JP5774309B2 - 癌マーカーおよび治療ターゲット - Google Patents
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Description
ハイブリダイゼーション:65度で16時間、5×SSC
二回洗浄:それぞれ室温(RT)で15分、2×SSC
二回洗浄:それぞれ65度で20分、0.5×SSC
ハイブリダイゼーション:65℃〜70℃で16〜20時間、5×〜6×SSC
二回洗浄:それぞれ室温で5〜20分、2×SSC
二回洗浄:それぞれ55℃〜70℃で30分、1×SSC
ハイブリダイゼーション:室温(RT)〜55℃で16〜20時間、6×SSC
少なくとも二回洗浄:それぞれ室温(RT)〜55℃で20〜30分、2×〜3×SSC
(i)CCR4と結合する抗体;任意選択的に、国際公開第0041724号パンフレット、国際公開第0164754号パンフレット、国際公開第05035582号パンフレット、国際公開第05035582号パンフレット、国際公開第03018635号パンフレット、国際公開第05053741号パンフレット、国際公開第0042074号パンフレットのいずれにて開示されている抗CCR4抗体、または
(ii)CCR4リガンドであるCCL17およびCCL22に結合する抗体;任意選択的に、国際公開第99/15666号パンフレットまたはIshida, T., et al (2004) Clin Cancer Res 10:7529−7539に開示されている抗CCL17または抗CCL22抗体。
(iii)CCR4拮抗剤;任意選択的に、国際公開第04007472号パンフレット、国際公開第05023771号パンフレット、国際公開第02094264号パンフレット、国際公開第0230358号パンフレット、国際公開第0230357号パンフレット、国際公開第05123697号パンフレット6、国際公開第05085212号パンフレット、国際公開第05082865号パンフレット、国際公開第04108717号パンフレット、欧州特許第1633729号、国際公開第03014153号パンフレットに開示されているCCR4拮抗剤
である。
i)CCR4を発現し、(a)増殖、(b)遊走、(c)タンパク質もしくはシグナル伝達分子の分泌、または(d)特定の条件下で培養した際の細胞生存性から選択された生物活性を示すことができるか、又は該生物活性を示す最中にある試験細胞を用意するステップと、
ii)一定期間、試験細胞を候補物質に曝すステップと、
iii)試験細胞の生物活性を測定し、それによって、候補物質の非存在下での当該試験細胞の生物活性がないこと又は予測された活性より少ない活性によって、抗癌剤を特定するステップとを含む、
ケモカイン受容体CCR4を発現する固形腫瘍または非血液系腫瘍対して活性を有する抗癌剤をスクリーニングする方法も含む。
(a)例えば、国際公開第0041724A1号パンフレット(LELAND STANFORD/LEUKOSITE)に開示されているCCR4調節物質、
(b)例えば、国際公開第0164754号パンフレット(協和発酵工業)、国際公開第05035582号パンフレット(協和発酵工業)、国際公開第03018635号パンフレット(協和発酵工業)、国際公開第05053741号パンフレット(協和発酵工業)もしくは国際公開第0042074号パンフレット(MILLENIUM PHARMACEUTICALS)に開示されている抗CCR4抗体、又は
(c)例えば、国際公開第04007472号パンフレット(小野薬品工業株式会社)、国際公開第05023771号パンフレット(小野薬品工業株式会社)、国際公開第02094264号パンフレット(TULARIK INC.)、国際公開第0230358号パンフレット(TULARTK/CHEMOCENTRYX)、国際公開第0230357号パンフレット(CHEMOCENTRYX)国際公開第051236976号パンフレット(アステラス製薬)国際公開第05082865号パンフレット(山之内製薬)、国際公開第04108717号パンフレット(アストラゼネカ社)、欧州特許第1633729号(アストラゼネカ社)もしくは国際公開第03014153号パンフレット(TOPIGEN PHARMACEUTIQUE INC.)に開示されているCCR4拮抗剤
