JP5750130B2 - ヒト胚盤胞由来幹細胞に由来する多能性非収縮心臓前駆細胞の新規の集団 - Google Patents

ヒト胚盤胞由来幹細胞に由来する多能性非収縮心臓前駆細胞の新規の集団 Download PDF

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Description

本発明は、ｈＢＳ細胞に由来する新規の多能性心臓前駆（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃａｒｄｉａｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ：ＭＣＰ）細胞集団、ならびにこうしたＭＣＰ細胞をたとえば医学的処置、医薬品開発、細胞療法および毒性試験などにおいて使用する可能性に関する。
さらに、ＭＣＰ細胞は自発的に収縮する心筋細胞様の細胞に分化する能力を有するため、たとえば初期の心筋再生プロセスまたは心臓再生障害もしくは奇形などの心臓発生のインビトロの研究における使用に対して魅力的である。
ＭＣＰ細胞は、ｈＢＳ細胞に由来するいわゆる基底（ｂａｓｅｍｅｎｔ）細胞の培養後にも得られる。したがって本発明は、ＭＣＰ細胞を提供できることが示されたこれらの基底細胞にも関する。
心血管疾患は世界中の多数の死の要因であり、健康管理システムにおいて大きな負担となっている。心臓移植は今なお末期の心疾患に対して利用可能な最良の処置である。しかし、この介入はコストが高いことに加え、この処置には免疫抑制薬の使用に由来する副作用および臓器ドナーが限られることに関する制限がある。他の可能性の中で、心筋再生を刺激する新規の試験的選択肢として細胞移植が出現した。細胞に基づく処置は臓器の必要性を減らすことから、心筋梗塞などの深刻な変性疾患にかかった個人および社会の両方にとって非常に重要なものとなるだろう。
心臓を***後の臓器とみる伝統的な見地には過去数年のうちに異議が唱えられており、筋細胞のターンオーバーおよび成体哺乳動物の心臓内に幹細胞／前駆細胞が存在することが示されている（ウルバネク（Ｕｒｂａｎｅｋ）ら、ＰＮＡＳ、２００３年、１００（１８）、ｐ．１０４４０−４５、ラウグヴィッツ（Ｌａｕｇｗｉｔｚ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、２００５年、４３３、ｐ．６４７−６５３、メッシーナ（Ｍｅｓｓｉｎａ）ら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ、２００４年、９５、ｐ．９１１−９２１、ベルトラミ（Ｂｅｌｔｒａｍｉ）ら、Ｃｅｌｌ、２００３年、１１４、ｐ．７６３−７７６、カイ（Ｃａｉ）ら、Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ、２００３年、５、ｐ．８７７−８８９）。新しい心筋細胞を生成できる幹細胞の供給源として、いくつかの異なる組織が提案された（例、胎児の心筋細胞、骨格の筋芽細胞、骨髄由来の幹細胞、臍帯血から単離された幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞、および胚の幹細胞）。これまでのところ、胚の幹細胞のみがインビトロで自発的に収縮する心筋細胞様の細胞に効率的に分化することが示されている（ケハット（Ｋｅｈａｔ）ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ、１０８：ｐ．４０７−４１４、２００１年、シュ（Ｘｕ）ら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ、９１：ｐ．５０１−５０８、２００２年、ヘー（Ｈｅ）ら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ、９３：ｐ．３２−３９、２００３年、ママリー（Ｍｕｍｍｅｒｙ）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０７：ｐ．２７３３−２７４０、２００３年）。しかし、ヒト胚盤胞幹細胞からの心臓幹細胞またはＭＣＰ細胞の誘導および単離は過去に示されていなかった。特にＭＣＰ細胞は、まだ心筋細胞様の細胞の機能的特徴を得ていない未熟な細胞である。
他方で、ヒト出生後の心臓の生検から心臓幹細胞が単離されて組織培養で増殖されたと報じられた（メッシーナら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ、２００４年、ＷＯ２００５／０１２５１０ Ａ１号、ＷＯ２００６／０５２９２５ Ａ２号）。これらの細胞はクローン原性であり、幹細胞および内皮細胞マーカ（例、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ−３４、Ｓｃａ−１）を発現し、インビボで筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞に分化できた。しかし、これらの単離はヒト生検材料の入手しやすさおよび生検材料の回収に対する外科的技術に左右される。
いくつかの報告はヒト胚幹細胞が収縮する筋細胞に分化する能力を示したが、ヒト胚幹細胞から別個の中間心臓前駆細胞集団を同定および単離した報告はこれまでになかった。
医薬品開発、毒性試験および細胞療法において以後使用するために、心臓前駆細胞を導出、単離および拡張するための簡単かつ非外科的な方法が非常に求められている。
本発明は、多能性心臓前駆（ＭＣＰ）細胞、およびｈＢＳ細胞からＭＣＰ細胞を調製する方法に関する。加えて、本発明はＭＣＰ細胞が由来する特定の基底細胞型に関する。本発明のＭＣＰ細胞は自発的に収縮する心筋細胞様の細胞に分化する固有の能力を有するため、薬物の発見、毒性試験および細胞療法における使用に特に好適である。
したがって本発明は１つの局面において、多能性心臓前駆（ＭＣＰ）細胞を含む、ヒト胚盤胞由来幹（ｈｕｍａｎ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ：ｈＢＳ）細胞に由来する細胞集団、およびこうしたＭＣＰ細胞に関する。ＭＣＰ細胞は形態的特徴付けに基づいて容易に同定され、さらにＭＣＰ細胞を含む細胞集団は以下の特徴を有する：
ｉ）細胞の少なくとも１％は未分化細胞に対する１つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４からなる群より選択される、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％は、ネスチンまたはＧＦＡＰを含む神経系マーカの１つまたはそれ以上のタンパク質発現を示さない、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％は、ブラキウリ（ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、ビメンチンまたはデスミンを含む中胚葉マーカの１つまたはそれ以上のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｖ）細胞の少なくとも１％は、Ｆｌｋ−１（ＫＤＲ）のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
さらに、細胞の少なくとも１％は、たとえばｉｓｌｅｔ−１、ｃＴＮＩ、ｃＴＮＴ、Ｎｋｘ２．５、アルファＭＨＣまたはコネキシン４３などの１つまたはそれ以上の初期段階心臓マーカのタンパク質発現を示さない。
ＭＰＣ細胞の重要な特徴は、それらが収縮しないことと、本明細書に記載されるような非常に特異的な形態を有することとである。
本明細書の開示から明らかとなるように、ＭＣＰ細胞はいわゆる基底細胞に由来する。基底細胞は、ｈＢＳ細胞を懸濁培養するか、または分化因子もしくは比較的短期間用の培地を含む強制凝集方法に供することによって得ることができる。この懸濁培養から細胞はプレート培養されて増殖され、基底細胞の単層が現れる。さらに培養すると、ＭＣＰ細胞のクラスタが糸に付いた風船の形で現れる。
基底細胞はＭＣＰ細胞を得るための重要な中間産物であるため、本発明は基底細胞を含む細胞集団およびこうした基底細胞にも関する。
別の局面において、本発明はＭＣＰ細胞に由来する心筋細胞様の細胞と、薬物の発見、薬物のスクリーニング、医学などにおける基底細胞、ＭＣＰ細胞および心筋細胞様の細胞の使用とに関する。さらに本発明は、細胞集団を得るための方法に関する。
発明の詳細
定義および略語
本明細書において用いられるＡＳＡという用語は、アスピリンの活性物質であるアセチルサリチル酸（Ａｃｅｔｙｌ Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ Ａｃｉｄ）を意味することが意図される。
本明細書において用いられる「胚盤胞由来幹細胞」という用語はＢＳ細胞と示され、そのヒトの形は「ｈＢＳ細胞」と呼ばれる。文献中ではこの細胞はしばしば胚幹細胞、より特定的にはヒト胚幹細胞と呼ばれる。
本明細書において用いられる「ＤＭＳＯ」という用語は、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を意味することが意図される。
本明細書において用いられる「基底細胞」という用語は、ＭＣＰ細胞が発生する細胞の層を意味することが意図される。基底細胞は、形態的特徴および特異的マーカの特徴によってさらに定義される。
本明細書において用いられる「ＭＣＰ」という用語は多能性心臓前駆体（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｃａｒｄｉａｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）を意味することが意図され、これは中胚葉系統内の多くの異なる細胞型の元となり得る細胞型である。ＭＣＰが元となり得るこうした細胞型の１つに心筋細胞様の細胞があり、これは成熟心筋細胞と共通の特徴を有する細胞である。ＭＣＰ細胞は、形態的特徴および特異的マーカの特徴、たとえばＦｌｋ−１（ＫＤＲ）、ＩＳＬ−１、Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４、およびトロポニンＴタイプ２（ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ ｔｙｐｅ ２：ＴＮＮＴ２）の遺伝子発現などによってさらに定義される。さらに、ＭＣＰ細胞は収縮しない心臓前駆体として定義される。
