JP5764057B2 - 有用物質生産方法及びこの生産方法で使用される界面活性剤 - Google Patents
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Description
タンパク質発現に用いる細菌として、グラム陰性菌の一種である大腸菌が汎用されている。大腸菌をタンパク質発現に利用する技術の開発が進んでおり、この技術は工業用タンパク質、食品加工用タンパク質及び医薬品用タンパク質の生産にまで幅広く用いられている。
従って得られるタンパク質量を増やすためには、以下の方法が有効である。
1.1細胞当たりの発現している組み換えタンパク質量を増加させる方法。
2.細胞数を増加させる方法。
1.大腸菌を破砕するための設備が必要である。
2.同時に抽出されるゲノムDNAを初めとする核酸成分がタンパク質抽出液の増粘の原因となるので、精製過程を進めるために核酸成分をタンパク質抽出液から除去する必要がある。
3.大腸菌由来のタンパク質やその他不純物がタンパク質抽出液に多量に混入するこが、毒性や免疫原性の原因となる。
4.多量に混入する大腸菌由来のタンパク質を組み換えタンパク質から分離するための精製工程が必要である。
5.大腸菌内に組み換えタンパク質が蓄積するため、生産量が限られる。
6.細菌の細胞内において封入体が形成される。
7.組み換えタンパク質が細胞内のプロテアーゼによって分解されるため、必要量の組み換えタンパク質が発現しない。
これらの欠点を解決するためには、大腸菌が組み換えタンパク質を培養液中に分泌生産する方法が必要である。
そこで、組み換えタンパク質を培養液中へ分泌生産するために一連の方法が開示されている(非特許文献1〜7)。
1.大腸菌が死にやすいため、高密度又は連続生産に適さない。
2.特定の組み換えタンパク質の生産にしか適用できない。
3.組み換えタンパク質が膜タンパク質等との融合タンパク質として発現しているため、融合タンパク質が活性の発現に影響を与える可能性がある。そのため、融合タンパク質を切断する工程を必要とするので費用がかかる。
4.組み換えタンパク質の発現量が十分でない。
すなわち、本発明は培養液中に含まれる細菌により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質生産方法であり、培養液中には、界面活性剤(A)が含まれており、培養液の体積を基準とした乾燥菌体密度が1.5g/L〜500g/Lである有用物質生産方法及びこの有用物質生産方法で使用する界面活性剤である。
本発明の有用物質の生産方法は、有用物質の高生産量を達成することができる。
また、本発明の界面活性剤は、細菌を用いて有用物質(タンパク質等)を生産する際に添加することによって、生産量及び分泌量を増大させる事が可能である。
ペリプラズムとは、細菌の細胞質膜より外側で細菌の最表面までの空間の事である。
ペリプラズムへの移行に必要なシグナル配列としては、Sec分泌シグナル配列やTAT分泌シグナル等が挙げられる。
[R−NH−(CH2)n−COO−]mM (1)
一般式(1)中、Rは炭素数1〜20の1価の炭化水素基である。nは1以上の整数である。mは1以上の整数である。Mはプロトン;又はアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム(アミン及びアルカノールアミン等由来のカチオンを含む)及び第4級アンモニウム等の1価又は2価のカチオンである。
また、(A1−1−1)として具体的には、アルキルアミノプロピオン酸型両性界面活性剤(コカミノプロピオン酸ナトリウム、ステアリルアミノプロピオン酸ナトリウム及びラウリルアミノプロピオン酸ナトリウム等);アルキルアミノ酢酸型両性界面活性剤(ラウリルアミノ酢酸ナトリウム等)及びN−ラウロイル−N’−カルボキシメチル−N’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。