から選択された物質の投与を含む、本願明細書に記載されている特定の固形腫瘍の予防または治療のための方法も提供する。
a)CCR4受容体を発現し、増殖が可能であるか、または増殖中である試験細胞を用意するステップと、
b)一定期間、試験細胞を候補物質に曝すステップと、
c)試験細胞の増殖を測定し、それによって、試験細胞のいかなる増殖における減少によって、抗癌剤を特定するか、かつ/または試験細胞の増殖の増加または継続によって、弱いまたは不活性な抗癌剤を特定するステップ
とを含む、抗癌剤をスクリーニングする方法を提供する。
a)CCR4受容体を発現し、増殖が可能であるか、または増殖中である試験細胞を具えるステップと、
b)前記細胞の少なくとも第一と第二の一定分量を具えるステップと、
c)前記第一の一定分量を候補物質に一定期間曝すステップと、
d)前記第二の一定分量を候補物質に一定期間曝さないステップと、
e)第一および第二の一定分量において、細胞の増殖の程度を測定し、それによって、第一の一定分量における細胞の増殖が、第二の一定分量における細胞と比較して、減少していることによって、抗癌剤を同定するか、かつ/または第二の一定分量と比較して第一の一定分量における細胞の増殖が増加するか、もしくは継続することによって、弱いまたは不活性な抗癌剤を特定するステップ
とを含む、抗癌剤をスクリーニングする方法を提供する。
a)CCR4を発現する試験細胞を具えるステップと、
b)一定期間試験細胞を候補物質に曝すステップと、
c)分泌されたタンパク質またはシグナル伝達分子のレベルを測定し、それによって、分泌されたタンパク質もしくはシグナル伝達分子のレベルの減少によって、抗癌剤を特定するか、かつ/または分泌されたタンパク質もしくはシグナル伝達分子のレベルが全く減少していないか、もしくは増加していることによって、弱いまたは不活性な抗癌剤を特定するステップ
とを含む、抗癌剤をスクリーニングする方法を提供する。
a)CCR4を発現する試験細胞を具えるステップ、
b)前記細胞の少なくとも第一および第二の一定分量を具えるステップと、
c)一定期間、前記第一の一定分量を候補物質に曝すステップと、
d)一定期間、前記第二の一定分量を候補物質に曝さないステップと、
e)第一および第二の一定分量における試験細胞の分泌されたタンパク質またはシグナル伝達分子のレベルを測定し、それによって、第二の一定分量における細胞とを比較して、第一の一定分量における細胞による分泌されたタンパク質またはシグナル伝達分子のレベルが減少していることによって、抗癌剤を特定するか、かつ/または第二の一定分量における細胞とを比較して第一の一定分量における細胞からの分泌された分子またはシグナル伝達分子のレベルがまったく減少していないか、もしくは増加していることによって、弱いまたは不活性な抗癌剤を特定するステップ
とを含む、抗癌剤をスクリーニングする方法を提供する。
a)CCR4受容体を発現し、遊走できるか、または遊走中である試験細胞を用意するステップ。
b)一定期間、試験細胞を候補物質に曝すステップと。
c)曝すのと同時にまたは曝した後に、細胞の遊走に適した条件を具え、曝した細胞のいかなる遊走をも測定し、曝した細胞における遊走が減少しているか、もしくは全くないことによって、抗癌剤を特定するか、かつ/または試験細胞の遊走が増加しているか、もしくは継続していることによって、弱いまたは不活性な抗癌剤を特定するステップ、
とを含む、抗癌剤をスクリーニングする方法を提供する。
a)CCR4受容体を発現し、遊走できるか、または遊走中である試験細胞を具えるステップと、
b)前記細胞の少なくとも第一および第二の一定分量を具えるステップと、
c)一定期間、前記第一の一定分量を候補物質に曝すステップと、
d)一定期間、前記第二の一定分量を候補物質に曝さないステップと、
e)曝すのと同時にまたは曝した後に、細胞の遊走に適した条件を用意し、第二の一定分量における細胞と比較した第一の一定分量における細胞の遊走の程度を測定し、それによって、遊走が減少しているか、もしくは全くないことによって、抗癌剤を特定するか、かつ/または第二の一定分量における細胞と比較して第一の一定分量における細胞の増殖が増加しているか、もしくは継続していることによって、弱いまたは不活性な抗癌剤を特定するステップ
とを含む。
a)CCR4受容体を発現する癌細胞を具えるステップと、
b)少なくともいくつかの癌細胞の死を引き起こす条件下で癌細胞を培養するステップと、
