was added. Furthermore, in the presence of SCF and TPO, 2C9. Among hematopoietic stem cells cultured for 5 days after adding G2, recipients were irradiated with lethal doses of 10, 50, 100, or 500 cells together with 2 × 10 5 competitor cells (Ly5.2) cells. Mice (Ly5.2) were transplanted. As a result of analyzing the number of mice in which donor cells were detected among mice transplanted with donor cells after 12 weeks, the number of mice from which donor-derived cells could be detected increased depending on the number of transplanted cells. It was also found that hematopoietic stem cells can be expanded in Ex vitro and that CD61 is involved in the function. The above results are summarized in FIG.
ＳＣＦのみ存在下、あるいはＴＰＯのみ存在下でＣＤ６１活性化抗体（２Ｃ９．Ｇ２）を添加し、造血幹細胞の増殖能を評価した（図８）。野生型（Ｗｔ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｌｙ５．１）をドナーとして、４０個のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞（造血幹細胞）を骨髄から採取・単離し、ＳＣＦ存在下あるいはＴＰＯ存在下で５日間培養し（２Ｃ９．Ｇ２はともに添加されている）、２ｘ１０５個の競合細胞（Ｌｙ５．２）細胞と共に、致死量放射線照射したレシピエントマウス（Ｌｙ５．２）に移植した。１２週後に移植マウスから末梢血を採取し、Ｌｙ５．１陽性細胞（ドナー由来細胞）の割合を検出した。その結果、ＴＰＯおよび２Ｃ９．Ｇ２存在下において培養した細胞群が最もドナー由来細胞の割合が高いことが示された。ＴＰＯ存在下でＣＤ６１を活性化させたときに、最も高い造血幹細胞の増殖能が示された。CD61 activating antibody (2C9.G2) was added in the presence of SCF alone or in the presence of TPO alone to evaluate the proliferative ability of hematopoietic stem cells (FIG. 8). 40 CD34 - KSL cells (hematopoietic stem cells) were collected from bone marrow using wild-type (Wt) C57BL / 6 mice (Ly5.1) as donors and cultured for 5 days in the presence of SCF or TPO ( 2C9.G2 were added together) and 2 × 10 5 competitor cells (Ly5.2) cells were transplanted into a lethal dose irradiated recipient mouse (Ly5.2). After 12 weeks, peripheral blood was collected from the transplanted mice, and the proportion of Ly5.1 positive cells (donor-derived cells) was detected. As a result, TPO and 2C9. The cell group cultured in the presence of G2 showed the highest percentage of donor-derived cells. When CD61 was activated in the presence of TPO, the highest proliferation ability of hematopoietic stem cells was shown.
ＴＰＯ存在下でＣＤ６１活性化抗体（２Ｃ９．Ｇ２）を添加し、ＣＤ６１機能不全型マウス由来の造血幹細胞の増殖能を評価した（図９）。野生型（Ｗｔ）あるいはＣＤ６１機能不全型（Ｙ７４７Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｌｙ５．２）をドナーとして、ぞれぞれ４０個のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞（造血幹細胞）を骨髄から採取・単離し、ＴＰＯおよび２Ｃ９．Ｇ２存在下で５日間培養し、２ｘ１０５個の競合細胞（Ｌｙ５．１）細胞と共に、致死量放射線照射したレシピエントマウス（Ｌｙ５．１）に移植した。１２週後に移植マウスから末梢血を採取し、Ｌｙ５．２陽性細胞（ドナー由来細胞）の割合を検出した。その結果、野生型ドナーマウス由来の細胞は２Ｃ９．Ｇ２存在下で約５０％の割合で検出されるのに対し、ＣＤ６１機能不全型ドナーマウス由来細胞は２Ｃ９．Ｇ２抗体存在下でも１０％程度しか検出されなかった。ＴＰＯ存在下での造血幹細胞の増殖にはＣＤ６１の活性化が必要であることが示された。CD61 activating antibody (2C9.G2) was added in the presence of TPO to evaluate the proliferative ability of hematopoietic stem cells derived from CD61 dysfunctional mice (FIG. 9). 40 CD34-KSL cells (hematopoietic stem cells) were collected and isolated from bone marrow using wild type (Wt) or CD61 dysfunctional type (Y747A) C57BL / 6 mice (Ly5.2) as donors, and TPO And 2C9. The cells were cultured in the presence of G2 for 5 days, and transplanted together with 2 × 10 5 competitor cells (Ly5.1) into recipient mice (Ly5.1) irradiated with a lethal dose of radiation. After 12 weeks, peripheral blood was collected from the transplanted mice, and the proportion of Ly5.2 positive cells (donor-derived cells) was detected. As a result, cells derived from wild-type donor mice were 2C9. CD61 dysfunctional donor mouse-derived cells are detected in 2C9. Only about 10% was detected even in the presence of the G2 antibody. Proliferation of hematopoietic stem cells in the presence of TPO was shown to require CD61 activation.
