JP5771206B2 - 分離検出用カラム及びそのキット - Google Patents

Description

本発明は、紫外線又は発色試薬に対する光学応答性及び試料中の成分の分離能の両方において異なる二つの固定相を有する分離検出用カラム及びそのキットに関する。

少量のサンプルを迅速に精製する手段として、ポリエチレン製チューブカラムに蛍光指示薬を含浸させたシリカゲルを充てんしてなる分離検出用カラム（フラッシュチューブ）が市販されている。この分離検出用カラムは、サンプルを端部に付着させた後に溶離液をカラムに流すことによって少量の化合物の分離を簡便に行うことができる。またこの分離検出用カラムでは、分離状況を紫外線の照射により確認することができ、分離した化合物を、チューブを切り取ることによって簡単に取り出すことができる。さらにこの分離検出用カラムでは、分取用ＴＬＣやその他のスティック状カラムのように固着剤等の助剤を使っていないことから、助剤による試料への影響を防止することができる。

一方で、分離剤には、光学異性体の分離に有用な、多糖のフェニルカルバメート誘導体等の多糖誘導体を含む分離剤が知られているが、このような多糖誘導体を含む分離剤には紫外線応答性を有する分離剤もある。前記の分離検出用カラムでは、紫外線の照射によって化合物の分離を確認することから、紫外線応答性を有する分離剤を用いることができず、このような紫外線応答性を有する分離剤を利用した分離検出の観点から、前記の分離検出用カラムには検討の余地が残されている。

本発明は、試料中の成分と同じ光学応答性を有する分離剤によって分離した成分を検出することが可能な分離検出用カラムを提供する。

本発明者らは、カラム管において、紫外線応答性と試料に対する分離能とを有する分離剤の層の下流側に、試料に対する分離能を有さず、また異なる紫外線応答性を有する分離剤の層を連設することによって、前者の分離剤で分離した成分が良好に検出されることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち本発明は、通液性を有する柱状又は筒状の第一及び第二の固定相を有し、第一及び第二の固定相の端同士が通液自在に連結され、第一及び第二の固定相の軸方向に移動相を通液させる分離検出用カラムであって、第一の固定相は、試料中の成分の分離能と、この成分の紫外線又は発色試薬に対する光学応答性と同じ光学応答性と、を有し、第二の固定相は、前記成分とは異なる光学応答性を有する、分離検出用カラムを提供する。

また本発明は、前記第二の固定相が前記分離能を有さない前記の分離検出用カラムを提供する。

また本発明は、前記第一及び第二の固定相が、それぞれ、カラム管中の粒子状の充填剤による充填層、通液性を有する柱状体、又は、非通液性の柱状又は筒状の支持体の周面に形成される、通液性を有する分離剤層、によって構成される前記の分離検出用カラムを提供する。

また本発明は、前記柱状体の形状が円柱状であり、前記支持体の形状が円柱状又は円筒状である前記の分離検出用カラムを提供する。

また本発明は、前記第一の固定相が光学異性体用分離剤を含み、前記第二の固定相が光学異性体用分離剤を含まない前記の分離検出用カラムを提供する。

また本発明は、光透過性を有するカラム管と、試料中の成分の分離能と、この成分の紫外線又は発色試薬に対する光学応答性と同じ光学応答性と、を有する粒子状の第一の充填剤と、前記成分とは異なる光学応答性を有する粒子状の第二の充填剤と、を含む分離検出用キットを提供する。

また本発明は、カラム管と、試料中の成分の分離能と、この成分の紫外線又は発色試薬に対する光学応答性と同じ光学応答性と、を有する粒子状の第一の充填剤と、前記カラム管に通液自在に連結される第二の円柱体及び第二の薄層クロマトグラフィー棒の一方又は両方と、を含む分離検出用キットであって、前記第二の円柱体は、前記成分とは異なる光学応答性と通液性とを有し、前記第二の薄層クロマトグラフィー棒は、非通液性の円柱状又は円筒状の支持体と、この支持体の周面に形成される、前記成分とは異なる光学応答性と通液性とを有する第二の分離剤層と、を有する、分離検出用キットを提供する。

また本発明は、通液性と試料中の成分の分離能と、この成分の紫外線又は発色試薬に対する光学応答性と同じ光学応答性と、を有する第一の円柱体、及び、非通液性の円柱状の支持体とこの支持体の周面に形成される第一の分離剤層とを有する第一の薄層クロマトグラフィー棒、の一方又は両方と、光透過性を有し、前記第一の円柱体又は第一の薄層クロマトグラフィー棒と通液自在に連結されるカラム管と、前記成分とは異なる光学応答性を有する粒子状の第二の充填剤と、を含み、前記第一の分離剤層が、前記分離能と、前記成分と同じ光学応答性と、通液性と、を有する、分離検出用キットを提供する。

また本発明は、通液性と試料中の成分の分離能と、この成分の紫外線又は発色試薬に対する光学応答性と同じ光学応答性と、を有する第一の柱状体、及び、非通液性の柱状又は筒状の支持体とこの支持体の周面に形成される第一の分離剤層とを有する第一の薄層クロマトグラフィー棒、の一方又は両方と、前記成分とは異なる光学応答性と通液性とを有する第二の柱状体、及び、非通液性の柱状又は筒状の支持体とこの支持体の周面に形成される第二の分離剤層とを有する第二の薄層クロマトグラフィー棒、の一方又は両方と、第一の柱状体又は第一の薄層クロマトグラフィー棒と第二の柱状体又は第二の薄層クロマトグラフィー棒とを通液自在に連結する連結具と、を含み、前記第一の分離剤層が、前記分離能と、前記成分と同じ光学応答性と、通液性と、を有し、前記第二の分離剤層が、前記成分とは異なる光学応答性と通液性とを有する、分離検出用キットを提供する。