c)一定期間、試験細胞を候補物質に曝すステップと、
d)癌の試験細胞の死を測定し、それによって、試験細胞における細胞死が増加しないか、またはあまり増加しないことによって、弱いまたは不活性な抗癌剤を特定するか、かつ/または細胞死が増加していることによって、抗癌剤を特定するステップ
とを含む、抗癌剤をスクリーニングする方法を提供する。
a)CCR4受容体を発現する癌細胞を用意するステップと、
b)前記細胞の少なくとも第一の一定分量および第二の一定分量を具えるステップと、
c)少なくともいくつかの癌細胞の死を引き起こす条件下で癌細胞を培養するステップと、
d)一定期間、前記第一の一定分量を候補物質に曝すステップと、
e)一定期間、前記第二の一定分量を候補物質に曝さないステップと、
f)第一及び第二の一定分量における癌の試験細胞の死を測定し、第二の一定分量における細胞と比較して、第一の一定分量における細胞死が増加することによって、弱いまたは不活性な抗癌剤を特定するか、かつ/または第二の一定分量における細胞と比較して、第一の一定分量における細胞の死が増加していることによって、抗癌剤を特定するステップと
を含む、抗癌剤をスクリーニングする方法を提供する。
mRNA研究のために、子宮頸癌患者から15の腫瘍生検(11の扁平上皮癌S1−S11、および4の腺癌、A1−A4)および14の非腫瘍性子宮頸部組織サンプル(N1−N14)を手術中に得られた、液体窒素中で急冷凍結した(snap−frozen)。診断を、Barts and The London NHS Trustの病理学部で行った。患者のサンプルを、FIGO分類法(段階I、II、III、IV)に従って分け、腫瘍生検を、核の非定型性のグレード(1、2、3)の増加、または同様に、中程度に、または弱い分化に伴って分類した。
子宮頸部組織生検を、液体窒素で冷やしたミル6750(グレン・クレストン社、スタンモアー)でホモジナイズし、次いでTri Reagent(商標)で可溶化した(シグマ、プール、英国)。抽出したRNAを、10ユニットのDNase(ファルマシア、セイトアルバンズ、英国)で製造業者の説明書に従って処理した。RPAを、Riboquant(登録商標)hCR5およびhCR6鋳型のセット(BD Pharmingen、オックスフォード、英国)並びに[α32P]UTP(アマシャム・インターナショナル社、エールズベリー、英国)を用いて行われた。RNase保護断片を、acrylamide−urea sequencing gel(バイオラドラボレトリー社、ヘメルヘンプステッド、英国)で流し、濾紙に吸着し真空下で乾燥した。オートラジオグラフィを、Kodak Biomax MSフィルムとTranscreen LE intensifying screen(シグマ社)を用いて行った。
パラフィン包埋された子宮頸部組織を、RNaseのない条件下で切断し、UV処理したPALM(登録商標)膜スライド(PALMS、マイクロレーザーテクノロジー、ドイツ)に乗せた。次に、これらを、キシレン中で脱パラフィン化し、段階的なアルコールで再水和化した。サンプルを、処理前にマイヤーのヘマトキシリン溶液で1分間染色し、脱水し、空気乾燥した。切片を、製造業者のプロトコールに従ってレーザーで顕微解剖した。簡潔に述べると、所定の部分をレーザー顕微解剖し、プロテインキナーゼ(PK)バッファーの入ったマイクロフュージキャップに急速に入れた。およそ505〜5000の細胞を、各セッションで捕獲した。レーザー顕微解剖された細胞を、5μLのPKと混合した100μLのPKバッファーに溶解した。全RNAを、Paraffin block RNA isolation kit(1902、アンビオン、アメリカ合衆国)を用いて、製造業者の説明書に従って抽出した。cDNAを、上記の通りに増幅し、製造業者の説明書に従って、custom−made microfluidic gene array card(PE Applied Biosystems)を用いて分析した。