本明細書において用いられる「ＭＣＰクラスタ」および「ＭＣＰ細胞クラスタ」という用語は、互いに付着した少なくとも２個のＭＣＰ細胞の群を意味することが意図される。
本明細書において用いられる「ダウンレギュレーションされた」および「アップレギュレーションされた」という用語は、未分化細胞に比べてレギュレーションに少なくとも２倍の相違があることを意味することが意図される。
フィーダ細胞
本明細書において用いられるフィーダ細胞は、単独または組合せて用いられる支持細胞型を意味することが意図される。さらにこの細胞型はヒトまたは他の種に由来してもよい。フィーダ細胞が由来し得る組織は、胚、胎児、新生児、子供、または成体の組織を含み、さらに***を含む皮膚、臍帯、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、間質または胸部に由来する組織を含む。フィーダ細胞は、ヒトの線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞および上皮細胞からなる群に属する細胞型に由来してもよい。フィーダ細胞を得るために用いられ得る特定の細胞型の例は、胚の線維芽細胞、胚体外の内胚葉細胞、胚体外の中胚葉細胞、胎児の線維芽細胞および／または線維細胞、胎児の筋細胞、胎児の皮膚細胞、胎児の肺細胞、胎児の内皮細胞、胎児の上皮細胞、臍帯の間充織細胞、胎盤の線維芽細胞および／または線維細胞、胎盤の内皮細胞、出生後の***の線維芽細胞および／または線維細胞、出生後の筋細胞、出生後の皮膚細胞、出生後の内皮細胞、成体の皮膚の線維芽細胞および／または線維細胞、成体の筋細胞、成体の卵管内皮細胞、成体の腺の子宮内膜細胞、成体の間質の子宮内膜細胞、成体の乳癌実質細胞、成体の内皮細胞、成体の上皮細胞、または成体のケラチン生成細胞を含む。フィーダ細胞がｈＢＳ細胞に由来するとき、その細胞は線維芽細胞であってもよい。
本明細書において用いられる「ＭＥＦ細胞」という用語は、マウス胚線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を意味することが意図される。
本明細書において用いられる「胚葉」という用語は、発生生物学において公知の３つの主要な系統、すなわち外胚葉（たとえば神経組織の元となる）、中胚葉（たとえば結合組織、軟骨および骨の元となる）、および内胚葉（たとえば腸上皮、肝臓および膵臓などの内臓の組織の元となる）のいずれかを意味することが意図される。
本明細書において用いられる「ｈＦＦ細胞」という用語は、ヒト***線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を意味することが意図される。ｈＦＦ細胞はさらに商業的に入手可能であったり、本明細書の「方法」部分に記載されるとおりに得られたりしてもよい。
本明細書において用いられる「ＦＧＦ」という用語は、好ましくはヒトおよび／または組換え体由来の線維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を意味し、これに属するサブタイプはたとえばｂＦＧＦ（時にはＦＧＦ２とも呼ばれる）およびＦＧＦ４などである。
本明細書において用いられる「ＥＧＦ」という用語は、上皮成長因子（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）を意味することが意図される。
「ＢＭＰ２」という用語は、成長因子のＢＭＰファミリーの一員である骨形態形成タンパク質２（ｂｏｎｅ−ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−２）を意味することが意図される。
本明細書において用いられる「異種成分不含（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）」という用語は、ヒト以外の動物の成分に対する直接的または間接的な露出を完全に回避したことを意味することが意図される。
本明細書において用いられる「強制凝集」という用語は、外部からの力を加えることによって細胞の相互への付着または表面への付着が増加することを意味することが意図される。
未分化ｈＢＳ細胞に対するマーカ：ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４（段階特異的胚抗原（ｓｔａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）３および４）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｏｃｔ−４、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ））。
初期分化ｈＢＳ細胞に対するマーカ：ＳＳＥＡ−１。
中胚葉系統または胚葉に対する発生生物学の見地からの初期マーカは、ビメンチン、デスミン、アルファサルコメリックアクチン（ａｌｐｈａ−ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ ａｃｔｉｎ）であり、中内胚葉細胞に対するマーカはブラキウリである。
外胚葉系統の細胞に対するマーカ：ネスチン、ＧＦＡＰ（神経膠線維酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）またはＧＦＡＰは、中枢神経系の星状細胞に排他的に見出される中間径フィラメントのタイプＩＩＩタンパク質である）。
心臓幹細胞マーカ：ｃキットおよび心臓前駆体マーカ：Ｉｓｌｅｔ−１、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４。ここでは初期心臓マーカとみなされる。
心筋細胞に対するマーカ：ｃＴｎＩ、ｃＴｎＴ（心臓トロポニン（ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ）ＩおよびＴ）、α−ＭＨＣ（アルファミオシン重鎖（ａｌｐｈａ−ｍｙｏｓｉｎ−ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ））、コネキシン４３。
上に述べたとおり、本発明はＭＣＰ細胞ならびに中間の基底細胞および心筋細胞様の細胞に分化したＭＣＰ細胞を提供する。このＭＣＰ細胞および基底細胞は新規であると考えられる。こうした細胞は、たとえば薬物の発見プロセス、薬物のスクリーニングプロセス、心臓細胞型に影響する可能性のある薬物を研究するためのインビトロのモデル、初期心臓発生などの心臓発生を研究するためのインビトロのモデル、ヒトの心臓変性障害を研究するためのインビトロのモデル、インビトロの心臓毒性試験などの多数の研究目的に対して有利に用いられる。
さらに、このＭＣＰ細胞、中間の基底細胞および得られる心筋細胞様の細胞は、たとえば心臓組織の変性などの組織変性によってもたらされる病状および／または疾患の処置および／または予防のために有利に用いられ得る。より特定的には、こうした障害は、壊死心筋、アポトーシス心筋、損傷した心筋、機能不全の心筋、および／または形態的に異常な心筋に関係する障害などの心臓障害を含む。その他の障害は、虚血性心疾患、心筋梗塞、リウマチ性心疾患、心内膜炎、自己免疫性心疾患、心臓弁膜疾患、先天性の心臓障害、心臓リズム異常（ｃａｒｄｉａｃ ｒｈｙｔｈｍ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓｍ）、心臓機能不全などを含む。したがって本発明に従った細胞、特にＭＣＰ細胞および心筋細胞様の細胞は、医学および薬の調製に用いることができる。
ＭＣＰ細胞
この状況におけるＭＣＰ細胞とは、非常に特異な形態および特異的マーカの特徴を有する細胞を意味することが意図される。したがって、本発明は第１の局面において、多能性心臓前駆（ＭＣＰ）細胞を含む、ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞に由来する細胞集団に関する。この細胞集団集団は以下の特徴を有する：
ｉ）細胞の少なくとも１％は未分化細胞に対する１つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４からなる群より選択される、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％は、ネスチンまたはＧＦＡＰを含む神経系マーカの１つまたはそれ以上のタンパク質発現を示さない、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％は、ブラキウリ、ビメンチンまたはデスミンを含む中胚葉マーカの１つまたはそれ以上のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｖ）細胞の少なくとも１％は、Ｆｌｋ−１（ＫＤＲ）のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
本明細書の実施例から分かるとおり、Ｆｌｋ−１はＭＣＰ細胞に対する優れたマーカである。
さらに、ＭＣＰ細胞に対して、細胞の少なくとも１％、たとえば少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、ｉｓｌｅｔ−１、ｃＴＮＩ、ｃＴＮＴ、Ｎｋｘ２．５、アルファＭＨＣまたはコネキシン４３を含む１つまたはそれ以上の初期段階心臓マーカのタンパク質発現を示さない。
たとえば心筋細胞などとは対照的に、ＭＣＰ細胞は収縮しない細胞である。したがってＭＣＰ細胞を含む本発明に従った細胞集団は、細胞の少なくとも５０％、たとえば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％が収縮しない細胞である。
本明細書の実施例から証明されるとおり、トロポニンＴ２はＭＣＰ細胞に対する良好なマーカである。したがって本発明に従った細胞集団は、細胞の少なくとも１％、たとえば少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がトロポニンＴ２のタンパク質および／または遺伝子発現を示す集団である。
ＣＤ３１もＭＣＰ細胞に対する優れたマーカであることが示されている。したがって本発明に従った細胞集団は、細胞の少なくとも１％、たとえば少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＣＤ３１のタンパク質および／または遺伝子発現を示す集団である。