また本発明は、前記第二の充填剤、前記第二の円柱体、前記第二の分離剤層、又は前記第二の柱状体が前記分離能を有さない前記の分離検出用キットを提供する。

また本発明は、前記第二の柱状体の形状が円柱状であり、前記支持体の形状が円柱状又は円筒状である前記の分離検出用キットを提供する。

また本発明は、前記第一の充填剤、円柱体、柱状体又は分離剤層が光学異性体用分離剤を含み、前記第二の充填剤、円柱体、柱状体又は分離剤層が光学異性体用分離剤を含まない前記の分離検出用キットを提供する。

また本発明は、前記光学異性体用分離剤が多糖誘導体である前記の分離検出用カラム及び分離検出用キットを提供する。

また本発明は、前記多糖誘導体が、多糖と、多糖の水酸基或いはアミノ基の一部又は全部と置き換わった芳香族エステル基、芳香族カルバモイル基、及び芳香族エーテル基のいずれかとからなる前記の分離検出用カラム及び分離検出用キットを提供する。

本発明では、前記第一及び第二の固定相が形成されることから、試料中の成分と同じ光学応答性を有する分離剤によって分離した成分を検出することが可能な分離検出用カラムを提供することができる。

本発明における連結具の第一の例を示す図である。 本発明における連結具の第二の例を示す図である。 本発明における連結具の第三の例を示す図である。 本発明の実施例で用いられる分離検出用カラムを示す図である。 図４の分離検出用カラムを用いたｔ−ＳＯの光学分割によるラフィネート成分が検出された状態を示す図である。

本発明の分離検出用カラムは、通液性を有する柱状又は筒状の第一及び第二の固定相を有する。ここで通液性とは、固定相の軸方向に対する断面方向の全域（固定相の軸を垂直に横断する固定相の断面の全域）を濡らしながら固定相の一端から他端まで液体を通す性質を言う。

第一の固定相は紫外線又は発色試薬に対する光学応答性と試料中の成分の分離能とを有する。ここで紫外線に対する光学応答性とは、蛍光等の紫外線による発光、又は紫外線の吸収を言う。また発色試薬に対する光学応答性とは、発色試薬による発色を言う。また試料中の成分の分離能とは、試料中の二以上の成分の少なくとも二つに対して異なる吸着性を示すことを言う。

第一の固定相の光学応答性は、試料中の成分の光学応答性と同じである。ここで光学応答性が同じとは、一方の光学応答性と他方の光学応答性とが、色や明るさによって光学的に区別できないことを言う。

第二の固定相は、前記成分の光学応答性、すなわち第一の固定相の光学応答性とは異なる光学応答性を有する。ここで異なる光学応答性とは、紫外線の照射又は発色試薬の発色処理による一方の光学的応答と他方の光学的応答とが、色や明るさによって光学的に識別できる程度に異なることを言う。紫外線に対する光学応答性の相違としては、例えば、紫外線による色の異なる発光、紫外線による発光と紫外線吸収、紫外線による発光と紫外線に対する無応答、及び、紫外線吸収と紫外線に対する無応答、が挙げられる。発色試薬に対する光学応答性の相違としては、例えば、発色試薬による発色の有無及び発色の相違が挙げられる。

このような第一及び第二の固定相は、それぞれ、カラム管中の粒子状の充填剤による充填層（以下、「充填型固定相」とも言う）か、通液性を有する柱状体（以下、「一体型固定相」とも言う）か、又は、非通液性の柱状又は筒状の支持体の周面に形成される、通液性を有する分離剤層（以下、「薄層型固定相」とも言う）、によって構成することができる。

前記充填型固定相は、充填剤をカラム管に充填することによって構成することができる。第一の固定相としての充填型固定相は、試料中の成分と同じ光学応答性と前記分離能とを有する分離剤を含む第一の充填剤をカラム管に充填することによって構成することができる。

第一の充填剤には、前記光学応答性と分離能とを有する分離剤から形成される粒子、前記光学応答性を有している粒子状の担体と、この担体に担持される前記分離能を有する分離剤とからなる粒子、及び、前記光学応答性を有さない粒子状の担体と、この担体に担持される前記光学応答性と分離能とを有する分離剤とからなる粒子、のいずれかを用いることができる。

前記分離剤は、少なくとも前記分離能を有する。前記分離剤は、担体が前記光学応答性を有さない場合は、前記分離能に加えて光学応答性を有する。光学応答性を有さない分離剤としては、例えば紫外線応答性を有さない分離剤として、芳香族基を含まない分離剤が挙げられる。紫外線応答性を有する分離剤としては、例えば芳香族基を含む分離剤が挙げられる。前記分離剤は、分離対象となる試料中の成分に応じて適宜に決められる。例えば光学異性体の分離であれば、分離剤には光学異性体用分離剤が用いられる。

前記分離剤には、前記光学応答性を有する低分子系の分離剤や高分子系の分離剤のいずれも用いることができる。低分子系の分離剤としては、例えば、配位子交換型の分離剤、電化移動（π−π）型の分離剤、水素結合型の分離剤、包接型の分離剤、イオン結合型の分離剤、インターカレート型の分離剤、クラウンエーテル又はその誘導体、及び、シクロデキストリン又はその誘導体、が挙げられる。高分子系の分離剤としては、例えば多糖誘導体、ポリアミド、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリルアミド、タンパク質、及び酒石酸誘導体が挙げられる。

前記光学異性体用分離剤には、種々の分離剤が知られているが、分離性能は汎用性の観点から、多糖誘導体であることが好ましい。このような多糖誘導体としては、例えば多糖と、多糖の水酸基或いはアミノ基の一部又は全部と置き換わった芳香族エステル基、芳香族カルバモイル基、及び芳香族エーテル基のいずれかとからなる化合物が挙げられ、例えばセルロースのフェニルカルバメート誘導体、セルロースのフェニルエステル誘導体、アミロースのフェニルカルバメート誘導体、及びアミロースのフェニルエステル誘導体が挙げられる。これらの誘導体におけるフェニル基は炭素数１〜２０の炭化水素、及びハロゲンからなる群から選ばれる一以上の置換基を有していてもよい。多糖の芳香族エステル誘導体として、より具体的にはセルロース トリス（４−メチルベンゾエート）が挙げられる。また多糖の芳香族カルバモイル誘導体として、より具体的にはアミロース トリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）が挙げられる。さらに多糖の芳香族エーテル誘導体として、より具体的にはセルロース トリベンジルエーテルが挙げられる。

