JPWO2020067435A1 - Method for sheeting pluripotent stem cell-derived cells - Google Patents
Method for sheeting pluripotent stem cell-derived cells Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2020067435A1 JPWO2020067435A1 JP2020549441A JP2020549441A JPWO2020067435A1 JP WO2020067435 A1 JPWO2020067435 A1 JP WO2020067435A1 JP 2020549441 A JP2020549441 A JP 2020549441A JP 2020549441 A JP2020549441 A JP 2020549441A JP WO2020067435 A1 JPWO2020067435 A1 JP WO2020067435A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- culture
- sheet
- cell population
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 531
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 161
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 55
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims abstract description 52
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 46
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 42
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 40
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 39
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 32
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 76
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 38
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 35
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 27
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 22
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 22
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 11
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 abstract description 23
- 230000008014 freezing Effects 0.000 abstract description 23
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 45
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 28
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 24
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 19
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 14
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 14
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 13
- 239000003590 rho kinase inhibitor Substances 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 12
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 11
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960000455 brentuximab vedotin Drugs 0.000 description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 7
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 5
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000003926 acrylamides Chemical class 0.000 description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- -1 1-oxo-2-methyl-2-propenyl Chemical group 0.000 description 3
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010044023 Ki-1 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 3
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 3
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 2
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 206010007558 Cardiac failure chronic Diseases 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 2
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 2
- QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N Vinyl ether Chemical class C=COC=C QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 2
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 2
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 2
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 2
- IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N [4-[[(2S)-5-(carbamoylamino)-2-[[(2S)-2-[6-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)hexanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]pentanoyl]amino]phenyl]methyl N-[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1S,2R)-1-hydroxy-1-phenylpropan-2-yl]amino]-1-methoxy-2-methyl-3-oxopropyl]pyrrolidin-1-yl]-3-methoxy-5-methyl-1-oxoheptan-4-yl]-methylamino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]-N-methylcarbamate Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H]([C@@H](CC(=O)N1CCC[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)c1ccccc1)OC)N(C)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)OCc1ccc(NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCCN2C(=O)CCC2=O)C(C)C)cc1)C(C)C IEDXPSOJFSVCKU-HOKPPMCLSA-N 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 108010015046 cell aggregation factors Proteins 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000009091 contractile dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- XJRBAMWJDBPFIM-UHFFFAOYSA-N methyl vinyl ether Chemical compound COC=C XJRBAMWJDBPFIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- OVHHHVAVHBHXAK-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylprop-2-enamide Chemical compound CCN(CC)C(=O)C=C OVHHHVAVHBHXAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000004683 skeletal myoblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLPJNCYCZORXHG-UHFFFAOYSA-N 1-morpholin-4-ylprop-2-en-1-one Chemical compound C=CC(=O)N1CCOCC1 XLPJNCYCZORXHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RESPXSHDJQUNTN-UHFFFAOYSA-N 1-piperidin-1-ylprop-2-en-1-one Chemical compound C=CC(=O)N1CCCCC1 RESPXSHDJQUNTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLPAQAXAZQUXBG-UHFFFAOYSA-N 1-pyrrolidin-1-ylprop-2-en-1-one Chemical compound C=CC(=O)N1CCCC1 WLPAQAXAZQUXBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RASDUGQQSMMINZ-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1-piperidin-1-ylprop-2-en-1-one Chemical compound CC(=C)C(=O)N1CCCCC1 RASDUGQQSMMINZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVCMKNCJDCTPIB-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-1-pyrrolidin-1-ylprop-2-en-1-one Chemical compound CC(=C)C(=O)N1CCCC1 LVCMKNCJDCTPIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQIGLEFUZMIVHU-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C(C)=C YQIGLEFUZMIVHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 208000019399 Colonic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 201000010046 Dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- 206010048858 Ischaemic cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 208000016222 Pancreatic disease Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 108090000184 Selectins Proteins 0.000 description 1
- 102000003800 Selectins Human genes 0.000 description 1
- 108010013296 Sericins Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000029033 Spinal Cord disease Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 108010023082 activin A Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- DMLAVOWQYNRWNQ-UHFFFAOYSA-N azobenzene Chemical group C1=CC=CC=C1N=NC1=CC=CC=C1 DMLAVOWQYNRWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000003320 cell separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N dorsomorphin Chemical compound C=1C=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C=CN=CC=2)C=CC=1OCCN1CCCCC1 XHBVYDAKJHETMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 108010038862 laminin 10 Proteins 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000003738 lymphoid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001704 mesoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108010093470 monomethyl auristatin E Proteins 0.000 description 1
- KAKALCZDCFZYRN-UHFFFAOYSA-N n-(2-ethoxyethyl)-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CCOCCNC(=O)C(C)=C KAKALCZDCFZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLQHOUDDHYMERA-UHFFFAOYSA-N n-(2-ethoxyethyl)prop-2-enamide Chemical compound CCOCCNC(=O)C=C YLQHOUDDHYMERA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPEKHIHQXHOSRM-UHFFFAOYSA-N n-(oxolan-2-ylmethyl)prop-2-enamide Chemical compound C=CC(=O)NCC1CCCO1 KPEKHIHQXHOSRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FIBUWQFQYAAXHD-UHFFFAOYSA-N n-cyclopropyl-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CC(=C)C(=O)NC1CC1 FIBUWQFQYAAXHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LCXIFAOALNZGDO-UHFFFAOYSA-N n-cyclopropylprop-2-enamide Chemical compound C=CC(=O)NC1CC1 LCXIFAOALNZGDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIWDVJPPVMGJGR-UHFFFAOYSA-N n-ethyl-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CCNC(=O)C(C)=C ZIWDVJPPVMGJGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWPMNMYLORDLJE-UHFFFAOYSA-N n-ethylprop-2-enamide Chemical compound CCNC(=O)C=C SWPMNMYLORDLJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000001711 oxyntic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229940068984 polyvinyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N prometryn Chemical compound CSC1=NC(NC(C)C)=NC(NC(C)C)=N1 AAEVYOVXGOFMJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N propane-1,1-diol Chemical compound CCC(O)O ULWHHBHJGPPBCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 1
- 102000000568 rho-Associated Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010041788 rho-Associated Kinases Proteins 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
Abstract
多能性幹細胞由来の分化誘導細胞から高品質な移植片を製造する方法、当該方法を用いて製造された移植片、当該移植片を用いた疾患の処置方法などを提供することを目的とする。（ａ）多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を含む細胞集団において、未分化細胞除去操作を実施する工程および任意に細胞集団を凍結し、その後解凍する工程、ならびに（ｂ）前記工程（ａ）で得られた細胞集団を培養基材に播種し、移植片形成培養する工程を含む、移植片の製造方法等により、上記課題が解決された。It is an object of the present invention to provide a method for producing a high-quality graft from a differentiation-inducing cell derived from a pluripotent stem cell, a graft manufactured by the method, a method for treating a disease using the graft, and the like. .. (A) A step of performing an undifferentiated cell removal operation in a cell population containing differentiation-inducing cells derived from pluripotent stem cells, a step of optionally freezing the cell population, and then thawing, and (b) the step (a). The above-mentioned problems were solved by a method for producing a transplant, which includes a step of seeding the cell population obtained in 1 above on a culture substrate and forming and culturing the transplant.
Description
本開示は、平成３０年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構 再生医療実現拠点ネットワークプログラム 疾患・組織別実用化研究拠点（拠点Ａ）「ｉＰＳ細胞を用いた心筋再生治療創成拠点」に係る委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願であって、多能性幹細胞由来の分化誘導細胞から細胞を含有する移植片、例えばシート状細胞培養物を製造する方法、当該方法を用いて製造されたシート状細胞培養物などの移植片、当該シート状細胞培養物などの移植片を用いた疾患の処置方法などに関する。 This disclosure was commissioned in 2018 by the National Research and Development Organization Japan Medical Research and Development Organization Regenerative Medicine Realization Center Network Program Disease / Tissue Practical Application Research Center (Center A) "Center for the Creation of Myocardial Regenerative Medicine Using iPS Cells" A method for producing a cell-containing transplant, for example, a sheet-like cell culture, from a differentiation-inducing cell derived from pluripotent stem cells, which is a patent application to which Article 19 of the Research and Development and Industrial Technology Enhancement Law is applied. The present invention relates to a transplant piece such as a sheet-shaped cell culture produced by the method, a method for treating a disease using the transplant piece such as the sheet-shaped cell culture, and the like.
成体の心筋細胞は自己複製能に乏しく、心筋組織が損傷を受けた場合、その修復は極めて困難である。近年、損傷した心筋組織の修復のために、細胞工学的手法により作製した心筋細胞を含む移植片を患部に移植する試みが行われている（特許文献１、非特許文献１）。かかる移植片の作製に用いる心筋細胞の供給源として最近注目されているのが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞から誘導した心筋細胞であり、このような多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物の作製や動物での治療実験が試みられている（非特許文献２〜３）。しかしながら、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物の開発は始まったばかりであり、その機能的特性や、それに影響する因子などについては依然不明な部分が多い。
Adult cardiomyocytes have poor self-renewal ability, and when myocardial tissue is damaged, its repair is extremely difficult. In recent years, in order to repair damaged myocardial tissue, attempts have been made to transplant a graft containing cardiomyocytes prepared by a cell engineering method into an affected area (
多能性幹細胞から生体移植の用途に供する細胞を分化誘導する場合、得られる細胞集団中に存在する未分化状態の幹細胞は造腫瘍性を有しているため、未分化細胞の残存は大きな問題となる。そこで、多能性幹細胞から目的細胞を分化誘導した後、未分化状態の幹細胞を除去するために様々な方法が研究されている（特許文献２〜４）。
When inducing differentiation of pluripotent stem cells for use in living body transplantation, the survival of undifferentiated cells is a major problem because the undifferentiated stem cells present in the obtained cell population have tumorigenicity. It becomes. Therefore, various methods have been studied for removing undifferentiated stem cells after inducing differentiation of target cells from pluripotent stem cells (
本開示は、多能性幹細胞由来の分化誘導細胞から高品質な移植片、例えばシート状細胞培養物を製造する方法、当該方法を用いて製造された移植片、当該移植片を用いた疾患の処置方法などを提供することを目的とする。 The present disclosure describes a method for producing a high-quality graft, for example, a sheet-like cell culture from pluripotent stem cell-derived differentiation-inducing cells, a graft produced using the method, and a disease using the graft. The purpose is to provide treatment methods and the like.
多能性幹細胞から分化誘導した細胞を臨床応用する場合、基礎研究の段階では求められない様々な条件が求められる。例えば、生体移植用の細胞集団を調製するにあたっては、材料から用いる試薬に至るまですべて移植の用途に用い得る、すなわちゼノフリーであることが求められ、また分化誘導され、生体移植用に調製された細胞集団は、未分化細胞の残存率が極力低いことや、凍結保存できることが求められる。 When clinically applying cells induced to differentiate from pluripotent stem cells, various conditions that are not required at the stage of basic research are required. For example, in preparing a cell population for living body transplantation, everything from materials to reagents used is required to be usable for transplantation, that is, to be xenofree, and differentiation is induced to prepare for living body transplantation. The cell population is required to have an extremely low survival rate of undifferentiated cells and to be able to be cryopreserved.
本発明者らは、多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いた生体移植用のシート状細胞培養物を研究する中で、臨床応用に耐え得るシート状細胞培養物を製造しようとすると、従来の方法では高品質なシート状細胞培養物を製造することが困難であるという新たな課題に直面した。そこでかかる課題を解決すべく研究を進める中で、臨床用に用いるために未分化細胞を除去したり、凍結保存したりする工程において、細胞のバイアビリティが低下するためにシート状細胞培養物の製造が困難となっているという新たな知見を見出した。 While studying sheet-shaped cell cultures for living body transplantation using pluripotent stem cell-derived myocardial cells, the present inventors have tried to produce sheet-shaped cell cultures that can withstand clinical application. The method faced a new challenge that it was difficult to produce high quality sheet cell cultures. Therefore, while conducting research to solve this problem, sheet-like cell cultures are used to reduce the viability of cells in the process of removing undifferentiated cells for clinical use or cryopreserving them. We found a new finding that manufacturing is difficult.
かかる知見に基づいてさらに研究を進め、従来知られた移植片形成方法とは異なる条件での移植片形成培養を行うことにより、臨床応用に耐え得る高品質な移植片、例えばシート状細胞培養物を製造することが可能であることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成させるに至った。 Based on this finding, further research is carried out, and by performing graft formation culture under conditions different from those of conventionally known graft formation methods, high-quality grafts that can withstand clinical application, such as sheet-like cell cultures, are used. As a result of finding that it is possible to manufacture the above-mentioned material and further researching it, the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、下記に掲げるものに関する：
［１］シート形成細胞を含む細胞集団を培養基材に播種してシート化することを含む、シート状細胞培養物の製造方法であって、前記細胞集団から死細胞を除去する工程を含む、前記方法。
［２］死細胞の除去が、フィルター処理により行われる、［１］の方法。
［３］フィルター処理が、５００μｍ以下のポアサイズを有するフィルターにより行われる、［２］の方法。
［４］シート化する前に、細胞集団を接着培養基材に播種して培養した後、該細胞集団を回収する工程をさらに含む、［１］〜［３］に記載の方法。
［５］シート形成細胞が、多能性幹細胞由来の分化誘導細胞である、［１］〜［４］に記載の方法。
［６］多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、［５］の方法。
［７］シート形成細胞が、筋芽細胞または心筋細胞である、［１］〜［６］の方法。
［８］細胞集団が、コンフルエントに達する密度で培養基材に播種される、［１］〜［７］の方法。
［９］細胞集団が、凍結保存後に解凍されたものである、［１］〜［８］の方法。
［１０］（ａ）多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団において、少なくとも１種の未分化細胞除去操作を実施する工程、
（ｂ）（ａ）で得られた細胞集団を凍結保存する工程、
（ｃ）（ｂ）で凍結保存した細胞集団を解凍する工程、
（ｄ）（ｃ）で解凍した細胞集団をフィルター処理する工程、および
（ｅ）（ｄ）でフィルター処理した細胞集団を、コンフルエントに達する密度で培養基材に播種し、シート化培養する工程、
を含む、シート状細胞培養物の製造方法。
［１１］（ｃ）から（ｅ）までの間、細胞を増殖させないことを特徴とする、［１０］の方法。
［１２］（ａ）の後かつ（ｅ）の前に、細胞集団を培養基材に播種して接着培養し、その後細胞集団を回収する工程をさらに含む、［１０］または［１１］の方法。
［１３］（Ａ）多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を含む細胞集団において、少なくとも１種の未分化細胞除去操作を実施する工程、
（Ｂ）（Ａ）で得られた細胞集団を凍結保存する工程、および
（Ｃ）（Ｂ）の凍結保存細胞を解凍して得られる細胞集団を、コンフルエントに達する密度で培養基材に播種し、シート化培養する工程、
を含む、シート状細胞培養物の製造方法。
［１４］多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、［１３］の方法。
［１５］分化誘導細胞が、心筋細胞である、［１３］または［１４］の方法。
［１６］（Ａ）の後かつ（Ｃ）の前に、細胞集団を接着培養基材に播種して培養した後、該細胞集団を回収する工程をさらに含む、［１３］〜［１５］の方法。
［１７］（Ａ）において、２種以上の異なる未分化細胞除去操作が実施される、［１３］〜［１６］の方法。
［１８］コンフルエントに達する密度が、０．４０〜２．３３×１０６個／ｃｍ２である、［１３］〜［１７］の方法。
［１９］シート化培養が、２〜３日間行われる、［１３］〜［１８］の方法。
［２０］シート化培養において、１日目の培養に用いるシート化媒体にＲｈｏキナーゼ阻害剤が含まれる、［１３］〜［１９］の方法。
［２１］（ａ）多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団において、少なくとも１種の未分化細胞除去操作を実施する工程、
（ｂ）（ａ）で得られた細胞集団を凍結保存する工程、
（ｃ）（ｂ）で凍結保存した細胞集団を解凍する工程、
（ｄ）（ｃ）で解凍した細胞集団をフィルター処理する工程、および
（ｅ）（ｄ）でフィルター処理した細胞集団を、コンフルエントに達する密度で培養基材に播種し、シート化培養する工程、
を含む、［１３］〜［２０］の方法。
［２２］（ｃ）から（ｅ）までの間、細胞を増殖させないことを特徴とする、［２１］に記載の方法。
［２３］（ａ）の後かつ（ｅ）の前に、細胞集団を培養基材に播種して接着培養し、その後細胞集団を回収する工程をさらに含む、［２１］または［２２］の方法。
［２４］（Ａ）多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を含む細胞集団において、少なくとも２種の異なる未分化細胞除去操作を実施する工程、および
（Ｂ）（Ａ）で得られた細胞集団を、培養基材に播種し、移植片形成培養する工程、
を含む、シート状細胞培養物の製造方法。
［２５］多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、［２４］の方法。
［２６］分化誘導細胞が、心筋細胞である、［２４］または［２５］の方法。
［２７］（Ａ）の後、細胞集団を接着培養基材に播種して培養した後、該細胞集団を回収する工程をさらに含む、［２４］〜［２６］の方法。
［２８］（Ａ）の後、細胞集団が凍結保存される、［２４］〜［２７］の方法。
［２９］移植片が、シート状細胞培養物であり、（Ｂ）において、細胞集団が、コンフルエントに達する密度で播種される、［２４］〜［２８］の方法。
［３０］コンフルエントに達する密度が、０．４０〜２．３３×１０６個／ｃｍ２である、［２９］に記載の方法。
［３１］移植片形成培養が、２〜３日間行われる、［２９］または［３０］の方法。
［３２］シート化培養において、１日目のシート化培養に用いるシート化媒体にＲｈｏキナーゼ阻害剤が含まれる、［２９］〜［３１］の方法。
［３３］未分化細胞除去操作が、熱処理法、無糖培養法および特異抗体を用いる方法からなる群から選択される少なくとも２種である、［２４］〜［３２］の方法。
［３４］（ａ）多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団において、少なくとも２種の未分化細胞除去操作を実施する工程、
（ｂ）（ａ）で得られた細胞集団を凍結保存する工程、
（ｃ）（ｂ）で凍結保存した細胞集団を解凍する工程、
（ｄ）（ｃ）で解凍した細胞集団をフィルター処理する工程、および
（ｅ）（ｄ）でフィルター処理した細胞集団を、コンフルエントに達する密度で培養基材に播種し、シート化培養する工程、
を含む、［２４］〜［３３］に記載の方法。
［３５］（ｃ）から（ｅ）までの間、細胞を増殖させないことを特徴とする、［３４］の方法。
［３６］（ａ）の後かつ（ｅ）の前に、細胞集団を培養基材に播種して接着培養し、その後細胞集団を回収する工程をさらに含む、［３４］または［３５］の方法。
［３７］（ｉ）胚様体を分散して細胞集団を得る工程、
（ｉｉ）（ｉ）で得られた細胞集団を、培養基材に播種して接着培養した後、該細胞集団を回収する工程、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた細胞集団を、培養基材に播種し、移植片形成培養する工程、
を含む、移植片の製造方法。
［３８］（ｉｉ）の後、得られた細胞集団を凍結保存することをさらに含む、［３７］に記載の方法。That is, the present invention relates to the following:
[1] A method for producing a sheet-like cell culture, which comprises seeding a cell population containing sheet-forming cells on a culture medium to form a sheet, which comprises a step of removing dead cells from the cell population. The method.