R−N+(CH3)2−CH2COO− (2)
一般式(2)中、Rは炭素数1〜20の1価の炭化水素基である。
水性希釈液における、界面活性剤(A)の合計濃度は、対象となる微生物、生理活性物質の種類及び抽出方法の種類によって適宜選択されるが、有用物質の分泌性及びハンドリング性の観点から、水性希釈液の重量を基準として、0.1〜99重量%が好ましく、より好ましくは1〜50重量%である。
なお、本発明においては、下記式によって定義される。
分泌効率(%)=100×{(X/Y)−Z}
X:遠心分離による菌体除去後に残る培養液中の有用物質
Y:培養液中の全有用物質
Z:溶菌した細菌の割合を示し、下記の式によって定義される。
Z=Z1/Z2
Z1:遠心分離による菌体除去後に残る培養液中の細胞質内局在物質
Z2:培養液中の全細胞質内局在物質
なお細胞質内局在物質とは、細胞質内に存在している物質であり、溶菌によって培養液中に溶出される物質をさす。
乾燥菌体密度は、次の手順(1)〜(5)により求める。
手順(1):あらかじめ容器(遠心チューブ)の重量を測定しておく。
手順(2):培養液100mlを手順(1)で重量を測定した容器に入れ、遠心分離(4,000G、15分、4℃)して、上澄みを抜き取り、細菌を集菌する。
手順(3):容器中の集菌した細菌を、0.9重量%NaCl水溶液[手順(2)で使用した培養液と同じ体積]で洗い、再度遠心分離(4,000G、15分、4℃)して、上澄みを抜き取り、細菌を集菌する。
手順(4):手順(3)で得られた細菌を容器にいれたままの状態で、105℃で10時間乾燥させた後、容器と細菌の合計の重量を測定する。
手順(5):手順(4)の後さらに105℃で2時間乾燥させた後、容器と細菌の合計の重量を測定して重量変化が無いことを確認する。さらに重量が減少するなら重量変化が無くなるまで105℃で乾燥を持続する。
手順(5)と手順(1)の測定値と手順(2)で使用した培養液の体積(L)を下記式に当てはめることにより、乾燥菌体密度を求める。
乾燥菌体密度(g/L)=([手順(5)の測定値]−[手順(1)の測定値])/0.1
細菌が大腸菌である場合の乾燥菌体密度は、培養液の体積を基準として、有用物質の生産が実施可能な観点から、1.5〜500g/Lであり、好ましくは3〜100g/Lであり、さらに好ましくは10〜50g/Lであり、最も好ましくは12〜27g/Lである。
本発明の有用物質の生産方法において、上記範囲内であれば、乾燥菌体密度が大きければ大きいほど有用物質の生産量は増加する。
工程(a):有用物質を生産する細菌(グラム陰性細菌等)を培養する培養液と界面活性剤を同時に存在させて有用物質を細胞外(培養液中)に分泌させる工程。
工程(b):工程(a)の後、培養液から有用物質を分離する工程。
(i)遺伝子組み換え
(i−1)目的タンパク質を発現している細胞からメッセンジャーRNA(mRNA)を分離し、該mRNAから単鎖のcDNAを、次に二重鎖DNAを合成し、該二本鎖DNAをファージDNA又はプラスミドに組み込む。得られた組み換えファージ又はプラスミドを宿主大腸菌に形質転換しcDNAライブラリーを作成する。
(i−2)目的とするDNAを含有するファージDNA又はプラスミドをスクリーニングする方法としては、ファージDNA又はプラスミドと目的タンパク質遺伝子又は相補配列の一部をコードするDNAプローブとのハイブリダイゼーション法が挙げられる。
(i−3)スクリーニング後のファージ又はプラスミドから目的とするクローン化DNA又はその一部を切りだし、該クローン化DNA又はその一部を発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって、目的遺伝子の発現ベクターを作成することができる。内膜を移行させるシグナル配列(ペリプラズムに目的物質を発現させるシグナル配列)をコードするDNAを同時に連結することもできる。