前記担体は、前記分離能を有さない物質が用いられる。第一の充填剤の場合には、前記担体は、分離剤が試料中の成分と同じ光学応答性を有さない場合にはその光学応答性を有する。光学応答性を有さない担体としては、例えば紫外線応答性を有さない担体として、芳香族基を含まない担体が挙げられ、光学応答性を有する担体としては、例えば紫外線応答性を有する担体として、芳香族基を含む担体が挙げられる。

前記担体は、多孔質体であることが、分離性能を高める観点から好ましい。また前記担体は、前記分離能を有さない範囲において表面が修飾されていてもよい。前記担体としては、例えば架橋ポリスチレン、架橋アクリル系ポリマー、エポキシ重合物等の合成高分子、セルロースやそれを架橋によって強化した架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、及び架橋マンナン架橋体等の多糖、及び、アルミナ、シリカゲル、メソポーラスシリカゲル、ゼオライト、珪藻土、溶融シリカ、粘度鉱物、ジルコニア、金属等の無機物、が挙げられる。

第一の固定相としての一体型固定相は、前記成分と同じ光学応答性と通液性と前記分離能とを有する第一の柱状体によって構成することができる。このような第一の柱状体は、少なくとも表面に前記分離剤を有する柱状の多孔質体によって形成される。このような多孔質体は、柱状に充填された第一の充填剤の粒子の接合、前記分離剤による柱状の多孔質体、及び、前記担体による柱状の多孔質体とこれに担持される前記分離剤、のいずれかによって形成することができる。

第一の充填剤の粒子の接合による多孔質体は、例えば特開平４−９３３３６号公報に記載されている方法を利用して、第一の充填剤の粒子が不溶な溶剤に可溶なプラスチック粒子と第一の充填剤とを混合し、得られた混合物を加熱加圧処理して成型し、得られた成形体から可溶性のプラスチックを溶剤処理によって除去することによって形成することができる。前記分離剤による柱状の多孔質体も、前記の方法を利用して形成することができる。

前記担体による柱状の多孔質体は、担体粒子の接合や担体による柱状体の多孔質化によって形成することができる、担体粒子の接合による多孔質体は、担体粒子が高分子や多糖等の有機化合物である場合には、前記の方法を利用して形成することができる。前記担体による柱状体の多孔質化による多孔質体は、例えば特許第３３９７２５５号公報や特許第３３１７７４９号公報に記載されている方法、いわゆるゾル−ゲル法を利用して形成することができる。

前記担体による柱状の多孔質体への分離剤の担持は、例えば、担体に分離剤を物理的に吸着させる、又は化学的に結合させて、多孔質体の細孔の表面を修飾、改質する公知の方法を利用して行うことができる。

前記柱状体は、分離検出時における固定相の断面全域における通液速度の均一化の観点から円柱体であることが好ましい。

第一の固定相としての薄層型固定相は、非通液性の柱状又は筒状の支持体の周面に形成される、通液性を有する前記分離剤の層によって構成することができる。前記支持体における非通液性とは、支持体の軸方向に対する断面方向の全域（支持体の軸を垂直に横断する支持体の断面の全域）において液体を通さない性質を言う。前記支持体としては、例えばガラス製、金属製、合成樹脂製、又は合成樹脂シートの貼り付け等による撥液処理を施した紙製の柱状体や筒が挙げられる。前記支持体は、均一な厚さの分離剤層の容易な形成や、他の形態の固定相との容易な接続の観点から、円柱体又は円筒体であることが好ましい。

前記分離剤の層は、前記支持体の周面に形成される。分離剤層は、支持体の形態に応じて、支持体の外周面に形成されてもよいし、内周面に形成されてもよい。分離剤層は、通液性を有する。このような分離剤層は、前記第一の充填剤による層や、少なくとも表面に前記分離剤を有し、かつ通液性を有するシートによって形成することができる。分離剤層の厚さは、分離検出時における移動相の適切な速度での移動の観点から、０．００５〜５ｍｍであることが好ましく、０．０１〜３ｍｍであることがより好ましく、０．１〜１ｍｍであることがさらに好ましい。このような薄層型固定相は、例えば必要に応じてバインダ等の他の成分を含有する前記分離剤のスラリーの支持体の周面への塗布や、前記分離剤を表面に有する通液性のシートの支持体の周面への巻着によって形成することができる。

第二の固定相としての充填型固定相は、第一の固定相とは異なる光学応答性を有する第二の充填剤をカラム管に充填することによって構成することができる。第二の充填剤には、前述した分離剤のうち、第一の固定相における分離剤とは前記光学応答性が異なる粒子状の分離剤や粒子状の前記担体を用いることができる。また第二の固定相としての一体型固定相は、第一の固定相とは異なる光学応答性と通液性とを有する第二の柱状体によって構成することができる。第二の柱状体は、第一の固定相における分離剤とは前記光学応答性が異なる分離剤を用いる以外は前記第一の柱状体と同様に構成することができ、また前記担体による柱状の多孔質体によって構成することができる。さらに第二の固定相としての薄層型固定相は、第一の固定相とは異なる光学応答性を有する通液性の層を前記支持体の周面に形成することによって構成することができる。このような層は、例えば第一の固定相における分離剤とは前記光学応答性が異なる粒子状の分離剤の支持体の周面への塗布や、前記担体のスラリーの支持体の周面への塗布や、前記分離剤を有さない通液性のシートの支持体の周面への巻着によって形成することができる。