[2] The method of [1], wherein the removal of dead cells is performed by filtering.
[3] The method of [2], wherein the filtering is performed by a filter having a pore size of 500 μm or less.
[4] The method according to [1] to [3], further comprising a step of seeding and culturing a cell population on an adhesive culture substrate before forming a sheet, and then recovering the cell population.
[5] The method according to [1] to [4], wherein the sheet-forming cells are pluripotent stem cell-derived differentiation-inducing cells.
[6] The method of [5], wherein the pluripotent stem cells are human iPS cells.
[7] The methods of [1] to [6], wherein the sheet-forming cells are myoblasts or cardiomyocytes.
[8] The method of [1] to [7], wherein the cell population is seeded on the culture medium at a density reaching confluence.
[9] The methods [1] to [8], wherein the cell population is thawed after cryopreservation.
[10] (a) A step of performing at least one undifferentiated cell removal operation in a cell population containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
(B) The step of cryopreserving the cell population obtained in (a),
(C) The step of thawing the cell population cryopreserved in (b),
(D) A step of filtering the cell population thawed in (c), and a step of seeding the cell population filtered in (e) (d) on a culture medium at a density reaching confluence and culturing in a sheet.
A method for producing a sheet-shaped cell culture, including.
[11] The method of [10], characterized in that cells are not proliferated between (c) and (e).
[12] The method according to [10] or [11], further comprising a step of seeding the cell population on a culture medium and adhering to the culture medium after (a) and before (e), and then recovering the cell population. ..
[13] (A) A step of performing at least one undifferentiated cell removal operation in a cell population containing differentiation-inducing cells derived from pluripotent stem cells.
(B) The step of cryopreserving the cell population obtained in (A) and the cell population obtained by thawing the cryopreserved cells of (C) (B) are seeded on a culture substrate at a density reaching confluence. , Sheet culturing process,
A method for producing a sheet-shaped cell culture, including.
[14] The method of [13], wherein the pluripotent stem cells are iPS cells.
[15] The method of [13] or [14], wherein the differentiation-inducing cell is a cardiomyocyte.
[16] A. Of [13] to [15], further comprising a step of seeding and culturing the cell population on an adhesive culture substrate after (A) and before (C), and then recovering the cell population. Method.
[17] The method of [13] to [16], wherein two or more different undifferentiated cell removal operations are performed in (A).
[18] The method of [13] to [17], wherein the density reaching the confluence is 0.40 to 2.33 × 10 6 pieces / cm 2.
[19] The method of [13] to [18], wherein the sheet-forming culture is carried out for 2 to 3 days.
[20] The methods of [13] to [19], wherein the sheeting medium used for the culture on the first day contains a Rho-kinase inhibitor in the sheeting culture.
[21] (a) A step of performing at least one undifferentiated cell removal operation in a cell population containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
(B) The step of cryopreserving the cell population obtained in (a),
(C) The step of thawing the cell population cryopreserved in (b),
(D) A step of filtering the cell population thawed in (c), and a step of seeding the cell population filtered in (e) (d) on a culture medium at a density reaching confluence and culturing in a sheet.
The method of [13] to [20] including.
[22] The method according to [21], wherein the cells are not proliferated between (c) and (e).
[23] The method of [21] or [22], further comprising the step of seeding the cell population on a culture medium and adhering to the culture medium after (a) and before (e), and then recovering the cell population. ..
[24] (A) In a cell population containing pluripotent stem cell-derived differentiation-inducing cells, a step of performing at least two different undifferentiated cell removal operations, and (B) the cell population obtained in (A). , The process of seeding on a culture substrate and culturing the implants,
A method for producing a sheet-shaped cell culture, including.
[25] The method of [24], wherein the pluripotent stem cells are iPS cells.
[26] The method of [24] or [25], wherein the differentiation-inducing cell is a cardiomyocyte.
[27] The method of [24] to [26], further comprising a step of seeding the cell population on an adhesive culture substrate after (A), culturing the cell population, and then recovering the cell population.
[28] The method of [24] to [27], wherein the cell population is cryopreserved after (A).
[29] The method of [24]-[28], wherein the implant is a sheet cell culture and in (B) the cell population is seeded at a density that reaches confluence.
[30] The method according to [29], wherein the density reaching confluence is 0.40 to 2.33 × 10 6 pieces / cm 2.
[31] The method of [29] or [30], wherein the graft-forming culture is carried out for 2 to 3 days.
[32] The methods of [29] to [31], wherein the sheeting medium used for the sheeting culture on the first day contains a Rho kinase inhibitor in the sheeting culture.
[33] The method of [24] to [32], wherein the undifferentiated cell removal operation is at least two selected from the group consisting of a heat treatment method, a sugar-free culture method, and a method using a specific antibody.
[34] (a) A step of performing at least two undifferentiated cell removal operations in a cell population containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
(B) The step of cryopreserving the cell population obtained in (a),
(C) The step of thawing the cell population cryopreserved in (b),
(D) A step of filtering the cell population thawed in (c), and a step of seeding the cell population filtered in (e) (d) on a culture medium at a density reaching confluence and culturing in a sheet.
The method according to [24] to [33], which comprises.
[35] The method of [34], characterized in that cells are not proliferated between (c) and (e).
[36] The method according to [34] or [35], further comprising the step of seeding the cell population on a culture medium and adhering to the culture medium after (a) and before (e), and then recovering the cell population. ..
[37] (i) Step of dispersing embryoid bodies to obtain a cell population,
(Ii) The step of collecting the cell population after seeding the cell population obtained in (ii) on a culture medium and adhering to the culture medium, and culturing the cell population obtained in (iii) (ii). The process of sowing on a substrate and culturing to form implants,
A method for producing a graft, including.
[38] The method of [37], further comprising cryopreserving the resulting cell population after (ii).
本発明によれば、多能性幹細胞から分化誘導した臨床用の細胞集団から、従来よりも高品質な移植片、例えばシート状細胞培養物を高効率に製造することができる。特に未分化細胞の残存率を極力低減させることができ、細胞集団を凍結保存した場合であっても、品質を低減することなく移植片、例えばシート状細胞培養物を製造することが可能となるため、生体移植用に非常に好適な移植片を提供することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to efficiently produce a higher quality graft, for example, a sheet-like cell culture, from a clinical cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells. In particular, the residual rate of undifferentiated cells can be reduced as much as possible, and even when the cell population is cryopreserved, it becomes possible to produce a graft, for example, a sheet-shaped cell culture without reducing the quality. Therefore, it is possible to provide a very suitable graft for living body transplantation.
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Unless defined otherwise herein, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as those commonly understood by one of ordinary skill in the art. All patents, applications and other publications and information referenced herein are hereby incorporated by reference in their entirety. In the event of a conflict between the publications referred to herein and the description herein, the description herein shall prevail.
本開示において、「多能性幹細胞」は、当該技術分野で周知の用語であり、三胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉および外胚葉に属する全ての系列の細胞に分化することができる能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞の非限定例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。ここで、ｉＰＳ細胞とは、遺伝子を導入することにより誘導された、分化万能性および自己複製能を有する細胞である。通常多能性幹細胞を特定の細胞に分化誘導する際には、まず多能性幹細胞を浮遊培養して、上記三胚葉のいずれかの細胞の凝集体（以下、「胚様体」という場合がある）を形成し、その後凝集体を形成する細胞を目的とする特定の細胞に分化誘導させる。 In the present disclosure, "pluripotent stem cell" is a well-known term in the art and has the ability to differentiate into three germ layers, i.e. cells of all lineages belonging to endoderm, mesoderm and ectoderm. Means a cell. Non-limiting examples of pluripotent stem cells include, for example, embryonic stem cells (ES cells), nuclear-transplanted embryonic stem cells (ntES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the like. Here, the iPS cell is a cell having pluripotency and self-renewal ability induced by introducing a gene. Normally, when inducing differentiation of pluripotent stem cells into specific cells, the pluripotent stem cells are first suspended and cultured, and then an aggregate of any of the above three germ layers (hereinafter, referred to as "embryonic body"). There is), and then the cells that form aggregates are induced to differentiate into specific cells of interest.
本開示において、「多能性幹細胞由来の分化誘導細胞」は、多能性幹細胞から特定の種類の細胞に分化するように分化誘導処理された任意の細胞を意味する。分化誘導細胞の非限定例は、心筋細胞、骨格筋芽細胞などの筋肉系の細胞、ニューロン細胞、オリゴデンドロサイト、ドーパミン産生細胞などの神経系の細胞、網膜色素上皮細胞などの網膜細胞、血球細胞、骨髄細胞などの造血系の細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞などの免疫関連の細胞、肝細胞、膵β細胞、腎細胞などの臓器を構成する細胞、軟骨細胞、生殖細胞などの他、これらの細胞に分化する前駆細胞や体性幹細胞などを含む。かかる前駆細胞や体性幹細胞の典型例としては、例えば心筋細胞における間葉系幹細胞、多分化性心臓前駆細胞、単能性心臓前駆細胞、神経系の細胞における神経幹細胞、造血系の細胞や免疫関連の細胞における造血幹細胞およびリンパ系幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞の分化誘導は、既知の任意の手法を用いて行うことができる。例えば、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導は、Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015やＷＯ２０１４／１８５３５８に記載の手法に基づいて行うことができる。 In the present disclosure, "pluripotent stem cell-derived differentiation-inducing cell" means any cell that has been subjected to differentiation-inducing treatment so as to differentiate from a pluripotent stem cell into a specific type of cell. Non-limiting examples of differentiation-inducing cells include muscular cells such as myocardial cells and skeletal myoblasts, neural cells such as neuron cells, oligodendrocytes and dopamine-producing cells, retinal cells such as retinal pigment epithelial cells, and blood cells. Hematopoietic cells such as cells and bone marrow cells, immune-related cells such as T cells, NK cells, NKT cells, dendritic cells and B cells, cells constituting organs such as hepatocytes, pancreatic β cells and renal cells, In addition to cartilage cells and germ cells, it also includes precursor cells and somatic stem cells that differentiate into these cells. Typical examples of such progenitor cells and somatic stem cells include mesenchymal stem cells in myocardial cells, pluripotent cardiac progenitor cells, monopoly cardiac progenitor cells, neural stem cells in neural cells, hematopoietic cells and immunity. Examples include hematopoietic stem cells and lymphoid stem cells in related cells. Induction of differentiation of pluripotent stem cells can be performed using any known method. For example, the induction of differentiation of pluripotent stem cells into cardiomyocytes can be performed based on the method described in Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015 and WO 2014/185358.
例えばヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を得る方法としては、以下のステップ：
（１）樹立されたヒトｉＰＳ細胞を、フィーダー細胞を含まない培養液で維持培養するステップ（フィーダーフリー法）、
（２）得られたｉＰＳ細胞から胚様体（中胚葉細胞を含む胚様体）を形成するステップ、
（３）得られた胚様体をアクチビンＡ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）４および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する培養液中で培養するステップ、
（４）得られた胚様体をＷｎｔ阻害剤、ＢＭＰ４阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤を含む培養液中で培養するステップ、および
（５）得られた胚様体をＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む培養液中で培養するステップ
を含む方法が例示される。For example, as a method for obtaining cardiomyocytes from human iPS cells, the following steps:
(1) A step of maintaining and culturing established human iPS cells in a culture medium containing no feeder cells (feeder-free method),
(2) A step of forming an embryoid body (embryoid body including mesoderm cells) from the obtained iPS cells.
(3) A step of culturing the obtained embryo-like body in a culture medium containing activin A, bone morphogenetic protein (BMP) 4, and basic fibroblast growth factor (bFGF).
(4) The step of culturing the obtained embryoid body in a culture medium containing a Wnt inhibitor, a BMP4 inhibitor and a TGFβ inhibitor, and (5) the obtained embryoid body in a culture medium containing VEGF and bFGF. A method comprising the step of culturing in is exemplified.
（１）のステップにおいて、例えばＷＯ２０１７０３８５６２に記載のように、StemFit AK03（味の素）を培地として用い、iMatrix511（ニッピ）上でｉＰＳ細胞を培養して適応させ、維持培養を行うことができる。また、例えばNakagawa M.,et al.A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.Sci Rep.2014;4:3594に記載のように、ｉＰＳ細胞を、７〜８日毎に、TrypLE（登録商標）Select（Thermo Fisher Scientific）を使用してシングルセルとして継代を行うことができる。上記（１）〜（５）のステップのあとに、任意で、（６）得られた心筋細胞を精製するステップを選択的に行ってもよい。心筋細胞の精製としては、以下に詳述するとおり、グルコースフリー培地を用いて心筋細胞以外を減少させる方法やＷＯ２０１７／０３８５６２に記載のように熱処理を用いて未分化細胞を減少させる方法などが挙げられる。 In step (1), for example, as described in WO2017038562, StemFit AK03 (Ajinomoto) can be used as a medium, and iPS cells can be cultured and adapted on iMatrix511 (Nippi) for maintenance culture. Also, as described in, for example, Nakagawa M., et al.A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.Sci Rep.2014; 4: 3594, iPS cells are used every 7 to 8 days. In addition, TrypLE® Select (Thermo Fisher Scientific) can be used for subculture as a single cell. After the steps (1) to (5) above, optionally, the step (6) of purifying the obtained cardiomyocytes may be selectively performed. Examples of purification of cardiomyocytes include a method of reducing non-cardiomyocytes by using a glucose-free medium and a method of reducing undifferentiated cells by heat treatment as described in WO2017 / 038562, as described in detail below. Be done.
また分化誘導細胞は、リプログラミングのための遺伝子以外の任意の有用な遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞から誘導された細胞であってもよい。かかる細胞の非限定例としては、例えば、Themeli M. et al. Nature Biotechnology, vol. 31, no. 10, pp. 928-933, 2013に記載のキメラ抗原受容体の遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞から誘導されるＴ細胞などが挙げられる。また、多能性幹細胞から分化誘導された後、任意の有用な遺伝子が導入された細胞もまた、本発明の分化誘導細胞に包含される。 In addition, the differentiation-inducing cell may be a cell derived from an iPS cell into which any useful gene other than the gene for reprogramming has been introduced. Non-limiting examples of such cells include, for example, iPS cells into which the chimeric antigen receptor gene described in Themeli M. et al. Nature Biotechnology, vol. 31, no. 10, pp. 928-933, 2013 has been introduced. Examples include T cells derived from. In addition, cells into which any useful gene has been introduced after induction of differentiation from pluripotent stem cells are also included in the differentiation-inducing cells of the present invention.
本開示において、「移植片」とは、生体内へ移植するための構造物を意味し、特に細胞を構成成分として含む移植用構造物を意味する。移植片において細胞同士は接着して全体としてある形状を形成している状態を少なくとも一つ含み、一つ一つの細胞が全てバラバラに遊離して存在している、いわゆる懸濁状態は、本開示の「移植片」には含まれない。好ましい一態様においては、移植片は、細胞および細胞由来の物質以外の構造物（例えばスキャフォールドなど）を含まない移植用構造物である。本開示における移植片としては、これに限定するものではないが、例えばシート状細胞培養物、スフェロイド、細胞凝集塊などが挙げられ、好ましくはシート状細胞培養物またはスフェロイド、より好ましくはシート状細胞培養物である。 In the present disclosure, the "graft" means a structure for transplantation into a living body, and particularly means a structure for transplantation containing cells as a constituent component. The present disclosure includes at least one state in which cells adhere to each other to form a certain shape in a graft, and all the cells are separated and exist in a so-called suspension state. It is not included in the "graft" of. In a preferred embodiment, the implant is a structure for transplantation that is free of cells and structures other than cell-derived substances (eg, scaffolds, etc.). The transplant pieces in the present disclosure include, but are not limited to, sheet-like cell cultures, spheroids, cell aggregates, and the like, preferably sheet-like cell cultures or spheroids, and more preferably sheet-like cells. It is a culture.