(ii)培養
(ii−1)宿主細菌を発現ベクターで形質転換して組み換え細菌を作成し、組み換え細菌を前培養する。前培養は寒天培地上で通常15〜43℃で3〜72時間行う。
(ii−2)有用物質の生産に用いる培養液を121℃、20分間オートクレーブ滅菌を行い、ここに寒天培地で前培養した組み換え細菌を培養する。培養は、通常15〜43℃で12〜72時間行う。なお、培養開始と同時に界面活性剤(A)を使用する場合は、界面活性剤(A)と培養液を混合し均一化したものを、培養液として用いて同様の操作を行う。また、培養後6時間から72時間後に界面活性剤(A)を加える場合は、界面活性剤を加えてから1〜1000時間培養を継続する。
(iii)精製
(iii−1)培養液中に分泌されたタンパク質は、遠心分離、中空糸分離、ろ過等で微生物及び微生物残さと分離される。
(iii−2)タンパク質を含む培養液は、イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム、アフィニティカラム及び限外カラム等のカラム処理を繰り返し、エタノール沈殿、硫酸アンモニウム沈殿及びポリエチレングリコール沈殿等の沈殿処理を必要に応じ適宜行うことによって分離精製される。
本発明の有用物質生産方法は、細菌内で作成した有用物質が細菌のペリプラズムに移行している場合に特に有効である。有用物質がペリプラズムに移行していることによって、有用物質が培養液中に分泌されやすくなる。
本発明の界面活性剤は、細菌を用いて有用物質(タンパク質等)を生産する際に添加する。
本発明の界面活性剤は、細菌を破壊しにくく、細菌が有用物質を連続的に生産することができ、生産量を飛躍的に向上することができる。
本発明の界面活性剤を用いて細菌の培養を行う事によって、細菌を死滅させることなく培養することが出来るので、工業レベルでの生産に十分な菌体密度を達成する事が可能になり、かつ、有用物質の分泌生産が可能になる。その結果、容易な精製かつ高生産量を達成することができる。
プライマー1と2(表4)を用いてPCR法により大腸菌株W3110のアルカリホスファターゼ(phoA)遺伝子を増幅した。PCR断片を制限酵素NdeIとBamHIで処理後、pET−22bプラスミド(Novagen社)のNdeI制限酵素サイトとBamHI制限酵素サイトに結合した。その後λDE3 Lysogenization Kit(Novagen社製)を用いて、大腸菌株AG1(ToYoBo(東洋紡績(株))社製)を改変して作成したAG1(DE3)大腸菌株にこのプラスミドを形質転換してアルカリホスファターゼ発現株(α)を作成した。発現したアルカリホスファターゼがペリプラズム画分に局在することをMETHODS IN ENZYMOLOGY 353巻 2002年 121頁の方法に基づいて解析し確認した。
<製造例2>
プライマー3と4(表4)を用いてPCR法により大腸菌株W3110のtorA遺伝子を増幅した。PCR断片を制限酵素NdeIとBamHIで処理後、pET−22bプラスミド(Novagen社製)のNdeI制限酵素サイトとBamHI制限酵素サイトに結合した。その後AG1(DE3)大腸菌株にこのプラスミドを形質転換してTorA発現株(β)を作成した。発現したTorAがペリプラズム画分に局在することをMETHODS IN ENZYMOLOGY 353巻 2002年 121頁の方法に基づいて解析し確認した。
<製造例3>
