JP5762000B2

JP5762000B2 - 免疫バランス制御剤

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Publication number: JP5762000B2
Application number: JP2010549743A
Authority: JP
Inventors: 西村　孝司; 孝司西村; 勉加納
Original assignee: Hokkaido University NUC; Nepuree Corp
Current assignee: Hokkaido University NUC; Nepuree Corp
Priority date: 2009-08-06
Filing date: 2010-08-03
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2030-08-03
Also published as: JPWO2011016432A1; US20120121616A1; WO2011016432A1; KR20120049164A

Description

本発明は、春菊の過熱水蒸気処理物を含有する免疫バランス制御剤に関する。

過熱蒸気は、一定の圧力のもとで、蒸気と液体が平衡を保ち共存しうる温度以上に熱せられた蒸気であり、例えば一気圧で１００℃以上に熱せられた水蒸気を過熱水蒸気という。過熱水蒸気を利用した技術は、殺菌、乾燥、食品加工などの分野に広がっており、特に食品加工の分野においては、食材の色、香り、味、テクスチャーなどの品質を変化させないという過熱水蒸気処理の利点を生かした技術開発が行われている（特許文献１、２など）。

過熱水蒸気処理は、食材の品質を変化させないほか、望ましくない余剰油脂や臭気成分などを低減させる効果をも有する（特許文献３、４）。さらには、所望の成分を増強させる技術としても利用が進められており、例えば特許文献５にはタマネギ外皮などのケルセチン配糖体含有物を過熱水蒸気処理することで得られるケルセチン含有組成物が、特許文献６にはコーヒー豆を過熱水蒸気処理することで、アクリルアミドが減少し、かつクロロゲン酸類が増加した焙煎コーヒー豆が得られることが開示されている。

このように過熱水蒸気処理により、何らかの生理的機能が付与もしくは増強された新たな素材を得ることが期待されているが、十分な生理的機能を有する素材は未だ得られていない。

特開２００６−１２９７３９号公報国際公開パンフレットＷＯ２００２／０８０６９０号特開２０００−１３９３６６号公報特開２００６−２０４１４８号公報特開２００７−２１０９１６号公報特開２００７−２８２５３７号公報

本発明は、過熱水蒸気処理物の新たな用途を提供することを目的とする。

本発明者らは、春菊の過熱水蒸気処理物が、タイプ１免疫賦活効果による感染防御や抗腫瘍活性に加えて、免疫バランスを調節することにより、過度のタイプ２免疫応答によって生ずるアレルギー疾患の改善作用を示すことを見いだし、下記の各発明を完成した。

（１）春菊の過熱水蒸気処理物を含有する免疫バランス制御剤。

（２）抗感染症用である、（１）に記載の免疫バランス制御剤。

（３）抗腫瘍用である、（１）に記載の免疫バランス制御剤。

（４）タイプ１免疫系機能強化用である、（１）に記載の免疫バランス制御剤。

（５）樹状細胞活性化用である、（４）に記載の免疫バランス制御剤。

（６）ＩＦＮ−γおよび／またはインターロイキン（ＩＬ）−１２産生促進用である、（４）に記載の免疫バランス制御剤。

本発明の免疫バランス制御剤は、古くから食品として利用されている春菊の過熱水蒸気処理物を有効成分とした、極めて安全性の高い、生体の免疫バランスを調節して正常化するという効果を有する組成物である。