本開示において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。本開示において、「スフェロイド」は細胞が互いに連結して略球状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、シート状細胞培養物やスフェロイドを構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層体（多層）、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。また、シート状細胞培養物は、細胞が明確な層構造を示すことなく、細胞１個分の厚みを超える厚みを有する３次元構造を有してもよい。例えば、シート状細胞培養物の垂直断面において、細胞が水平方向に均一に整列することなく、不均一に（例えば、モザイク状に）垂直方向に複数の細胞が配置された状態で存在していてもよい。 In the present disclosure, "sheet-shaped cell culture" refers to cells connected to each other to form a sheet. In the present disclosure, "spheroid" refers to cells connected to each other to form a substantially spherical shape. The cells may be linked to each other directly (including those via cell elements such as adhesion molecules) and / or via intervening substances. The intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance capable of at least physically (mechanically) connecting cells to each other, and examples thereof include an extracellular matrix. The mediators are preferably derived from cells, particularly those derived from sheet-like cell cultures and cells constituting spheroids. The cells are at least physically (mechanically) connected, but may be more functionally, for example, chemically or electrically connected. The sheet-like cell culture may be composed of one cell layer (single layer) or two or more cell layers (laminate (multilayer), for example, two layers, three layers, etc. It may be 4 layers, 5 layers, 6 layers, etc.). Further, the sheet-shaped cell culture may have a three-dimensional structure having a thickness exceeding the thickness of one cell without showing a clear layered structure of the cells. For example, in the vertical cross section of a sheet-shaped cell culture, cells are not uniformly aligned in the horizontal direction, but are present in a state in which a plurality of cells are arranged non-uniformly (for example, in a mosaic pattern) in the vertical direction. May be good.
本開示のシート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本開示のシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本開示のシート状細胞培養物は、好ましくは、シート状細胞培養物を構成する細胞由来の物質（細胞外マトリックスなど）のみからなり、それら以外の物質を含まない。 The sheet cell cultures of the present disclosure preferably do not contain scaffolds. Scaffolds may be used in the art to attach cells to and / or inside the surface and maintain the physical integrity of sheet cell cultures, such as polyvinylidene difluoride (polyvinylidene difluoride). Although membranes made of PVDF) and the like are known, the sheet-shaped cell cultures of the present disclosure can maintain their physical integrity even in the absence of such scaffolds. Further, the sheet-shaped cell culture of the present disclosure preferably comprises only cell-derived substances (extracellular matrix, etc.) constituting the sheet-shaped cell culture, and does not contain any other substances.
細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、シート状細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本開示においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本開示の一態様において、細胞は自家細胞（autologous cells）または他家細胞（allogeneic cells）である。本開示の一態様において、細胞は自家細胞（自家ｉＰＳ細胞に由来する自家細胞、自家ｉＰＳ細胞を分化誘導して得られた自家分化誘導細胞を含む）である。本開示の別の態様において、細胞は他家細胞（他家ｉＰＳ細胞に由来する他家細胞、他家ｉＰＳ細胞を分化誘導して得られた他家分化誘導細胞を含む）である。 The cell may be a heterologous cell or an allogeneic cell. Here, "heterologous cell" means a cell derived from an organism of a species different from the recipient when the sheet-shaped cell culture is used for transplantation. For example, when the recipient is a human, cells derived from monkeys and pigs correspond to heterologous cells. In addition, "homogeneous cell" means a cell derived from an organism of the same species as the recipient. For example, when the recipient is a human, the human cell corresponds to an allogeneic cell. Allogeneic cells include autologous cells (also referred to as autologous cells or autologous cells), ie, recipient-derived cells and allogeneic non-autologous cells (also referred to as allogeneic cells). Autologous cells are preferred in the present disclosure because they do not cause rejection when transplanted. However, it is also possible to utilize heterologous cells and allogeneic non-autologous cells. When using heterologous cells or allogeneic non-autologous cells, immunosuppressive treatment may be required to suppress rejection. In the present specification, cells other than autologous cells, that is, allogeneic non-self-derived cells and allogeneic non-self-derived cells may be collectively referred to as non-autologous cells. In one aspect of the disclosure, the cells are autologous cells or allogeneic cells. In one aspect of the present disclosure, the cell is an autologous cell (including an autologous cell derived from an autologous iPS cell and an autologous differentiation-inducing cell obtained by inducing differentiation of an autologous iPS cell). In another aspect of the present disclosure, the cell is an allogeneic cell (including an allogeneic cell derived from an allogeneic iPS cell, an allogeneic differentiation-inducing cell obtained by inducing differentiation of an allogeneic iPS cell).
本開示は一側面において、臨床グレードの移植片、例えばシート状細胞培養物を製造する方法に関する。本発明者らは、多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を臨床応用するにあたって十分高品質な移植片、例えばシート状細胞培養物の製造においては、移植片の材料となる多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を含む細胞集団から未分化細胞を除去する工程や、該細胞集団を凍結保存する工程は、必要であると同時に細胞集団に含まれる細胞にダメージを与える原因ともなっていることを見出した。そしてこれらの工程を２工程以上実施した場合、従来知られた方法では十分な品質の移植片を製造することができないことを見出し、上記工程を２工程以上実施した場合であっても高品質な移植片を得るための移植片の製造条件を検討した結果、多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を含む細胞集団をコンフルエントに達する密度で播種してシート化することにより、高品質なシート状細胞培養物を得ることができることを見出した。 In one aspect, the disclosure relates to methods of producing clinical grade implants, such as sheet cell cultures. The present inventors are derived from pluripotent stem cells, which are materials for transplants, in the production of high-quality transplants, for example, sheet-shaped cell cultures, for clinical application of pluripotent stem cell-derived differentiation-inducing cells. It was found that the step of removing undifferentiated cells from the cell population containing differentiation-inducing cells and the step of cryopreserving the cell population are necessary and at the same time cause damage to the cells contained in the cell population. .. Then, when these steps are carried out in two or more steps, it is found that a transplant piece of sufficient quality cannot be produced by a conventionally known method, and even when the above steps are carried out in two or more steps, the quality is high. As a result of examining the manufacturing conditions of the transplant to obtain the transplant, high-quality sheet-like cells were obtained by seeding and sheeting a cell population containing pluripotent stem cell-derived differentiation-inducing cells at a density reaching confluence. It has been found that a culture can be obtained.
したがって本開示の方法の一側面において、多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を含む細胞集団から未分化細胞を除去する少なくとも１種の工程および任意に細胞集団を凍結保存する工程を含む、移植片の製造方法に関する。
本開示の方法は、以下の工程を含む：
（ａ）多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を含む細胞集団において、未分化細胞除去操作を実施する工程および任意に細胞集団を凍結し、その後解凍する工程、ならびに
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた細胞集団を培養基材に播種し、移植片形成培養する工程。Therefore, in one aspect of the method of the present disclosure, a transplant piece comprises at least one step of removing undifferentiated cells from a cell population containing differentiation-inducing cells derived from pluripotent stem cells, and optionally a step of cryopreserving the cell population. Regarding the manufacturing method of.
The method of the present disclosure includes the following steps:
(A) A step of performing an undifferentiated cell removal operation in a cell population containing differentiation-inducing cells derived from pluripotent stem cells, a step of optionally freezing the cell population, and then thawing, and (b) the step (a). A step of seeding the cell population obtained in the above step on a culture medium and culturing the cells to form a transplant.
本開示の方法に用い得る多能性幹細胞の非限定例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。分化誘導細胞の非限定例は、心筋細胞、骨格筋芽細胞などの筋肉系の細胞、ニューロン細胞、オリゴデンドロサイト、ドーパミン産生細胞などの神経系の細胞、網膜色素上皮細胞などの網膜細胞、血球細胞、骨髄細胞などの造血系の細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞などの免疫関連の細胞、肝細胞、膵β細胞、腎細胞などの臓器を構成する細胞、軟骨細胞、生殖細胞などの他、これらの細胞に分化する前駆細胞や体性幹細胞、分化誘導前または後に他の有用な遺伝子を導入された細胞などを含む。
本開示の方法において、多能性幹細胞は、任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。好ましくは、多能性幹細胞は、ヒト細胞である。好ましい一態様において、多能性幹細胞はヒトｉＰＳ細胞である。Non-limiting examples of pluripotent stem cells that can be used in the method of the present disclosure include, for example, embryonic stem cells (ES cells), nuclear-transplanted embryonic stem cells (ntES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the like. Be done. Non-limiting examples of differentiation-inducing cells include muscular cells such as myocardial cells and skeletal myoblasts, neural cells such as neuron cells, oligodendrocytes and dopamine-producing cells, retinal cells such as retinal pigment epithelial cells, and blood cells. Hematopoietic cells such as cells and bone marrow cells, immune-related cells such as T cells, NK cells, NKT cells, dendritic cells and B cells, cells constituting organs such as hepatocytes, pancreatic β cells and renal cells, In addition to chondrocytes, germ cells, etc., it includes precursor cells and somatic stem cells that differentiate into these cells, cells into which other useful genes have been introduced before or after induction of differentiation, and the like.
In the methods of the present disclosure, pluripotent stem cells can be derived from any organism. Such organisms include, but are not limited to, for example, humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, horses, goats, sheep, rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, etc. Is included. Preferably, the pluripotent stem cell is a human cell. In a preferred embodiment, the pluripotent stem cell is a human iPS cell.
本開示において、「未分化細胞除去操作」は、多能性幹細胞を分化誘導して得られた分化誘導細胞を含む細胞集団から、腫瘍形成能を有する未分化細胞を除去する操作を意味し、既知の任意の手法を用いて行うことができる。かかる手法の非限定例としては、未分化細胞に特異的なマーカー（例えば、細胞表面マーカーなど）を用いた種々の分離法、例えば、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）、フローサイトメトリー法、アフィニティ分離法や、特異的プロモーターにより選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子など）を発現させる方法、未分化細胞の生存に必要な因子（メチオニン等の栄養源やｂＦＧＦ等の未分化状態の維持因子など）を除いた培地で培養して未分化細胞を駆逐する方法、分化を促進する因子（ＳＢ４３１５４２、ドルソモルフィン、ＣＨＩＲ９９０２１など）の存在下で培養し、未分化細胞の分化を促進させる方法、未分化細胞の表面抗原をターゲットにした薬剤で処理する方法などが挙げられる。また、ＷＯ２０１４／１２６１４６、ＷＯ２０１２／０５６９９７に記載の方法、ＷＯ２０１２／１４７９９２に記載の方法、ＷＯ２０１２／１３３６７４に記載の方法、ＷＯ２０１２／０１２８０３（特表２０１３−５３５１９４）に記載の方法、ＷＯ２０１２／０７８１５３（特表２０１４−５０１５１８）に記載の方法、特開２０１３−１４３９６８およびTohyama S. et al., Cell Stem Cell Vol.12 January 2013, Page 127-137に記載の方法、Lee MO et al., PNAS 2013 Aug 27;110(35):E3281-90に記載の方法、ＷＯ２０１６／０７２５１９に記載の方法、ＷＯ２０１３／１０００８０に記載の方法、特開２０１６−０９３１７８に記載の方法、ＷＯ２０１７／０３８５２６に記載の熱処理を用いる方法なども挙げられる。好ましくは、未分化細胞の除去操作は、ＷＯ２００７／０８８８７４に記載されるような無糖培地で培養する方法、ＷＯ２０１６／０７２５１９に記載されるような特異抗体を用いる方法およびＷＯ２０１７／０３８５２６に記載されるような熱処理を用いる方法などが挙げられる。 In the present disclosure, the "undifferentiated cell removal operation" means an operation for removing undifferentiated cells having tumorigenicity from a cell population including differentiation-inducing cells obtained by inducing differentiation of pluripotent stem cells. This can be done using any known technique. Non-limiting examples of such a method include various separation methods using markers specific to undifferentiated cells (for example, cell surface markers), for example, magnetic cell separation method (MACS), flow cytometry method, affinity separation. Methods, methods for expressing selective markers (eg, antibiotic resistance genes, etc.) by specific promoters, factors necessary for the survival of undifferentiated cells (nutrient sources such as methionine, maintenance factors for undifferentiated state such as bFGF, etc.) A method of eradicating undifferentiated cells by culturing in a medium excluding Examples thereof include a method of treating with a drug targeting the surface antigen of. Further, the method described in WO2014 / 126146, WO2012 / 056997, the method described in WO2012 / 147992, the method described in WO2012 / 133674, the method described in WO2012 / 012803 (Special Table 2013-535194), WO2012 / 078153 (Special). Table 2014-501518), JP 2013-143968 and Tohyama S. et al., Cell Stem Cell Vol.12 January 2013, Page 127-137, Lee MO et al., PNAS 2013 Aug 27; 110 (35): The method described in E3281-90, the method described in WO2016 / 072519, the method described in WO2013 / 10080, the method described in JP-A-2016-093178, and the heat treatment described in WO2017 / 038526 are used. The method is also mentioned. Preferably, the operation for removing undifferentiated cells is described in WO2007 / 088874, a method of culturing in a sugar-free medium, a method of using a specific antibody as described in WO2016 / 072519, and WO2017 / 038526. Examples thereof include a method using such a heat treatment.
特異抗体を用いる方法とは、例えば未分化細胞特異的なマーカーを認識する抗体を用いて、該未分化細胞マーカーを発現する細胞を除去する方法などが挙げられる。未分化細胞特異的なマーカーとして例えば、ＣＤ３０、Ｌｉｎ２８などが挙げられる。
かかる方法の具体例としては、例えばブレンツキシマブ・ベドチンを用いた方法が挙げられる。ブレンツキシマブ・ベドチンは、ＣＤ３０抗原を標的とする抗体と微小管阻害作用有する低分子薬剤（モノメチルアウリスタチンＥ：ＭＭＡＥ）とを結合させた抗体薬物複合体であり、再発・難治性のＣＤ３０陽性のホジキンリンパ腫等に対する治療薬であり、アドセトリスの商標名で販売されている。ブレンツキシマブ・ベドチンは、ＣＤ３０抗原を発現する細胞に選択的に作用することができ、ＣＤ３０抗原は上述のとおり未分化細胞において高度に発現しているため、ブレンツキシマブ・ベドチンにより未分化細胞を除去することができる。具体的な操作としては、ブレンツキシマブ・ベドチンを培養培地に添加してインキュベートすることにより行われる。Examples of the method using a specific antibody include a method of removing cells expressing the undifferentiated cell marker by using an antibody that recognizes a marker specific to the undifferentiated cell. Examples of markers specific to undifferentiated cells include CD30 and Lin28.
Specific examples of such a method include a method using brentuximab vedotin. Brentuximab vedotin is an antibody-drug conjugate that combines an antibody that targets the CD30 antigen with a small molecule drug (monomethyl auristatin E: MMAE) that has a microtubule inhibitory effect, and is relapsed / refractory CD30 positive. It is a therapeutic drug for Hodgkin lymphoma, etc., and is sold under the brand name of ADCETRIS. Brentuximab vedotin can selectively act on cells expressing the CD30 antigen, and since the CD30 antigen is highly expressed in undifferentiated cells as described above, brentuximab vedotin causes undifferentiated cells. Can be removed. As a specific operation, brentuximab vedotin is added to the culture medium and incubated.
未分化細胞除去操作は、単一の除去操作のみを行ってもよいし、複数の異なる除去操作を組み合わせて行ってもよい。ある態様において、未分化細胞除去操作は単一の除去操作のみ行われる。かかる除去操作としては、例えば無糖培地で培養する方法、特異抗体を用いる方法、熱処理を用いる方法などが挙げられる。別の態様において、未分化細胞除去操作は、２種の異なる除去操作を組み合わせて行われる。さらに別の態様において、未分化細胞除去操作は、３種またはそれ以上の異なる除去操作を組み合わせて行われる。かかる組み合わせとしては、例えば無糖培地で培養する方法と特異抗体を用いる方法との組み合わせ、無糖培地で培養する方法と熱処理を用いる方法との組み合わせ、特異抗体を用いる方法と熱処理を用いる方法との組み合わせ、ならびに無糖培地で培養する方法、特異抗体を用いる方法および熱処理を用いる方法の組み合わせなどが挙げられる。これらの未分化細胞除去操作を複数組み合わせることにより、相乗的な未分化細胞除去効果を得ることができる。未分化細胞除去操作の組み合わせの具体例としては、まずｉＰＳ細胞由来の分化誘導細胞を、ＷＯ２０１７／０３８５６２に記載されている方法などにより熱処理し、その後ＷＯ２００７／０８８８７４に記載されている方法などにより無糖培地で培養し、その後ＷＯ２０１６／０７２５１９に記載されている抗ＣＤ３０抗体結合薬剤処理法などの特異的抗体処理を行うことなどが挙げられる。
好ましい一態様において、未分化細胞除去操作として、熱処理法、無糖培地での培養法および特異抗体を用いる方法からなる群から選択される、少なくとも２種の方法を用いて行われる。The undifferentiated cell removal operation may be performed only by a single removal operation, or may be performed by combining a plurality of different removal operations. In some embodiments, the undifferentiated cell removal operation involves only a single removal operation. Examples of such a removal operation include a method of culturing in a sugar-free medium, a method of using a specific antibody, a method of using heat treatment, and the like. In another embodiment, the undifferentiated cell removal operation is performed by combining two different removal operations. In yet another embodiment, the undifferentiated cell removal operation is performed by combining three or more different removal operations. Such combinations include, for example, a combination of a method of culturing in a sugar-free medium and a method of using a specific antibody, a combination of a method of culturing in a sugar-free medium and a method using heat treatment, a method using a specific antibody, and a method using heat treatment. , And a combination of a method of culturing in a sugar-free medium, a method of using a specific antibody, and a method of using heat treatment. By combining a plurality of these undifferentiated cell removal operations, a synergistic undifferentiated cell removal effect can be obtained. As a specific example of the combination of undifferentiated cell removal operations, first, the iPS cell-derived differentiation-inducing cells are heat-treated by the method described in WO2017 / 0388562, and then not by the method described in WO2007 / 088744. Examples thereof include culturing in a sugar medium and then performing specific antibody treatment such as the anti-CD30 antibody-binding drug treatment method described in WO2016 / 072519.