プライマー5と6(表4)を用いてPCR法により大腸菌株W3110のpdxA遺伝子を増幅した。PCR断片を制限酵素NdeIとBamHIで処理後、pET−22bプラスミド(Novagen社製)のNdeI制限酵素サイトとBamHI制限酵素サイトに結合した。その後AG1(DE3)大腸菌株にこのプラスミドを形質転換してPdxA発現株(γ)を作成した。発現したPdxAが細胞質画分に局在することをMETHODS IN ENZYMOLOGY 353巻 2002年 121頁の方法に基づいて解析し確認した。
<A−0>
次の(1)〜(4)に従って界面活性剤を使用しない場合の大腸菌(α)及び(β)の分泌効率を求めた。
(1)製造例1〜3で得た大腸菌(α)、(β)及び(γ)をそれぞれLB培養液(バクトトリプトン10g/L、イーストエキストラクト5g/L、NaCl10g/L、クロラムフェニコール30mg/L)1mLに植菌して37℃で一夜振とう培養して培養液を作製した。
(2)遠心機を用いて集菌(4,000G、4℃、15分)を行いTB培養液(Difco社製)1mLに再懸濁し、クロラムフェニコール(30mg/L)とIPTG(100μM)を加えて37℃で3時間振とう培養を行うことによりphoA、torA又はpdxAの発現誘導を行なった。
(3)その後再び遠心機を用いて集菌(4,000G、4℃、15分)を行い2.5mLのTris−NaCl緩衝液(50mM Tris(pH7.5)、100mM NaCl)に再懸濁し、25μL分注を行い25μLのTris−NaCl緩衝液と混合した。
(4)その後、37度で1時間保温した。上清の液を取り出しTris−NaCl緩衝液で適切な濃度に希釈後、抗Hisタグ抗体を用いたELISAアッセイにより組み換えタンパク質量の定量を行った。(3)の遠心分離前のサンプルも超音波処理(200W、10分)後、同様にELISAアッセイを行って組み換えタンパク質の定量を行った。大腸菌(γ)を用いて溶菌した細菌の割合を算出し、大腸菌(α)と大腸菌(β)の組み換えタンパク質の分泌効率を下記式により算出し、表1にまとめた。なお、表1において、「0」は、分泌効率が0%であることを示しており、「−」は、分泌効率の測定を行わなかったことを示している。
分泌効率(%)=100×{(X/Y)−Z}
X:大腸菌(α)又は(β)を使用した場合の遠心分離による菌体除去後に残る培養液中の組み換えタンパク質の量
Y:大腸菌(α)又は(β)を使用した場合の培養液中の全組み換えタンパク質の量
Z:大腸菌(γ)によって求めた溶菌した細菌の割合
Z=Z1/Z2
Z1:大腸菌(γ)を使用した場合の遠心分離による菌体除去後に残る培養液中の組み換えタンパク質の量
Z2:大腸菌(γ)を使用した場合の培養液中の全組み換えタンパク質の量
<大腸菌(α)の分泌効率の測定>
“X”は、大腸菌(α)を用いて上記(1)〜(4)を行ったときの、上記(4)の上清の液を取り出し、Tris−NaCl緩衝液で適切な濃度に希釈後、抗Hisタグ抗体を用いたELISAアッセイ(分光光度計「SUNRISE THERMO」、Wako(和光純薬工業(株))社製を用いて定量を行った)により求めた組み換えタンパク質量の測定値であり、0.0であった。
“Y”は、大腸菌(α)を用いて上記(1)〜(4)を行ったときの、上記(3)の遠心分離を行う前のサンプルを超音波処理(200W、10分)後、“X”での操作と同様のELISAアッセイを行って求めた組み換えタンパク質量の測定値であり、2.5であった。
“Z1”は、大腸菌(γ)を用いて上記(1)〜(4)を行ったときの、上記(4)の上清の液を取り出し、Tris−NaCl緩衝液で適切な濃度に希釈後、“X”での操作と同様のELISAアッセイを行うことにより求めた組み換えタンパク質量の測定値であり、0.0であった。
“Z2”は、大腸菌(γ)を用いて上記(1)〜(4)を行ったときの、上記(3)の遠心分離を行う前のサンプルを超音波処理(200W、10分)後、“X”での操作と同様のELISAアッセイを行って求めた組み換えタンパク質量の測定値であり、1.1であった。