パラフィン包埋切片(4μm)を、CCR4、CCL17およびCCL22について染色した。簡潔に述べると、切片を、キシレン中で脱ワックス化し、エタノール勾配によって脱水した。PBSで洗った後、抗原を、95℃で20分間、Target Retrieval Solution(S1700、DAKO)で曝すか、または電子レンジで9分間、Antigen Unmasking Solution(H−3300、Vector)で曝した。切片を、正常ウサギまたはヤギ血清で30分間ブロックし、一晩4℃で以下の一次抗体条件:CCR4(1:300、ab1669、AbCam、Canbridge)、CCL17(1:50、ab9816−50、AbCam、Cambridge)およびCCL22(1:20、500−P107、Peprotech)でインキュベートした。室温で30分間のビオチン化された二次抗体(抗ヤギまたは抗ウサギIgG、1:200、Vector)によるインキュベート後、抗原を、3、3’−ジアミノベンジジン(DAB;Sigma)で明らかにした。次に、スライドを、ヘマトキシリン対比染色し、乾燥し、乗せた。一次抗体を省略したものを、ネガティブコントロールとして用いた。CCR4抗体の特異性を確認するために、いくつかのCCR4陰性細胞を、このケモカイン受容体のcDNAでトランスフェクトした。CCR4抗体は、トランスフェクトが成功した細胞上でのみ表面タンパク質検出した。
非悪性および悪性の上皮細胞でのCCR4、CCL17およびCCL22の発現の評価のために、各々のサンプルを、以下のスコア付けシステムによって半定量的に評価した:0(ポジティブなタンパク質発現なし)、+1(平均して<25%の断面が、陽性発現を有する)、+2(26〜50%)、+3(51〜75%)、+4(>76%)。陽性細胞の強度を、以下の通りに分析された:0(発現なし)、1(軽度の発現)、2(中程度の発現)、3(強い発現)。腫瘍ストローマ(腫瘍内の浸潤の細胞)、および腫瘍の浸潤境界(腫瘍周囲の浸潤の細胞)のCCR4、CCL17およびCCL22発現のスコア付けを、「移動平均」方法に基づいて行った[43]。壊死部分を避けた。合計15の強拡大視野(×400拡大率)を計数した。5つの尺度を、以下の通りに設定した:0=CCR4タンパク質発現なし;+1=HPF当たり1〜10のCCR4陽性細胞;+2=HPF当たり10〜20の陽性細胞;+3(HPF当たり21〜30の細胞);+4(>30の細胞)。全体の染色結果を、「パーセンテージ」×「強度」を算出することで得た。腫瘍および浸潤細におけるIHCスコア付けを、正式の病理学者(YW)によって行なった。
子宮頸癌細胞株C−41(ATCC、ロックビル、MD、米国)を10%のFCSを補充したDMEM培地で培養した。いくつかの実験において、細胞を、1、10、100または1000ng/mLのCCL17またはCCL22(PeproTech、ロンドン、英国)で刺激した。増殖および遊走を、先に記載した方法を用いて評価した[11]。
統計的有意差を、ウェルチの修正(Welch's correction)を有する対応のないt検定(Instat software、サンディエゴ、CA)によって評価した。P値が<0.05の場合、有意であるとみなす。
リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ(RPA)を用いて、新鮮な冷凍されたヒト子宮頸部組織の生検における13のケモカイン受容体mRNAをスクリーニングした。図1Aにおける概要のグラフから分かるように、非腫瘍性および悪性の生検の間のいくらかの別個の差異があるケモカイン受容体mRNAの範囲が、子宮頸部組織抽出物において見られた。ケモカイン受容体CCR4は、特に興味深く、悪性子宮頸部には存在したが、非腫瘍性子宮頸部生検由来の抽出物には存在しなかった(図1B)。
図2(AC)に示すように、生検のストローマ部分における白血球がCCR4陽性で染色された。ストローマ部分におけるCCR4陽性についてのIHCのスコアを、図3A(白い棒)にまとめた。非腫瘍性組織は、CCR4の白血球について陰性だった(図2A、3A)。CINサンプルにおいて、より多くのCCR4発現ストローマの細胞があり(図2B、3A)、これは、浸潤性腫瘍性の子宮頸部サンプルにおいてさらに増加した(図2C、3A)。浸潤する白血球でのCCR4の発現の強度も、悪性の進行とともに増加した。非腫瘍性組織において、該強度は軽度であり;CINおよび腺癌において、強度は中程度から強いものであり、浸潤性SCC、再発性腫瘍およびリンパ節転移において、強度は強かった(図8)。