In a preferred embodiment, the undifferentiated cell removal operation is performed using at least two methods selected from the group consisting of a heat treatment method, a culture method in a sugar-free medium, and a method using a specific antibody.
多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を含む細胞集団は、未分化細胞除去操作を行った後、任意に、培養基材上（好ましくは平面状の培養基材上）に播種して接着培養を行い、その後培養細胞を回収するステップを実施してよい。かかる接着培養ステップは、後述する凍結保存ステップの前に実施されても、凍結保存および解凍後に実施されてもよい。接着培養ステップを実施することにより、死細胞を効率的に取り除くことができ、その後の移植片の形成において、高品質な移植片の形成を、高確率で達成することが可能となる。 After performing the undifferentiated cell removal operation, the cell population containing the differentiation-inducing cells derived from pluripotent stem cells is optionally seeded on a culture medium (preferably on a flat culture medium) and adherently cultured. Then, the step of collecting the cultured cells may be carried out. Such an adhesive culture step may be carried out before the cryopreservation step described later, or after cryopreservation and thawing. By carrying out the adhesion culture step, dead cells can be efficiently removed, and in the subsequent formation of the graft, the formation of a high-quality graft can be achieved with a high probability.
かかる接着培養ステップにおいて、培養条件などは、通常の接着培養を行う場合の条件に準じてよい。例えば、市販の接着培養用培養容器を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下での培養などであってよい。細胞の播種密度は、細胞同士の接着および／または細胞と培養基材との接着の形成を妨げない密度であればいかなる密度であってもよく、例えばサブコンフルエントな密度であってもよいし、コンフルエントに達する密度またはそれ以上であってもよい。培養時間は、細胞同士の接着および／または細胞と培養基材との接着が形成される程度の時間であればよく、具体的には例えば２〜１６８時間、２〜１４４時間、２〜１２０時間、２〜９６時間、２〜７２時間、２〜４８時間、２〜２４時間、２〜１２時間、２〜６時間、２〜４時間程度であればよい。
また、上記未分化細胞除去操作を接着培養ステップにおいて行っても良い。例えば、接着培養ステップでの接着培養中に熱や特異抗体で処理したり、接着培養の一部を無糖培地で行ったりしてもよい。In such an adhesive culture step, the culture conditions and the like may be the same as the conditions for performing normal adhesive culture. For example, a commercially available culture container for adhesive culture may be used for culturing under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions. The seeding density of the cells may be any density as long as it does not interfere with the adhesion between the cells and / or the formation of the adhesion between the cells and the culture substrate, and may be, for example, a subconfluent density. It may be at or above a density that reaches confluence. The culturing time may be such that adhesion between cells and / or adhesion between cells and the culture substrate is formed, and specifically, for example, 2 to 168 hours, 2 to 144 hours, and 2 to 120 hours. , 2 to 96 hours, 2 to 72 hours, 2 to 48 hours, 2 to 24 hours, 2 to 12 hours, 2 to 6 hours, 2 to 4 hours.
Moreover, the above-mentioned operation for removing undifferentiated cells may be performed in the adhesive culture step. For example, the adhesive culture may be treated with heat or a specific antibody during the adhesive culture in the adhesive culture step, or a part of the adhesive culture may be performed in a sugar-free medium.
接着培養した細胞の回収は、当該技術分野において公知の方法を用いてよい。具体例としては、例えば接着培養した細胞を、トリプシン、TrypLEＴＭ Selectなどのプロテアーゼで処理し、解離した細胞を回収する、などが挙げられる。さらに任意に、回収した細胞を洗浄してもよい。
接着培養ステップは、複数の未分化細胞除去操作と組み合わせて行われ得る。複数の未分化細胞除去操作と組み合わせて行われる場合、接着培養ステップは、未分化細胞除去操作の前、未分化細胞除去操作の後または各未分化細胞除去操作の間に行われてよい。すなわち、複数の未分化細胞除去操作と、接着培養ステップとは、任意の組み合わせで行われてよい。これに限定するものではないが、具体例としては、例えば複数の未分化細胞除去操作を操作Ａ、操作Ｂ、操作Ｃとし、接着培養ステップをＸとする場合、各操作の順番は、Ａ→Ｂ→Ｘ、Ａ→Ｃ→Ｘ、Ｂ→Ｃ→Ｘ、Ａ→Ｂ→Ｃ→Ｘ、Ａ→Ｃ→Ｂ→Ｘ、Ｂ→Ａ→Ｃ→Ｘ、Ｂ→Ｃ→Ａ→Ｘ、Ｃ→Ｂ→Ａ→Ｘ、Ｃ→Ａ→Ｂ→Ｘ、Ｘ→Ａ→Ｂ、Ｘ→Ａ→Ｃ、Ｘ→Ｂ→Ｃ、Ｘ→Ａ→Ｂ→Ｃ、Ｘ→Ａ→Ｃ→Ｂ、Ｘ→Ｂ→Ａ→Ｃ、Ｘ→Ｂ→Ｃ→Ａ、Ｘ→Ｃ→Ｂ→Ａ、Ｘ→Ｃ→Ａ→Ｂ、Ａ→Ｘ→Ｂ、Ａ→Ｘ→Ｃ、Ｂ→Ｘ→Ｃ、Ａ→Ｘ→Ｂ→Ｃ、Ａ→Ｘ→Ｃ→Ｂ、Ｂ→Ｘ→Ａ→Ｃ、Ｂ→Ｘ→Ｃ→Ａ、Ｃ→Ｘ→Ａ→Ｂ、Ｃ→Ｘ→Ｂ→Ａ、Ａ→Ｂ→Ｘ→Ｃ、Ａ→Ｃ→Ｘ→Ｂ、Ｂ→Ａ→Ｘ→Ｃ、Ｂ→Ｃ→Ｘ→Ａ、Ｃ→Ａ→Ｘ→ＢまたはＣ→Ｂ→Ｘ→Ａなどであってよい。For the recovery of the adherently cultured cells, a method known in the art may be used. Specific examples include, for example , treating adherently cultured cells with a protease such as trypsin or TrypLE TM Select to recover dissociated cells. Further, optionally, the collected cells may be washed.
The adhesion culture step can be performed in combination with multiple undifferentiated cell removal operations. When performed in combination with a plurality of undifferentiated cell removal operations, the adhesion culture step may be performed before the undifferentiated cell removal operation, after the undifferentiated cell removal operation, or during each undifferentiated cell removal operation. That is, the plurality of undifferentiated cell removal operations and the adhesive culture step may be performed in any combination. Although not limited to this, as a specific example, when a plurality of undifferentiated cell removal operations are operation A, operation B, and operation C, and the adhesion culture step is X, the order of each operation is A →. B-> X, A->C-> X, B->C-> X, A->B->C-> X, A->C->B-> X, B->A->C-> X, B->C->A-> X, C->B->A-> X, C->A->B-> X, X->A-> B, X->A-> C, X->B-> C, X->A->B-> C, X->A->C-> B, X->B->A-> C, X->B->C-> A, X->C->B-> A, X->C->A-> B, A->X-> B, A->X-> C, B->X-> C, A->X->B-> C, A->X->C-> B, B->X->A-> C, B->X->C-> A, C->X->A-> B, C->X->B-> A, A->B-> It may be X-> C, A->C->X-> B, B->A->X-> C, B->C->X-> A, C->A->X-> B or C->B->X-> A.
多能性幹細胞由来の分化誘導細胞を含む細胞集団は、未分化細胞除去操作を行った後、任意に凍結保存されてよい。かかる凍結保存は、細胞（細胞集団）を凍結するステップと凍結細胞を解凍するステップとを含んでもよい。細胞の凍結は、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、容器内の細胞を、凍結手段、例えば、フリーザー、ディープフリーザー、低温の媒体（例えば、液体窒素等）に供することなどが挙げられる。凍結手段の温度は、容器内の細胞集団の一部、好ましくは全体を凍結させ得る温度であれば特に限定されないが、典型的には約０℃以下、好ましくは約−２０℃以下、より好ましくは約−４０℃以下、さらに好ましくは約−８０℃以下である。また、凍結操作における冷却速度は、凍結解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には４℃から冷却を始めて約−８０℃に達するまで約１時間〜約５時間、好ましくは約２時間〜約４時間、特に約３時間かける程度の冷却速度である。具体的には、例えば、約０．４６℃／分の速度で冷却することができる。かかる冷却速度は、所望の温度に設定した凍結手段に、細胞を含む容器を直接、または、凍結処理容器に収容して供することにより達成することができる。凍結処理容器は、容器内の温度の下降速度を所定の速度に制御する機能を有していてもよい。かかる凍結処理容器としては、既知の任意のもの、例えば、BICELL(R)（日本フリーザー）、プログラムフリーザーなどを用いることができる。The cell population containing the differentiation-inducing cells derived from pluripotent stem cells may be optionally cryopreserved after the undifferentiated cell removal operation. Such cryopreservation may include a step of freezing cells (cell population) and a step of thawing frozen cells. Freezing of cells can be performed by any known method. Such a technique includes, but is not limited to, subjecting the cells in the container to a freezing means, for example, a freezer, a deep freezer, a low temperature medium (for example, liquid nitrogen, etc.). The temperature of the freezing means is not particularly limited as long as it can freeze a part, preferably the whole cell population in the container, but is typically about 0 ° C. or lower, preferably about -20 ° C. or lower, more preferably. Is about −40 ° C. or lower, more preferably about −80 ° C. or lower. The cooling rate in the freezing operation is not particularly limited as long as it does not significantly impair the viability and function of the cells after freezing and thawing, but typically, cooling is started from 4 ° C. until it reaches about -80 ° C. The cooling rate is about 5 hours, preferably about 2 hours to about 4 hours, particularly about 3 hours. Specifically, for example, it can be cooled at a rate of about 0.46 ° C./min. Such a cooling rate can be achieved by providing the freezing means set to a desired temperature with the container containing the cells directly or by accommodating the container in the freezing treatment container. The freezing treatment container may have a function of controlling the rate of decrease in temperature inside the container to a predetermined speed. As the freezing treatment container, any known container, for example, BICELL (R) (Japan Freezer), a program freezer, or the like can be used.
凍結操作は、細胞を培養液や生理緩衝液などに浸漬させたまま行ってもよいが、細胞を凍結・解凍操作から保護するための凍結保護剤を培養液に加えたり、培養液を、凍結保護剤を含む凍結保存液と置換するなどの処理を施したうえで行ってもよい。したがって、凍結ステップを含む本開示の製造方法は、培養液に凍結保護剤を添加するステップ、または、培養液を凍結保存液に置換するステップをさらに含んでもよい。培養液を凍結保存液に置換する場合、凍結時に細胞が浸漬している液に有効濃度の凍結保護剤が含まれていれば、培養液を実質的に全て除去してから凍結保存液を添加しても、培養液を一部残したまま凍結保存液を添加してもよい。ここで、「有効濃度」とは、凍結保護剤が、毒性を示すことなく、凍結保護効果、例えば、凍結保護剤を用いない場合と比べた、凍結解凍後の細胞の生存率、活力、機能などの低下抑制効果を示す濃度を意味する。かかる濃度は当業者に知られているか、ルーチンの実験などにより適宜決定することができる。 The freezing operation may be performed while the cells are immersed in a culture solution or a physiological buffer, but a cryoprotectant for protecting the cells from the freezing / thawing operation may be added to the culture solution, or the culture solution may be frozen. It may be carried out after undergoing treatment such as replacement with a cryopreservation solution containing a protective agent. Therefore, the production method of the present disclosure including a freezing step may further include a step of adding a cryoprotectant to the culture solution or a step of replacing the culture solution with a cryopreservation solution. When replacing the culture solution with a cryopreservation solution, if the solution in which the cells are immersed at the time of freezing contains an effective concentration of cryoprotectant, substantially all of the culture solution is removed before adding the cryopreservation solution. Alternatively, the cryopreservation solution may be added while leaving a part of the culture solution. Here, the "effective concentration" means that the cryoprotectant does not show toxicity and has a cryoprotective effect, for example, the survival rate, vitality, and function of cells after freeze-thaw as compared with the case where no cryoprotectant is used. It means a concentration that shows a decrease suppressing effect such as. Such a concentration is known to those skilled in the art or can be appropriately determined by routine experiments or the like.
凍結保護剤は、細胞に対して凍結保護作用を示すものであれば特に限定されずに、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、セリシン、プロパンジオール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルデンプン、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、アドニトール、ペルセイトール、ラフィノース、ラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールなどを含む。凍結保護剤は、単独で用いても、２種または３種以上を組み合わせて用いてもよい。 The cryoprotectant is not particularly limited as long as it exhibits a cryoprotective effect on cells, and is, for example, dimethylsulfoxide (DMSO), glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, sericin, propanediol, dextran, polyvinylpyrrolidone, and the like. Includes polyvinyl alcohol, hydroxyethyl starch, chondroitin sulfate, polyethylene glycol, formamide, acetamide, adonitol, persetol, raffinose, lactose, trehalose, sucrose, mannitol and the like. The cryoprotectant may be used alone or in combination of two or three or more.
培養液への凍結保護剤の添加濃度、または、凍結保存液中の凍結保護剤の濃度は、上記で定義した有効濃度であれば特に限定されず、典型的には、例えば、培養液または凍結保存液全体に対して約２％〜約２０％（ｖ／ｖ）である。しかしながら、この濃度範囲からは外れるが、それぞれの凍結保護剤について知られているか、実験的に決定した代替的な使用濃度を採用することもでき、かかる濃度も本開示の範囲内である。 The concentration of the cryoprotectant added to the culture solution or the concentration of the cryoprotectant in the cryopreservation solution is not particularly limited as long as it is the effective concentration defined above, and typically, for example, the culture solution or freeze. It is about 2% to about 20% (v / v) with respect to the entire storage solution. However, although outside this concentration range, alternative use concentrations known or experimentally determined for each cryoprotectant can also be employed, such concentrations are also within the scope of the present disclosure.
凍結した細胞を解凍するステップは、既知の任意の細胞解凍手法により行うことができ、典型的には、例えば、凍結した細胞を、解凍手段、例えば、凍結温度より高い温度の固形、液状もしくはガス状の媒体（例えば、水）、ウォーターバス、インキュベーター、恒温器などに供したり、または、凍結した細胞を、凍結温度より高い温度の媒体（例えば、培養液）で浸漬することにより達成されるが、これに限定されない。解凍手段または浸漬媒体の温度は、細胞を所望の時間内に解凍できる温度であれば特に限定されないが、典型的には約４℃〜約５０℃、好ましくは約３０℃〜約４０℃、より好ましくは約３６℃〜約３８℃である。また、解凍時間は、解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には約２分以内であり、特に約２０秒以内とすることで生存率の低下を大幅に抑制することができる。解凍時間は、例えば、解凍手段または浸漬媒体の温度、凍結時の培養液または凍結保存液の容量もしくは組成などを変化させて調節することができる。凍結した細胞は、任意の手法により凍結させた細胞を含み、その非限定例としては、例えば、上記の細胞を凍結するステップにより凍結された細胞などが挙げられる。一態様において、凍結した細胞は、凍結保護剤の存在下で凍結された細胞である。一態様において、凍結した細胞は、本開示の製造方法に用いるためのものである。 The step of thawing frozen cells can be performed by any known cell thawing technique, typically for example, frozen cells are thawed by means of thawing, eg, solid, liquid or gas at a temperature above the freezing temperature. It can be achieved by subjecting the cells to a medium (eg, water), a water bath, an incubator, an incubator, etc., or by immersing the frozen cells in a medium (eg, a culture solution) having a temperature higher than the freezing temperature. , Not limited to this. The temperature of the thawing means or the immersion medium is not particularly limited as long as the cells can be thawed within a desired time, but is typically about 4 ° C to about 50 ° C, preferably about 30 ° C to about 40 ° C. It is preferably from about 36 ° C to about 38 ° C. The thawing time is not particularly limited as long as it does not significantly impair the survival rate and function of the cells after thawing, but is typically within about 2 minutes, and in particular, by setting it within about 20 seconds, the survival rate can be increased. The decrease can be significantly suppressed. The thawing time can be adjusted by changing, for example, the temperature of the thawing means or the immersion medium, the volume or composition of the culture solution or the cryopreservation solution at the time of freezing, and the like. Frozen cells include cells frozen by any method, and non-limiting examples thereof include cells frozen by the above-mentioned step of freezing cells. In one embodiment, the frozen cells are cells that have been frozen in the presence of a cryoprotectant. In one embodiment, the frozen cells are for use in the production methods of the present disclosure.