特定の場合には、Ｎｋｘ２．５およびＧＡＴＡ−４もＭＣＰ細胞に対する良いマーカである。実施例に示されるとおり、これは特にＭＣＰ細胞がマウスフィーダ細胞上での培養後に得られる場合である。したがって本発明に従った細胞集団は、細胞の少なくとも１％、たとえば少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＮｋｘ２．５および／またはＧＡＴＡ−４のタンパク質および／または遺伝子発現を示す集団である。
特定の実施形態において、本発明に従った細胞集団の細胞の少なくとも１％、たとえば少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％はＦｌｋ−１（ＫＤＲ）、トロポニンＴ２、ＣＤ３１、Ｎｋｘ２．５およびＧＡＴＡ−４のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、すなわちそれらの細胞はＭＣＰ細胞である。
別の特定の実施形態において、本発明に従った細胞集団の細胞の少なくとも１％、たとえば少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は前駆細胞の１つまたはそれ以上のマーカＦｌｋ−１（ＫＤＲ）およびＩＳＬ−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、すなわちそれらの細胞はＭＣＰ細胞である。
さらなる特定の実施形態において、本発明に従った細胞集団の細胞の少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は前駆細胞の２つまたはそれ以上のマーカＦｌｋ−１（ＫＤＲ）、Ｎｏｔｃｈ−１またはＩＳＬ−１のタンパク質および／または遺伝子発現を示し、すなわちそれらの細胞はＭＣＰ細胞である。
特徴ｉ）は、細胞全体が分化した細胞であること、すなわちそれらの細胞が由来するｈＢＳ細胞とは異なることを確実にする。
特徴ｉｉ）は細胞全体が神経様の細胞に分化していないことを確実にし、特徴ｉｉｉ）は細胞が中胚葉の性質を有することを示し、特徴ｉｖ）はｈＢＳ細胞が発達してＭＣＰ細胞になったことを確実にする。
さらに、細胞の少なくとも１％は、たとえばｉｓｌｅｔ−１、ｃＴＮＩ、ｃＴｎＴ、Ｎｋｘ２．５、アルファＭＨＣまたはコネキシン４３などの１つまたはそれ以上の初期段階心臓マーカのタンパク質発現を示さない。この特徴は、これらの細胞がまだ心臓様の細胞に分化していないこと、すなわちこれらの細胞がまだ異なる種類の細胞に発達する可能性を有する前駆細胞であることを確実にする。本明細書の実施例に示されるとおり、ＭＣＰ細胞は発達して心筋細胞様の細胞またはその他の分化細胞型になり得るが、基底細胞を提供する能力も有する。
ＭＣＰ細胞は、光学顕微鏡法を用いて見ることのできる非常に特徴的な形態を有する。さらに、ＭＣＰ細胞は本明細書の図面に示される。実施形態の１つにおいて、本発明は、小さく丸い明位相差像を示す（ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）細胞のクラスタとして現れるＭＣＰ細胞を含む細胞集団に関する；個々の細胞は直径５〜２０μｍであり、各クラスタは２〜５００個の細胞からなる。図２のパネルａ、ｂおよびｃに例示されるとおり、ＭＣＰ細胞のクラスタは円形または細長い形である。
通常、ＭＣＰ細胞のクラスタは緩く付着した細胞の塊として現れ、基底細胞上に生育されるときには基底細胞の単層の上にある。さらに、ＭＣＰ細胞は核対細胞質の比率が比較的高く、たとえば細胞の合計体積の１：２〜１：６４である。図２にさらなる特徴的な形態的特徴がみられ、すなわちＭＣＰクラスタは図１８の概略スケッチに示されるような糸に付いた風船の形で現れる。
したがって、特定の実施形態において、本発明に従った細胞集団においては、ＭＣＰ細胞の少なくとも５０％が
１．小さく丸い明位相差像を示す細胞のクラスタとして生育し、
２．円形または細長い形のクラスタを形成し、そのクラスタは緩く付着した細胞の塊として現れ、基底細胞上に生育されるときには基底細胞の単層の上にあり、
３．比較的高い核対細胞質の比率を有し、および／または
４．糸に付いた風船の形で現れ、
それらの細胞は以下の特徴をすべて有する：
ｉ）細胞の少なくとも１％は未分化細胞に対する１つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４からなる群より選択される、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％は、たとえばネスチンまたはＧＦＡＰなどの神経系マーカの１つまたはそれ以上のタンパク質発現を示さない、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％は、たとえばブラキウリ、ビメンチンまたはデスミンなどの中胚葉マーカの１つまたはそれ以上のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、および
ｉｖ）細胞の少なくとも１％は、Ｆｌｋ−１（ＫＤＲ）のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
特定の実施形態においては、細胞の少なくとも１％は、たとえばｉｓｌｅｔ−１、ｃＴＮＩ、ｃＴＮＴ、Ｎｋｘ２．５、アルファＭＨＣまたはコネキシン４３などの１つまたはそれ以上の初期段階心臓マーカのタンパク質発現を示さない（特徴ｖ））。
好ましくは、ＭＣＰ細胞の少なくとも５０％は４つの特徴のうち少なくとも２つ、たとえば４つの特徴のうち少なくとも３つ、または４つの特徴すべてを有する。
本発明の実施形態の１つにおいて、ＭＣＰ細胞の少なくとも５５％、たとえば少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、特徴ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）および／またはｉｖ）に関する要求を満たす。
上述のとおり、本発明はＭＣＰ細胞を含む細胞集団にも関する。こうした細胞集団は、少なくとも特徴ｉ）を満たし、たとえば少なくとも特徴ｉ）に示されるマーカのうち少なくとも２つ、たとえば少なくとも３つ、少なくとも４つ、またはすべてのマーカに対して特徴ｉ）を満たす。ＭＣＰ細胞を未分化ｈＢＳ細胞と区別できることは大変望ましいため、この特徴は重要である。
本発明の実施形態の１つにおいて、ＭＣＰ細胞を含む細胞集団中の細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、未分化細胞に対する１つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４からなる群より選択される。
さらに、または代替的に、この細胞集団は少なくとも特徴ｉｉ）に示される両方のマーカに対して特徴ｉｉ）を有する。この特徴は、神経型の細胞への分化を回避することを確実にするために重要である。本発明の実施形態の１つにおいて、ＭＣＰ細胞を含む細胞集団中の細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、たとえばネスチンまたはＧＦＡＰなどの神経系マーカの１つまたはそれ以上のタンパク質発現を示さない。
特徴ｉｉｉ）は中胚葉的特徴の存在に関係し、好ましくは少なくとも特徴ｉｉｉ）に示されるマーカのうち２つまたは３つに対して特徴ｉｉｉ）が満たされる。本発明の実施形態の１つにおいて、ＭＣＰ細胞を含む細胞集団中の細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、たとえばブラキウリ、ビメンチンまたはデスミンなどの中胚葉マーカの１つまたはそれ以上のタンパク質および／または遺伝子発現を示す。
特徴ｖ）は細胞がまだ初期段階の心臓様の細胞に発達していないことを確実にするために重要であり、したがって細胞集団は、好ましくは少なくとも特徴ｉｖ）に示されるマーカのうち少なくとも２つ、たとえば２、３、４、５または６つに対して特徴ｉｖ）を有する。本発明の実施形態の１つにおいて、ＭＣＰ細胞を含む細胞集団中の細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％は、たとえばｉｓｌｅｔ−１、ｃＴＮＩ、ｃＴＮＴ、Ｎｋｘ２．５、アルファＭＨＣまたはコネキシン４３などの１つまたはそれ以上の初期段階心臓マーカのタンパク質および／または遺伝子発現を示さない。
特に、この細胞集団は４つの特徴のうち少なくとも２つ、たとえば４つの特徴のうち少なくとも３つ、または４つの特徴すべてを有する。
本発明に従った細胞集団は異種成分不含であってもよく、これは医学的目的に使用されるときには利点となる。
本発明に従ったＭＣＰ細胞は、培養の際にそれらが示す特徴ｉ）−ｖ）のいずれかを維持できる。この状況における「維持された特徴」という用語は、定められた培養および分析期間にわたる安定したタンパク質、遺伝子または抗原の発現を意味することが意図され、それはたとえば免疫組織化学ならびに発現強度の測定および比較によってさらに示すことができる。したがって、本発明に従ったＭＣＰ細胞を含む細胞集団は、インビトロで培養されてもよい。
さらに、ＭＣＰ細胞は基底細胞の同一層から再生成されてその後単離されてもよい。こうした再生成は最大２０回行なわれ得る。基底細胞およびＭＣＰ細胞はどちらもＦｌｋ−１（ＫＤＲ）遺伝子発現などの前駆体特性を示し、微速度撮影を通じた研究（実施例１４）では、基底細胞がＭＣＰ細胞の元となるのと同様にＭＣＰ細胞も基底細胞の元となり得る、すなわちこれらの細胞はいくつかの共通の特性を有する密接に関連する前駆細胞となることが示された。
分化したＭＣＰ細胞
新規ＭＣＰ細胞の非常に重要な特性の１つは、心筋細胞様の細胞に分化できることである。したがって本発明の実施形態の１つにおいて、本発明に従った細胞集団は、少なくとも５日の期間にわたるプレート培養および分化培地の使用によって分化されて、以下の特徴のうち少なくとも１つを有するようになる：
ｉ）細胞の少なくとも１％は、たとえばブラキウリ、ビメンチンまたはデスミンなどの中胚葉マーカの１つまたはそれ以上のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％は、たとえばｉｓｌｅｔ−１、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、ｃＴＮＩ、ｃＴＮＴ、またはコネキシン４３などの１つまたはそれ以上の心臓マーカのタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％は未分化幹細胞に対する１つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４からなる群より選択される。