ELISAアッセイによって求められる測定値は、タンパク質量に比例する濃度範囲で測定を行った。ELISAアッセイの測定値から、タンパク質量の定量値を求めることもできる。
これらのタンパク質量の測定値から、界面活性剤を使用していない場合の大腸菌(α)の分泌効率を求めた。
大腸菌(α)の分泌効率=100×{(0.0/2.5)−(0.0/1.1)}=0
大腸菌(α)及び大腸菌(β)についてそれぞれ、A−0の(3)において、大腸菌を緩衝液へ再懸濁した直後に、界面活性剤(A)としてポリオキシエチレン(3モル)トリデシルエーテル酢酸ナトリウムを菌懸濁液の重量を基準として1重量%になるように加えたこと以外は上記と同様にして培養し、前述の定義に従って分泌効率を算出し、表1にまとめた。
大腸菌(α)及び大腸菌(β)について、A−1において、ポリオキシエチレン(3モル)トリデシルエーテル酢酸ナトリウムを表1に記載の界面活性剤及び量に変更したこと以外はA−1と同様にして分泌効率を算出し、表1〜3にまとめた。
なお、表2及び表3において、「0」は、分泌効率が0%であることを示しており、「−」は、分泌効率の測定を行わなかったことを示している。
また、大腸菌(β)の分泌効率を測定したのは、大腸菌が生産するタンパク質の種類が変わっても、界面活性剤(A)の添加により大腸菌が同じような分泌効率の傾向を示すことを確認するためである。大腸菌(β)の分泌効率は、界面活性剤(A)としてA−1、A−3又はA−6の界面活性剤を使用した場合について、各々測定を行った。
A−16:SIGMA社製
A−22:日本エマルジョン(株)製、「EMALEX 400di−ISEX」
A−29:日本エマルジョン(株)製、「EMALEX PE−12EX」
A−32:日本エマルジョン(株)製、「EMALEX GWIS 320」
A−34:日本エマルジョン(株)製、「EMALEX 1805」
A−38:日本エマルジョン(株)製、「EMALEX 600di−ISEX」
A−40:日本エマルジョン(株)製、「EMALEX PEIS−10EX」
大腸菌(β)をLB培地10mlに植菌して37℃で一夜振とう培養して培養液を作製した。遠心機を用いて集菌を行いTB培地(Difco社製)10mlに再懸濁し、torAの発現誘導を行い37℃で振とう培養を行い振とう培養開始後から0、0.5、1、2時間後にサンプリングを行い、遠心分離機によって集菌を行った。集菌体を緩衝液(50mM Tris(pH7.5)、100mM NaCl)に懸濁して超音波破砕(200W、10分)を行った後SDS−PAGEによって解析し、生産した組み換えタンパク質バンドの定量を行った。得られたデータから菌体1g当たりのタンパク質量に換算してグラフを作製した。この結果を図1(界面活性剤無し)に示す。
発現誘導時に界面活性剤(A)としてA−7の界面活性剤を培養液の重量を基準として1%になるように加えたこと、サンプリングの時間を0、2、4、15、19、21時間後に行い遠心分離後の上清の解析を行ったこと以外は比較例1と同様にして、同様にグラフを作成した。なお、培養21時間後の培養液中の乾燥菌体密度は1.72g/Lだった。この結果を図1(界面活性剤有り)に示す。
プライマー9と10(表4)を用いてPCR法によりBacillus licheniformisのbglC遺伝子を増幅した。PCR増幅断片を制限酵素NcoIとBamHIで処理後、pET−22bプラスミド(Novagen社製)のNcoI制限酵素サイトとBamHI制限酵素サイトに結合した。その後、BL21(DE3)大腸菌株(Novagen社製)へ形質転換を行い、セルラーゼを発現する大腸菌(δ)を作成した。
プライマー7と8(表4)を用いてPCR法によりBacillus licheniformisのsubtilisin Carlsberg遺伝子を増幅した。PCR増幅断片を制限酵素NcoIとBamHIで処理後、pET−22bプラスミド(Novagen社製)のNcoI制限酵素サイトとBamHI制限酵素サイトに結合した。その後、BL21(DE3)大腸菌株(Novagen社製)へ形質転換を行い、プロテアーゼを発現する大腸菌(ε)を作成した。