本開示の方法は、凍結した細胞を解凍するステップの後、かつ、移植片を形成するステップの前に、細胞を洗浄するステップを含んでいてもよい。細胞の洗浄は、既知の任意の手法により行うことができ、典型的には、例えば、細胞を洗浄液（例えば、血清や血清成分（血清アルブミンなど）を含むもしくは含まない、培養液（例えば、培地等）または生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）など）に懸濁し、遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿した細胞を回収することにより達成されるが、これに限定されない。細胞を洗浄するステップにおいては、かかる懸濁、遠心分離、回収のサイクルを１回または複数回（例えば、２、３、４、５回など）行ってもよい。本開示の一態様において、細胞を洗浄するステップは、凍結した細胞を解凍するステップの直後に行われる。 The methods of the present disclosure may include washing the cells after the step of thawing the frozen cells and before the step of forming the implant. Washing of cells can be performed by any known technique, typically, for example, a culture medium (eg, medium) containing or not containing a wash solution (eg, serum or serum components (eg, serum albumin)). Etc.) or suspension in a physiological buffer (eg, PBS, HBSS, etc.), centrifugation, discarding the supernatant, and collecting the precipitated cells, but not limited to. In the step of washing the cells, such suspension, centrifugation, and recovery cycles may be performed once or more than once (for example, 2, 3, 4, 5 times, etc.). In one aspect of the present disclosure, the step of washing cells is performed immediately after the step of thawing frozen cells.
本開示の方法は、凍結した細胞集団を解凍した後、当該細胞集団を培養基材に播種し、移植片を形成するステップを含む。移植片の形状により、播種する培養基材や細胞の密度などは異なり得る。例えば移植片がシート状である場合、平面の細胞接着性培養基材に細胞を播種し、移植片がスフェアである場合は、細胞非接着性の培養基材に細胞を播種する、などが挙げられ、当業者であれば適宜最適な条件を選択し得る。以下に移植片がシート状細胞培養物である場合を例として、本発明を詳述する。移植片がシート状細胞培養物である場合、本開示の方法は、前記細胞集団をコンフルエントに達する密度で培養基材に播種し、シート化するステップを含む。細胞のシート化は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。シート化は、細胞同士が接着分子や、細胞外マトリックスなどの細胞間接着機構を介して互いに接着することにより達成されると考えられている。したがって、播種した細胞をシート化するステップは、例えば、細胞を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。かかる条件としては、例えば、３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の気圧（大気圧）下で行うことができる。当業者であれば、播種する細胞の種類に応じて最適な条件を選択することができる。本明細書において、播種した細胞を培養して移植片を形成することを「移植片形成培養」と称し、移植片がシート状細胞培養物である場合の移植片形成培養を特に、「シート化培養」と呼ぶ場合もある。シート化培養の非限定例は、例えば、特許文献１、特開2010-081829、特開2010-226991、特開2011-110368、特開2011-172925、WO2014/185517などに記載されている。The method of the present disclosure comprises the step of thawing a frozen cell population and then seeding the cell population on a culture medium to form a graft. Depending on the shape of the implant, the culture medium to be seeded and the density of cells may differ. For example, when the implant is in the form of a sheet, cells are seeded on a flat cell-adherent culture substrate, and when the implant is sphere, cells are seeded on a cell-non-adhesive culture substrate. Therefore, a person skilled in the art can appropriately select the optimum conditions. The present invention will be described in detail below by taking the case where the implant is a sheet-like cell culture as an example. When the implant is a sheet-like cell culture, the method of the present disclosure comprises the step of seeding the cell population on a culture substrate at a density reaching confluence and sheeting. Cell sheeting can be performed by any known method and condition. Sheet formation is believed to be achieved by the cells adhering to each other via adhesion molecules or intercellular adhesion mechanisms such as extracellular matrix. Thus, the step of sheeting the seeded cells can be accomplished, for example, by culturing the cells under conditions that form cell-cell adhesions. Such conditions may be any as long as they can form cell-cell adhesion, but usually, cell-cell adhesion can be formed under the same conditions as general cell culture conditions. Such conditions include, for example, culturing at 37 ° C. and 5% CO 2. In addition, the culture can be carried out under normal atmospheric pressure (atmospheric pressure). Those skilled in the art can select the optimum conditions according to the type of cells to be seeded. In the present specification, culturing seeded cells to form a graft is referred to as "graft-forming culture", and the graft-forming culture when the graft is a sheet-like cell culture is particularly "sheet-forming". Sometimes called "culture". Non-limiting examples of sheeted culture are described in, for example,
培養基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平2-211865、特開2003-33177参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、CellSeed Inc.のUpCell(R)）、これらを本開示の製造方法に使用することができる。The surface of the culture substrate may be coated with a material whose physical properties change in response to irritation, for example, temperature or light. Such materials include, but are not limited to, for example, (meth) acrylamide compounds, N-alkyl substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N-ethylacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, etc. N-isopropylacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N-cyclopropylmethacrylamide, N-ethoxyethylacrylamide, N-ethoxyethylmethacrylamide, N-tetrahydrofurfurylacrylamide, N-tetrahydrofurfurylmethacryl (Amid, etc.), N, N-dialkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N, N-dimethyl (meth) acrylamide, N, N-ethylmethylacrylamide, N, N-diethylacrylamide, etc.), having cyclic groups (eg, N, N-dialkylacrylamide, N, N-diethylacrylamide, etc.) Meta) Acrylamide derivatives (eg 1- (1-oxo-2-propenyl) -pyrrolidine, 1- (1-oxo-2-propenyl) -piperidin, 4- (1-oxo-2-propenyl) -morpholin, 1 -(1-oxo-2-methyl-2-propenyl) -pyrrolidine, 1- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) -piperidin, 4- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) -A temperature-responsive material consisting of a homopolymer or copolymer of a vinyl ether derivative (eg, methylvinyl ether) or a homopolymer or copolymer of a vinyl ether derivative (eg, methylvinyl ether), a photoabsorbable polymer having an azobenzene group, a vinyl derivative of triphenylmethane leucohydrooxide and an acrylamide-based single amount. Known materials such as a copolymer with a body and a photoresponsive material such as N-isopropylacrylamide gel containing spirobenzopyran can be used (see, for example, JP-A-2-211865 and JP-A-2003-33177). ). By giving a predetermined stimulus to these materials, their physical characteristics, for example, hydrophilicity and hydrophobicity can be changed, and the exfoliation of the cell culture adhering on the material can be promoted. Culture dishes coated with a temperature-responsive material are commercially available (eg, CellSeed Inc.'s UpCell (R) ) and can be used in the production methods of the present disclosure.
上記培養基材は、種々の形状であってもよいが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、例えば、約１ｃｍ２〜約２００ｃｍ２、約２ｃｍ２〜約１００ｃｍ２、約３ｃｍ２〜約５０ｃｍ２などであってよい。The culture substrate may have various shapes, but is preferably flat. The area thereof is not particularly limited, but may be, for example, about 1 cm 2 to about 200 cm 2 , about 2 cm 2 to about 100 cm 2 , about 3 cm 2 to about 50 cm 2 .
培養基材は血清および／または細胞接着性成分などの他のコーティング剤（合わせて「コーティング成分」と記載する場合がある）でコート（被覆またはコーティング）されていてもよい。コーティング成分でコートされた培養基材を用いることにより、より高密度のシート状細胞培養物を形成することができる。「コーティング成分でコートされている」とは、培養基材の表面にコーティング成分が付着している状態を意味する。かかる状態は、限定されずに、例えば、培養基材をコーティング成分で処理することにより得ることができる。コーティング成分による処理は、コーティング成分を培養基材に接触させること、および、必要に応じて所定期間インキュベートすることを含む。また、インキュベートする温度は特に限定されないが、例えば、４℃〜３７℃などであってもよい。血清としては、異種血清および同種血清を用いることができる。異種血清は、細胞培養物を移植に用いる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ウシやウマに由来する血清、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などが異種血清に該当する。また、「同種血清」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト血清が同種血清に該当する。同種血清は、自己血清（自家血清ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する血清、およびレシピエント以外の同種個体に由来する同種他家血清を含む。なお、本明細書中で、自己血清以外の血清、すなわち、異種血清と同種他家血清を非自己血清と総称することもある。他のコーティング剤としては、細胞外マトリクスや細胞接着因子などの細胞接着性成分などが挙げられる。細胞接着性成分としては、これに限定するものではないが、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックス、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などが挙げられる。また、これらの改変物（例えば機能的ドメインを含むポリペプチドなど）も、本開示の細胞接着性成分に包含される。これらの改変物としては、例えばラミニン５１１およびラミニン２１１（ラミニンの改変物）、ＶＴＮ−Ｎ（ビトロネクチンの改変物）、レトロネクチン(R)（フィブロネクチンの改変物）などが挙げられる。The culture substrate may be coated (coated or coated) with other coating agents such as serum and / or cell adhesion components (collectively referred to as "coating components"). By using a culture substrate coated with a coating component, a higher density sheet-like cell culture can be formed. "Coated with a coating component" means a state in which the coating component is attached to the surface of the culture medium. Such a state can be obtained without limitation, for example, by treating the culture substrate with a coating component. Treatment with the coating component involves contacting the coating component with the culture substrate and, if necessary, incubating for a predetermined period of time. The incubation temperature is not particularly limited, but may be, for example, 4 ° C to 37 ° C. As the serum, heterologous serum and allogeneic serum can be used. Heterologous serum means serum derived from an organism of a different species from its recipient when the cell culture is used for transplantation. For example, when the recipient is human, sera derived from bovine or horse, for example, fetal bovine serum (FBS, FCS), calf serum (CS), horse serum (HS), etc. correspond to heterologous sera. In addition, "homogeneous serum" means serum derived from an organism of the same species as the recipient. For example, if the recipient is human, human serum corresponds to allogeneic serum. Allogeneic sera include autologous sera (also referred to as autologous sera), that is, sera derived from the recipient and allogeneic sera derived from allogeneic individuals other than the recipient. In addition, in this specification, sera other than autologous serum, that is, allogeneic serum and allogeneic serum may be collectively referred to as non-autologous serum. Examples of other coating agents include extracellular matrix and cell adhesion components such as cell adhesion factors. The cell adhesion component is not limited to this, for example, extracellular matrix such as collagen, fibronectin, laminin, vitronectin, proteoglycan, glycosaminoglycan, and cell adhesion factors such as cadherin family, selectin family, and integrin family. And so on. These modifications (eg, polypeptides containing a functional domain) are also included in the cell adhesion components of the present disclosure. Examples of these variants include laminin 511 and laminin 211 (a variant of laminin), VTN-N (a variant of vitronectin), retronectin (R) (a variant of fibronectin) and the like.
培養基材をコートするためのコーティング成分は、市販されているか、または、所望の生物から採取した生体試料から定法により調製することができる。具体的には、例えば血清を調製する方法として、採取した血液を室温で約２０分〜約６０分程度放置して凝固させ、これを約１０００×ｇ〜約１２００×ｇ程度で遠心分離し、上清を採取する方法などが挙げられる。 The coating component for coating the culture substrate can be commercially available or can be prepared by a conventional method from a biological sample collected from a desired organism. Specifically, for example, as a method for preparing serum, the collected blood is allowed to stand at room temperature for about 20 minutes to about 60 minutes to coagulate, and this is centrifuged at about 1000 × g to about 1200 × g. Examples thereof include a method of collecting the supernatant.
培養基材上でインキュベートする場合、コーティング成分は原液で用いても、希釈して用いてもよい。希釈は、任意の媒体、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７、ＤＭＥＭ／Ｆ１２など）等で行うことができる。希釈濃度は、コーティング成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０．５％〜約１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１％〜約６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約５％〜約４０％（ｖ／ｖ）である。 When incubating on a culture substrate, the coating component may be used as a stock solution or diluted. Dilution can be made in any medium, such as, but not limited to, water, saline, various buffers (eg, PBS, HBS, etc.), various liquid media (eg, DMEM, MEM, F12, DME, RPMI1640, etc.). It can be performed in MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, DMEM / F12, etc.). The dilution concentration is not particularly limited as long as the coating component can adhere to the culture substrate, and is, for example, about 0.5% to about 100% (v / v), preferably about 1% to about 60% (v). / V), more preferably from about 5% to about 40% (v / v).
本開示において、「コンフルエントに達する密度」は、播種した際に細胞が培養容器の接着表面一面を覆うことが想定される程度の密度、例えば、播種した際に、細胞が互いに接触することが想定される程度の密度、接触阻害が発生する密度、または接触阻害により細胞の増殖を実質的に停止する密度であり、当業者であれば、目的細胞の大きさと培養容器の接着表面の面積から計算可能である。したがって当業者であれば、最適な播種密度もまた適宜決定することができる。播種密度の上限は、特に制限されないが、密度が過度に高い場合には、死滅する細胞が多くなり、非効率となる。本発明の一態様において、播種密度は、例えば約０．４×１０６個/ｃｍ２〜約１．０×１０７個/ｃｍ２、約０．４×１０６個/ｃｍ２〜約５．０×１０６個/ｃｍ２、約０．４×１０６個/ｃｍ２〜約３．０×１０６個/ｃｍ２、約０．５×１０６個/ｃｍ２〜約１．０×１０７個/ｃｍ２、約０．５×１０６個/ｃｍ２〜約５．０×１０６個/ｃｍ２、約０．５×１０６個/ｃｍ２〜約３．０×１０６個/ｃｍ２、約１．０×１０６個/ｃｍ２〜約１．０×１０７個/ｃｍ２、約１．０×１０６個/ｃｍ２〜約５．０×１０６個/ｃｍ２、約１．０×１０６個/ｃｍ２〜約３．０×１０６個/ｃｍ２、約１．５×１０６個/ｃｍ２〜約１．０×１０７個/ｃｍ２、約１．５×１０６個/ｃｍ２〜約５．０×１０６個/ｃｍ２、約１．５×１０６個/ｃｍ２〜約３．０×１０６個/ｃｍ２、約２．０×１０６個/ｃｍ２〜約１．０×１０７個/ｃｍ２、約２．０×１０６個/ｃｍ２〜約５．０×１０６個/ｃｍ２、約２．０×１０６個/ｃｍ２〜約３．０×１０６個/ｃｍ２などであり得る。好ましい一態様において、播種密度は、約０．４０〜２．３３×１０６個/ｃｍ２であり、より好ましくは約１．０５×１０６個/ｃｍ２〜約２．３３×１０６個/ｃｍ２であり、さらに好ましくは約１．７６×１０６個/ｃｍ２〜約２．３３×１０６個/ｃｍ２である。In the present disclosure, the "density reaching confluence" is a density at which cells are expected to cover the entire adhesive surface of the culture vessel when seeded, for example, it is assumed that cells come into contact with each other when seeded. The density is such that the density is such that contact inhibition occurs, or the density at which cell proliferation is substantially stopped by contact inhibition. It is possible. Therefore, those skilled in the art can appropriately determine the optimum seeding density. The upper limit of the seeding density is not particularly limited, but if the seeding density is excessively high, more cells will die, resulting in inefficiency. In one embodiment of the present invention, the seeding density is, for example, about 0.4 × 10 6 / cm 2 to about 1.0 × 10 7 / cm 2 , about 0.4 × 10 6 / cm 2 to about 5. .0 × 10 6 pieces / cm 2 , about 0.4 × 10 6 pieces / cm 2 to about 3.0 × 10 6 pieces / cm 2 , about 0.5 × 10 6 pieces / cm 2 to about 1.0 × 10 7 pieces / cm 2 , about 0.5 × 10 6 pieces / cm 2 to about 5.0 × 10 6 pieces / cm 2 , about 0.5 × 10 6 pieces / cm 2 to about 3.0 × 10 6 pieces / cm 2 , about 1.0 x 10 6 pieces / cm 2 to about 1.0 x 10 7 pieces / cm 2 , about 1.0 x 10 6 pieces / cm 2 to about 5.0 x 10 6 pieces / cm 2 , about 1.0 x 10 6 pieces / cm 2 to about 3.0 x 10 6 pieces / cm 2 , about 1.5 x 10 6 pieces / cm 2 to about 1.0 x 10 7 pieces / cm 2 , about 1.5 x 10 6 pieces / cm 2 to about 5.0 x 10 6 pieces / cm 2 , about 1.5 x 10 6 pieces / cm 2 to about 3.0 x 10 6 pieces / cm 2 , Approximately 2.0 x 10 6 pcs / cm 2 to Approximately 1.0 x 10 7 pcs / cm 2 , Approximately 2.0 x 10 6 pcs / cm 2 to Approximately 5.0 x 10 6 pcs / cm 2 , Approximately 2 It can be 0.0 × 10 6 pieces / cm 2 to about 3.0 × 10 6 pieces / cm 2 . In a preferred embodiment, the seeding density is from about 0.40 to 2.33 × 10 6 / cm 2 , more preferably from about 1.05 × 10 6 / cm 2 to about 2.33 × 10 6. It is / cm 2 , and more preferably about 1.76 × 10 6 pieces / cm 2 to about 2.33 × 10 6 pieces / cm 2 .
シート化培養の時間は、播種する細胞の種類や細胞密度により異なり得る。例えばｉＰＳ細胞から心筋細胞を調製してシート化する場合、例えば約２．１×１０５個／ｃｍ２などの密度で播種し、４日以上培養することによりシート化を行っていた。これに対し、本開示の方法では、播種密度をコンフルエントに達する密度、すなわち従来よりも高密度で播種することにより、シート化培養の期間を短縮することが可能である。また、高密度で播種してシート化培養する場合、シート形成後に形成されたシート状細胞培養物が培養基材から剥離しやすくなるため、長期間のシート化培養を行うことは好ましくない。したがって本開示の一態様において、シート化培養は、２〜４日、より好ましくは２〜３日行われる。The time of sheeting culture may vary depending on the type of cells to be seeded and the cell density. For example, when cardiomyocytes are prepared from iPS cells and made into a sheet, they are seeded at a density of, for example, about 2.1 × 10 5 cells / cm 2, and cultured for 4 days or more to form a sheet. On the other hand, in the method of the present disclosure, it is possible to shorten the period of sheeting culture by sowing at a density that reaches confluence, that is, at a higher density than before. Further, in the case of seeding at a high density and culturing in a sheet, it is not preferable to carry out the sheet culturing for a long period of time because the sheet-like cell culture formed after the sheet formation is easily peeled off from the culture substrate. Therefore, in one aspect of the present disclosure, sheeting culture is carried out for 2-4 days, more preferably 2-3 days.
