JP4470246B2 - レーザー走査顕微鏡装置 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザー走査顕微鏡装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
図１は、光走査装置を有する共焦点顕微鏡装置であり、共焦点顕微鏡装置の光路概略図の一例を示す。Ｘ方向に走査するスキャナに連続で高速に走査を行うレゾナントガルバノミラー５を用い、それに直交するＹ方向の走査を行うスキャナにガルバノミラー６を用い、またＸ、Ｙ方向に直交するＺ方向に走査を行うスキャナにピエゾ素子１３を用い、点走査・点検出を行う共焦点型のレーザー走査顕微鏡の光路概略図である。
【０００３】
具体的には、図１において、レーザー光源１より照射されたレーザー光は、励起フィルタ２を通って励起波長以外の波長をスプリットされた後、ビームエクスパンダ３で広げられダイクロイックミラー４で反射する。その後、Ｘ走査のレゾナントガルバノミラー５aとＹ走査のガルバノミラー５bとで構成された２次元走査系５は、それぞれのミラーの協調動作によりレーザー光を面走査する。
【０００４】
走査されたレーザー光は対物レンズ６を通り試料面７に集光される。そのときの試料から発せられる光は同一光路を逆にたどりダイクロイックミラー４を透過する。これは発せられた光の波長が励起波長と異なるからである。
その後、発光された光はバリアフィルタ８を通った後、集光レンズ９により集光される。ピンホール１０は試料面７上の焦点面と共役の位置にあるため、集光された光のうち、試料面７上の焦点面から発せられた光以外をカットする。ピンホール１０を通った光はエミッションフィルタ１１を通り、フォトデテクター１２で検出される。
【０００５】
その検出信号をラスターに合わせて並べてディスプレイすると、試料面７の２次元データが得られる。この２次元データは、ピンホール１０により試料面７の焦点面以外の光をカットされているので、焦点面の２次元情報と言って良い。それゆえ、対物レンズ６をピエゾ素子１３などで上下させることで、連続的なZ方向のスキャンを行うこともできる。
【０００６】
上記の例の構成では、レゾナントガルバノミラー５ａは止まることがないので、可能となるスキャンニングはX‐Y、X‐Z、X‐Y‐Z方向である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記高速レーザー走査型の共焦点顕微鏡においては、X‐Z方向走査を行う際にZ方向の走査にピエゾ素子を用いたとしても、X方向走査があまりにも早いため、Z方向走査が1ステップ進む間に、複数回のX方向走査が行われてしまう。そのため、試料に対してX方向の同一箇所に複数回レーザー光が照射される結果となり、生体試料を用いている場合は、その試料が受けるダメージは無視できないほどに大きくなってしまう。レーザーパワーを絞るにしても、十分な信号を得るためには絞りきれなかった。
【０００８】
従来のX‐Z方向へのレーザー光走査を行う際の測定のタイミングと、対物レンズ６の焦点がX‐Z断面においてどのように移動しているかを拡大して表した一例を図４、図５に示す。この場合はX方向へのレーザー光走査が速いため、Z方向走査の測定タイミング１４が1ステップ進む際に、X方向走査の測定タイミング１７が6ステップ進んでしまっている。しかし、X‐Z方向走査の1ライン分の情報を測定するタイミング１６はX,Zともに1ステップの部分１８であり、X方向走査の残りの5ステップ１９は無駄に走査しているだけであった。
【０００９】
本件発明は、上記の課題を解決し、従来と同等な画像を得るために必要な照明を得るが、生体試料等へのダメージを軽減できるレーザー走査顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本件請求項１に記載の発明は、レーザー光源からの光を対物レンズを介して、該対物レンズの光軸に直交する第１の方向に走査させる第１のスキャナと、
前記光源からの光を前記対物レンズを介して前記光軸方向に沿って第２の方向に走査させる第２のスキャナとを備え、前記光源からの光を立体試料内にて二次元的に走査し、前記立体試料内からの光を検出器で受光するレーザー走査顕微鏡装置において、
前記第１のスキャナの走査速度は、前記第２のスキャナの走査速度よりも相対的に速いという特性を有し、
前記第２のスキャナにより１ライン分の走査をしている間に、前記第１のスキャナは複数ライン分の走査を繰り返し、前記検出器で前記立体試料内からの光を受光するとともに、前記立体試料内からの光を変換した信号を積算するように制御し、かつ、前記積算した積算値が、前記第１のスキャナの１ライン分の走査によって取得した信号で画像形成を行うときに必要とされる信号の所定値よりも大きくなるように、前記レーザー光源からの光の強度を制御する制御手段を設けたことを特徴とする。