上下図はそれぞれ、実施例および比較例１の過熱水蒸気処理物のＩＦＮ−γ産生誘導（産生促進）作用を示す図である。縦軸はＩＦＮ−γ産生レベルを、横軸は添加した過熱水蒸気処理物を示す。実施例の過熱水蒸気処理物による脾臓細胞からのＩＦＮ−γ産生誘導における、ＩＬ−１２の影響を示す図である。縦軸はＩＦＮ−γ産生レベルを示し、横軸は実施例の過熱水蒸気処理物を添加しない群（無添加群）と添加した群（春菊添加群）とをそれぞれ示す。実施例の過熱水蒸気処理物の樹状細胞活性化作用を示した、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。横軸は細胞表面における測定対象の分子の発現レベルを示し、無添加群とは実施例の過熱水蒸気処理物を添加しない群を、春菊添加群とは実施例の過熱水蒸気処理物を添加した群とをそれぞれ示す。実施例の過熱水蒸気処理物の樹状細胞活性化作用を示したＩＬ−１２産生誘導能を示す図である。縦軸はＩＬ−１２産生レベルを示し、横軸は実施例の過熱水蒸気処理物を添加しない群（無添加群）と添加した群（春菊添加群）とをそれぞれ示す。実施例の過熱水蒸気処理物が、ＴＬＲ（ＴｏｌｌＬｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒ）依存的にＩＦＮ−γ産生誘導（産生促進）作用を示す図である。縦軸はＩＦＮ−γ産生レベルを示し、横軸は実施例の過熱水蒸気処理物を添加しない群（無添加群）と添加した群（春菊添加群）における７週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス脾臓免疫細胞（野生型）、ＴＬＲ２欠損マウス脾臓免疫細胞、ＴＬＲ４欠損マウス脾臓免疫細胞およびＴＬＲ９欠損マウス脾臓免疫細胞をそれぞれ示す。実施例の過熱水蒸気処理物を添加しない場合（無添加群）と添加した場合（春菊添加群）との、ＮＫ１．１陽性かつＴＣＲβ陰性細胞、ＮＫ１．１陽性かつＴＣＲβ陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞におけるＩＦＮ−γの産生について、細胞内染色法を用いたフローサイトメトリーで測定した結果を示すグラフである。各グラフの縦軸は各細胞の表面における測定対象の分子の発現レベルをそれぞれ示し、横軸はＩＦＮ−γ産生レベルを示す。実施例の過熱水蒸気処理物を添加しない場合（無添加群）と添加した場合（春菊添加群）との、７週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス脾臓免疫細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）およびＮＫ１．１陽性細胞を含まない７週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス脾臓免疫細胞におけるＩＦＮ−γ産生レベルを示す図である。縦軸はＩＦＮ−γ産生レベルを、横軸は実施例の過熱水蒸気処理物を添加しない群（無添加群）と添加した群（春菊添加群）におけるそれぞれの細胞を示す。実施例の過熱水蒸気処理物（春菊ネピュレ）および比較例２の通常熱処理物（春菊ピューレ）のＩＦＮ−γ産生誘導（産生促進）作用を示す図である。縦軸はＩＦＮ−γ産生レベルを示し、横軸は実施例の過熱水蒸気処理物を添加しない群（無添加群）と添加した群（春菊添加群）とをそれぞれ示す。

本発明は、春菊の過熱水蒸気処理物を含有する免疫バランス制御剤である。春菊はキク科キク属の植物であり、葉部と茎部が一般に食用とされ、日常的に摂取される野菜として日本国内に広く流通している。

本発明の実施にあたっては、食用に供される春菊であれば用いることが可能であり、例えば学名でＣｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｃｏｒｏｎａｒｉｕｍと称される種を用いることができる。

なお春菊の栄養成分としてビタミンＣやカロテンを豊富に含むことは知られているものの、免疫制御作用に関しては知られていない。

過熱水蒸気処理は、春菊をそのまま、あるいは適切な大きさに粉砕して、行う。前記春菊は、生であっても良いし、乾燥物であっても良い。

過熱水蒸気処理に用いる蒸気の温度は、１２０℃〜５００℃程度の範囲であるのが好ましく、さらに好ましくは２３０℃〜２８０℃である。また過熱水蒸気処理の時間は、材料の大きさや量により適宜設定されるが、本発明の免疫バランス制御剤の機能を十分なものとするためには３０秒〜２４０秒程度の範囲の時間が好ましい。