CD68+マクロファージおよびFoxP3+制御性T細胞の数は、子宮頸部の悪性の進行とともに増加した。図2 D−Iに示すように、正常な子宮頸部の生検においてCD68およびFoxP3細胞はほとんど存在しないが、CINでは数が増加し、両方の細胞のタイプは浸潤癌においては顕著であった。
非腫瘍性子宮頸部生検において、正常な上皮細胞は、CCR4を発現していなかった(図2A)。しかしながら、90%を超えるCINのケースにおける上皮細胞は、CCR4を発現した(図2Bおよび2E)。96%のSCCサンプルは、CCR4陽性の上皮細胞を有し(図2Cおよび2F)、90%の腺癌サンプルの上皮細胞は、CCR4陽性だった(図2G)。すべての再発性腫瘍およびリンパ節転移における悪性の上皮細胞は、CCR4タンパク質を発現した。上皮細胞上のCCR4タンパク質についてのIHCの結果の詳細のすべてを、図9に示し、図2Dにまとめた(黒い棒)。CCR4発現は、少数の上皮細胞に制限されていなかった。図2E〜Gおよび9は、CINおよび浸潤癌の子宮頸部生検における大部分の悪性上皮細胞がCCR4陽性であったことを示す。
図8および9におけるデータの統計解析は、CIN病変が非腫瘍性子宮頸部組織と比較した際に上皮の区画(P=0.0001)およびストローマの区画(P=0.0001)の両方においてCCR4タンパク質の有意な上方制御を示したことを示す。浸潤性SCCにおけるCCR4発現も、非腫瘍性子宮頸部組織と比較した際に、上皮の区画(P=0.0001)およびストローマの区画(P=0.0001)の両方において有意に増加した。また、腺癌サンプルにもおいても、CCR4が、非腫瘍性子宮頸部組織と比較した際に、上皮細胞(P=0.0006)およびストローマの細胞(P=0.0050)で15上方制御されていた。
正常組織において、CCL22は、マクロファージ、単球、DC、B細胞およびT細胞の生産物である[13、14]。また、CCL22は、上皮組織で見られ;たとえば腸上皮は、TNFαなどの炎症性サイトカインによって更に上方制御できるCCL22を恒常的に生産する[15]。mRNAを、14の正常な子宮頸部、11のSCC及び4の腺の癌生検から単離し、CCL22のレベルを、リアルタイムRT PCRで評価した。図4Aに示すように、CCL22 mRNAレベルが、正常な生検と比較して悪性の組織において低かったが、これは有意なものではなかった(P=0.43)。50人の異なる患者からの合計52のパラフィン包埋の子宮頸部組織サンプルを、CCL22タンパク質について評価した:非腫瘍性、n=16;CIN、n=17;SCC、n=19。すべての子宮頸部生検において、CCL22が、上皮細胞において検出された(図4B〜D)。16の正常なサンプルのうちの14、15/17CIN5、14/19SCCは、CCL22陽性上皮細胞を有していた。すべての生検における浸潤する白血球は、CCL22を含んでいた(図4C、D)。上皮のIHCスコアは、CIN病変からSCCでわずかに下降した(図4E黒い棒)。しかしながら、CCL22についてのストローマのスコアは、正常からCINおよびSCCにわたって増加していた(図4E白い棒)。
正常組織において、CCL17は、脈管およびリンパの内皮細胞で発現していたが、マクロファージ、DCおよびケラチノサイトでも生産された[16、17、55]。mRNAを、14の正常な子宮頸部、11のSCCおよび4の腺癌の生検から単離し、CCL17レベルをリアルタイムRT−PCRによって評価した。図5Aに示すように、CCL17のmRNAのレベルは、正常な子宮頸部と比較してSCCにおいてより高かった。70人の異なる患者由来のパラフィン包埋子宮頸部組織の合計74サンプルを、CCL17タンパク質について評価した:非腫瘍性、n=21;CIN、n=33;SCC、n=20。正常な子宮頸部生検は、上皮およびストローマの両方の少数のサンプルにおいて、低レベルのCCL17を有していた(図5B)。23/33のCINサンプル、および13/20のSCCと比較して、2/19の正常なサンプルのみ、上皮におけるCCL17陽性細胞を有していた。CCL17陽性であるストローマの細胞の数は、正常なサンプルと比較して、CIN(図5C)およびSCC(図5D)において増加した。25/33CINおよび15/20SCCと比較して、21の正常な生検のうち6が、CCL17陽性ストローマ細胞を有していた。上皮およびストローマのCCL17のIHCスコアは、正常な生検と比較して、CINおよびSCCにおいて増加していた(図5E)。個々の生検からのIHCスコアを分析した際に、正常な生検と比較して、CIN(P=0.001)およびSCC(P=0.002)由来のストローマにおけるCCL17のIHCスコアにおいて、統計学的に有意な差異があった。また、正常なものと比較して、CIN(P=0.001)およびSCC(P=0.009)の上皮の領域におけるIHCスコアにおいても差異があった。これらのデータは、上皮内の新形成から浸潤性疾患までの移行によって、ケモカインの勾配が変化したことを示す。