比較例2として製造例4で得た大腸菌(δ)、比較例4として製造例5で得た大腸菌(ε)の終夜培養液1mlをそれぞれ作成し、0.5mlをLB培養液(アンピシリン 100mg/L含有)5mlに植菌して30℃3時間振とう培養を行い、前培養液を作成した。前培養液を50mLの培養液(酵母エキス(日本製薬社製)1.2g、ポリペプトン(日本製薬社製)0.6g、リン酸2カリウム0.47g、リン酸1カリウム0.11g、硫酸アンモニウム0.35g、リン酸2ナトリウム12水和物0.66g、クエン酸ナトリウム2水和物0.02g、グリセロール0.2g、ラクトアルブミン水解物1.5g、消泡剤(信越シリコーン製、「KM−70」)0.3g、1mM硫酸マグネシウム、微量金属溶液(塩化カルシウム18.9μg、塩化鉄(III)500μg、硫酸亜鉛7水和物9.0μg、硫酸銅5.1μg、塩化マンガン4水和物6.7μg、塩化コバルト4.9μg、エチレンジアミン4酢酸4ナトリウム200μg)、100mg/Lアンピシリン)に植菌し微生物培養装置(エイブル社製、製品名「BioJr.8」)を用いてpH6.8、30℃を維持したまま培養を開始した。培養開始後1M IPTGを0.15mL加えた。培養開始14時間後から、グリセリン/タンパク質溶液(50% グリセリン、50g/L ラクトアルブミン水解物、33g/L 消泡剤(信越シリコーン製、「KM−70」)、100mg/L アンピシリン)の滴下を開始した。培養開始後、48時間目に培養を終了し、培養液を回収して培養液中の総タンパク質をSDS−PAGEで解析をして、タンパク質バンドの定量から生産した組み換えタンパク質量の定量を行った。
培養終了時の乾燥菌体密度は、次の手順(1)〜(5)により求めた。
手順(1):あらかじめ容器(遠心チューブ)の重量を測定した。
手順(2):培養液100mlを手順(1)で重量を測定した容器に入れ、遠心分離(4,000G、15分、4℃)して、上澄みを抜き取り、細菌を集菌した。
手順(3):容器中の集菌した細菌に、手順(2)で使用した培養液と等量の体積の0.9%NaCl水溶液で洗い、再度遠心分離(4,000G、15分、4℃)して、上澄みを抜き取り、細菌を集菌した。
手順(4):手順(3)で得られた細菌を容器にいれたままの状態で、105℃で10時間乾燥させた後、容器と細菌の合計の重量を測定した。
手順(5):手順(4)の後さらに105℃で2時間乾燥させた後、容器と細菌の合計の重量を測定して重量変化が無いことを確認した。さらに重量が減少するなら重量変化が無くなるまで乾燥を持続した。
手順(5)と手順(1)の測定値と手順(2)で使用した培養液の体積(L)を下記式に当てはめることにより、乾燥菌体密度を求めた。
乾燥菌体密度(g/L)=([手順(5)の測定値]−[手順(1)の測定値])/0.1
この方法は数回行い培養液の濁度と乾燥菌体密度が比例関係にあることが明らかになったので、比較例2〜4及び実施例2〜14では測定した濁度から乾燥菌体密度を算出した。
<培養液の濁度の測定>
乾燥菌体密度を測定した培養液と同じ培養液を用いて、濁度計((株)島津製作所社製、UV−1700)を用いて、1mlの石英セルを用いて濁度の測定を行った。
培養液は、適切な吸光度になるように生理食塩水で希釈して測定を行った。細菌を含まないこと以外は同じ培養液を、上記と同じ希釈率で希釈して吸光度を測定してブランクとした。培養液の濁度は下記式によって算出した。
培養液の濁度=[(希釈した培養液の濁度測定値)−(ブランクの濁度測定値)]×希釈倍率
乾燥菌体密度と培養液の濁度をプロットし、図3を得た。図3から、乾燥菌体密度と培養液の濁度の関係を表す次式を導いた。