また過熱水蒸気処理は、同じ処理条件のまま、もしくは温度条件や時間条件を変えて、２回以上行っても良く、さらには前記特許文献１に記載されるように、２回以上の過熱水蒸気処理の間に破砕加工工程を組み込んでも良い。

過熱水蒸気処理後の材料は、そのまま本発明の免疫バランス制御剤として利用できる他、さらに遠心分離や濾過などによる固液分離、水、エタノールなどのアルコールおよびこれらの混合物を使用した溶媒抽出、スプレードライや凍結乾燥などによる乾燥などの処理を施して使用することができ、本明細書ではこれらの全てを「過熱水蒸気処理物」という。

本発明にいう免疫バランス制御、すなわち免疫バランスを制御する作用とは、タイプ１免疫系機能とタイプ２免疫系機能の一方、特にタイプ２免疫系機能が亢進されている状態を解消して、両免疫系機能が制御された状態に導く作用を意味する。なお、本発明にいう免疫バランスの制御は免疫バランスの調節、調整と交換可能に使用される。

一般に、タイプ１免疫系は、抗原提示細胞である樹状細胞やマクロファージからの抗原ペプチドの提示とＩＬ−１２、ＩＦＮ−γの作用によって誘導されるＴｈ１細胞（１型ヘルパーＴ細胞）が関与する免疫系として理解されている。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γなどＴｈ２細胞（２型ヘルパーＴ細胞）の分化阻害やＢ細胞の成熟阻害を介したＩｇＥ抗体の産生を抑制するサイトカインの他に、ＩＬ−２やＴＮＦ−αなどを産生し、キラーＴ細胞などの細胞性免疫の活性化や樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞の活性を高める働きを有する。一方のタイプ２免疫系は、抗原提示細胞であるマクロファージからの抗原ペプチドの提示とＩＬ−４の作用によって誘導されるＴｈ２細胞が関与する免疫系として理解されている。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４やＩＬ−１３などのＢ細胞の成熟を介したＩｇＥなどの抗体の産生を増加させ、液性免疫を活性化するサイトカインの他に、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０を産生する。

Ｔｈ２細胞から産生されるＩＬ−４、ＩＬ−１０は、Ｔｈ１細胞からのＩＦＮ−γの産生を抑制するように、互いにその作用を制御し合うことが知られており、またタイプ２免疫系機能が優性であると細胞性免疫が抑制され、感染症が重症化し易く、またＢ細胞の成熟を介したＩｇＥ抗体産生が増加し、アレルギー体質に陥りやすいと考えられている。従って、タイプ１免疫系機能とタイプ２免疫系機能のバランスの崩壊、特に行き過ぎたタイプ２免疫系機能の亢進ないし優性は、必ずしも生体にとって好ましいものとは言えない。

本発明で使用する過熱水蒸気処理物は、樹状細胞やナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）を活性化する作用、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の産生を誘導ないし促進する作用を示す。ＮＫ細胞やＮＫＴ細胞を活性化する作用とは、例えば、ＮＫ細胞やＮＫＴ細胞におけるＩＦＮ−γの産生を誘導する作用などを挙げることができる。従って、本発明の免疫バランス制御剤を、特にタイプ２免疫系機能が亢進している個体に投与することによって、タイプ１免疫系機能を強化することができ、その結果、免疫バランスを制御することができる。この様に、本発明で使用する過熱水蒸気処理物は、タイプ１免疫系機能を強化するタイプ１免疫系機能強化剤として利用することもでき、また樹状細胞活性化剤やＮＫ細胞活性化剤、ＮＫＴ細胞活性化剤、ＩＦＮ−γ産生促進剤、ＩＬ−１２産生促進剤としても利用することができる。

なお上記の本発明で使用する過熱水蒸気処理物が示す生理活性は、全く意外なことに、同じ材料を用いて通常の熱処理を施した場合と比較して、極めて強力であることが確認されている。