前記第二の固定相は、前記分離能を有していてもよいし、有していなくてもよい。第二の固定相が前記分離能を有することは、第二の固定相における前記成分のさらなる分離を可能とする観点から好ましく、例えば第一の固定相から所望の成分のスポットのさらなる分析や、第二の固定相を取り外した後の抽出操作やその後の分析に好適に用いることができる。第二の固定相が前記分離能を有さないことは、第一の固定相における分離状態を正確に検出する観点から好ましく、例えば第一の固定相で分離した成分の検出や分取に加えて、第一の固定相における分離剤のＲｆ値の正確な測定に好適に用いることができる。

第二の固定相は、第二の固定相におけるスポットの確認の観点から、光学応答性を有さないことが好ましく、試料中の成分や第一の固定相の光学応答性とは対照的な光学応答性を有していることがより好ましい。例えば第一の固定相が前記光学異性体用分離剤を含む場合であれば、前記第二の固定相が光学異性体用分離剤を含まないことが好ましく、例えば前記成分や第一の固定相が紫外線を吸収する成分である場合では、第二の固定相は、紫外線に対する応答性を有さないことが好ましく、紫外線によって発光することがより好ましい。このような光学特性が調整された第二の固定相は、例えば紫外線応答性を有さない固定相に、紫外線の照射によって蛍光を発する蛍光剤を塗布することによって形成することができる。

前記カラム管は、第一の固定相のみを含む場合には、光透過性を有していても有していなくてもよい。ここで光透過性とは、第二の固定相におけるスポットの光学的特徴（発色、発光、及び吸光等）を確認可能な透明性を言う。前記カラム管は、第二の固定相を含む場合には光透過性を有する。

前記カラム管は、移動相の位置、状態、スポットの状態等の分離操作時の状態を観察する観点から、少なくともこれらの状態を確認できる程度の透明性を有することが好ましい。このようなカラム管には、例えば石英ガラスの管や、ＰＦＡ（テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体）等のフッ素樹脂製の管を用いることができる。さらにカラム管は、軸方向にレンズの作用を奏する厚みが設けられていてもよく、このようなカラム管は、スポットが拡大して示されることから、スポットの目視での確認を容易にする観点から好ましい。

前記カラム管の長さは、充填剤の分離能が適切に発現される長さであればよく、前記成分の分離の観点からは長いことが好ましく、取り扱いの容易さや分離検出操作の簡便さの観点からは短いことが好ましい。このような観点から、第一又は第二の固定相に用いられるカラム管の長さは、２〜５０ｃｍであることが好ましく、３〜３０ｃｍであることがより好ましく、３〜２０ｃｍであることがさらに好ましい。

前記カラム管は、前記成分の迅速な分離の観点からは細いことが好ましく、前記成分の検出の容易さや分取の観点からは太いことが好ましい。このような観点から、カラム管の内径は、０．１〜１０ｍｍであることが好ましく、０．１〜８ｍｍであることがより好ましく、０．１〜５ｍｍであることがさらに好ましい。

前記充填剤の粒径は、前記成分の分離の観点からは小さいことが好ましく、前記成分の迅速な分離の観点からは大きいことが好ましい。このような観点から、充填剤の粒径は、０．５〜５０μｍであることが好ましく、１〜３０μｍであることがより好ましく、１〜２０μｍであることがさらに好ましい。充填剤の粒径は、充填剤の粒子の大きさを代表する値であればよく、平均粒径であってもよいし、カタログ値であってもよい。充填剤の粒径は、例えばレーザー回折・散乱法によって求めることができる。

第一及び第二の固定相は、互いの端同士が通液自在に連結される。ここで通液自在とは、第一から第二の固定相へ、固定相の軸方向に対する断面（固定相の軸を垂直に横断する固定相の断面）全域において液体が通じることを言う。第一及び第二の固定相は直接連結されていてもよいし、両者を通液自在に連結する連結具を介して連結されていてもよいし、通液性を有するスペーサを介して連結されていてもよい。また第一及び第二の固定相は、それぞれ、前述した充填型固定相であってもよいし、一体型固定相であってもよいし、薄層型固定相であってもよい。

例えば第一及び第二の固定相が充填型固定相である場合では、このような分離検出用カラムは、光透過性を有するカラム管と、カラム管の一端側に充填される前記分離剤を含む充填剤と、カラム管の他端側に充填される、前記分離剤を含まない充填剤又は粒子状の担体とによって形成することができる。カラム管の中央には、前記スペーサを設けることが好ましい。このようなスペーサとしては、例えば、脱脂綿やグラスウール等の繊維塊、ろ紙、グラスフィルタ、及び、海砂等の、充填剤よりも粗い粒子、が挙げられる。

また第一及び第二の固定相のうち、一方が充填型固定相であって、他方が一体型固定相である場合では、このような分離検出用カラムは、充填型固定相を形成するカラム管と一体型固定相とを、直接、前記スペーサを介して、又は前記連結具を介して連結することによって形成することができる。充填型固定相と一体型固定相との直接連結は、例えば一体型固定相を充填型固定相のカラム管の一端に挿入することによって行うことができる。

前記連結具としては、例えば前記第一及び第二の固定相の両方の端部に嵌合する連結具や、前記第一及び第二の固定相の一端の外周面に巻きつけられる粘着材が挙げられる。
前記連結管としては、例えば、図１に示すように、第一及び第二の固定相の両方の端部に外嵌する合成樹脂製等の非通液性の円管１１からなる連結具や、図２に示すように、第一及び第二の固定相の両方の端部に外嵌する非通液性の円管１２とその内周面の中央部に周設されるセラミックペーパーやガラスウール等の通液材料１３とからなる連結具や、図３に示すように、非通液性の円柱体１４とその外周面を被覆する通液材料１５とからなり、カラム管や円筒状の支持体に内嵌する連結具が挙げられる。