シート化に用いる媒体（シート化媒体と称する場合もある）としては、細胞のシート化を可能にするものであれば特に限定されず、例えば、生理食塩水、種々の生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）、種々の細胞培養用の基礎培地をベースにしたものなどを使用してもよい。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本発明に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。シート化媒体は、血清（例えば、ウシ胎仔血清などのウシ血清、ウマ血清、ヒト血清等）、種々の成長因子（例えば、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ等）などの添加物を含んでもよい。ＦＢＳを用いる場合、ＦＢＳ２０％（１０％以上２５％未満、より好ましくは１５％以上２５％未満）が好ましい。
The medium used for sheeting (sometimes referred to as sheeting medium) is not particularly limited as long as it enables cell sheeting, and is, for example, physiological saline and various physiological buffer solutions (for example, PBS). , HBSS, etc.), those based on various basal media for cell culture, etc. may be used. Such basal medium is not limited to, for example, DMEM, MEM, F12, DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, DMEM. / F12 and the like are included. Many of these basal media are commercially available, and their compositions are also known. The basal medium may be used as it has a standard composition (for example, as it is on the market), or the composition may be appropriately changed depending on the cell type and cell conditions. Therefore, the basal medium used in the present invention is not limited to those having a known composition, and includes those in which one or more components are added, removed, increased or decreased. The sheeting medium may contain additives such as serum (eg, bovine serum such as bovine fetal serum, horse serum, human serum, etc.) and various growth factors (eg, FGF, EGF, VEGF, HGF, etc.). When FBS is used,
シート化媒体は、シート化培養中に適宜入れ替えてよい。また、シート化の進行に合わせて媒体の組成を変化させてもよい。本発明者らは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を添加したシート化媒体を、シート化培養１日目の媒体として用いることにより、効果的にシート状細胞培養物が形成されることを新たに見出した。したがって本開示の好適な一態様において、１日目のシート化培養に用いるシート化媒体は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む。かかる態様においては、２日目以降のシート化媒体にはＲｈｏキナーゼ阻害剤を含んでも含まなくてもよいが、好ましくはＲｈｏキナーゼ阻害剤を含まない。
また、上記未分化細胞除去操作をシート化培養中に行っても良い 。例えば、シート化培養中に熱や特異抗体で処理したり、シート化培養の一部を無糖培地で行ったりしてもよい。The sheeting medium may be appropriately replaced during the sheeting culture. Further, the composition of the medium may be changed according to the progress of sheet formation. The present inventors have newly stated that a sheet-like cell culture can be effectively formed by using a sheet-forming medium to which a Rho-kinase (ROCK) inhibitor is added as a medium for the first day of sheet-forming culture. I found it. Therefore, in a preferred embodiment of the present disclosure, the sheeting medium used for the sheeting culture on
In addition, the above-mentioned undifferentiated cell removal operation may be performed during sheet-forming culture. For example, the sheeted culture may be treated with heat or a specific antibody, or a part of the sheeted culture may be carried out in a sugar-free medium.
本発明者らはまた、培養基材に播種される細胞集団において、死細胞が存在すると、死細胞同士がくっついて凝集体を形成しやすいという知見に着目した。そしてかかる死細胞の凝集体が、シート化においてシート状細胞培養物の破損や穴あきに影響していることを見出し、これらを播種前に除去することでシート状細胞培養物が破損するリスクを低減できることを新たに見出した。したがって本開示は別の一側面において、シート形成細胞（例えば多能性幹細胞由来の分化誘導細胞など）を含む細胞集団を培養基材に播種する前に、死細胞除去のための処理を行うステップを含む、シート状細胞培養物の製造方法に関する。 The present inventors also focused on the finding that in the cell population seeded on the culture substrate, when dead cells are present, the dead cells tend to stick to each other to form aggregates. Then, it was found that such agglomerates of dead cells affect the breakage and perforation of the sheet-shaped cell culture in sheet formation, and removing these before seeding risks damaging the sheet-shaped cell culture. We have newly found that it can be reduced. Therefore, in another aspect of the present disclosure, a process for removing dead cells is performed before seeding a cell population containing sheet-forming cells (for example, differentiation-inducing cells derived from pluripotent stem cells) into a culture medium. The present invention relates to a method for producing a sheet-shaped cell culture including.
本開示において、死細胞の除去には、既知の任意の死細胞除去手段を用いることができる。かかる死細胞除去手段としては、これに限定するものではないが、例えばセルストレーナーなどのフィルターを用いてフィルター処理する方法、セルソーターにより分離する方法、磁気ビーズにより分離する方法、密度勾配遠心分離を用いる方法、ＤＮａｓｅなどの酵素で生細胞と死細胞の凝集を乖離する方法などが挙げられる。簡便性などの観点から、フィルター処理する方法が好ましい。 In the present disclosure, any known dead cell removing means can be used to remove dead cells. The dead cell removing means is not limited to this, and for example, a method of filtering with a filter such as a cell strainer, a method of separating with a cell sorter, a method of separating with magnetic beads, and a density gradient centrifugation are used. Examples thereof include a method and a method of dissociating the aggregation of live cells and dead cells with an enzyme such as DNase. From the viewpoint of convenience and the like, the filtering method is preferable.
死細胞やそれらが凝集した凝集体などが播種される細胞集団に混在している場合、形成されたシート状細胞培養物中の厚みが不均一になったり、シートの一部が形成されなくなったりすることにより、シート状細胞培養物に破損や穴あきが生じるリスクが高まる。そこでこれらの細胞を除去することにより、培養基材上に均一に生細胞が分布し、形成されるシート状細胞培養物の厚みが均一となるため、シート状細胞培養物の破損のリスクを低減することができる。 When dead cells or aggregates in which they are aggregated are mixed in the seeded cell population, the thickness in the formed sheet-like cell culture may become uneven, or a part of the sheet may not be formed. This increases the risk of breakage and perforation of the sheet cell culture. Therefore, by removing these cells, the viable cells are uniformly distributed on the culture substrate, and the thickness of the sheet-shaped cell culture formed becomes uniform, so that the risk of damage to the sheet-shaped cell culture is reduced. can do.
本開示において「フィルター処理」とは、所定のポアサイズを有するフィルターで細胞集団をろ過して、ポアサイズ以上の粒径を有する物質を分離除去することを意味する。例えば市販のセルストレーナーなど、所定のポアサイズ、例えば５００μｍ、２００μｍ、１００μｍなど、を有するフィルターを用いて細胞集団をろ過すると、死細胞により凝集した凝集体が除去されるため、フィルターを通った細胞集団から死細胞を除去することができる。
フィルターのポアサイズは、細胞凝集体を生細胞と分離できるポアサイズであればよく、したがってポアサイズの上限値は、例えば５００μｍ以下、２００μｍ以下、１５０μｍ以下、１００μｍ以下、８５μｍ以下、７０μｍ以下、４０μｍ以下など、死細胞の凝集体よりも小さいサイズであればよい。またポアサイズの下限値は、例えば１０μｍ以上、１５μｍ以上、２０μｍ以上、４０μｍ以上など、生細胞が通れるサイズよりも大きければよい。また、異なる２種類のポアサイズのフィルターを組み合わせて通しても良い。In the present disclosure, "filtering" means filtering a cell population with a filter having a predetermined pore size to separate and remove substances having a particle size equal to or larger than the pore size. When a cell population is filtered using a filter having a predetermined pore size, for example, 500 μm, 200 μm, 100 μm, etc., such as a commercially available cell strainer, aggregates aggregated by dead cells are removed, and thus the cell population that has passed through the filter. Dead cells can be removed from.
The pore size of the filter may be any pore size capable of separating cell aggregates from living cells, and therefore, the upper limit of the pore size is, for example, 500 μm or less, 200 μm or less, 150 μm or less, 100 μm or less, 85 μm or less, 70 μm or less, 40 μm or less, etc. It may be smaller in size than the aggregate of dead cells. The lower limit of the pore size may be larger than the size through which living cells can pass, such as 10 μm or more, 15 μm or more, 20 μm or more, and 40 μm or more. Further, two different types of pore size filters may be combined and passed through.
細胞集団中の死細胞は、その細胞膜が破壊されて細胞内の核酸（ＤＮＡなど）が溶出すると、そこに生細胞をトラップして凝集体（凝集塊）を形成する傾向にあることが知られている。かかる凝集体は、移植片（特にシート状細胞培養物など）の形成において均一性を損なわせるなどの悪影響を及ぼし得、穴あきなどの原因となり得る。上述のようなポアサイズのフィルターを通すことにより、かかる凝集体が細胞集団から分離され、フィルター処理前では一視野あたり（例えば１０倍拡大下で視野面積は約３ｃｍ２）の死細胞による凝集体（凝集塊）が、例えば６個以上存在したのにもかかわらず、フィルター処理後では同条件下で死細胞による凝集体（凝集塊）が、例えば５個以下からゼロ、４個以下からゼロ、３個以下からゼロ、２個以下からゼロ、または１個以下からゼロ、へ減少する。かかる凝集体は、その数がすくないほど好ましい移植片を得ることができる。凝集塊の除去との観点では、フィルターのポアサイズは上述のとおり、４０μｍ〜１００μｍが好ましい。It is known that dead cells in a cell population tend to trap live cells and form aggregates (aggregates) when the cell membrane is destroyed and intracellular nucleic acids (DNA, etc.) are eluted. ing. Such aggregates can have adverse effects such as impairing homogeneity in the formation of implants (particularly sheet-like cell cultures) and can cause perforations and the like. By passing through a pore-sized filter as described above, such aggregates are separated from the cell population, and before filtering, aggregates of dead cells per field (for example, a field area of about 3 cm 2 at 10-fold magnification) (for example, a field area of about 3 cm 2). Although there were 6 or more agglutinates (aggregates), for example, after filtering, the number of agglutinates (aggregates) due to dead cells under the same conditions was, for example, 5 or less to zero, 4 or less to zero, 3 It decreases from less than or equal to zero, from less than two to zero, or from less than one to zero. The smaller the number of such aggregates, the more preferable the graft can be obtained. From the viewpoint of removing agglomerates, the pore size of the filter is preferably 40 μm to 100 μm as described above.
本側面の方法は、特に多能性幹細胞から分化誘導された細胞を用いてシートを形成する場合など、限られたリソースを用いてシート状細胞培養物を形成する場合に特に効果を発揮する。したがって好ましい一態様において、シート形成細胞は、多能性幹細胞（例えばヒトｉＰＳ細胞など）から分化誘導された細胞（例えば筋芽細胞または心筋細胞など）である。一態様において、形成された心筋細胞シートには心筋細胞のほかに血管内皮細胞、細胞壁、線維芽細胞を含んでもよい。本開示のシート状細胞培養物に含まれる細胞の構成比は、例えば、心筋細胞約３０〜７０％、血管内皮細胞０．１％〜約２０％、および壁細胞約１％〜約４０％であってもよい。 The method of this aspect is particularly effective when forming a sheet-like cell culture using limited resources, such as when forming a sheet using cells induced to differentiate from pluripotent stem cells. Therefore, in a preferred embodiment, the sheet-forming cells are cells induced to differentiate from pluripotent stem cells (eg, human iPS cells, etc.) (eg, myoblasts, cardiomyocytes, etc.). In one embodiment, the formed cardiomyocyte sheet may contain vascular endothelial cells, cell walls, fibroblasts in addition to cardiomyocytes. The composition ratio of cells contained in the sheet-shaped cell culture of the present disclosure is, for example, about 30 to 70% of cardiomyocytes, 0.1% to about 20% of vascular endothelial cells, and about 1% to about 40% of parietal cells. There may be.
本側面の方法において、シート化培養は、既知の任意の方法を用いてよいが、特に細胞増殖が起こらないシート化培養によりシート形成する際に顕著に効果を発揮する。細胞増殖が起こらないシート化培養の例としては、例えば心筋細胞などの増殖性の低い細胞のシート化培養や、コンフルエントに達する密度で細胞集団を播種した場合のシート化培養などが挙げられる。一態様において、細胞増殖が起こらないシート化培養は、凍結された細胞を解凍する工程から死細胞除去の行程を介してシート化培養の行程まで細胞増殖がおこらない条件で行う。 In the method of this aspect, any known method may be used for the sheet culture, but the sheet formation is particularly effective when the sheet is formed by the sheet culture in which cell proliferation does not occur. Examples of sheet culture in which cell proliferation does not occur include sheet culture of cells having low proliferation such as cardiomyocytes, and sheet culture in which a cell population is seeded at a density reaching confluence. In one embodiment, the sheet culture in which cell proliferation does not occur is carried out under the condition that cell proliferation does not occur from the step of thawing the frozen cells to the process of sheet culture through the process of removing dead cells.
上述のとおり、シート状細胞培養物の臨床応用においては、シート形成細胞を凍結保存できることが好ましい。しかしながら、例えば多能性幹細胞由来の分化誘導細胞などを凍結保存し、その後解凍をすると、ある程度の量の細胞が死細胞となってしまう。したがって本側面の方法は、特にシート形成細胞を含む細胞集団をいったん凍結保存し、その後解凍して回収する場合に好適に用いることができる。 As described above, in the clinical application of sheet-shaped cell cultures, it is preferable that sheet-forming cells can be cryopreserved. However, if, for example, pluripotent stem cell-derived differentiation-inducing cells are cryopreserved and then thawed, a certain amount of cells become dead cells. Therefore, the method of this aspect can be preferably used particularly when a cell population containing sheet-forming cells is once cryopreserved, then thawed and recovered.
本開示のシート状細胞培養物の製造方法の特に好ましい一態様は、以下のステップを含む：
（ａ）多能性幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団において、少なくとも１種の未分化細胞除去操作を実施する工程、
（ｂ）（ａ）で得られた細胞集団を凍結保存する工程、
（ｃ）（ｂ）で凍結保存した細胞集団を解凍する工程、
（ｄ）（ｃ）で解凍した細胞集団をフィルター処理する工程、および
（ｅ）（ｄ）でフィルター処理した細胞集団を、コンフルエントに達する密度で培養基材に播種し、シート化培養する工程。
かかる態様において、（ａ）〜（ｅ）の各工程は、上記において詳述したとおりである。さらに他の工程、例えば；
（ｆ）（ｅ）で形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離する工程、
（ｇ）細胞集団を接着培養基材に播種して接着培養を行い、その後該細胞集団を回収する工程、
等を含んでもよい。A particularly preferred embodiment of the method for producing sheet cell cultures of the present disclosure comprises the following steps:
(A) A step of performing at least one undifferentiated cell removal operation in a cell population containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
(B) The step of cryopreserving the cell population obtained in (a),
(C) The step of thawing the cell population cryopreserved in (b),
(D) A step of filtering the cell population thawed in (c), and a step of seeding the cell population filtered in (e) and (d) on a culture medium at a density reaching confluence and culturing in a sheet.
In such an embodiment, each of the steps (a) to (e) is as described in detail above. Yet other steps, such as;
(F) A step of exfoliating the sheet-shaped cell culture formed in (e) from the culture substrate,
(G) A step of seeding a cell population on an adhesive culture substrate, performing adhesive culture, and then collecting the cell population.
Etc. may be included.
本開示の別の側面は、接着培養ステップを含む移植片の製造方法に関する。本側面の移植片の製造方法は、以下の工程を含む：
（ａ）胚様体を分散して細胞集団を得る工程；
（ｂ）（ａ）で得られた細胞集団を、培養基材に播種して接着培養した後、該細胞集団を回収する工程；
（ｃ）（ｂ）で得られた細胞集団を、培養基材に播種し、移植片形成培養する工程。Another aspect of the present disclosure relates to a method for producing a graft that includes an adhesive culture step. The method for producing the implant on this side includes the following steps:
(A) A step of dispersing the embryoid body to obtain a cell population;
(B) A step of seeding the cell population obtained in (a) on a culture substrate, adhering to and culturing the cell population, and then recovering the cell population;
(C) A step of seeding the cell population obtained in (b) on a culture medium and culturing a graft.
工程（ａ）において、ｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞から分化誘導して得られた胚様体を、トリプシンやTrypLEＴＭ Selectなどのプロテアーゼで処理して分散させ、細胞集団を得る。かかる胚様体の分散は、当該技術分野において公知であり、例えばMiki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015やＷＯ２０１４／１８５３５８などに記載の手法に基づいて行うことができる。In step (a), the embryoid body obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells such as iPS cells is treated with a protease such as trypsin or TrypLE TM Select and dispersed to obtain a cell population. Such dispersion of embryoid bodies is known in the art, and can be performed based on the methods described in, for example, Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015 and WO 2014/185358. can.
工程（ｂ）において、胚様体を分散して得られた細胞集団を、接着培養に供し、その後培養細胞を回収する。かかる接着培養ステップおよび回収ステップについては、上記において詳述したとおりである。上述したとおり、かかる接着培養により、死細胞を効率的に取り除くことができ、回収して得られた細胞集団は高いバイアビリティを示す。
工程（ｂ）で得られた細胞集団は、そのまま移植片形成培養に供されてもよいが、（ｂ）の後任意に凍結保存ステップおよび解凍ステップを含んでもよい。凍結保存ステップおよび解凍ステップについては、上記において詳述したとおりである。In step (b), the cell population obtained by dispersing the embryoid body is subjected to adhesive culture, and then the cultured cells are collected. The adhesive culture step and the recovery step are as described in detail above. As described above, such adhesive culture can efficiently remove dead cells, and the recovered cell population exhibits high viability.