また、本発明で使用する過熱水蒸気処理物は、タイプ１免疫系機能を強化することにより、タイプ２免疫系機能が優位にある状態、例えばアレルギーを緩和することができ、あるいはＮＫ細胞やＮＫＴ細胞におけるＩＦＮ−γの産生を誘導するなどして、感染症抑制効果や抗腫瘍効果などを得ることができることから、アレルギー性疾患の治療の他、感染症や悪性腫瘍などの細胞性免疫の亢進が求められる疾患の治療に対して有効である。すなわち、本発明で使用する過熱水蒸気処理物は、アレルギー抑制剤や感染症抑制剤、抗腫瘍剤としての利用が可能である。

また、本発明で使用する過熱水蒸気処理物は、これを服用することで、平常時からタイプ１免疫系機能とタイプ２免疫系機能のバランスが保つことができ、感染症などの外的異物の侵入に対する抵抗性を高め、さらに行き過ぎた免疫応答反応であるアレルギーや自己免疫疾患に対しても、これを緩和する作用を有するものと期待することができる。

具体的には、本発明の免疫バランス制御剤には、ウイルスや細菌などによる感染症、腫瘍、炎症、アトピー性皮膚炎、肌荒れ、敏感肌、花粉症、喘息、気管支喘息、鼻炎、蕁麻疹などのアレルギー性疾患などの予防、治療あるいは症状の改善効果を期待することができる。

本発明における過熱水蒸気処理物は、そのまま免疫バランス制御剤として利用できる他、感染症予防、抑制ないし治療剤、抗腫瘍剤、アレルギー性疾患予防、抑制ないし治療剤などの医薬組成物として利用することができる。また、一般的な賦形剤と組み合わせることで組成物とし、さらに皮膚外用剤、内服剤、注射剤その他の一般的な剤型に製剤化して使用することも可能である。

上記組成物あるいは各種の剤型は、過熱水蒸気処理物の他に、ビタミン、生薬、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤その他の医薬を有効成分として必要に応じて配合し、医薬品、医薬部外品の形態としても差し支えない。

また製剤化において使用される賦形剤は、例えば、錠剤やカプセルなどの経口固形剤、水性液剤や懸濁液剤などの内服液剤、軟膏、貼付剤、ローション、クリーム、スプレー、座剤その他の、剤型毎に当業者に広く知られ、また用いられている成分を適宜組み合わせて使用することができる。

上記組成物あるいは剤型における過熱水蒸気処理物の配合量は特に規定されるものではなく、剤形の種類、品質、期待される効果の程度によって若干異なるが、組成物あるいは製剤全量中、乾燥固形分として１〜９９重量％、好ましくは１０〜９９重量％、更に好ましくは５０〜９９重量％配合させるのが良い。

また本発明の免疫バランス制御剤は、そのまま、あるいは適当な飲食品成分と組み合わせることで、ジュースもしくは乳飲料などの飲料、ヨーグルトやアイスクリームなどの乳製品、スープ、ゼリー、ジャム、菓子、パン類などの食品の形態としてもよく、さらに健康食品またはサプリメントの形態としてもよい。食品中に配合して摂取あるいは投与する場合には、適宜、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などと混合し、用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。さらには、食品原料中に混合して食品を調製し、機能性食品として製品化することによって摂取することができる。

本発明で使用する過熱水蒸気処理物は食品を原料としているため、これを上記の飲食品などの形態で摂取する場合の量に特段の制限はない。一般に食品として使用される範囲の量を摂取することが望ましく、具体的には１回につき０．５〜２５０ｇ、好ましくは１〜２００ｇであり、１日当たりの総摂取量は０．５〜５００ｇ、好ましくは１〜４００ｇである。