図１の連結具は、例えば、充填型固定相同士、一体型固定相同士、又は充填型固定相と一体型固定相との連結に好適に用いることができる。図２の連結具は、例えば、支持体の外周面に分離剤層を有する薄層型固定相同士、又はこの薄層型固定相と他の固定相との連結に好適に用いることができる。図３の連結具は、例えば、円筒状の支持体の内周面に分離剤層を有する薄層型固定相同士、又はこの薄層型固定相と充填型固定相との連結に好適に用いることができる。

なお、図示の連結具はいずれも円筒状又は円柱状の形態としたが、一体型固定相や充填型固定相の断面形状に合致する、円形以外の断面形状を有していてもよいし、また、一端側の断面形状が円形で、他端側の断面形状が多角形等の非円形である筒状又は柱状の形態であってもよい。

また第一及び第二の固定相のうち、一方が充填型固定相であって、他方が薄層型固定相である場合では、このような分離検出用カラムは、充填型固定相を形成するカラム管と、薄層型固定相を形成する、分離剤層を有する支持体とを、充填型固定相と一体型固定相との連結と同様に、直接、前記スペーサを介して、又は前記連結具を介して連結することによって形成することができる。

また第一及び第二の固定相がそれぞれ一体型固定相である場合では、第一及び第二の固定相を形成するそれぞれの一体型固定相を、前記連結具を介して連結することによって形成することができる。又は、これらの一体型固定相をカラム管に挿入してカラム管内で直接、又は前記スペーサを介して連結してもよい。

また第一及び第二の固定相のうち、一方が一体型固定相であって、他方が薄層型固定相である場合では、このような分離検出用カラムは、一体型固定相と、薄層型固定相を形成する分離剤層を有する支持体とを、直接、又は前記連結具を介して連結することによって形成することができる。

また第一及び第二の固定相がそれぞれ薄層型固定相である場合では、このような分離検出用カラムは、前記支持体の周面の一端側に前記分離剤を含む通液性の第一の分離剤層を形成し、前記支持体の周面の他端側に、第一の分離剤層に隣接して、前記分離剤を含まない充填剤又は粒子状の前記担体による通液性の第二の分離剤層を形成することによって形成することができる。

なお、第一及び第二の固定相の両方が充填型固定相又は薄層型固定相である場合では、このような分離検出用カラムは、第一の固定相を第一のカラム管又は第一の支持体を用いて形成し、第二の固定相を第二のカラム管又は第二の支持体を用いて形成し、それぞれのカラム管同士又は支持体同士を、前記の連結具を介して連結することによって形成することも可能である。

また、第一及び第二の固定相の両方が薄層型固定相である場合では、このような分離検出用カラムは、第一及び第二の固定相の一方の支持体に柱状の支持体を用い、他方の支持体に、前記柱状の支持体に外嵌する筒状の支持体を用い、かつこの筒状の支持体の内周面に分離剤層を形成する場合には、これらの支持体同士を直接連結することによって形成することも可能である。

第一の固定相の長さと第二の固定相との長さは、各固定相において分離能が適切に発現される長さであればよく、同じであっても異なっていてもよい。第一の固定相は成分の分離に十分な長さを有していればよく、第二の固定相は成分の検出に十分な長さを有していればよい。例えば第一の固定相の長さは１〜４０ｃｍであることが好ましく、１．５〜２５ｃｍであることがより好ましく、２〜１８ｃｍであることがさらに好ましい。また、第二の固定相の長さは１〜４０ｃｍであることが好ましく、１．５〜２５ｃｍであることがより好ましく、２〜１８ｃｍであることがさらに好ましい。

本発明の分離検出用カラムでは、第一及び第二の固定相の軸方向に移動相を通液させる。本発明の分離検出用カラムは、第一の固定相の一端に試料を付着させ、付着させた試料を必要に応じて乾燥させ、第一の固定相の一端から第二の固定相の他端へ移動相を通して試料中の成分を第一の固定相で分離し、分離した成分の少なくとも一つを第二の固定相に到達させることによって、また第二の固定相においてさらなる分離に供することによって、試料中の成分の分離に用いることができる。また本発明の分離検出用カラムは、さらに第二の固定相に紫外線を照射するか、又は発色試薬の発色処理を施すことによって、第二の固定相に到達した成分の検出に用いることができる。さらに本発明の分離検出用カラムは、第二の固定相に到達した成分を含む第二の固定相の一部又は全部を取り出し、必要に応じて抽出することによって、第二の固定相に到達した成分の分取に用いることができる。

移動相には、水、塩の水溶液、有機溶剤、及びこれらの混合溶剤を用いることができる。有機溶剤は一種でも二種以上でもよい。塩としては、例えば硫酸銅水溶液及び過塩素酸塩が挙げられる。有機溶剤としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール、及び、ヘキサン等の炭化水素が挙げられる。また移動相には、酸やアルカリを適量混合してもよい。酸としては、検出しようとする成分の安定化の観点から、例えば酢酸、プロピオン酸、及びテトラフルオロ酢酸が挙げられ、アルカリとしては、例えばジエチルアミン、モノエタノールアミン、及びトリエチルアミンが挙げられる。

第二の固定相において、発色試薬による光学応答性によって前記成分を検出する場合には、発色試薬及びその発色処理については公知の技術を採用することができる。このような発色試薬としては、例えば、アニスアルデヒド溶液、リンモリブデン酸溶液、ヨウ素、ニンヒドリン溶液、カメレオン溶液、ＤＮＰＨ溶液、塩化マンガン溶液、及びブロモクレゾールグリーン溶液が挙げられる。発色処理としては、例えば、発色試薬を第二の固定相へ塗布、散布、又は暴露によって付着させ、必要に応じて第二の固定相を加熱して発色させる処理が挙げられる。

本発明の分離検出用カラムでは、第一及び第二の固定相が円柱状又は円筒状であることが、固定相の軸方向における移動相の均一な通液の観点から好ましい。また充填型固定相の場合では、このような均一な通液を可能とする固定相を、タッピングによる充填剤の充填や分離剤溶液への多孔質体の浸漬、或いは支持体への分離剤のスラリーの塗布によって容易に形成することができる。