ＭＣＰ細胞の特徴と比較すると、ＭＣＰ細胞に由来するこれらの心筋細胞様の細胞は中胚葉マーカに関する特徴を維持していることが分かる。特定の実施形態において、これらの細胞は少なくとも特徴ｉ）を満たし、たとえば少なくとも特徴ｉ）に示されるマーカのうち２つまたは３つに対して特徴ｉ）を満たす。特定の実施形態において、特徴ｉ）は細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である。
さらに、ＭＣＰ細胞に由来する心筋細胞様の細胞は、特徴ｉｉ）を有することによってその心筋細胞様の性質、つまり陽性の心臓マーカを有すること、すなわち心臓様の細胞に分化したことを確認する必要がある。特定の実施形態において、これらの細胞は少なくとも特徴ｉｉ）に示されるマーカのうち少なくとも２つ、たとえば２、３、４、５または６つに対して特徴ｉｉ）を満たす。特定の実施形態において、特徴ｉｉ）は細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である。
分化した細胞は分化に関する特徴も保持しており、すなわち分化を受けた後の細胞集団は、少なくとも特徴ｉｉｉ）に示されるマーカのうち少なくとも２つ、たとえば２、３、４または５つに対して特徴ｉｉｉ）を有する。特定の実施形態において、特徴ｉｉｉ）は細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である。
好ましくは、分化を受けた後の細胞集団は少なくとも２つの特徴または３つの特徴すべてを有する。
基底細胞
基底細胞は、ＭＣＰ細胞の形成において重要な中間細胞である。基底細胞はそれらが由来するｈＢＳ細胞とは異なり、ＭＣＰ細胞とも形態的に異なる。したがって本発明はヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞に由来する細胞集団にも関し、この細胞集団は基底細胞を含む。この細胞集団は以下の特徴を有する：
ｉ）細胞の少なくとも１％はブラキウリのタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％はアルファサルコメリックアクチンのタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％はビメンチンのタンパク質発現を示さない、
ｉｖ）細胞の少なくとも１％はデスミンのタンパク質発現を示さない、および
ｖ）細胞の少なくとも１％は未分化細胞に対する１つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４からなる群より選択される。
本明細書の実施例から分かるとおり、基底細胞は、たとえば実施例３の表ＩＩに列挙される遺伝子などのいくつかの遺伝子の遺伝子および／またはタンパク質発現を示す。したがって、基底細胞を含む本発明に従った細胞集団は、以下のさらなる特徴を有する：
ｉ）細胞の少なくとも１％は実施例３の表ＩＩに列挙される遺伝子、たとえばバソヌクリン１（Ｂａｓｏｎｕｃｌｉｎ １：ＢＮＣ１）、ネフロネクチン（ｎｅｐｈｒｏｎｅｃｔｉｎ：ＮＰＮＴ）、フィブリノゲンアルファ鎖（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ａｌｐｈａ ｃｈａｉｎ：ＦＧＡ）、アネキシンＡ８（ａｎｎｅｘｉｎ Ａ８：ＡＮＸＡ８）、マトリックスＧｌａタンパク質（ｍａｔｒｉｘ Ｇｌａ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＧＰ）、透明帯糖タンパク質４（ｚｏｎａ ｐｅｌｌｕｃｉｄａ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ４：ＺＰ４）、トロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ：ＴＨＢＤ）、ホメオボックスＢ７（ｈｏｍｅｏｂｏｘ Ｂ７：ＨＯＸＢ７）、心臓および神経冠誘導体発現１（ｈｅａｒｔ ａｎｄ ｎｅｕｒａｌ ｃｒｅｓｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ １：ＨＡＮＤ１）、デスモコリン３（ｄｅｓｍｏｃｏｌｌｉｎ ３：ＤＳＣ３）、インターロイキン６シグナルトランスデューサ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ：ＩＬ６ＳＴ）、アクアポリン１（ａｑｕａｐｏｒｉｎ １：ＡＱＰ１）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＦＲＺＢ）、ブラジキニン受容体Ｂ１（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂ１：ＢＤＫＲＢ１）、成長ホルモン受容体（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＧＨＲ）、およびキナーゼ挿入ドメイン受容体（Ｆｌｋ−１）（ｋｉｎａｓｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＫＤＲ）などのうち少なくとも１つまたはそれ以上の遺伝子発現を示す、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％は、未分化ｈＢＳ細胞に比べてダウンレギュレーションされたｏｃｔ−４およびｎａｎｏｇの遺伝子発現を有する。
基底細胞に対する上記の特徴は通常、細胞集団中の細胞の少なくとも５％、たとえば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％に対して有効である。
基底細胞は、光学顕微鏡法を用いて見ることのできる非常に特徴的な形態を有する。さらに、基底細胞は本明細書の図面に示される。実施形態の１つにおいて、本発明は、原始内胚葉に似た形態を有する基底細胞を含む細胞集団に関し、基底細胞は上皮様であり、すなわち内皮細胞様の形を有する。基底細胞は暗位相差像を示し（ｐｈａｓｅ−ｄａｒｋ）、境界明瞭（すなわち隣接細胞間の境界が明らか）であり、および／または光学顕微鏡法によって明らかにされるとおりの角張った形を有してもよい（図１９）。
特定の実施形態において、本発明は基底細胞を含む細胞集団に関し、その基底細胞の少なくとも５％は
１．原始内胚葉に似た形態を有し、
２．上皮様であり、
３．光学顕微鏡法によって明らかにされるとおりに暗位相差像を示し、かつ境界明瞭であり、および／または
４．光学顕微鏡法によって明らかにされるとおりの角張った形を有し、
さらに以下の特徴のうち少なくとも１つを有する：
ｉ）細胞の少なくとも１％はブラキウリのタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％はアルファサルコメリックアクチンのタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％はビメンチンのタンパク質発現を示さない、および
ｉｖ）細胞の少なくとも１％はデスミンのタンパク質発現を示さない、
ｖ）細胞の少なくとも１％は未分化細胞に対する１つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４からなる群より選択される。
特定の実施形態において、基底細胞の少なくとも５％は５つの特徴のうち少なくとも２つを有し、好ましくはその２つの特徴はｉ）およびｉｖ）であり、または基底細胞の少なくとも５％は少なくとも３つ、４つ、または５つの特徴すべてを有する。通常、これらの特徴は細胞の少なくとも１０％、たとえば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である。
本発明の特定の実施形態において、ＧＡＴＡ−１は重要な転写因子である。ＧＡＴＡ−１は造血（血液形成）に関与することが報告されているため、ＧＡＴＡ−１の役割は特に注目される（フーバー（Ｈｕｂｅｒ）およびゾン（Ｚｏｎ）、１９９８年、１０（２）：ｐ．１０３−１０９、Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）。ＧＡＴＡ−１は、発達の際に起こる初期細胞プロセスを調節することによって心臓発生と造血との生物学的結び付きを提供できると我々は提案する。血管細胞および血液細胞の元となる血管芽細胞は、心臓前駆体と共通の発達経路を有し、やはり初期胚の中胚葉に由来する。
上述のとおり、本発明は基底細胞を含む細胞集団にも関する。こうした細胞集団は少なくとも特徴ｉ）を満たすか、５つの特徴のうち少なくとも２つを満たし、好ましくはその２つの特徴はｉ）およびｉｖ）であり、または５つの特徴のうち少なくとも３つを満たすか、５つの特徴のうち少なくとも４つを満たすか、または細胞集団は５つの特徴すべてを有する。一般的に、特徴ｉ）−ｖ）の各々は細胞の少なくとも５％、たとえば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％に対して有効である。
基底細胞は、異種成分不含の形で得られてもよい。
細胞集団の細胞の個々の型の使用は、本明細書に前述されるか、または実施例もしくは添付の請求項に示される。
特定の実施形態において、本発明は基底細胞およびＭＣＰ細胞を含む細胞集団に関し、その細胞集団全体（すなわち基底細胞およびＭＣＰ細胞）の少なくとも５％はＦｌｋ−１の遺伝子および／またはタンパク質発現を示す。
調製のための方法
出発材料
本発明に対する出発材料は、好適には未分化ｈＢＳ細胞系などの多能性未分化ｈＢＳ細胞である。こうした材料はセラーティス社（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ ＡＢ）から得ることができ、ＮＩＨの幹細胞登録（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｇｉｓｔｒｙ）ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／を通じても入手可能である。セラーティス社の２つのｈＢＳ細胞系（ＳＡ００１およびＳＡ００２）およびＳＡ００２の１つのサブクローン（ＳＡ００２．５）がＮＩＨを通じて入手可能である。本発明ではこれらのｈＢＳ細胞系がしばしば用いられている。