子宮頸癌細胞におけるCCR4発現の生物学的重要性を調査するために、多くの子宮頸癌細胞株(CaSki、Mel 80、HeLa−Ohio、 Hela−S3、Siha、C33A、C41−1)をCCR4発現についてスクリーニングした。細胞株C−41が、細胞表面CCR4を恒常的に発現した(図6A)。FACS分析を用いて、C−41細胞は、細胞表面CCR4を発現したことが示された。この細胞株も、細胞内のCCL22タンパク質を有していたが、他のCCR4リガンドであるCCL17は存在しなかった(図6A)。100ng/mLのCCL22による刺激後、細胞表面CCR4タンパク質は、2時間後にC−41細胞で内部移行し、3時間後に表面に戻った(図6B)。100ng/mLのCCL17で刺激後も、細胞表面CCR4タンパク質は、2時間後にC−41細胞で内部移行し、3時間後に表面に戻った(図6C)。トランスウェル遊走分析アッセイにおいて、C−41細胞は、CCL17およびCCL22の両方に対する典型的なベル型の走化性反応を示した(図6D)。10ng/mLで、CCL17は、有意な遊走を誘導し(P=0.036)、更に、100ng/mLおよび1000ng/mLでも(それぞれP=0.0006およびP=0.0004)誘導した。同様の結果が、10ng/mL(P=0.0081)、100ng/mL(P=0.0009)および1000ng/mL(P=0.0348)のCCL22で見られた。
CCR4の発現およびケモカインリガンドの変化が子宮頸癌に特異的であるかどうか、それらが、炎症と関連するいずれの他の悪性腫瘍においても見られるかどうかは不明であった。食道癌は、腫瘍性の進行の全段階の例が、多くの場合同じ患者から同時に得ることができる上皮癌である。CCR4発現を、食道癌の患者由来の31の標本において調べた。27のケースにおいて、食道の発癌のすべての段階:正常、過形成、形成異常、上皮内癌および浸潤癌が同じ患者由来の生検に存在した。31のケースのうち4のケースは、浸潤癌の部分がない前浸潤の病変を有していた。図7Aに示すように、過形成上皮の基底層の周囲のわずかなCCR4陽性細胞を除けば、検出可能なCCR4発現が、食道の正常な上皮細胞になかった(図7B)。31のケースのうち30のケースにおいて、CCR4タンパク質が前浸潤の病変の全段階における上皮細胞に存在し(図7C、D)、過形成の上皮細胞におけるものより形成異常の病変におけるCCR4発現細胞の強度及びパーセンテージがはるかに高かった。浸潤癌における上皮細胞も、CCR4陽性だった(図7H)。いくつかの場合において、正常な粘膜と異常な粘膜との間の突然の移行があった。(図7C、D)。最も面白いことに、形成異常細胞において、CCR4発現の高いレベルがあったが、表層における細胞および隣接した正常な粘膜は陰性だった。CCR4陽性細胞がストローマにも存在し、パターンが子宮頸癌と同様であった。図7Eに示すように、正常な粘膜下層において、CCR4陽性細胞がわずかであり悪性の進行とともに、ストローマに浸透しているより多くのCCR4陽性細胞があった(図7F−H)。
IHCを用いて、発癌の全段階が各サンプルにおいて存在している23の食道サンプルにおけるCCL17およびCCL22の発現を評価した。概して、CCL17は、正常組織の上皮およびストローマの領域において存在しないが、わずかなCCL17陽性の細胞がストローマおよび少数の過形成の領域にあった。CCL17陽性の上皮またはストローマ細胞を持続しているサンプル数のが、形成異常のものにおいて増加し、浸潤性の領域において最も高く、これらの10/23は、ある程度CCL17陽性を示した。特に、形成異常の上皮の粘膜下層における内皮細胞または血管/リンパ管で、CCL17の免疫反応が強かったが、正常な上皮の粘膜下層ではそうではなかったことが注目された。