さらに充填型固定相や、分離剤又は担体の円柱体に連続気泡を形成してなる多孔質の一体型固定相の場合では、薄層クロマトグラフィープレートにおける分離層の形成で用いられるバインダ等の、相の形成に要する助剤を用いることなく固定相を形成することができることから、このような助剤による分離への影響を除くことができる。さらには、薄層クロマトグラフィープレートのような他の分離検出用の器具に対して、その形成や使用が容易であり、操作性に優れている。

本発明は、前述した本発明の分離検出用カラムを組み立て可能なキットを含む。このような分離検出用キットは、光透過性を有する前記カラム管と、試料中の成分の分離能と、この成分の光学応答性と同じ光学応答性と、を有する前記第一の充填剤と、この第一の分離剤とは異なる光学応答性を有し前記分離能を有していてもよい前記第二の充填剤とを含む分離検出用キットであってもよい。この分離検出用キットにおいて、本発明の分離検出用カラムは、カラムの一端側に第一の充填剤を充填し、第一の充填剤層に隣接して、又は前記スペーサを介してカラムの他端側に第二の充填剤を充填することによって構成することができる。この分離検出用キットは、分離検出用カラムにおいて、充填剤の種類や固定相の長さを任意に設定することができることから、例えば分離条件の検討により効果的である。

また前記分離検出用キットは、前記カラム管と、前記第一の充填剤と、前記カラム管に通液自在に連結される第二の円柱体及び第二の薄層クロマトグラフィー棒の一方又は両方とを含む分離検出用キットであってもよい。第二の円柱体は、第一の充填剤の光学応答性とは異なる光学応答性を有し前記分離能を有していてもよい前記一体型固定相である。第二の薄層クロマトグラフィー棒は、柱状又は筒状の非通液性の支持体と、この支持体の外周面又は内周面に形成される分離剤層とを有し、この分離剤層が第一の充填剤の光学応答性とは異なる光学応答性を有し前記分離能を有していてもよい部材であり、前記薄層型固定相を形成する。この分離検出用キットにおいて、第一の固定相は、カラム管に第一の充填剤を充填することによって形成することができる。本発明の分離検出用カラムは、カラム管の端部に第二の円柱体又は第二の薄層クロマトグラフィー棒を挿入することによって構成することができる。この分離検出用キットは、分離検出用カラムにおいて、第一の充填剤の種類を任意に設定でき、かつ第一の固定相と第二の固定相との連結が容易であることから、例えば分離条件の容易な検討により効果的である。

なお、薄層クロマトグラフィー棒は、柱状又は筒状の支持体の外周面に分離剤層が形成されてなる形態と、筒状の支持体の内周面に分離剤層が形成されてなる形態とを含む。柱状の支持体には、例えば断面形状が多角形や円形の棒を用いることができ、筒状の支持体には、例えば断面形状が多角形の管や、カラム管や、カラム管と同じ寸法の管を用いることができる。

また前記分離検出用キットは、第一の円柱体及び第一の薄層クロマトグラフィー棒の一方又は両方と、これらと通液自在に連結される、光透過性を有するカラム管と、前記第二の充填剤とを含む分離検出用キットであってもよい。第一の円柱体は、通液性と、試料中の成分の分離能と、前記成分の光学応答性と同じ光学応答性と、を有する前記一体型固定相である。第一の薄層クロマトグラフィー棒は、前記支持体とこの支持体の外周面又は内周面に形成される分離剤層とを有し、この分離剤層が通液性と、試料中の成分の分離能と、前記成分の光学応答性と同じ光学応答性と、を有する部材であり、前記薄層型固定相を構成する。この分離検出用キットにおいて、第二の固定相は、カラム管に第二の充填剤を充填することによって形成することができる。本発明の分離検出用カラムは、カラム管の端部に第一の円柱体又は第一の薄層クロマトグラフィー棒を挿入することによって構成することができる。この分離検出用キットは、分離検出用カラムにおいて、第二の固定相が充填型固定相であることから、任意のスポットを含む固定相の部分を粒子状の充填剤として取り出すことができることから、例えば成分の分取により効果的である。

また前記分離検出用キットは、前記第一の柱状体及び前記第一の薄層クロマトグラフィー棒の一方又は両方と、前記第二の柱状体及び前記第二の薄層クロマトグラフィー棒の一方又は両方と、第一の柱状体又は第一の薄層クロマトグラフィー棒と第二の柱状体又は第二の薄層クロマトグラフィー棒とを通液自在に連結する前記連結具とを含む分離検出用キットであってもよい。この分離検出用キットにおいて、第一の柱状体又は第一の薄層クロマトグラフィー棒と第二の柱状体又は第二の薄層クロマトグラフィー棒とを、連結具を介して連結することによって本発明の分離検出用カラムを構成することができる。この分離検出用キットは、分離検出用カラムにおいて、第一及び第二の固定相の連結が容易であることから、分離の容易な検出により効果的である。

また前記分離検出用キットは、光透過性を有していなくてもよい第一のカラム管と、前記第一の充填剤と、光透過性を有する第二のカラム管と、前記第二の充填剤と、これらのカラム管を通液自在に連結する連結具とを含む分離検出用キットであってもよい。この分離検出用キットにおいて、第一の充填剤を充填した第一のカラム管と第二の充填剤を充填した第二のカラム管とを、連結具を介して連結することによって、本発明の分離検出用カラムを構成することができる。この分離検出用キットは、充填剤の詰め替えによって各固定相を一本のカラム管に対して複数回形成することができ、かつこれらの固定相を容易に連結することができることから、各充填型固定相の容易な形成と分離検出用カラムの利用後の廃棄物の発生の抑制とに、より効果的である。