以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定的に解釈されるものではない。

＜実施例＞
４ｃｍの長さにカットした春菊（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）３ｋｇを、高温の水蒸気で常圧下１０分過熱処理した。処理後の春菊を永田精機株式会社製「高速遊星型ミキサーニュー・トンＵＭ−Ｎ１３」で１１００ｒｐｍ、１００秒間処理した。ミキサー処理した春菊を超高速遠心機（ＳＣＲ２０ＢＡ：ＨＩＴＡＣＨＩ社）で２０００回転 (２５０００×ｇ)、１０分処理し、沈殿画分と上澄み画分とを得、凍結乾燥機を用いてこの上澄み画分を乾燥させることにより水溶画分を調製した。次に、前記沈殿画分を１０倍量の３０体積％エタノール水溶液に懸濁して３０分攪拌した後、濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いて３０体積％エタノール固形分と３０体積％エタノール濾液とに分離した。３０体積％エタノール濾液を濃縮遠心機（ＥＹＥＬＡ社）で処理してエタノールを蒸発させた後、液体窒素で冷却し、凍結乾燥機で完全に溶媒を除去することにより、３０体積％エタノール抽出画分を調製した。次いで、前記３０体積％エタノール固形分を１０倍量の６０体積％エタノール水溶液に懸濁して３０分間攪拌した後、濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いて６０体積％エタノール固形分と６０体積％エタノール濾液とに分離した。６０体積％エタノール濾液を３０体積％エタノール濾液と同様に処理することにより、６０体積％エタノール抽出画分を調製した。

＜比較例１＞
実施例の春菊をニンジン（Ｄａｕｃｕｓｃａｒｏｔａ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ほうれん草（Ｓｐｉｎａｃｉａｏｌｅｒａｃｅａ）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍｃｅｐａ）と置き換えた他は、実施例と同様にして各々の３０体積％エタノール抽出画分を得た。

＜比較例２＞
大きめのなべに２Ｌの水を入れ、完全に沸騰させたあと、春菊１００ｇを入れ、３分間加熱した。過熱後の春菊はエースホモジナイザー（ＡＭ−３／ＫＮ３３２５０１２；日本精機製作所）で十分に粉砕した。以降、超遠心分離およびエタノール抽出を実施例と同様に行い、３０体積％エタノール抽出画分を得た。

＜試験例＞
（１）ＩＦＮ−γ産生誘導（産生促進）作用
チャールス・リバー社より購入した７週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスより脾臓を採取した。１０％ＦＣＳ、２．３８ｍｇ／ｍＬＨｅｐｅｓ、０．１１ｍｇ／ｍＬピルビン酸ナトリウム、２００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（和光純薬社）中でピンセットを用いて脾臓をほぐした。細胞を培養液と共にナイロンメッシュ(和光純薬社)に通して組織部分を除去しながら回収した。小型冷却遠心機（ｈｉｍａｃＣＦ７Ｄ２、ＨＩＴＡＣＨＩ社）を用いて１５００ｒｐｍ、５分間遠心処理したあと、上清を捨て２ｍＬの０．１５５Ｍ塩化アンモニウムで３７℃、１分３０秒インキュベートすることで赤血球を排除し、脾臓免疫細胞／前記ＲＰＭＩ−１６４０培地を調製した。実施例と比較例１で得た各種抽出サンプルを２００μｇ／ｍＬの濃度から共培養し、炭酸ガスインキュベーターを用いて３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で培養し、４８時間後培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡＭｏｕｓｅＩＦＮ−γ ＢＤＯｐｔＥＩＡｓｅｔ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて培養上清中のＩＦＮ−γ量を定量した。

結果を図１に示す。実施例の春菊の３０体積％エタノール抽出物のみが強いＩＦＮ−γ産生誘導活性を示した。

（２）脾臓細胞からのＩＦＮ−γ産生誘導におけるＩＬ−１２の影響
実施例の春菊３０体積％エタノール抽出物を用いて、脾臓細胞培養時にモノクローナル抗ＩＬ−１２抗体を添加してＩＬ−１２の機能を阻害した他は（１）と同様に実験を行った。

その結果を図２に示す。抗ＩＬ−１２抗体添加により、春菊によるＩＦＮ−γ産生誘導の強い抑制が確認され、ＩＬ−１２によってＩＦＮ−γの産生が誘導されていることが示された。