The cell population obtained in step (b) may be directly subjected to graft-forming culture, or may optionally include a cryopreservation step and a thawing step after (b). The cryopreservation and thawing steps are as detailed above.
工程（ｃ）において、細胞集団を培養基材に播種して移植片を形成する。かかる移植片を形成するステップについてもまた、上記において詳述したとおりである。 In step (c), the cell population is seeded on the culture medium to form a graft. The steps to form such a graft are also detailed above.
本開示の別の側面は、上記製造方法により製造された移植片に関する。上述のとおり本開示の方法により得られる移植片は、特に臨床目的、すなわち疾患の処置に好適に用いることができる。したがって本開示の移植片は、それを必要とする対象の臓器・器官に適用することが想定される任意の移植片形成細胞（例えば多能性幹細胞由来の分化誘導細胞）を含む。かかる移植片形成細胞の非限定的な例としては、例えば、心臓、血液、血管、肺、肝臓、膵臓、腎臓、大腸、小腸、脊髄、中枢神経系、骨、眼、または皮膚などに適用される細胞などが挙げられる。また、本開示の移植片は疾患を処置するために対象に適用されるものである。したがって、本開示の一側面として、本開示の方法により調製された移植片を有効成分として含む、疾患を処置するための細胞培養物や組成物に関する。疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患、血液疾患、血管疾患、肺疾患、肝疾患、膵臓疾患、腎臓疾患、大腸疾患、小腸疾患、脊髄疾患、中枢神経系疾患、骨疾患、眼疾患、または皮膚疾患などが挙げられる。移植片形成細胞が心筋細胞である場合には、心筋梗塞（心筋梗塞に伴う慢性心不全を含む）、拡張型心筋症、虚血性心筋症、収縮機能障害（例えば、左室収縮機能障害）を伴う心疾患（例えば、心不全、特に慢性心不全）などが挙げられる。疾患は、本開示の移植片が、その処置に有用なものであってもよい。 Another aspect of the present disclosure relates to a graft produced by the above-mentioned production method. As described above, the implants obtained by the methods of the present disclosure can be particularly suitably used for clinical purposes, that is, for the treatment of diseases. Thus, the implants of the present disclosure include any implant-forming cells (eg, pluripotent stem cell-derived differentiation-inducing cells) that are expected to be applied to the target organ / organ in need thereof. Non-limiting examples of such graft-forming cells are applied, for example, to the heart, blood, blood vessels, lungs, liver, pancreas, kidney, large intestine, small intestine, spinal cord, central nervous system, bone, eye, or skin. Examples include cells. The implants of the present disclosure are also applied to the subject to treat the disease. Therefore, as one aspect of the present disclosure, it relates to a cell culture or composition for treating a disease, which comprises a graft prepared by the method of the present disclosure as an active ingredient. Diseases are not limited, for example, heart disease, blood disease, vascular disease, lung disease, liver disease, pancreatic disease, kidney disease, colon disease, small bowel disease, spinal cord disease, central nervous system disease, bone disease, eye. Diseases, skin diseases, etc. may be mentioned. When the graft-forming cells are myocardial cells, they are accompanied by myocardial infarction (including chronic heart failure associated with myocardial infarction), dilated cardiomyopathy, ischemic cardiomyopathy, and contractile dysfunction (for example, left ventricular contractile dysfunction). Examples include heart failure (eg, heart failure, especially chronic heart failure). The disease may be one in which the graft of the present disclosure is useful for its treatment.
本開示の別の側面は、本開示の方法により製造された移植片の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、前記対象における疾患を処置する方法に関する。処置の対象となる疾患は、上記したとおりである。 Another aspect of the disclosure relates to a method of treating a disease in a subject in need thereof, comprising applying an effective amount of the implant produced by the method of the disclosure to a subject in need thereof. The diseases to be treated are as described above.
本開示において、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、組織の異常に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。 In the present disclosure, the term "treatment" shall include all types of medically acceptable prophylactic and / or therapeutic interventions aimed at the cure, temporary remission or prevention of a disease. For example, the term "treatment" is medically acceptable for a variety of purposes, including delaying or stopping the progression of a disease associated with a tissue abnormality, regressing or eliminating a lesion, preventing the onset or recurrence of the disease, and the like. Including interventions to be performed.
本開示の処置方法においては、移植片の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、本開示の移植片等と併用することができる。 In the treatment method of the present disclosure, an ingredient that enhances the viability, engraftment and / or function of the implant, other active ingredients useful for treating the target disease, etc. are used in combination with the implant of the present disclosure. be able to.
本開示の処置方法は、本開示の製造方法に従って、本開示の移植片を製造するステップをさらに含んでもよい。本開示の処置方法は、移植片を製造するステップの前に、対象から移植片を製造するための細胞（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚細胞、血球等）または細胞の供給源となる組織（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚組織、血液等）を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物、組成物、または移植片等の投与を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物、組成物、または移植片等の投与を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、移植片等の投与を受ける対象とは異種の個体である。 The treatment method of the present disclosure may further include the step of producing the implant of the present disclosure according to the production method of the present disclosure. The treatment method of the present disclosure serves as a cell (for example, skin cells, blood cells, etc. when using iPS cells) or a source of cells for producing a graft from a subject before the step of producing the graft. It may further include the step of collecting tissue (for example, skin tissue, blood, etc. when using iPS cells). In one embodiment, the subject from which the cell or tissue from which the cell is source is collected is the same individual as the subject to whom the cell culture, composition, implant, or the like is administered. In another embodiment, the subject from which the cell or tissue from which the cell is sourced is harvested is a separate entity of the same species as the subject receiving the administration, such as a cell culture, composition, or implant. In another embodiment, the subject from which the cell or tissue that is the source of the cell is collected is an individual that is different from the subject to which the implant or the like is administered.
本開示において、有効量とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、シート状細胞培養物のサイズ、重量、枚数等）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。 In the present disclosure, the effective amount is, for example, an amount capable of suppressing the onset or recurrence of a disease, reducing symptoms, or delaying or stopping the progression (for example, size, weight, number of sheet-shaped cell cultures, etc.). The amount is preferably an amount that prevents the onset and recurrence of the disease or cures the disease. In addition, an amount that does not cause an adverse effect exceeding the benefit of administration is preferable. Such an amount can be appropriately determined by, for example, a test in an experimental animal such as a mouse, a rat, a dog or a pig, or a disease model animal, and such a test method is well known to those skilled in the art. In addition, the size of the tissue lesion to be treated can be an important index for determining the effective amount.
投与方法としては、例えば、静脈投与、筋肉内投与、骨内投与、髄腔内投与、組織への直接的な適用などが挙げられる。投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。組織に適用する際、本発明の細胞培養物、組成物、または移植片等を対象の組織に縫合糸やステープルなどの係止手段により固定してもよい。 Examples of the administration method include intravenous administration, intramuscular administration, intraosseous administration, intrathecal administration, and direct application to tissues. The frequency of administration is typically once per treatment, but multiple doses can be administered if the desired effect is not obtained. When applied to a tissue, the cell culture, composition, implant or the like of the present invention may be fixed to the target tissue by a locking means such as a suture or a staple.
本発明を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これらは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but these show specific specific examples of the present invention, and the present invention is not limited thereto.
以下の実施例において、多能性幹細胞には、京都大学ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）で樹立された臨床用ヒトｉＰＳ細胞を用い、M. Nakagawa et al., Scientific Reports, 4:3594 (2014)を参考に、フィーダーフリー法で維持した。また胚様体は、Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015やＷＯ２０１４／１８５３５８およびＷＯ２０１７／０３８５６２の記載を参考にして、心筋細胞へと分化誘導して得た。具体的には、フィーダー細胞を含まない培養液で維持培養したヒトｉＰＳ細胞を、EZ Sphere（旭硝子）上で１０μＭのY27632（和光純薬）を含有するStemFit AK03培地（味の素）中で１日培養し、得られた胚様体をアクチビンＡ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）４および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する培養液中で培養し、さらにＷｎｔ阻害剤（ＩＷＰ３）およびＢＭＰ４阻害剤（Dorsomorphin）およびＴＧＦβ阻害剤（ＳＢ４３１５４２）を含む培養液中で培養し、その後ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む培養液中で培養を行った。得られた細胞集団における心筋細胞の割合は５０％〜９０％であった。 In the following examples, clinical human iPS cells established at the Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University were used as pluripotent stem cells, and M. Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3594 (2014). Was maintained by the feeder-free method with reference to. The embryoid body was obtained by inducing differentiation into cardiomyocytes with reference to the descriptions in Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015 and WO2014 / 185358 and WO2017 / 038562. Specifically, human iPS cells maintained and cultured in a culture medium containing no feeder cells are cultured on EZ Sphere (Asahi Glass) for one day in StemFit AK03 medium (Ajinomoto) containing 10 μM Y27632 (Wako Pure Chemical Industries). Then, the obtained embryo-like body was cultured in a culture medium containing Actibin A, bone-forming protein (BMP) 4, and basic fibroblast growth factor (bFGF), and further, Wnt inhibitor (IWP3) and BMP4 inhibition were performed. The cells were cultured in a culture medium containing a drug (Dorsomorphin) and a TGFβ inhibitor (SB431542), and then cultured in a culture medium containing VEGF and bFGF. The proportion of cardiomyocytes in the obtained cell population was 50% to 90%.
例１．シート化培養条件の検討
上記で得られた、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞を含む細胞集団を用いて臨床用のシート状細胞培養物を形成する場合、未分化細胞の除去、細胞集団の凍結および解凍などの細胞のバイアビリティが低下する工程が追加されればされるほど、シート状細胞培養物の形成が困難になる傾向にあった。そこで、培養日数、シート化媒体等を変えた様々な条件下でシート化培養を行い、細胞バイアビリティが低下したと考えられる細胞集団においても好適にシート状細胞培養物を形成できるシート化培養条件を検討した。 Example 1. Examination of sheeted culture conditions When a clinical sheet-like cell culture is formed using the cell population containing myocardial cells induced to differentiate from human iPS cells obtained above, removal of undifferentiated cells and cell population The more steps that reduce cell viability, such as freezing and thawing, were added, the more difficult it was to form sheet-like cell cultures. Therefore, sheet-forming culture conditions that allow sheet-like culture to be suitably formed even in a cell population that is considered to have decreased cell viability by performing sheet-forming culture under various conditions in which the number of culture days, sheet-forming medium, etc. are changed. It was investigated.
比較例として、ＷＯ２０１７／０３８５６２の実施例２に記載の方法を用い、製造例１および２と比較した。各例におけるシート化手順の概要は以下のとおりである。
比較例：上記方法によりヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を分化誘導し、その後４２℃で熱処理により未分化細胞を除去し、シート化培養した。
製造例１：上記方法によりヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を分化誘導し、その後ＷＯ２０１６／０７２５１９に記載の抗ＣＤ３０抗体結合薬剤処理を用いて未分化細胞を除去し、その後かかる細胞集団を、プログラムフリーザーを用いて−１℃／分の速度で−８０℃まで低下させたのちに液体窒素中で凍結保存した後解凍し、シート化培養した。培養基材は、細胞播種の前日にＦＢＳ含有ＤＭＥＭを温度応答性培養皿に添加し、３７℃でコーティングを行ったものを用いた。シート化培養においては細胞を播種したのち、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を行い、一日ごとに培地交換を実施した。培養後は温度を低下させることで、細胞をシート状に剥離した。また、シート化培養の１日目のみ、シート化媒体にＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を加えた。シート化培養の２日目以降からシート化媒体からＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を除いた（「シート化培養の１日目のみ、シート化媒体にＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を加えた」とはシート化培養の２日目以降からシート化媒体はＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を含まないことを意味する、以下同様）。As a comparative example, the method described in Example 2 of WO2017 / 038562 was used and compared with Production Examples 1 and 2. The outline of the sheeting procedure in each example is as follows.
Comparative Example: Cardiomyocytes were induced to differentiate from human iPS cells by the above method, and then undifferentiated cells were removed by heat treatment at 42 ° C. and cultured in a sheet.
Production Example 1: Cardiomyocytes are induced to differentiate from human iPS cells by the above method, then undifferentiated cells are removed using the anti-CD30 antibody-binding drug treatment described in WO2016 / 072519, and then the cell population is subjected to a program freezer. After lowering the temperature to −80 ° C. at a rate of -1 ° C./min, the cells were cryopreserved in liquid nitrogen, thawed, and cultured in a sheet. As the culture substrate, DMEM containing FBS was added to a temperature-responsive culture dish on the day before cell seeding and coated at 37 ° C. was used. In the sheet culture, after seeding the cells, the cells were cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 , and the medium was changed every day. After culturing, the cells were exfoliated into sheets by lowering the temperature. In addition, the Rho-kinase inhibitor Y27632 was added to the sheeting medium only on the first day of the sheeting culture. The Rho-kinase inhibitor Y27632 was removed from the sheeted medium from the second day onward of the sheeted culture (“Only on the first day of the sheeted culture, the Rho kinase inhibitor Y27632 was added to the sheeted medium” means that the sheeted culture was added. From the second day onward, it means that the sheeting medium does not contain the Rho-kinase inhibitor Y27632, and so on.
製造例２：上記方法によりヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を分化誘導し、その後ＷＯ２０１７／０３８５６２に記載の熱処理、ＷＯ２００７／０８８８７４に記載の無糖培地培養法、ＷＯ２０１６／０７２５１９に記載の抗ＣＤ３０抗体結合薬剤処理を順に用いて未分化細胞を除去し、その後かかる細胞集団を、プログラムフリーザーを用いて−１℃／分の速度で−８０℃まで低下させたのちに液体窒素中で凍結保存した後解凍し、シート化培養した。培養基材は、細胞播種の前日にＦＢＳ含有ＤＭＥＭを温度応答性培養皿に添加し、３７℃でコーティングを行ったものを用いた。シート化培養においては細胞を播種したのち、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を行い、一日ごとに培地交換を実施した。培養後は温度を低下させることで、細胞をシート状に剥離した。また、シート化培養の１日目のみ、シート化媒体にＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を加えた。以下に、シート化培養の行程を示す。
上記各培養条件を下表に示す。
比較例と製造例１とを比較すると、熱処理による未分化細胞除去だけを行い、低い播種密度でシート化培養した場合（比較例）はシート形成に４日かかったのに対して、アドセトリス処理による未分化細胞除去および凍結保存後解凍したものを高密度播種してシート化培養し、さらにシート化培養時にＲｈｏキナーゼ阻害剤処理（day1のみ）する（製造例１）と、より短い時間でシート形成することができた。また比較例と製造例２とを比較すると、熱処理、無糖培養およびアドセトリス処理により未分化細胞除去を行い、さらに凍結保存後解凍したものを高密度播種してシート化培養し、シート化培養時にＲｈｏキナーゼ阻害剤処理（day1のみ）した場合であっても、より短い時間でシート形成することができた。
Comparing Comparative Example and Production Example 1, it took 4 days to form a sheet when only undifferentiated cells were removed by heat treatment and sheet-cultured at a low seeding density (Comparative Example), whereas ADCETRIS treatment was used. Sheets are formed in a shorter time by removing undifferentiated cells, cryopreserving, and then thawing, seeding the cells at high density, culturing them in a sheet, and then treating them with a Rho-kinase inhibitor (
例２．培養日数の検討
次にシート化媒体中の血清濃度の影響を比較するため、製造例２と同様に、ＦＢＳ濃度のみ２０％または３０％としてシート化培養した。
結果を図１に示す。２０％のＦＢＳで３日間培養することにより、シート化することが可能であった。したがって、製造例２の条件において、ＦＢＳ濃度は３０％ではなく２０％が好ましいことが明らかになった。 Example 2. Examination of the number of culture days Next, in order to compare the influence of the serum concentration in the sheeting medium, sheeting culture was performed with only the FBS concentration of 20% or 30% as in Production Example 2.
The results are shown in FIG. It was possible to form a sheet by culturing in 20% FBS for 3 days. Therefore, it was clarified that the FBS concentration is preferably 20% instead of 30% under the conditions of Production Example 2.
さらに２０％ＦＢＳを添加したシート化媒体を用いた場合の、培養日数を変化させた場合のシート状細胞培養物の品質への影響を検討した。培養日数を２日にした場合、９例中７例でシート化が確認されたのに対し、培養日数を３日にした場合は９例全てにおいてシート化が確認された。また、未分化細胞マーカーであるＬｉｎ２８の発現率を確認したところ、培養開始時は０．０２２％であったのに対し、培養２日目では若干増加して０．０３３％であった。しかし培養３日目では０．０１４％に低下していた。これらのことに鑑みると、製造例２の条件において、ＦＢＳ濃度を２０％にした場合、シート化培養日数は３日（７２時間）が好ましいことが明らかになった。すなわち、高密度播種でシート化することにより、従来よりも短い時間でシート化することが可能となるが、未分化細胞除去工程や凍結保存工程などの細胞のバイアビリティを低下させると考えらえる工程が繰り返された場合、その中でもシート化培養期間を長めに設定する（シート化培養日数を少なくとも３日（７２時間））ことにより、シート形成の成功率が向上し、未分化細胞の残存率が低減するという効果が期待できることがわかった。 Furthermore, the effect on the quality of the sheet-shaped cell culture when the number of culture days was changed when the sheet-forming medium to which 20% FBS was added was used was examined. When the number of days of culture was 2 days, sheet formation was confirmed in 7 of 9 cases, whereas when the number of culture days was 3 days, sheet formation was confirmed in all 9 cases. Moreover, when the expression rate of Lin28, which is an undifferentiated cell marker, was confirmed, it was 0.022% at the start of the culture, whereas it increased slightly to 0.033% on the second day of the culture. However, it decreased to 0.014% on the third day of culture. In view of these facts, it was clarified that under the conditions of Production Example 2, when the FBS concentration was 20%, the number of days for sheet-forming culture was preferably 3 days (72 hours). That is, by forming a sheet by high-density seeding, it is possible to form a sheet in a shorter time than before, but it is considered that the viability of cells such as an undifferentiated cell removal step and a cryopreservation step is reduced. When the process is repeated, the success rate of sheet formation is improved and the survival rate of undifferentiated cells is improved by setting the sheet-forming culture period longer (the number of sheet-forming culture days is at least 3 days (72 hours)). It was found that the effect of reducing the amount of culturing can be expected.