セラーティス（商標）ｈＢＳ細胞系ＳＡ００１、ＳＡ００２、ＳＡ０４６、ＳＡ０９４、ＳＡ１１１、ＳＡ１２１、ＳＡ１８１、ＳＡ１９１、ＳＡ１９６、ＳＡ２０２、ＳＡ２１８、ＳＡ２４０、ＳＡ３４８、ＳＡ３５２、ＳＡ３９９、ＳＡ４６１、ＳＡ５０２、ＳＡ５０６、ＳＡ５２１、およびＳＡ５４０は、ＭＲＣ（医学研究会議（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ））における英国幹細胞バンク登録（ＵＫ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｒｅｇｉｓｔｒｙ）に対しても承認されている。
ｈＢＳ細胞が出発材料として推奨されるのは、以下の特徴のためである：アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、Ｏｃｔ−４に対して陽性、ＳＳＥＡ−１に対して陰性、テロメラーゼ活性、ならびにインビトロおよびインビボにおける多能性（後者は免疫不全マウスにおける奇形腫形成によって示された）。
使用前に、出発材料として用いられるｈＢＳ細胞系は、特徴付けプログラムを受けるＬＯＴ調製から得られてもよい。ｈＢＳ細胞系のＬＯＴ調製は、標準化された方法に従うと、培養物中のｈＢＳ細胞の拡張およびその後の単一継代中の１００本より多いストローの凍結を構成する（特許出願中、ＷＯ２００４０９８２８５号）。本明細書の実験部分を参照されたい。
本明細書において用いられる出発材料はさらに、完全に異種成分不含で得られてもよく、それによって再生医療における使用の可能性に対する完全に異種成分不含の基底細胞、ＭＣＰ細胞または心筋細胞様の細胞が得られてもよい。ｈＢＳ細胞の異種成分不含の導出のためには、使用されるすべての培地および基質構成要素、フィーダ細胞およびその他の材料は、いかなるヒト以外の動物材料にも由来または接触してはならない。ｈＢＳ細胞の異種成分不含の導出、さらに異種成分不含の基底細胞、ＭＣＰ細胞または心筋細胞様の細胞を得るために好適な構成要素は、異種成分不含で導出されたヒト線維芽細胞、たとえばヒト***線維芽細胞など、組換え成長因子、分化因子および／またはその他の可能な添加剤を有する血清を含まない培地またはヒト血清を主成分とする培地、ならびに細胞の解離および増殖のためのヒト組換え酵素または滅菌した機械的ツールである。
３Ｄ培養
Ｉ．懸濁培養
基底細胞およびＭＣＰ細胞は、未分化のｈＢＳ細胞から得られる。基底細胞を含む細胞集団は、以下のステップを含む方法によって得られる：
ｉ）約１日から約１０日、たとえば約１日から約６日などの間、懸濁培養中の分化培地において未分化ｈＢＳ細胞の１つまたはそれ以上のコロニー切片またはコロニーを培養するステップ、
ｉｉ）こうして培養された細胞を続けて増殖および分化するための培養容器に移すステップ、
ｉｉｉ）任意には、光学顕微鏡における形態的基準および／または本明細書において定義される関連マーカの同定によって基底細胞を同定するステップ、
ｉｖ）任意には、こうして得られた基底細胞を単離するステップ、および
ｖ）任意には、ステップｉｉ）−ｉｖ）を繰返すステップ。
未分化ｈＢＳ細胞は３〜６日間、たとえば４〜５日間維持および増殖された。未分化細胞は（例、手動で）切開され、以下に懸濁培養として定義されるものなどの分化培地中に置かれた。細胞は懸濁液中に１〜１０日間、たとえば１〜８日間または１〜６日間維持され、たとえばゼラチン被覆された皿などに移されて、細胞クラスタの付着が導かれた。増殖および分化は約２〜６日間、たとえば４日間続けられる。細胞のクラスタから細胞の単層が現れ、基底細胞はたとえば光学顕微鏡法などを用いることによって同定できる（本明細書において考察されるとおり）。
ＩＩ．強制凝集
基底細胞およびＭＣＰ細胞は、未分化のｈＢＳ細胞から得られる。基底細胞を含む細胞集団は、以下のステップを含む方法によって得られる：
ｉ）ｈＢＳ細胞を分離および解離して懸濁液にし、細胞懸濁液をマルチウェル組織培養プレートに分配するステップ、
ｉｉ）細胞の強制凝集のために遠心力を加えるステップ、
ｉｉｉ）こうして増強された３Ｄクラスタ化細胞を、約１日から約２０日、たとえば約６日から約８日などの間、マイクロウェル形式の分化培地中で培養するステップ、
ｉｖ）任意には、こうして３Ｄ培養された細胞を続けて増殖および分化するための培養容器に移すステップ、
ｖ）任意には、光学顕微鏡における形態的基準および／または本明細書において定義される関連マーカの同定によって基底細胞を同定するステップ、
ｖｉ）任意には、こうして得られた基底細胞を単離するステップ、および
ｖｉｉ）任意には、ステップｉｉｉ）−ｉｖ）を繰返すステップ。
ステップｉ）は通常、未分化のｈＢＳ細胞コロニーの切片を血清を含むかまたは含まない分化培地に懸濁することによって開始する。（例、懸濁培養におけるステップｉ）および強制凝集法におけるステップｉｉｉ）に対する）好適な分化培地は、実施例１に記載される分化培地であって、ＫＯ−ＤＭＥＭにグルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）（例、０．１ｍＭから２ｍＭ、たとえば１ｍＭの濃度）、β−ＭｅＯＨ（例、０．０１ｍＭから約１ｍＭ、たとえば０．１ｍＭの濃度）、１つまたはそれ以上の可欠アミノ酸（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ：ＮＥＡＡ）（例、０．１％から約２％、たとえば１％の濃度）、ＰｅＳＴ（例、約０．１％から約２％、たとえば約１％の濃度）、および／または血清、たとえばウシ胎児血清など（例、５％から３０％、たとえば約２０％の濃度）を補った培地、または実施例６に記載されるＣＧＭ培地（基本培地は３５％のＩＭＤＭおよび６５％のＤＭＥＭ：Ｆ１２からなり、そこに１％のＰｅＳＴおよびグルタマックスが補われて、３．５％のＦＢＳ、２％のＢ−２７、０．１ｍＭのβ−ＭｅＯＨ、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、４ｎＭのカルディオトロフィン１（Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１）、および４０ｎＭのトロンビンの最終濃度にされる）、またはそれらの組合せもしくは変形を含むがそれに限定されない。
血清が含まれる場合には、その血清はＦＢＳまたはヒト血清であってもよい。血清が存在するとき、血清の濃度は少なくとも２％、たとえば約２％から約３０％、約５％から約２５％または約２０％である。
強制凝集法において、ステップｉ）（すなわち分離）は、細胞の酵素処理、たとえばコラゲナーゼＩＶなどのコラゲナーゼによる処理などによって開始される。酵素の濃度は通常、５０〜５００Ｕ／ｍＬに相当する範囲である。分離された細胞は次いで培地（上述の培地など）に移され、機械的に解離される。ステップｉｉ）では、１００×ｇから１０００×ｇ、特に約４００×ｇの遠心分離が、通常は好適な期間（例、４００×ｇで５分間またはそれに同等のもの）行なわれる。遠心分離後、細胞は５〜１０日、特に６〜８日の期間インキュベートされる。３Ｄクラスタ構造は、たとえば培地を含有するゼラチン被覆された皿などに移されて、２〜６日間、特に４日間培養される。培地は通常１〜３日ごと、たとえば２日目または３日目ごとに交換される。
基底細胞は次いで形態学的に同定されてもよいし、本明細書に記載される特異的マーカの使用によって同定されてもよい。
基底細胞の導出
基底細胞の形成を可能にするためには、懸濁法のステップｉ）を比較的短期間で行なうことが重要であることを本発明者らは見出した。よって特定の実施形態において、ステップｉ）は約１日から約６日、たとえば約１日から約４日、約１日から約３日、または約１日から約２日の期間にわたって行なわれる。
懸濁法のステップｉｉ）において、懸濁培養からの細胞は培養容器中または細胞外基質上に蒔かれる。たとえばマルチウェル形式、培養皿、フラスコなど、あらゆる好適な容器が用いられてもよい。好ましくは、細胞が容器の表面に付着し、培地が用いられることによって細胞が増殖および分化を続ける。細胞は、プラスチック、たとえば組織培養プラスチックの上に直接付着するか、タンパク質コーティング、たとえばラミニン、ポリオルニチンなどの上、細胞外基質成分、たとえばマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の上、またはフィーダの上、または好ましくはゼラチン被覆された容器の上に付着してもよい。
ステップｉｉ）において用いられる培地は血清が含まれても含まれなくてもよい。血清が存在するとき、ステップｉｉ）における使用に対しても上述と同じ濃度が好適である。培地は切換えられても、同じタイプの培地がステップｉｉ）で用いられてもよい。好適な培地は、実施例１に記載される分化培地およびＣＧＭ培地を含む。使用される培地に対する好適な添加剤は、ＥＧＦおよびｂＦＧＦなどの成長因子、ならびにトロンビンなどのセリンプロテアーゼである。実施例４に記載されるとおり、ＭＣＰ細胞の濃縮のために、この培地はＩＭＤＭおよびＤＭＥＭ：Ｆ１２をさらに含んでもよく、任意に１％のＰｅＳＴおよびグルタマックスが補われて、３．５％のＦＢＳ、２％のＢ−２７、０．１ｍＭのβ−ＭｅＯＨ、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、４ｎＭのカルディオトロフィン１、および４０ｎＭのトロンビンの最終濃度にされてもよい。
通常、ステップｉｉ）は約２日から約２０日、たとえば約２日から約１５日、約２日から約１０日、約２日から約６日、または約２日から約４日の期間にわたって行なわれる。
次いで基底細胞が現れて、本明細書に前述されるとおりに同定され得る。基底細胞は、たとえば鋭利なマイクロキャピラリもしくは別の好適なツールを用いた機械的切開によって、またはＥＤＴＡなどのキレート化剤を用いて、たとえばコラゲナーゼ、トリプシンなどを用いた酵素分解によって単離されてもよい。基底細胞は再びプレート培養されて、ステップｉｉ）−ｉｖ）が繰返される。
基底細胞または基底細胞を含む細胞集団は、たとえば本明細書の実施例に記載されるとおりの凍結または低温保存などによって保存でき、本明細書に記載される目的に使用できる。
ＭＣＰ細胞の導出
単離または非単離基底細胞をＭＣＰ細胞の調製に用いることができる。したがって本発明は、ＭＣＰ細胞を含む細胞集団の調製のための方法にも関し、この方法は基底細胞を得るためのステップ、たとえば上記に定めたステップｉ）−ｉｉｉ）を含むか、または代替的に、単離または非単離基底細胞の使用および以下のさらなるステップを含む：