（３）樹状細胞活性化作用
チャールス・リバー社より購入した７週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの大腿骨から骨髄細胞を採取し、６穴平底プレート（Ｎｕｎｃ社）に１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるよう播種し、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ (Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）の存在下で６日間培養し、抗原提示細胞である樹状細胞を誘導した。この細胞と、実施例の春菊３０％エタノール抽出物とを１０％ＦＣＳ、２．３８ｍｇ／ｍＬＨｅｐｅｓ、０．１１ｍｇ／ｍＬピルビン酸ナトリウム、２００Ｕ／ｍＬペニシリンＧ、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で共培養し、２４時間後における細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ４０分子およびＣＤ８６分子の発現レベルを、抗ＭＨＣクラスＩ分子抗体（ＡＦ６−８８．５）、抗ＭＨＣクラスＩＩ分子抗体（ＡＦ６−８８．５）、抗ＣＤ４０抗体（３／２３）および抗ＣＤ８６抗体（ＧＬ１）を用いたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）により検出した。

その結果を図３に示す。春菊３０体積％エタノール抽出物を添加した群では、添加しないコントロールにくらべ、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＤ４０分子およびＣＤ８６分子の著しい発現の上昇が見られた。このことから、春菊３０体積％エタノール抽出物は樹状細胞を活性化させていることがわかった。

（４）樹状細胞からのＩＬ−１２産生誘導能
（３）と同条件で、実施例の春菊３０体積％エタノール抽出物のＩＬ−１２産生について検討した。細胞を回収した際の培養上清中に含まれるＩＬ−１２ｐ７０を、ＥＬＩＳＡＭｏｕｓｅＩＬ−１２ｐ７０ＢＤＯｐｔＥＩＡｓｅｔ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて定量した。

その結果を図４に示す。春菊３０体積％エタノール抽出物は樹状細胞からＩＬ−１２産生を誘導することが確認された。

（５）ＩＦＮ−γ産生誘導におけるＴＬＲ依存性の検討
チャールス・リバー社より購入した７週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス、あるいはオリエンタルバイオサービス社より入手したＴＬＲ２（ＴｏｌｌＬｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒ２）欠損マウス、ＴＬＲ４（ＴｏｌｌＬｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒ４）欠損マウスおよびＴＬＲ９（ＴｏｌｌＬｉｋｅＲｅｃｅｐｔｏｒ９）欠損マウスからそれぞれ脾臓を採取し、実施例の春菊３０体積％エタノール抽出物を用いて、（１）と同じ条件で実験を行った。

その結果を図５に示す。春菊による脾臓細胞からのＩＦＮ−γ産生誘導はＴＬＲ４が欠損した場合にほとんど認められなくなり、ＴＬＲ９が欠損した場合、減弱したことから、春菊による免疫バランス制御効果はＴＬＲ４に強く依存し、ＴＬＲ９に部分的に依存していることが明らかとなった。

（６）ＩＦＮ−γ産生誘導細胞の同定
（１）と同様にして脾臓免疫細胞／ＲＰＭＩ−１６４０培地を調製し、これに実施例の春菊３０体積％エタノール抽出物を２５μｇ／ｍＬ添加して、炭酸ガスインキュベーターを用いて３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で１２時間培養した。ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ（ＢＦＡ）を添加してさらに１２時間経過させた後、細胞を回収して、抗ＴＣＲβ抗体、抗ＣＤ４抗体（ＧＫ１．５）、抗ＣＤ８抗体（５３−６．７）、抗ＮＫ１．１抗体（ＰＫ１３６）および抗ＩＦＮ−γ抗体（ＸＭＧ１．２）を反応させ、ＮＫ１．１陽性かつＴＣＲβ陰性細胞、ＮＫ１．１陽性かつＴＣＲβ陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞におけるＩＦＮ−γ産生について、細胞内染色法を用いたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）により検出した。