乾燥菌体密度=0.28×(培養液の濁度)
培養開始後、培養液の重量を基準として1重量%になるように界面活性剤(A)としてA−14の界面活性剤を加え、グリセリン/タンパク質溶液中にもグリセリン/タンパク質溶液を基準として1重量%になるようにA−14の界面活性剤を加えたこと以外は比較例2と同様に行った。
培養開始後、培養液の重量を基準として1重量%になるように界面活性剤(A)としてA−14の界面活性剤を加え、グリセリン/タンパク質溶液中にもグリセリン/タンパク質溶液を基準として1重量%になるようにA−14の界面活性剤を加えたことと培養液の遠心上清のみを解析したこと以外は比較例2と同様に行った。なお、培養開始から界面活性剤を入れるまでの時間は、比較例3よりも長かった。
実施例2において、A−14の界面活性剤を表5に記載の界面活性剤及び量に変更したこと以外は同様にして得られた組み換えタンパク質の定量、乾燥菌体密度の測定を行った。結果を表5にまとめた。
培養開始後、培養液の重量を基準として1重量%になるように界面活性剤(A)としてA−6の界面活性剤を加え、グリセリン/タンパク質溶液中にもグリセリン/タンパク質溶液を基準として1重量%になるようにA−6の界面活性剤を加えたことと培養液の遠心上清のみを解析したこと以外は比較例4と同様に行った。
培養開始後、培養液の重量を基準として0.1重量%になるように界面活性剤(A)としてA−6の界面活性剤を加え、グリセリン/タンパク質溶液中にもグリセリン/タンパク質溶液を基準として0.1重量%になるようにA−6の界面活性剤を加えたことと、培養液の遠心上清のみを解析したこと以外は、比較例4と同様に行った。
培養開始後、培養液の重量を基準として5重量%になるように界面活性剤(A)としてA−6の界面活性剤を加え、グリセリン/タンパク質溶液中にもグリセリン/タンパク質溶液を基準として5重量%になるようにA−6の界面活性剤を加えたことと、培養液の遠心上清のみを解析したこと以外は、比較例4と同様に行った。
Shewanella putrefaciensの終夜培養液10mlを作成し、培養液(ポリペプトン(日本製薬社製)10g、酵母エキス(日本製薬社製)2g、硫酸マグネシウム7水和物0.5g、Seawater(Daigo)750mL)1Lに植菌して30℃5時間振とう培養を行い、前培養液を作成した。前培養液を10Lの培養液(ポリペプトン(日本製薬社製)200g、酵母エキス(日本製薬社製)40g、硫酸マグネシウム7水和物10g、Seawater(Daigo)7.5L)に植菌し微生物培養装置(エイブル社製)を用いてpH7.3、30℃を維持したまま培養を開始した。培養開始後、48時間目に培養液を回収して遠心分離を行った培養液上清画分の総タンパク質をSDS−PAGEで解析をして、45kDa付近のタンパク質バンドの定量を行った。
培養終了時の乾燥菌体密度は、次の手順(1)〜(5)により求めた。
手順(1):あらかじめ容器(遠心チューブ)の重量を測定した。
手順(2):培養液100mlを手順(1)の容器入れ、遠心分離(4,000G、15分、4℃)して、上澄みを抜き取り、細菌を集菌した。
手順(3):容器中の集菌した細菌に、手順(2)で使用した培養液と等量の体積の0.9%NaCl水溶液で洗い、再度遠心分離(4,000G、15分、4℃)して、上澄みを抜き取り、細菌を集菌した。
手順(4):手順(3)で得られた細菌を容器にいれたままの状態で、105℃で10時間乾燥させた後、容器と細菌の合計の重量を測定した。
手順(5):手順(4)の後さらに105℃で2時間乾燥させた後、容器と細菌の合計の重量を測定して重量変化が無いことを確認した。さらに重量が減少するなら重量変化が無くなるまで乾燥を持続した。
手順(5)と手順(1)の測定値と手順(2)で使用した培養液の体積(L)を下記式に当てはめることにより、乾燥菌体密度を求めた。