ｖｉ）ＭＣＰ細胞の出現が光学顕微鏡および／または本明細書において定義される関連マーカの同定によって明らかにされるまで基底細胞を培養するステップ、
ｖｉｉ）こうして得られたＭＣＰ細胞を単離するステップ。
ＭＣＰ細胞を得るための基底細胞の培養に対する好適な培地は、たとえば分化培地またはＣＧＭ培地またはそれらの組合せなどである。培地は血清を含有しても（上記を参照）、血清を含まなくてもよい。培地は切換えられても、同じ培地であってもよい。
プレート培養後約２日から約２５日、たとえばプレート培養後約２日から約２０日、約２日から約１５日、約２日から約１０日、約２日から約５日、または約２日から約４日の期間の後に、ＭＣＰ細胞のクラスタが現れる。これらのクラスタは、たとえば鋭利なマイクロキャピラリもしくは別の好適なツールを用いた機械的切開によって、またはＥＤＴＡなどのキレート化剤を用いて、たとえばコラゲナーゼ、トリプシンなどを用いた酵素分解によって単離できる。
ＭＣＰクラスタは、基底細胞が現れた後の１日目から２０日目の間、たとえば５日目から１０日目の間などに、たとえば１回から２０回、５回から１０回などの連続的なラウンドでさらに単離できる。
ＭＣＰ細胞は、たとえば保存、心臓分化に対する使用、特徴付け、薬物の発見における使用、毒性試験における使用、再生医療における使用、および／または基底細胞の入手などのために、さらに２次培養されてもよい。
ＭＣＰ細胞の分化
さらに、ＭＣＰ細胞は、心筋細胞様の細胞を提供するために以下のステップによって分化されてもよい：
ｉ）１つまたはそれ以上の分化因子、たとえばＢＭＰおよびＦＧＦファミリーの成長因子など、Ｂ−２７、５−アザデオキシシチジン、ＤＭＳＯ、レチノイン酸、ＡＳＡおよびアスコルビン酸、ならびに／または分化培地の存在する表面上にＭＣＰ細胞を蒔くことによって、分化したＭＣＰ細胞を得るステップ。
その他の局面
本発明はキットにも関する。上述の局面の詳細および細部は、必要な変更を加えてキットの局面にも適用される。特定の実施形態は添付の請求項から明らかになる。よって本発明のキットは、基底細胞、ＭＣＰ細胞またはＭＣＰ細胞に由来する心筋細胞様の細胞を含む細胞集団と、ｉｉ）心臓分化を起こす１つまたはそれ以上の成熟因子および／または成熟培地と、ｉｉｉ）任意には、使用のための指示書とを含んでもよい。成熟培地は、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、ｂＦＧＦが補われたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、自己の予め調整されたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、ＣＧＭ培地、および心臓に特定のその他の培地からなる群より選択されてもよく、１つまたはそれ以上の成熟因子は、ｂＦＧＦなどのＦＧＦ、ＢＭＰ、５−アザデオキシシチジン、ＤＭＳＯ、レチノイン酸、アスコルビン酸、およびＡＳＡからなる群より選択される。このキットは、成熟をモニタするためのツールをさらに含んでもよい。好適なツールは以下を含んでもよい：
ｉ）未分化ｈＢＳ細胞に対するマーカ、デスミン、アルファサルコメリックアクチン、ブラキウリ、ネスチン、ＧＦＡＰ、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４、ｃＴｎＩ、ｃＴｎＴ、α−ＭＨＣ、およびコネキシン４３からなる群より選択される発現マーカをコードする遺伝子のうち少なくとも３つ、たとえば少なくとも４つまたは少なくとも５つに対するＰＣＲプライマ、または
ｉ）未分化ｈＢＳ細胞に対するマーカ、デスミン、アルファサルコメリックアクチン、ブラキウリ、ネスチン、ＧＦＡＰ、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４、ｃＴｎＩ、ｃＴｎＴ、α−ＭＨＣ、およびコネキシン４３からなる群より選択される発現マーカ抗原のうち少なくとも３つ、たとえば少なくとも４つまたは少なくとも５つに対する抗体。
別の実施形態において、本発明のキットは以下のものを含む：
ｉ）基底細胞および／またはＭＣＰ細胞、
ｉｉ）任意には、インビトロおよび／またはインビボで分化を起こすための因子、
ｉｉｉ）細胞を患者に投与するためのツール、またはこうした細胞を、たとえばすぐに使用できる注射器に入れるなど投与可能な形にしたもの。
本発明は、以下の非限定的な実施例および図面においてさらに例示される。特定の実施形態は本明細書の項目および請求項から明らかになる。
基底細胞の形態を示す図である。Ａは、分化するｈＢＳ細胞の付着性クラスタから生じた、プレート培養の３日後の分化細胞の単層を示す。基底細胞は迷路に似た特徴的な密集した網状組織中で生育するため、分化するｈＢＳ細胞の培養物中で光学顕微鏡を用いて基底細胞の領域を容易に区別できる。基底細胞の形態は原始内胚葉に類似しており、これらの細胞は上皮様である。加えて、個々の細胞は暗位相差像を示し、境界明瞭であり、通常は角張った形をしている。この図面は、ＭＥＦ細胞上で維持された、ｈＢＳ細胞系ＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５、継代２６から得られた細胞を例示する。基底細胞の典型的な領域が示される。Ｂは、分化するｈＢＳ細胞の付着性クラスタから生じた、プレート培養の８日後の分化細胞の単層を示す。この単層は基底細胞を含有する（典型的な領域が示される）。この図面は、ｈＦＦ細胞上で維持された、ｈＢＳ細胞系ＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５、継代４２＋酵素的解離４から得られた細胞を例示する。ＣおよびＤは、分化するｈＢＳ細胞の付着性クラスタから生じた、プレート培養の１５日後の分化細胞の単層を示し、その上にＭＣＰ細胞のクラスタが現れている。パネルＣでは、四角の中に典型的な領域が示される。パネルＤでは、四角が基底細胞を有する領域をマークし、破線の楕円が基底細胞上にあるＭＣＰ細胞の典型的なクラスタをマークしている。これらの図面は、ＭＥＦ細胞上で維持された、ｈＢＳ細胞系ＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５、継代２６から得られた細胞を例示する。 基底細胞上にあるＭＣＰ細胞クラスタの形態を示す図である。パネルＡ−Ｃは、分化したｈＢＳ細胞のプレート培養後１５日の、基底細胞の単層に緩く付着した小さく丸い明位相差像を示す細胞のクラスタとして生育するＭＣＰ細胞を示す。このＭＣＰ細胞は核対細胞質の比率が高い。クラスタの典型的な特徴は、「糸に付いた風船」に似ていることである。ＭＣＰ細胞クラスタは円形または細長い形のいずれであってもよい。楕円は典型的なＭＣＰ細胞クラスタを示す。これらの図面は、ＭＥＦ細胞上で維持された、ｈＢＳ細胞系ＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５、継代２６から得られた細胞を例示する。パネルＡは、「糸に付いた風船」の形態を有するＭＣＰクラスタの概略スケッチを含む。 単離および再プレート培養された鼓動していないＭＣＰ細胞の形態を示す図である。Ａは、新たな培養皿の（血清を含有する）分化培地中に移された、単離６日後の単離ＭＣＰ細胞クラスタの形態を示す。この図面は、ＭＥＦ細胞上で維持された、ｈＢＳ細胞系ＳＡ４６１、ＬＯＴＢＦ４６１、継代２２から得られた細胞を例示する。Ｂは、新たな培養皿の分化培地中に移された、単離７日後の単離ＭＣＰ細胞クラスタの形態を示す。この図面は、ＨＦＦ細胞上で維持された、ｈＢＳ細胞系ＳＡ１２１、ＬＯＴＢＤ１２１、継代１５６＋酵素的解離１０から得られた細胞を例示する。Ｃは、新たな培養皿の分化培地中に移された、単離１２日後の単離ＭＣＰ細胞クラスタの形態を示す。この図面は、ＨＦＦ細胞上で維持された、ｈＢＳ細胞系ＳＡ１２１、ＬＯＴＢＤ１２１、継代１５６＋酵素的解離１０から得られた細胞を例示する。 新たな基底細胞および新たなＭＣＰクラスタの元となる、単離され再プレート培養されたＭＣＰ細胞の形態を示す図である。この図面は、ＦＢＳを有さない分化培地における単離１日後の、新たな基底細胞に分化する単離ＭＣＰ細胞を示す。基底細胞上にある新たなＭＣＰ細胞が観察できる（楕円によって示される）。この図面は、ｈＦＦ細胞上で維持された、ｈＢＳ細胞系ＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２、継代５５＋酵素的解離３、およびＭＥＦ細胞上のＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５、継代２６から得られた細胞を例示する。 ＭＣＰ細胞に由来する自発的に収縮する細胞の形態を示す図である。図５Ａ−図５Ｆは、ＭＥＦ細胞上で維持された、ｈＢＳ細胞系ＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２、継代３４から得られた細胞を例示する。Ａは、分化培地における単離８日後の、増殖し自発的に収縮するＭＣＰ細胞クラスタの形態を示す。Ｂは、単離１１日後の同じ細胞クラスタを示す。Ｃは単離１３日後である。Ｄは単離１５日後である。Ｅは単離１８日後である。Ｆは単離２６日後である。 血清不在のときのＭＣＰ細胞の分化を示す図である。図６Ａ−図６Ｃは、ｈＦＦ細胞上で維持された、ｈＢＳ細胞系ＡＬ００２、継代５５＋酵素的解離３、およびＭＥＦ細胞上のＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５、継代２６から得られた細胞を例示する。Ａは、単離１日後の、血清を含まない培地中の単離ＭＣＰ細胞の典型的な形態を示す。Ｂは、単離７日後の、血清を含まない培地中の単離ＭＣＰ細胞の典型的な均質の形態を示す。Ｃは、単離９日後の、血清を含まない培地中の単離ＭＣＰ細胞の典型的な均質の形態を示す。 単離直後に固定されたＭＣＰ細胞クラスタにおけるサイトスピン（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ）ビメンチン発現を用いて単離されたときに直接行なわれたＭＣＰ細胞のビメンチン染色を示す図である。核はＤＡＰＩによって青色に染色され、ビメンチン（マウス抗ビメンチン抗体、Ｖ−６６３０、シグマ）はＴＲＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ１抗体（サザンバイオテクノロジー（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））によって視覚化される。