【００１１】
なお、上記の括弧内は実施形態の符号を記載した。
【００１２】
【発明の実施の形態】
図１乃至図３は、本発明の実施形態を示しており、図１は、レーザー走査顕微鏡の光路概略図であり、図２は、Z方向走査のレーザー照射のタイミング、及びX方向走査のレーザー照射のタイミングを示すタイミングチャート図であり、図３は、X‐Z断面のレーザー照射の走査図である。
【００１３】
図２及び図３は、本実施形態におけるX‐Z方向走査を行う際の測定のタイミングと、対物レンズ６の焦点がX‐Z断面においてどのように移動しているかを拡大して表した一例を示す。この場合はX方向へのレーザー光の走査が速いため、Z方向走査の測定タイミング２０が1ステップ進む際に、X方向走査の測定タイミング２１が6ステップ進む（期間１８に相当）。
【００１４】
図２に示すように、Z方向走査の1ライン目を測定するタイミング２０の測定期間は、X方向走査の測定タイミング２１の６ステップ分の期間１８に相当し（図３の部分２２）であり、その６回分の測定を積算することで、従来の6倍の信号が得ることができるようになる。レーザー走査顕微鏡のマイクロコンピュータMC（制御手段）は、レーザー光の強度を調整すると共に、フォトデテクター１２で検出された測定値を期間１８の間、積算することで、その積算値が所定値以上になるようにレーザー光の強度を制御している。
【００１５】
そのため、レーザー光のパワーを絞ることができ、生体試料へのダメージを軽減できる。また、レーザー光を絞ったとしても、S/Nが√6倍良くなった情報をX‐Z方向の走査の1ライン分の情報として得ることができる。よって、従来の方法で得られたX‐Z方向の走査の1ライン分の信号と同等の結果を得るために必要なレーザーパワーが従来のレーザーパワーの1/√6で良い。
【００１６】
また、今回はX方向走査が速いとして例示したが、特にX方向に限っているわけではなく、ある1方向の走査が速くて且つ止めることができないものであり、もう1方向の走査が遅いような場合に用いられる。例えば、X方向のレーザー走査に対して、Y方向のレーザー走査が遅い場合にも適用できる。
【００１７】
【発明の効果】
本発明を用いることで、レーザーパワーを絞ったとしても十分S/Nの高い信号を得ることができるようになる。またレーザーパワーが絞れることで、生体試料などに与えるダメージを軽減できるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】レーザー走査顕微鏡の光路概略図である。
【図２】本発明の実施形態の測定タイミングと焦点の移動の断面拡大図である。
【図３】本発明の実施形態のX‐Z断面のレーザー照射の走査図である。
【図４】従来の測定タイミングと焦点の移動の断面拡大図である。
【図５】従来のX‐Z断面のレーザー照射の走査図である。
【符号の説明】
１ レーザー光源
２ 励起フィルタ
３ ビームエクスパンダ
４ ダイクロイックミラー
５ａ Ｘ方向走査レゾナントガルバノミラー
５ｂ Ｙ走査のガルバノミラー
５ ２次元走査系
６ 対物レンズ
７ 試料面
８ バリアフィルタ
９ 集光レンズ
１０ ピンホール
１１ エミッションフィルタ
１２ フォトデテクター
１３ ピエゾ素子

Claims (1)

1. レーザー光源からの光を対物レンズを介して、該対物レンズの光軸に直交する第１の方向に走査させる第１のスキャナと、
   前記光源からの光を前記対物レンズを介して前記光軸方向に沿って第２の方向に走査させる第２のスキャナとを備え、前記光源からの光を立体試料内にて二次元的に走査し、前記立体試料内からの光を検出器で受光するレーザー走査顕微鏡装置において、
   前記第１のスキャナの走査速度は、前記第２のスキャナの走査速度よりも相対的に速いという特性を有し、
   前記第２のスキャナにより１ライン分の走査をしている間に、前記第１のスキャナは複数ライン分の走査を繰り返し、前記検出器で前記立体試料内からの光を受光するとともに、前記立体試料内からの光を変換した信号を積算するように制御し、かつ、前記積算した積算値が、前記第１のスキャナの１ライン分の走査によって取得した信号で画像形成を行うときに必要とされる信号の所定値よりも大きくなるように、前記レーザー光源からの光の強度を制御する制御手段を設けたことを特徴とするレーザー走査顕微鏡装置。

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