例３．フィルター処理工程のシート化への影響
凍結保存細胞を解凍した後フィルター処理を行うことによるシート化への影響を比較した。上記製造例２において、凍結保存細胞を解凍後、すぐに播種した場合（フィルターなし群）およびFalcon(R)１００μｍセルストレーナーでフィルター処理した後に播種した場合（フィルター群）で、シート状細胞培養物の品質に差ができるか否かを、心筋細胞３ロットを用いて検討した。
結果を図２および３に示す。フィルターなし群（Ｎ群）とフィルター群（Ｆ群）と比べると回収生細胞数に変化がないことが分かる。一方、バイアビリティはフィルター処理をすることで上昇することがわかった。また、フィルター処理群ではシート播種後に凝集している細胞が減少していることが観察された。フィルター処理前後でトロポニン陽性率を測定したところ、処理前が８６％に対して、処理後も８６％で変化がないことを確認した。また、未分化細胞率Ｌｉｎ２８値には大きな差は見られなかった。 Example 3. Effect of filtering process on sheeting The effects of filtering after thawing cryopreserved cells were compared. In Production Example 2 above, sheet-like cell cultures were obtained when the cryopreserved cells were thawed and then seeded immediately (no filter group) and when the cells were filtered with a Falcon (R) 100 μm cell strainer and then seeded (filter group). Whether or not there was a difference in the quality of the cells was examined using 3 lots of cardiomyocytes.
The results are shown in FIGS. 2 and 3. It can be seen that there is no change in the number of recovered viable cells as compared with the unfiltered group (N group) and the filtered group (F group). On the other hand, it was found that the viability can be increased by filtering. In addition, it was observed that the number of cells agglutinating after seeding the sheet decreased in the filtered group. When the troponin positive rate was measured before and after the filter treatment, it was confirmed that there was no change in 86% after the treatment compared with 86% before the treatment. In addition, there was no significant difference in the Lin28 value of the undifferentiated cell rate.
フィルターなし群ではいくつかのシート状細胞培養物に穴あきや破損が観察された（図３中□で囲まれた部分）確率が７８％だったのに対して、フィルター群では穴あきや破損はの発生確率が３０％に低下した。すなわち、細胞を解凍後播種前にフィルター処理によって細胞集団から死細胞を除去することにより、穴あきや破損がない臨床適用可能なシート状細胞培養物を高確率で得ることができた。すなわち、細胞を解凍後播種前にフィルター処理することにより、シート化培養中の細胞死を減らすことができると考えられた。 In the unfiltered group, the probability that some sheet-shaped cell cultures were perforated or damaged (the part surrounded by □ in Fig. 3) was 78%, whereas in the filter group, perforations or damage were observed. The probability of occurrence of was reduced to 30%. That is, by removing dead cells from the cell population by filtering after thawing the cells and before seeding, a clinically applicable sheet-like cell culture without perforations or breakage could be obtained with high probability. That is, it was considered that cell death during sheeting culture could be reduced by filtering the cells after thawing and before seeding.
例４．フィルター処理工程の凝集体形成への影響
例３で得られたフィルター群とフィルターなし群において、顕微鏡下でシート化前の播種細胞を観察した。一視野あたり（１０倍拡大下で視野面積約３ｃｍ２）の死細胞による凝集体（凝集塊）形成により生じる隙間の数が減少していることが明らかになった。死細胞による凝集体（凝集塊）一つあたり一つの隙間としてカウントした。フィルタなし群では一視野あたり（１０倍拡大下で視野面積約３ｃｍ２）１９個の凝集体（凝集塊）が観察されたのに対し、フィルター群では５個以下であった（図４）。凝集体（凝集塊）が少ないほど穴あきや破損がない臨床適用可能なシート状細胞培養物を得ることができた。 Example 4. Effect of filtering step on aggregate formation In the filter group and the non-filter group obtained in Example 3, seeded cells before sheeting were observed under a microscope. It was clarified that the number of gaps caused by the formation of aggregates (aggregates) by dead cells per visual field (visual field area of about 3 cm 2 under 10-fold magnification) was reduced. Each agglomerate (aggregate) due to dead cells was counted as one gap. In the unfiltered group, 19 aggregates (aggregates) were observed per visual field (visual field area of about 3 cm 2 at 10-fold magnification), whereas in the filter group, 5 or less were observed (Fig. 4). The smaller the number of aggregates (aggregates), the more clinically applicable sheet-like cell cultures that were not perforated or damaged could be obtained.
例５．播種密度と培養日数のシート化への影響
製造例３：ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞を分化誘導し、その後ＷＯ２０１６／０７２５１９に記載の抗ＣＤ３０抗体結合薬剤処理を用いて未分化細胞を除去し、その後かかる細胞集団を、プログラムフリーザーを用いて−１℃／分の速度で−８０℃まで低下させたのちに液体窒素中で凍結保存した。その後細胞集団を解凍し、Falcon（Ｒ）１００μｍセルストレーナーでフィルター処理した後に、シート化培養に供した。培養基材は、細胞播種の前日に２０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを温度応答性培養皿に添加し、３７℃で一晩インキュベートしてコーティングを行ったものを用いた。シート化培養においては細胞を播種したのち、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を行い、一日ごとに培地交換を実施した。培養後は温度を低下させることで、細胞をシート状に剥離した。また、シート化培養の１日目のみ、シート化媒体にＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を加えた。播種密度を２×１０５個／ｃｍ２〜１．２×１０６個／ｃｍ２で、シート化培養日数は２日または３日とした。同一の条件を５ロットの心筋細胞でｎ＝１〜２で実施した。 Example 5. Effect of seeding density and culture days on sheeting Production Example 3: Differentiation of myocardial cells from human iPS cells is induced, and then undifferentiated cells are treated with the anti-CD30 antibody-binding drug treatment described in WO2016 / 072519. After removal, such cell populations were then cooled to −80 ° C. at a rate of -1 ° C./min using a program freezer and then cryopreserved in liquid nitrogen. Then, the cell population was thawed , filtered with a Falcon (R) 100 μm cell strainer, and then subjected to sheeting culture. As the culture substrate, DMEM containing 20% FBS was added to a temperature-responsive culture dish the day before cell seeding, and the cells were incubated overnight at 37 ° C. for coating. In the sheet culture, after seeding the cells, the cells were cultured under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 , and the medium was changed every day. After culturing, the cells were exfoliated into sheets by lowering the temperature. In addition, the Rho-kinase inhibitor Y27632 was added to the sheeting medium only on the first day of the sheeting culture. The sowing density was 2 × 10 5 pieces / cm 2 to 1.2 × 10 6 pieces / cm 2 , and the number of days for sheeting culture was 2 or 3 days. The same conditions were performed with 5 lots of cardiomyocytes at n = 1-2.
各ロットの処理条件は下表にまとめたとおりである。
結果を下表および図５に示す。
ＷＯ２０１７／０３８５６２の実施例２にあるような低播種密度（２×１０５個／ｃｍ２）で凍結・解凍ステップを含む場合は、シート化培養が２〜３日においてほとんどの心筋細胞ロットでシート形成できないことが分かる。また、シート化培養日数２日においては高播種密度（１．２×１０６個／ｃｍ２）にしてもシート形成できない心筋細胞があることが分かる。一方、シート化培養日数３日においては６×１０５個／ｃｍ２〜１．２×１０６個／ｃｍ２の範囲においてすべての心筋細胞ロットでシート形成が問題なくできることが分かった。
また平面培養を含まない心筋細胞ロットＥでは他の細胞ロットと比べてシート形成がしにくいことが分かる。If freezing and thawing steps are included at low seeding densities (2 x 10 5 cells / cm 2 ) as in Example 2 of WO2017 / 038562, sheeting cultures are sheeted in most cardiomyocyte lots in 2-3 days. It turns out that it cannot be formed. Further, it can be seen that there is a cardiomyocytes unable sheet formation also in high seeding density (1.2 × 10 6 cells / cm 2) in the seat of
Further, it can be seen that the cardiomyocyte lot E, which does not include the planar culture, is more difficult to form a sheet than the other cell lots.
本発明により、多能性幹細胞から分化誘導した細胞等を用いてシート状細胞培養物などの移植片を形成する際に、高品質な移植片を高確率で得ることができる。特に臨床用に用いる移植片に要求される様々な条件のため、バイアビリティが低下した分化誘導細胞を用いる場合であっても、高品質な移植片を簡便に形成することが可能となる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, when a graft such as a sheet-shaped cell culture is formed using cells or the like induced to differentiate from pluripotent stem cells, a high-quality graft can be obtained with high probability. In particular, due to various conditions required for clinically used grafts, it is possible to easily form high-quality grafts even when differentiation-inducing cells with reduced viability are used.
Claims (12)
（ｂ）（ａ）で得られた細胞集団を凍結保存する工程、
（ｃ）（ｂ）で凍結保存した細胞集団を解凍する工程、
（ｄ）（ｃ）で解凍した細胞集団をフィルター処理する工程、および
（ｅ）（ｄ）でフィルター処理した細胞集団を、コンフルエントに達する密度で培養基材に播種し、シート化培養する工程、
を含む、シート状細胞培養物の製造方法。(A) A step of performing at least one undifferentiated cell removal operation in a cell population containing pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.
(B) The step of cryopreserving the cell population obtained in (a),
(C) The step of thawing the cell population cryopreserved in (b),
(D) A step of filtering the cell population thawed in (c), and a step of seeding the cell population filtered in (e) (d) on a culture medium at a density reaching confluence and culturing in a sheet.
A method for producing a sheet-shaped cell culture, including.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2023148172A JP2023175787A (en) | 2018-09-27 | 2023-09-13 | Method for forming pluripotent stem cell-derived cell into sheet |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018182440 | 2018-09-27 | ||
| JP2018182440 | 2018-09-27 | ||
| PCT/JP2019/038188 WO2020067435A1 (en) | 2018-09-27 | 2019-09-27 | Sheeting method for pluripotent stem cell-derived cells |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023148172A Division JP2023175787A (en) | 2018-09-27 | 2023-09-13 | Method for forming pluripotent stem cell-derived cell into sheet |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2020067435A1 true JPWO2020067435A1 (en) | 2021-09-09 |
Family
ID=69950771
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020549441A Pending JPWO2020067435A1 (en) | 2018-09-27 | 2019-09-27 | Method for sheeting pluripotent stem cell-derived cells |
| JP2023148172A Pending JP2023175787A (en) | 2018-09-27 | 2023-09-13 | Method for forming pluripotent stem cell-derived cell into sheet |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023148172A Pending JP2023175787A (en) | 2018-09-27 | 2023-09-13 | Method for forming pluripotent stem cell-derived cell into sheet |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPWO2020067435A1 (en) |
| WO (1) | WO2020067435A1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020067438A1 (en) * | 2018-09-27 | 2020-04-02 | 国立大学法人大阪大学 | Sheeting method for pluripotent stem cell-derived cells |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007088874A1 (en) * | 2006-01-31 | 2007-08-09 | Asubio Pharma Co., Ltd. | Method for purifying cardiac myocyte and presumptive cardiac myocyte derived from stem cell and fetus |
| JP2012500021A (en) * | 2008-08-20 | 2012-01-05 | アンスロジェネシス コーポレーション | Improved cell composition and method for producing the same |
| WO2016072519A1 (en) * | 2014-11-07 | 2016-05-12 | 国立大学法人大阪大学 | Differentiation-induced cell population from which undifferentiated cells have been removed, use of same, and method for producing same |
| WO2016076368A1 (en) * | 2014-11-12 | 2016-05-19 | テルモ株式会社 | Myocardial cell sheet |
| WO2016167332A1 (en) * | 2015-04-17 | 2016-10-20 | 国立大学法人大阪大学 | Method for cryopreserving sheet-shaped cell culture |
| WO2017010544A1 (en) * | 2015-07-15 | 2017-01-19 | テルモ株式会社 | Cryopreservation method for myocardial cells derived from pluripotent stem cells or from mesenchymal stem cells derived from adipose tissue or bone marrow |
| WO2017038562A1 (en) * | 2015-08-31 | 2017-03-09 | 学校法人東京女子医科大学 | Method for reducing pluripotent stem cells, method for producing cell population having reduced pluripotent stem cells |
-
2019
- 2019-09-27 JP JP2020549441A patent/JPWO2020067435A1/en active Pending
- 2019-09-27 WO PCT/JP2019/038188 patent/WO2020067435A1/en active Application Filing
-
2023
- 2023-09-13 JP JP2023148172A patent/JP2023175787A/en active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007088874A1 (en) * | 2006-01-31 | 2007-08-09 | Asubio Pharma Co., Ltd. | Method for purifying cardiac myocyte and presumptive cardiac myocyte derived from stem cell and fetus |
| JP2012500021A (en) * | 2008-08-20 | 2012-01-05 | アンスロジェネシス コーポレーション | Improved cell composition and method for producing the same |
| WO2016072519A1 (en) * | 2014-11-07 | 2016-05-12 | 国立大学法人大阪大学 | Differentiation-induced cell population from which undifferentiated cells have been removed, use of same, and method for producing same |
| WO2016076368A1 (en) * | 2014-11-12 | 2016-05-19 | テルモ株式会社 | Myocardial cell sheet |
| WO2016167332A1 (en) * | 2015-04-17 | 2016-10-20 | 国立大学法人大阪大学 | Method for cryopreserving sheet-shaped cell culture |
| WO2017010544A1 (en) * | 2015-07-15 | 2017-01-19 | テルモ株式会社 | Cryopreservation method for myocardial cells derived from pluripotent stem cells or from mesenchymal stem cells derived from adipose tissue or bone marrow |
| WO2017038562A1 (en) * | 2015-08-31 | 2017-03-09 | 学校法人東京女子医科大学 | Method for reducing pluripotent stem cells, method for producing cell population having reduced pluripotent stem cells |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| "BD Falcon(TM) Tubes and Pipets", INTERNET ARCHIVE: WAYBACK MACHINE [ONLINE], JPN6019049518, 26 June 2011 (2011-06-26), ISSN: 0004967608 * |
| BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 425, JPN6019049517, 25 July 2012 (2012-07-25), pages 321 - 327, ISSN: 0004967609 * |
| STEM CELL REPORTS, vol. 10, JPN6019049519, 10 May 2018 (2018-05-10), pages 1879 - 1894, ISSN: 0004967611 * |
| STEM CELL REPORTS, vol. 9, JPN6019049516, 26 October 2017 (2017-10-26), pages 1546 - 1559, ISSN: 0004967610 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2020067435A1 (en) | 2020-04-02 |
| JP2023175787A (en) | 2023-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6948261B2 (en) | Method for cryopreserving pluripotent stem cells or cardiomyocytes derived from adipose tissue or bone marrow-derived mesenchymal stem cells | |
| AU2015223798B2 (en) | Method for fabricating cell aggregate for self-organization | |
| JP6491187B2 (en) | Use of microparticles and endothelial cells with decellularized organs and tissues | |
| JP2007524411A (en) | Tissue system with undifferentiated stem cells derived from the limbus | |
| US20060084167A1 (en) | Formation of Hybrid Cells by Fusion of Lineage Committed Cells with Stem Cells | |
| Nair et al. | Identification of p63+ keratinocyte progenitor cells in circulation and their matrix-directed differentiation to epithelial cells | |
| JP2023052609A (en) | Method for manufacturing cell culture | |
| JP2023175787A (en) | Method for forming pluripotent stem cell-derived cell into sheet | |
| Nakatsuka et al. | Identification and characterization of lineage− CD45− Sca-1+ VSEL phenotypic cells residing in adult mouse bone tissue | |
| JP7256818B2 (en) | Sheeting method of cardiomyocytes | |
| JPWO2020067436A1 (en) | Method for forming grafts of pluripotent stem cell-derived cells | |
| WO2021065984A1 (en) | Method for forming sheet of cardiomyocytes | |
| JPWO2020067438A1 (en) | Method for sheeting pluripotent stem cell-derived cells | |
| US20200109368A1 (en) | Method for preparing differentiation-induced cells | |
| WO2020067443A1 (en) | Somatic cell sheet-forming method | |
| CN116806257A (en) | Preparation method of myocardial stem cells/myocardial precursor cells and myocardial fibrosis inhibition method | |
| JP7105487B2 (en) | Cryografts and methods of making cryografts | |
| Al Abdulsalam et al. | Cultivation of corneal endothelial cells from sheep | |
| JP2016096732A (en) | Production method of sheet-like cell culture | |
| WO2021065989A1 (en) | Method for increasing proportion of cd56+ cells | |
| JP2019154363A (en) | Medical cell culture | |
| WO2020067434A1 (en) | Method for cryopreserving cells | |
| WO2020067442A1 (en) | Method for cryopreserving cells | |
| JPWO2019177135A1 (en) | Method for producing sheet-shaped cell culture | |
| JPWO2019177146A1 (en) | Method for producing sheet-shaped cell culture |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20200629 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201023 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220218 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230118 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230314 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230616 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230913 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20231031 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20231208 |