ＴＰＯ存在下でＣＤ６１のリガンドであるビトロネクチンやオステオポンチンを作用させ、造血幹細胞の増殖能を評価した（図１０）。ビトロネクチン（濃度：５μｇ／ｍＬ）およびオステオポンチン（濃度：５μｇ／ｍＬ）はマンガンイオンの存在下で作用させた。野生型（Ｗｔ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｌｙ５．１）をドナーとして、４０個のＣＤ３４−ＫＳＬ細胞（造血幹細胞）を骨髄から採取・単離し、ＴＰＯおよびビトロネクチン、あるいはオステオポンチン存在下で５日間培養し、２ｘ１０５個の競合細胞（Ｌｙ５．２）細胞と共に、致死量放射線照射したレシピエントマウス（Ｌｙ５．２）に移植した。１２週後に移植マウスから末梢血を採取し、Ｌｙ５．２陽性細胞（ドナー由来細胞）の割合を検出した。その結果、陰性対照（ＢＳＡ存在下）では２０％程度のドナー細胞しか検出されなかったが、ビトロネクチンやオステオポンチン存在下では、４０％程度のドナー細胞が検出された。ＣＤ６１のリガンドであるビトロネクチンやオステオポンチンを作用させた場合、造血幹細胞の増殖能が促進されることが示された。In the presence of TPO, vitronectin and osteopontin, which are CD61 ligands, were allowed to act to evaluate the proliferative ability of hematopoietic stem cells (FIG. 10). Vitronectin (concentration: 5 μg / mL) and osteopontin (concentration: 5 μg / mL) were allowed to act in the presence of manganese ions. 40 CD34 - KSL cells (hematopoietic stem cells) were collected from bone marrow using wild type (Wt) C57BL / 6 mice (Ly5.1) as donors and cultured for 5 days in the presence of TPO and vitronectin or osteopontin. 2 × 10 5 competitor cells (Ly5.2) cells were transplanted together with lethal dose irradiated recipient mice (Ly5.2). After 12 weeks, peripheral blood was collected from the transplanted mice, and the proportion of Ly5.2 positive cells (donor-derived cells) was detected. As a result, only about 20% of donor cells were detected in the negative control (in the presence of BSA), but about 40% of donor cells were detected in the presence of vitronectin and osteopontin. It was shown that the proliferation ability of hematopoietic stem cells was promoted when vitronectin and osteopontin, which are CD61 ligands, were allowed to act.
以上の実施例をまとめると図１１のようになる。培地中に存在するトロンボポエチンが組織幹細胞のｃ−ｍｐｌ受容体に結合するだけであると、その幹細胞が***、分化する方が、幹細胞が未分化の状態で冉増殖することより優先されることが分かった。一方、そのトロンボポエチンが組織幹細胞のｃ−ｍｐｌ受容体に結合し際、β−３インテグリンシグナルを誘導させる物質が幹細胞に作用すると、上のときとは逆に幹細胞が未分化の状態で再増殖することの方がその幹細胞が***、分化することが分かった。すなわち、組織幹細胞をトロンボポエチン存在下において、β−３インテグリンシグナルを誘導させれば、培養した幹細胞は未分化の状態で増殖できることが分かった。 The above embodiment is summarized as shown in FIG. If the thrombopoietin present in the medium only binds to the c-mpl receptor of the tissue stem cell, it is preferred that the stem cell divides and differentiates over that the stem cell proliferates in an undifferentiated state. I understood. On the other hand, when the thrombopoietin binds to the c-mpl receptor of the tissue stem cell, if a substance that induces β-3 integrin signal acts on the stem cell, the stem cell reproliferates in an undifferentiated state contrary to the above case. It turns out that the stem cells divide and differentiate. That is, it was found that cultured stem cells can proliferate in an undifferentiated state by inducing a β-3 integrin signal in the presence of thrombopoietin in the presence of thrombopoietin.
本発明の培養方法を利用すれば、組織幹細胞を未分化の状態で増殖させられる。この培養方法を利用すると組織幹細胞を生体外でさまざまな形態の細胞集合体にすることができるようになり、再生医療分野においても極めて有用な基盤技術となる。 If the culture method of the present invention is used, tissue stem cells can be proliferated in an undifferentiated state. When this culture method is used, tissue stem cells can be made into cell aggregates of various forms in vitro, which is an extremely useful basic technology in the field of regenerative medicine.
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