細胞系ＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５、継代２６およびＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２、継代４８。 それぞれＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２、継代４８、ＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５、継代４２＋４酵素的継代、ＳＡ１２１、ＬＯＴＢＤ１２１、継代１５６＋１０および１１酵素的継代、ならびにＳＡ４６１、ＬＯＴ４６１、継代２２の分化したＭＣＰ細胞の免疫組織化学分析によって得られた結果を例示する図である。Ａは、分離後３日間分化されたＭＣＰ細胞におけるビメンチン発現（マウス抗ビメンチン抗体、Ｖ−６６３０、シグマ）がＴＲＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ１抗体（サザンバイオテクノロジー）によって視覚化されたものである。核はＤＡＰＩによって青色に染色された。Ｂは、分離後３日間分化されたＭＣＰ細胞におけるデスミン発現（マウス抗デスミン抗体、ＭＡＢ１６９８、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））がＴＲＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ１抗体（サザンバイオテクノロジー）によって視覚化されたものである。核はＤＡＰＩによって青色に染色された。Ｃは、分離後７日間分化されたＭＣＰ細胞におけるアルファサルコメリックアクチンの発現（マウス抗アルファサルコメリックアクチン、Ａ２１７２、シグマ）がＦＩＴＣ結合ＩｇＭ抗体によって視覚化されたものである。核はＤＡＰＩによって青色に染色された。Ｄは、分離後１６日間分化されたＭＣＰ細胞におけるＮｋｘ２．５の発現（抗Ｎｋｘ２．５抗体、サンタクルーズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））がアレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８抗ウサギＩｇＧ抗体によって視覚化されたものである。 基底細胞の免疫組織化学分析によって得られた結果を例示する図である。Ａは、分化培地に蒔かれた後３６日間培養された基底細胞におけるα−サルコメリックアクチンの発現（マウス抗アルファサルコメリックアクチン、Ａ２１７２、シグマ）を示す。抗原マーカはＦＩＴＣ結合ＩｇＭ抗体によって視覚化される。用いられた細胞系はＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２、継代２６である。Ｂは、基底細胞を含むすべての細胞核のＤＡＰＩ染色を示す。Ｃは、図面ＡおよびＢをともに重ね合せたものである。Ｄは、分化培地に蒔かれた後１５日間培養された基底細胞におけるブラキウリの発現（ウサギ抗ブラキウリ、ｓｃ−２０１０９、サンタクルーズバイオテクノロジー）を例示する。抗原マーカはアレクサ４８８抗ウサギＩｇＧ抗体によって視覚化される。用いられた細胞系はＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５、継代３２である。Ｅは、基底細胞を含むすべての細胞核のＤＡＰＩ染色を示す。Ｆは、図９Ｄおよび図９Ｅをともに重ね合せたものである。図面Ｄ−Ｆ中の円は、基底細胞上にありかつブラキウリに対して陽性に染色されるＭＣＰ細胞クラスタを示す。 Ｂ２７含有培地で培養される単離およびプレート培養されたＭＣＰ細胞の形態を示す図である。ＭＣＰ細胞はｈＢＳ細胞系ＳＡ４６１に由来し、単離されたクラスタは新たなＩＶＦ皿に移された。その後細胞は２％のＢ２７補充を含有する血清を含まない培地中で維持された。図１０は、単離およびプレート培養後（示されるとおり）１、２、４、７、および１０日目（ｄａｙ）のＭＣＰ細胞クラスタを示す。基底細胞の典型的な出現がｄａｙ ４、７、および１０に示される。 Ｂ２７含有培地で培養される単離およびプレート培養されたＭＣＰ細胞の形態を示す図である。ＭＣＰ細胞はｈＢＳ細胞系ＳＡ４６１に由来し、単離されたクラスタは新たなＩＶＦ皿に移された。その後細胞は２％のＢ２７補充を含有する血清を含まない培地中で維持された。図１１は、単離およびプレート培養後のｄａｙ １０におけるＭＣＰ細胞の免疫組織化学染色を示す図である。この図面は形態と、ＤＡＰＩ染色と、ブラキウリ発現に対する染色とを示す。 基底細胞において特異的に発現する遺伝子の遺伝子発現レベルを示す図である。実施例３に記載されるとおりにマイクロアレイ分析が行なわれ、表ＩＩに列挙される遺伝子の部分集合の遺伝子発現レベルがプロットされる。ｙ軸は遺伝子発現レベルに正比例する強度単位を示す。パネルＡは以下に対する値を示す：バソヌクリン１（ＢＮＣ１）、ネフロネクチン（ＮＰＮＴ）、フィブリノゲンアルファ鎖（ＦＧＡ）、アネキシンＡ８（ＡＮＸＡ８）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、透明帯糖タンパク質４（ＺＰ４）。ＵＤ＝未分化細胞、ＭＣ＝基底細胞またはＭＣＰ細胞を除く混合分化細胞、ＢＣ＝基底細胞、ＣＭ１＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞、ＣＭ２＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞。 基底細胞において特異的に発現する遺伝子の遺伝子発現レベルを示す図である。実施例３に記載されるとおりにマイクロアレイ分析が行なわれ、表ＩＩに列挙される遺伝子の部分集合の遺伝子発現レベルがプロットされる。ｙ軸は遺伝子発現レベルに正比例する強度単位を示す。パネルＢは以下に対する値を示す：トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）、ホメオボックスＢ７（ＨＯＸＢ７）、心臓および神経冠誘導体発現１（ＨＡＮＤ１）、デスモコリン３（ＤＳＣ３）、インターロイキン６シグナルトランスデューサ（ＩＬ６ＳＴ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）。ＵＤ＝未分化細胞、ＭＣ＝基底細胞またはＭＣＰ細胞を除く混合分化細胞、ＢＣ＝基底細胞、ＣＭ１＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞、ＣＭ２＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞。 基底細胞において特異的に発現する遺伝子の遺伝子発現レベルを示す図である。実施例３に記載されるとおりにマイクロアレイ分析が行なわれ、表ＩＩに列挙される遺伝子の部分集合の遺伝子発現レベルがプロットされる。ｙ軸は遺伝子発現レベルに正比例する強度単位を示す。パネルＣは以下に対する値を示す：Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＦＲＺＢ）、ブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１）、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（Ｆｌｋ−１）（ＫＤＲ）。ＵＤ＝未分化細胞、ＭＣ＝基底細胞またはＭＣＰ細胞を除く混合分化細胞、ＢＣ＝基底細胞、ＣＭ１＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞、ＣＭ２＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞。 基底細胞において中間レベルで発現される心筋細胞マーカ遺伝子の遺伝子発現レベルを示す図である。実施例３に記載されるとおりにマイクロアレイ分析が行なわれ、心筋細胞マーカ遺伝子の遺伝子発現レベルがプロットされる。ｙ軸は遺伝子発現レベルに正比例する強度単位を示す。パネルＡは以下に対する値を示す：ミオシン重ポリペプチド６（ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ６：ＭＹＨ６）、ホスホランバン（ｐｈｏｓｐｈｏｌａｍｂａｎ：ＰＬＮ）、チチン（ｔｉｔｉｎ：ＴＴＮ）、ＧＡＴＡ結合タンパク質６（ＧＡＴＡ６）、ＧＡＴＡ結合タンパク質４（ＧＡＴＡ４）、Ｔボックス５（Ｔ−ｂｏｘ ５：ＴＢＸ５）、Ｔボックス２（Ｔ−ｂｏｘ ２：ＴＢＸ２）、およびアクチニンアルファ２（ａｃｔｉｎｉｎ ａｌｐｈａ ２：ＡＣＴＮ２）。ＵＤ＝未分化細胞、ＭＣ＝基底細胞またはＭＣＰ細胞を除く混合分化細胞、ＢＣ＝基底細胞、ＣＭ１＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞、ＣＭ２＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞。 基底細胞において中間レベルで発現される心筋細胞マーカ遺伝子の遺伝子発現レベルを示す図である。実施例３に記載されるとおりにマイクロアレイ分析が行なわれ、心筋細胞マーカ遺伝子の遺伝子発現レベルがプロットされる。ｙ軸は遺伝子発現レベルに正比例する強度単位を示す。パネルＢは以下に対する値を示す：心臓ＬＩＭタンパク質（ｃａｒｄｉａｃ ＬＩＭ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＳＲＰ３）、トロポニンＴタイプ２（ＴＮＮＴ２）、ミオシン重ポリペプチド７（ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ７：ＭＨＹ７）、ミオシン結合タンパク質Ｃ（ｍｙｏｓｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ：ＭＹＢＰＣ３）、ミオシン軽ポリペプチド４（ｍｙｏｓｉｎ ｌｉｇｈｔ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ４：ＭＹＬ４）、ミオシン軽ポリペプチド７（ＭＹＬ７）、トロポモジュリン１（ｔｒｏｐｏｍｏｄｕｌｉｎ １：ＴＭＯＤ１）、およびミオシン軽ポリペプチド３（ＭＹＬ３）。