11の異なる腫瘍のタイプ:肺、結腸、膀胱、胃、膵臓、皮膚、***、脳、食道、卵巣および前立腺についての5〜10の腫瘍サンプル及び2〜5の正常なサンプルから単離したRNAから生成したcDNAを含む腫瘍のcDNAライブラリ(Cancer Research UK)を使用した。CCR4 mRNAの発現レベルを、定量的なリアルタイムRT−PCRを使用して測定した。
図11は、抗CCR4抗体を使用して、CCR4発現を検出する、子宮頸部(C41、C33A)および腎癌の細胞株における蛍光標示式細胞分取(FACS)分析の結果を示す。すべての細胞株は、CCR4を発現した。図11中の点線は、アイソタイプが一致したコントロールの抗体のデータを示す。
腫瘍に存在する最も一般的なサイトカインは、IL−10、TGF−β、FGF、TNF−αである。C41子宮頸癌細胞株を、異なるサイトカイン(IL−10、TNF−α、TGF−β、FGF;20ng/mL)で24時間、培養において刺激した。次に、CCR4の発現を、FACS分析によって決定した。図12に示すように、CCR4は、無刺激の細胞(黒線)と比較した際に、IL−10、TGF−βおよびFGF刺激後(青色線)の陽性細胞のパーセンテージの観点から上方制御されていた。点線は、アイソタイプのコントロールについてのデータを示す。太線は、刺激の後のCCR4発現を示す。結果は、腫瘍微小環境が腫瘍細胞上のCCR4の発現を誘導することができることを示す。
Claims (26)
- 固形腫瘍サンプル中の、または患者から採取された非血液学的な細胞腫瘍サンプル中の腫瘍上皮細胞によって発現したケモカイン受容体CCR4の量を測定するステップを含む癌患者の予測または診断の特徴の情報を得る方法であって、CCR4の量が、予測または診断の特徴の情報を提供する、方法。
- 固形腫瘍サンプルまたは非血液系細胞腫瘍サンプルにおける腫瘍上皮細胞によって発現したCCR4の量をCCR4の活性の基準の量と比較することによって、予測または診断の特徴の情報を得る、請求項1に記載の方法。
- CCR4活性の基準の量を1又は複数の非腫瘍サンプルにおいて測定する、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 情報を用いて、患者の固形腫瘍または非血液系細胞腫瘍が、CCR4の発現または活性を調節するかまたは阻害する物質を用いる抗癌治療に対して感受性があるかどうかを予測する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 患者が抗癌治療を受け、治療開始の前後において、患者の固形腫瘍サンプルまたは非血液系腫瘍サンプルにおける腫瘍上皮細胞によって発現したCCR4の量を測定し、得られた情報を用いて、患者の固形腫瘍または非血液系細胞腫瘍が抗癌治療に反応したかどうかを決定する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 情報を、固形腫瘍または非血液系細胞腫瘍の診断に使用するか、情報を用いて、固形腫瘍または非血液系細胞腫瘍を段階分けする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗癌治療は、CCR4の発現又は活性を調節するか、または阻害する物質を含む、請求項4または請求項5に記載の方法。
- 前記CCR4の発現または活性を調節するか、または阻害する物質は:
(i)CCR4と結合する抗体;
(ii)CCR4リガンドであるCCL17およびCCL22に結合する抗体;または
(iii)CCR4拮抗剤;
である請求項7に記載の方法。 - 固形腫瘍または非血液系腫瘍が、子宮頸部の癌である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 固形腫瘍または非血液系腫瘍が、食道の癌である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 固形腫瘍または非血液系腫瘍が、腎臓の癌である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 固形腫瘍または非血液系腫瘍が、脳の癌である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 固形腫瘍または非血液系腫瘍が、***の癌である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 