その結果を図６に示す。ＮＫ１．１陽性かつＴＣＲβ陰性細胞は、ＮＫ細胞のマーカーを発現するとともにＴ細胞特異的マーカーを発現していないことからＮＫ細胞であることが分かり、また、ＮＫ１．１陽性かつＴＣＲβ陽性細胞は、ＮＫ細胞のマーカーを発現するとともにＴ細胞特異的マーカーを発現することからＮＫＴ細胞であることがわかる。そして、ＮＫ１．１陽性かつＴＣＲβ陰性細胞とＮＫ１．１陽性かつＴＣＲβ陽性細胞とが、春菊３０体積％エタノール抽出物の添加により活性化されてＩＦＮ−γが産生誘導されることがわかる。これらのことから、春菊３０体積％エタノール抽出物の添加によりＩＦＮ−γの産生が誘導される細胞はＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞であることが示された。

（７）ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞におけるＩＦＮ−γ産生誘導の確認
（６）の結果から、春菊３０体積％エタノール抽出物の添加による、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞におけるＩＦＮ−γ産生誘導の確認をさらに行った。

［７−１］
チャールス・リバー社より購入した７週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの腹腔内に抗ＮＫ１．１抗体（ＰＫ１３６）を２００μｇ投与し、２４時間経過後に脾臓を採取した。以降、（１）と同様にして脾臓免疫細胞／ＲＰＭＩ−１６４０培地を調製し、ＮＫ１．１陽性細胞すなわちＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞が含まれていないことを確認した後、実施例の春菊３０体積％エタノール抽出物を２５μｇ／ｍＬ添加して、炭酸ガスインキュベーターを用いて３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で４８時間培養した。続いて、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡＭｏｕｓｅＩＦＮ−γ ＢＤＯｐｔＥＩＡｓｅｔ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて培養上清中のＩＦＮ−γ量を定量した。

［７−２］
また、抗ＮＫ１．１抗体（ＰＫ１３６）を投与しない他は［７−１］と同様にして脾臓免疫細胞／ＲＰＭＩ−１６４０培地を調製し、これに実施例の春菊３０体積％エタノール抽出物を２５μｇ／ｍＬ添加して、炭酸ガスインキュベーターを用いて３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気下で４８時間培養した。続いて、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡＭｏｕｓｅＩＦＮ−γ ＢＤＯｐｔＥＩＡｓｅｔ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて培養上清中のＩＦＮ−γ量を定量し、これをコントロールとした。

その結果を図７に示す。コントロールと比較して、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞が含まれていない脾臓細胞におけるＩＦＮ−γ量は著しく低値であることから、春菊３０体積％エタノール抽出物は、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞を活性化させてＩＦＮ−γの産生を誘導すること、および春菊３０体積％エタノール抽出物の添加により産生誘導されるＩＦＮ−γは、主にＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞によるものであることが示された。

（８）抽出法によるＩＦＮ−γ誘導活性の違い
実施例の過熱水蒸気処理したサンプル（春菊ネピュレ；「ネピュレ」は登録商標）と比較例２で通常の熱処理をしたサンプル（春菊ピューレ）におけるＩＦＮ−γ誘導能を比較するため、各々の３０体積％エタノール抽出物を用いて、（１）と同様に実験を行った。

その結果、図８に示すように、ネピュレ（登録商標）でより強い活性が示された。このことから、春菊には元からＩＦＮ−γの産生を誘導する物質が含まれているが、過熱水蒸気処理によりその活性はより強くなることが示された。

Claims

タイプ１免疫系機能強化用である、加熱水蒸気処理した春菊をエタノール抽出してなる春菊の過熱水蒸気処理物を含有する免疫バランス制御剤。
樹状細胞活性化用である、請求項１に記載の免疫バランス制御剤。
ＩＦＮ−γおよび／またはインターロイキン１２産生促進用である、請求項１に記載の免疫バランス制御剤。