また前記分離検出用キットは、円柱状又は円筒状の固定相と、多角形等の非円形の断面形状を有する柱状又は筒状の固定相と、これらを通液自在に連結する連結具とを含んでいてもよい。この分離検出用キットは、断面形状の異なる固定相を連結してなる分離検出用カラムを形成することができる。なお、非円形の断面形状を有する固定相は、例えば円筒状のカラム管に充填剤を充填してなるカラムの側面から圧力をかけることによってなる、断面形状が楕円形のカラムは、充填密度をより大きく、またより均一にすることができ、分離能のさらなる向上の観点から好ましく、また例えば断面形状が楕円形や矩形の固定相は、毛細管現象を発現させやすい観点、充填剤の充填量の低減の観点、又は側面からスポットを目視で確認しやすい観点から好ましい。前記の分離検出用キットは、一方の固定相に前述の長所を有する固定相を有する分離検出用カラムを形成することができる。

また前記分離検出用キットは、これらのキットの複数のキットの構成要素を一つのキットに含んでいてもよい。さらに前記分離検出用キットは、分離検出用カラムの組み立てや使用に有用なさらなる部材を含んでいてもよい。このようなさらなる部材としては、例えば、前記連結具、カラム管のエンドキャップ、カラム管と移動相の管とを連結する管継手、分離検出用カラムのスタンド、分離検出時に分離検出用カラムと移動相とを収容する容器、及び、必要に応じてカラム管や連結具に挿入される前記スペーサが挙げられる。

また前記分離検出用キットは、分離剤の種類が異なる二種以上の充填剤、円柱体、柱状体、及び薄層クロマトグラフィー棒を含んでいてもよいし、大きさや材料、物性が異なる二種以上のカラム管、円柱体、柱状体、及び薄層クロマトグラフィー棒を含んでいてもよい。このような分離検出用キットは、分離検出用カラムの分離条件の検討への利用の観点からより効果的である。

以下に本発明の一具体例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されない。

本実施例における分離検出用カラムを図４に示す。
図４の分離検出用カラムは、紫外線透過性を有する管１と、この管１の一端側に充填される第一の充填剤層２と、管１の他端側に充填される第二の充填剤層３と、第一及び第二の充填剤層２、３の間に介在する通液性を有するスペーサ４と、管１の他端側に詰められたエンドキャップ５とを有する。

管１はポリテトラフルオロエチレン製の管である。管１の外径は３ｍｍであり、管１の内径は１ｍｍであり、管１の長さは６ｃｍである。

第一の充填剤層２は、ダイセル化学工業株式会社製ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（同社の登録商標）の充填剤（以下、「ＡＤ充填剤」とも言う）の層である。このＡＤ充填剤の粒径は２０μｍである。また第一の充填剤層２の充填長さは３ｃｍである。

第二の充填剤層３は、シリカゲルの層である。このシリカゲルは蛍光剤としてマンガン含有ケイ酸亜鉛を含んでいる。このシリカゲルの粒径は１５μｍである。また第二の充填剤層３の充填長さは３ｃｍである。

スペーサ４及びエンドキャップ５はそれぞれ石英ウールである。スペーサ４の充填長さは４ｍｍである。

図４の分離検出用カラムは、管１の他端にエンドキャップ５を詰め、管１の一端からシリカゲルをタッピングによって充填し、次いでスペーサ４を管１の一端から詰めて第二の充填剤層２の一端側を押さえ、次いで管１の一端からＡＤ充填剤をタッピングによって管１の一端まで充填することによって構成されている。

管１の一端、すなわち第一の充填剤層２の一端部に試料溶液を付着させる。試料溶液はトランス−スチルベンオキシド（ｔ−ＳＯ）の溶液である。この試料溶液における溶剤はｎ−ヘキサンとイソプロピルアルコールを体積比で１：９で含有する混合溶剤であり、試料の濃度は１０，０００質量ｐｐｍである。試料溶液の付着は、分離検出用カラムの一端を試料溶液に直接浸漬することによって行った。試料溶液の付着は、例えばパルツールピペットを用いて分離検出用カラムの一端から第一の充填剤層２へ試料溶液を滴下することによって行ってもよい。

次いで展開液（移動相）を分離検出用カラムの一端から第一の充填剤層２へ約０．０５ｍＬ滴下して第一の充填剤層２に浸透させる。展開液は、ｎ−ヘキサンとイソプロピルアルコールを体積比で９：１で含有する混合溶剤である。浸透後、分離検出用カラムを、展開液を収容している容器内に、分離検出用カラムの一端が展開液に浸されるように立てかけ、第一及び第二の充填剤層２及び３において試料を展開させる。

毛細管現象によってエンドキャップ５まで展開液を展開させ、第二の充填剤層３に紫外線を照射することにより、図５に示すように、図中の斜線部で示されるような蛍光が観察され、第一の充填剤層２で分離したｔ−ＳＯのラフィネート成分（ＡＤ充填剤により吸着されにくい成分）のスポットが、蛍光を発しない領域として観察される。

近年では製薬の有効成分やその原料として有用な光学異性体のさらなる開発が求められており、それに伴って、光学異性体の確認や光学異性体のより精密な分離の技術の開発も求められている。本発明によれば、多糖誘導体による光学異性体用分離剤のように紫外線応答性を有する分離剤による光学分割をカラムクロマトグラフィーによって簡便に行うことができ、液体クロマトグラフィーの条件の初期設定や最適化の有用な材料をより簡便に提供することができる。したがって、本発明によって、さらに有用な光学異性体の開発やより生産性に優れた光学異性体の製造方法の確立等の、クロマトグラフィーによる分離を伴う技術のさらなる発展が期待される。

１ 管
２ 第一の充填剤層
３ 第二の充填剤層
４ スペーサ
５ エンドキャップ
１１、１２ 円管
１３、１５ 通液部材
１４ 円柱体

Claims (22)