固形腫瘍または非血液系腫瘍が、卵巣の癌である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 固形腫瘍または非血液系腫瘍が、前立腺の癌である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 固形腫瘍または非血液系腫瘍が、胃の癌である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 固形腫瘍または非血液系腫瘍が、膵臓の癌である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 癌患者における固形腫瘍または非血液系腫瘍の腫瘍上皮細胞によって発現したケモカイン受容体CCR4の存在を検出するか、または量を測定するために腫瘍上皮細胞によって発現したCCR4に対して反応性を有する抗体を使用する方法であって、検出又は測定した際の腫瘍の腫瘍上皮細胞によって発現されるCCR4の存在又は量が、診断の特徴の情報を提供する、方法。
- 固形腫瘍または非血液系腫瘍の腫瘍上皮細胞によるCCR4の発現の量を検出するか、または測定するために、配列番号1にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを使用する方法であって、検出又は測定した際の腫瘍の腫瘍上皮細胞によって発現されるCCR4の存在又は量が、診断の特徴の情報を提供する、方法。
- 情報を用いて、患者の固形腫瘍または非血液系細胞腫瘍が、CCR4の発現又は活性を調節するかまたは阻害する物質を用いる抗癌治療に対して感受性があるかどうかを予測するか;
患者が抗癌治療を受け、治療開始の前後において、CCR4の量および/または活性を測定し、得られた情報を用いて、患者の固形腫瘍または非血液系細胞腫瘍が抗癌治療に反応したかどうかを決定するか;
情報を、固形腫瘍または非血液系細胞腫瘍の診断に使用するか;または
情報を、固形腫瘍または非血液系細胞腫瘍の段階分けに使用する請求項18または請求項19に記載の使用方法。 - CCR4との反応性を有する抗体、およびストリンジェントな条件下で配列番号1とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーから選択された少なくとも一つの試薬と、キットの使用者が、サンプルのCCR4の量を測定するために、患者由来の固形腫瘍または非血液系腫瘍のサンプルに、試薬を投与するように導く説明書を含む、患者由来の固形腫瘍または非血液系腫瘍の腫瘍上皮細胞のサンプルから癌患者の予測又は診断の特徴の情報を得るためのキット。
- 1又は複数の非腫瘍細胞の基準のサンプルを含み、前記説明書が、キットの使用者が患者のサンプルおよび基準のサンプルの両方におけるCCR4の活性の量を測定するように導く、請求項21に記載のキット。
- 前記説明書が、CCR4の活性の量についての基準値を含む、請求項21または22に記載のキット。
- i)CCR4を発現し、(a)増殖、(b)遊走、(c)タンパク質もしくはシグナル伝達分子の分泌、または(d)特定の条件下で培養した際の細胞生存性から選択された生物活性を示すことができるか、又は該生物活性を示す最中にある試験細胞を用意するステップと、
ii)一定期間、試験細胞を候補物質に曝すステップと、
iii)試験細胞の生物活性を測定し、それによって、候補物質の非存在下での当該試験細胞の生物活性がないこと又は予測された活性より少ない活性によって、抗癌剤を特定するステップとを含む、
ケモカイン受容体CCR4を発現する腫瘍上皮細胞を含む固形腫瘍または非血液系腫瘍に対して活性を有する抗癌剤をスクリーニングする方法。 - 試験細胞のコントロールの一定分量を候補物質に曝さず、予想された生物活性を決定するように、コントロール細胞の生物活性を測定するステップ;および/または
試験細胞およびいずれのコントロール細胞の生物活性を、CCR4受容体のリガンドの添加によって誘導するステップを含む、
請求項24に記載の方法。 - CCR4受容体の前記リガンドが、CCL17及び/又はCCL22である、請求項25に記載の方法。
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