乾燥菌体密度(g/L)=([手順(5)の測定値]−[手順(1)の測定値])/0.1
微生物培養装置での培養開始後に培養液の重量を基準として1重量%になるようにA−14の界面活性剤を加えたこと以外は比較例5と同様に行った。
微生物培養装置での培養開始後に培養液の重量を基準として1重量%になるようにA−7の界面活性剤を加えたこと以外は比較例5と同様に行った。
表1〜表3から、界面活性剤の中でもA−1〜A−61の界面活性剤は、分泌効率が1以上であることが分かった。これらの界面活性剤は、大腸菌のペリプラズム中のタンパク質を溶出させる効果が高く、分泌生産においても高い有効性が期待された。そこで実際に数種類の界面活性剤をもちいて分泌生産による生産性の確認を実施例1〜15で行った。
その結果、表5に示すように、界面活性剤を使用していない比較例2及び4と比較して、本発明の実施例2〜14は生産したタンパク質が培養液中に効率的に分泌されていることがわかる。
また、菌体1g当たりのタンパク質生産量の時間ごとの推移を表した図1において、界面活性剤無しの場合は、培養時間が1時間以降はタンパク質量がほとんど変化しなかった。一方、界面活性剤有りの場合は、タンパク質量が15時間経過しても増加し続けていることがわかる。
さらに、実施例8において、培養液中の乾燥菌体密度とタンパク質の量をプロットした図2から、本発明の界面活性剤の存在下でも、細菌が死滅することなく増殖しながら、タンパク質を生産しつづけていることが分かる。
これらのことから、界面活性剤を用いることで、細菌のタンパク質の生産を妨げることなく、長時間分泌生産をすることができ、生産したタンパク質を効率的に培養液中に取り出すことが可能であり、タンパク質の生産量が増加したことがわかる。
また、比較例3と実施例2の比較から、同じ細菌及び界面活性剤による分泌生産方法でも、乾燥菌体密度が大きい方が、タンパク質の生産量が多くなることがわかる。
さらに、実施例3〜9を比較した場合、界面活性剤の分泌効率が大きい実施例の方がタンパク質の生産量が多くなることがわかる。
なお、本明細書において、分泌効率が「0.0」であることは、必ずしも細菌内の有用物質が細菌外(培養液中)へ全く分泌されないことを示しているのではない。例えば、実施例3では、大腸菌(α)の分泌効率が「0.0」である界面活性剤A−76を使用しているが、大腸菌(δ)が分泌した組み換えタンパク質の生産量は0.07g/Lであった。
また、本発明の界面活性剤は、細菌のペリプラズム画分の抽出試薬としても使用できる。
Claims (6)
- 培養液中に含まれる細菌により有用物質を培養液中に分泌生産する有用物質生産方法であり、
培養液中には、界面活性剤(A)が含まれており、
培養液の体積を基準とした乾燥菌体密度が1.5g/L〜500g/Lであり、
細菌はグラム陰性菌であり、
界面活性剤(A)が両性界面活性剤、アニオン系界面活性剤及びHLBが0〜13のノニオン系界面活性剤からなる群より選ばれる少なくとも1種である有用物質生産方法。 - 有用物質がタンパク質である請求項1に記載の有用物質生産方法。
- 細菌内で発現したタンパク質がペリプラズムへ移行する性質を有するタンパク質である請求項2に記載の有用物質生産方法。
- 細菌が大腸菌である請求項1〜3のいずれかに記載の有用物質生産方法。
- 界面活性剤の使用量が、培養液の重量を基準として0.0001〜10重量%である請求項1〜4のいずれかに記載の有用物質生産方法。
- 界面活性剤の分泌効率が1〜100%である請求項1〜5のいずれかに記載の有用物質生産方法。
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Citations (2)
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