1. 通液性を有する柱状又は筒状の第一及び第二の固定相を有し、第一及び第二の固定相の端同士が通液自在に連結され、第一及び第二の固定相の軸方向に移動相を通液させる分離検出用カラムであって、
   第一の固定相は、試料中の成分の分離能と、この成分の紫外線又は発色試薬に対する光学応答性と同じ光学応答性と、を有し、
   第二の固定相は、前記成分とは異なる光学応答性を有する、分離検出用カラム。
2. 前記第二の固定相が前記分離能を有さないことを特徴とする請求項１に記載の分離検出用カラム。
3. 前記第一及び第二の固定相が、それぞれ、カラム管中の粒子状の充填剤による充填層、通液性を有する柱状体、又は、非通液性の柱状又は筒状の支持体の周面に形成される、通液性を有する分離剤層、によって構成されることを特徴とする請求項１又は２に記載の分離検出用カラム。
4. 前記柱状体の形状が円柱状であり、前記支持体の形状が円柱状又は円筒状であることを特徴とする請求項３に記載の分離検出用カラム。
5. 前記第一の固定相が光学異性体用分離剤を含み、前記第二の固定相が光学異性体用分離剤を含まないことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離検出用カラム。
6. 前記光学異性体用分離剤が多糖誘導体であることを特徴とする請求項５に記載の分離検出用カラム。
7. 前記多糖誘導体が、多糖と、多糖の水酸基或いはアミノ基の一部又は全部と置き換わった芳香族エステル基、芳香族カルバモイル基、及び芳香族エーテル基のいずれかとからなることを特徴とする請求項６に記載の分離検出用カラム。
8. 光透過性を有するカラム管と、
   試料中の成分の分離能と、この成分の紫外線又は発色試薬に対する光学応答性と同じ光学応答性と、を有する粒子状の第一の充填剤と、
   前記成分とは異なる光学応答性を有する粒子状の第二の充填剤と、を含む分離検出用キット。
9. 前記第二の充填剤が前記分離能を有さないことを特徴とする請求項８に記載の分離検出用キット。
10. 前記第一の充填剤が光学異性体用分離剤を含み、前記第二の充填剤が光学異性体用分離剤を含まないことを特徴とする請求項９に記載の分離検出用キット
11. カラム管と、
    試料中の成分の分離能と、この成分の紫外線又は発色試薬に対する光学応答性と同じ光学応答性と、を有する粒子状の第一の充填剤と、
    前記カラム管に通液自在に連結される第二の円柱体及び第二の薄層クロマトグラフィー棒の一方又は両方と、を含む分離検出用キットであって、
    前記第二の円柱体は、前記成分とは異なる光学応答性と通液性とを有し、
    前記第二の薄層クロマトグラフィー棒は、非通液性の円柱状又は円筒状の支持体と、この支持体の周面に形成される、前記成分とは異なる光学応答性と通液性とを有する第二の分離剤層と、を有する、分離検出用キット。
12. 前記第二の円柱体及び前記第二の分離剤層が前記分離能を有さないことを特徴とする請求項１１に記載の分離検出用キット。
13. 前記第一の充填剤が光学異性体用分離剤を含み、前記第二の分離剤層が光学異性体用分離剤を含まないことを特徴とする請求項１２に記載の分離検出用キット
14. 通液性と、試料中の成分の分離能と、この成分の紫外線又は発色試薬に対する光学応答性と同じ光学応答性と、を有する第一の円柱体、及び、非通液性の円柱状の支持体とこの支持体の周面に形成される第一の分離剤層とを有する第一の薄層クロマトグラフィー棒、の一方又は両方と、
    光透過性を有し、前記第一の円柱体又は第一の薄層クロマトグラフィー棒と通液自在に連結されるカラム管と、
    前記成分とは異なる光学応答性を有する粒子状の第二の充填剤と、を含み、
    前記第一の分離剤層が、前記分離能と、前記成分と同じ光学応答性と、通液性と、を有する、分離検出用キット。
15. 前記第二の充填剤が前記分離能を有さないことを特徴とする請求項１４に記載の分離検出用キット。
16. 前記第一の円柱体及び第一の分離剤層が光学異性体用分離剤を含み、前記第二の充填剤が光学異性体用分離剤を含まないことを特徴とする請求項１５に記載の分離検出用キット
17. 通液性と試料中の成分の分離能と、この成分の紫外線又は発色試薬に対する光学応答性と同じ光学応答性と、を有する第一の柱状体、及び、非通液性の柱状又は筒状の支持体とこの支持体の周面に形成される第一の分離剤層とを有する第一の薄層クロマトグラフィー棒、の一方又は両方と、
    前記成分とは異なる光学応答性と通液性とを有する第二の柱状体、及び、非通液性の柱状又は筒状の支持体とこの支持体の周面に形成される第二の分離剤層とを有する第二の薄層クロマトグラフィー棒、の一方又は両方と、
    第一の柱状体又は第一の薄層クロマトグラフィー棒と第二の柱状体又は第二の薄層クロマトグラフィー棒とを通液自在に連結する連結具と、を含み、
    前記第一の分離剤層が、前記分離能と、前記成分と同じ光学応答性と、通液性と、を有し、
    前記第二の分離剤層が、前記成分とは異なる光学応答性と通液性とを有する、分離検出用キット。
18. 前記第二の柱状体及び前記第二の分離剤層が前記分離能を有さないことを特徴とする請求項１１に記載の分離検出用キット。
19. 前記第二の柱状体の形状が円柱状であり、及び前記支持体の形状が円柱状又は円筒状であることを特徴とする請求項１１又は１４に記載の分離検出用キット。
20. 前記第一の柱状体及び第一の分離剤層が光学異性体用分離剤を含み、前記第二の柱状体及び第二の分離剤層が光学異性体用分離剤を含まないことを特徴とする請求項１８又は１９に記載の分離検出用キット。
21. 前記光学異性体用分離剤が多糖誘導体であることを特徴とする請求項１０、１３、１６、及び２０のいずれか一項に記載の分離検出用キット。
22. 前記多糖誘導体が、多糖と、多糖の水酸基或いはアミノ基の一部又は全部と置き換わった芳香族エステル基、芳香族カルバモイル基、及び芳香族エーテル基のいずれかとからなることを特徴とする請求項２１に記載の分離検出用キット。

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