ＵＤ＝未分化細胞、ＭＣ＝基底細胞またはＭＣＰ細胞を除く混合分化細胞、ＢＣ＝基底細胞、ＣＭ１＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞、ＣＭ２＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞。 基底細胞において中間レベルで発現される心筋細胞マーカ遺伝子の遺伝子発現レベルを示す図である。実施例３に記載されるとおりにマイクロアレイ分析が行なわれ、心筋細胞マーカ遺伝子の遺伝子発現レベルがプロットされる。ｙ軸は遺伝子発現レベルに正比例する強度単位を示す。パネルＣは以下に対する値を示す：ＬＩＭドメイン結合３（ＬＩＭ ｄｏｍａｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ３：ＬＤＢ３）、ミオゼニン２（ｍｙｏｚｅｎｉｎ ２：ＭＹＯＺ２）、クレアチンキナーゼ（ｃｒｅａｔｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ：ＣＫＭ）、ミオグロビン（ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ：ＭＢ）、およびミオメシン１（ｍｙｏｍｅｓｉｎ １：ＭＹＯＭ１）。ＵＤ＝未分化細胞、ＭＣ＝基底細胞またはＭＣＰ細胞を除く混合分化細胞、ＢＣ＝基底細胞、ＣＭ１＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞、ＣＭ２＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞。 ＭｉｔｏＦｌｕｏｒ（商標）緑色色素によるＭＣＰ細胞の染色を示す図である。この図面は、異なる濃度で異なる期間にわたりＭｉｔｏＦｌｕｏｒ（商標）緑色色素によって染色されたＭＣＰ細胞を示す。ＭＣＰ細胞はｈＢＳ細胞系ＳＡ００２およびＳＡ００２．５に由来し、培養の９〜２０日後に最終濃度５０〜２００ｎＭのＭｉｔｏＦｌｕｏｒ（商標）緑色色素で染色された。実験の１つにおいて、細胞は１５分、３０分および４５分間インキュベートされ、その後装填溶液が除去され、次いで染色後の異なる時点において蛍光が観察された。別の実験においては、染色時間は４５分から最大１９時間まで変動され、各時点後に蛍光がモニタされた。２００ｎＭの色素で３０−４５分間またはそれより長く染色されたＭＣＰ細胞中のミトコンドリアは、染色の直後または延長時間に色素を蓄積させた後に、明るい緑色の蛍光を特定的に示した。この染色は、蓄積時間を増加させても合計染色インキュベーション時間を増やしても、強くなったりより特定的になったりすることはなかった。１００ｎＭのＭｉｔｏＦｌｕｏｒ（商標）緑色色素で処理された細胞は、２００ｎＭの色素での染色と同じパターンを示すために、４５分よりも長い染色または色素を蓄積させるための時間を必要とした。これらの実験の代表的な写真をＡ−Ｄに示す。Ａは、２００ｎＭの色素で４５分間染色したＭＣＰ細胞の光学顕微鏡写真を示す。Ｂは、２００ｎＭの色素で４５分間染色したＭＣＰ細胞の対応する蛍光写真を示す；蛍光は染色の直後に観察された。Ｃは、１００ｎＭで１９時間染色したＭＣＰ細胞の光学顕微鏡写真を示す。Ｄは、１００ｎＭで１９時間染色したＭＣＰ細胞の対応する蛍光顕微鏡写真を示す；蛍光は染色の直後に観察された。矢印はＭＣＰ細胞クラスタを示す。 リアルタイムｑＰＣＲを用いた、ＭＥＦ上で培養されたｈＢＳ細胞に由来するＭＣＰ細胞の遺伝子発現分析を示す図である。ＭＣＰ細胞クラスタはＭＥＦ細胞上で維持されたｈＢＳ細胞系ＳＡ００２から得られた。ＭＣＰ細胞は、９６ウェルプレート中の分化するｈＢＳ細胞から形成される３Ｄクラスタのプレート培養の９〜１８日後に、緩く付着した細胞クラスタの機械的切開によって採取された。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて特定の遺伝子のｍＲＮＡレベルを定めた。その値は、未分化の対照を１００％としたときの相対的遺伝子発現として表わされる。ＭＣＰ以外は各群において１回の観察が行なわれ、ＭＣＰの値は３回の異なる観察の平均＋ＳＥである。パネルＡは以下の遺伝子発現レベルを示す：Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｎｏｔｃｈ−１、Ｉｓｌｅｔ−１（ＩＳＬ−１）、およびＦｌｋ−１（ＫＤＲ）。ＵＤ＝未分化細胞、ＭＣ＝基底細胞またはＭＣＰ細胞を除く混合分化細胞。 リアルタイムｑＰＣＲを用いた、ＭＥＦ上で培養されたｈＢＳ細胞に由来するＭＣＰ細胞の遺伝子発現分析を示す図である。ＭＣＰ細胞クラスタはＭＥＦ細胞上で維持されたｈＢＳ細胞系ＳＡ００２から得られた。ＭＣＰ細胞は、９６ウェルプレート中の分化するｈＢＳ細胞から形成される３Ｄクラスタのプレート培養の９〜１８日後に、緩く付着した細胞クラスタの機械的切開によって採取された。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて特定の遺伝子のｍＲＮＡレベルを定めた。その値は、未分化の対照を１００％としたときの相対的遺伝子発現として表わされる。ＭＣＰ以外は各群において１回の観察が行なわれ、ＭＣＰの値は３回の異なる観察の平均＋ＳＥである。パネルＢは以下の遺伝子発現レベルを示す：Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４、トロポニンＴ２、ＣＤ３１、およびＡＣＴＡ２。ＵＤ＝未分化細胞、ＭＣ＝基底細胞またはＭＣＰ細胞を除く混合分化細胞。 リアルタイムｑＰＣＲを用いた、ｈＦＦ上で培養されたｈＢＳ細胞に由来するＭＣＰ細胞の遺伝子発現分析を示す図である。ＭＣＰ細胞クラスタはｈＦＦ細胞上で維持されたｈＢＳ細胞系Ｅ３−ＳＡ００２から得られた。ｈＦＦ培養系においては、緩く付着したＭＣＰ細胞クラスタのみを採取した（９６ウェルプレート中で形成される３Ｄクラスタのプレート培養の９〜１８日後）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて特定の遺伝子のｍＲＮＡレベルを定めた。その値は、未分化の対照を１００％としたときの相対的遺伝子発現として表わされる。パネルＡは以下の遺伝子発現レベルを示す：Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｎｏｔｃｈ−１、Ｉｓｌｅｔ−１（ＩＳＬ−１）、およびＦｌｋ−１（ＫＤＲ）。ＵＤ＝未分化細胞、ＭＣ＝基底細胞またはＭＣＰ細胞を除く混合分化細胞。ｈＦＦ＝ヒト***線維芽細胞。 リアルタイムｑＰＣＲを用いた、ｈＦＦ上で培養されたｈＢＳ細胞に由来するＭＣＰ細胞の遺伝子発現分析を示す図である。ＭＣＰ細胞クラスタはｈＦＦ細胞上で維持されたｈＢＳ細胞系Ｅ３−ＳＡ００２から得られた。ｈＦＦ培養系においては、緩く付着したＭＣＰ細胞クラスタのみを採取した（９６ウェルプレート中で形成される３Ｄクラスタのプレート培養の９〜１８日後）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて特定の遺伝子のｍＲＮＡレベルを定めた。その値は、未分化の対照を１００％としたときの相対的遺伝子発現として表わされる。パネルＢは以下の遺伝子発現レベルを示す：Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４、トロポニンＴ２、ＣＤ３１、およびＡＣＴＡ２。ＵＤ＝未分化細胞、ＭＣ＝基底細胞またはＭＣＰ細胞を除く混合分化細胞。ｈＦＦ＝ヒト***線維芽細胞。 基底細胞におけるｈＢＳ細胞マーカ遺伝子の遺伝子発現レベルを示す図である。実施例３に記載されるとおりマイクロアレイ分析が行なわれ、Ｏｃｔ−４およびＮａｎｏｇの遺伝子発現レベルがプロットされる。ｙ軸は遺伝子発現レベルに正比例する強度単位を示す。ＵＤ＝未分化細胞、ＭＣ＝基底細胞またはＭＣＰ細胞を除く混合分化細胞、ＢＣ＝基底細胞、ＣＭ１＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞、ＣＭ２＝ｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞。 基底細胞上にあるＭＣＰ細胞クラスタの形態を示す図である。パネルＡは図２のものであるが、「糸に付いた風船」の形態を有するＭＣＰクラスタの概略スケッチを含む。 基底細胞の形態を示す図である。図１のパネルＤと類似の図面であって、角張った形を有する基底細胞の形態を示す。
方法および材料
実験部分で用いられる材料に関する特定の詳細を以下の部分に示す。以下の略語が用いられている。
ＤＡＰＩは、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩水和物（４’，６’−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｈｙｄｒａｔｅ）を意味することが意図され、これは細胞核を視覚化するために用いられる試薬である。
ＤＭＥＭは、細胞培養基本培地のダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）を意味することが意図される。
ＦＩＴＣは、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を意味することが意図され、これはしばしば免疫反応を視覚化するための２次抗体への結合として用いられる。
グルタマックスまたは（グルタマックスＴＭ）は、しばしば細胞培養培地への添加として用いられるグルタミン代用物を意味することが意図される。
ＩＭＤＭは、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）を意味することが意図される。
ＰＥＳＴは、抗菌性の細胞培養添加として用いられるペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）とストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）との混合物を意味することが意図される。
ＳＣＩＤマウスは、重症複合免疫不全マウス（Ｓｅｖｅｒｅｌｙ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ）を意味することが意図される。
ＴＲＩＴＣは、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｉｓｏ−Ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を意味することが意図され、これはしばしば免疫反応を視覚化するための２次抗体への結合として用いられる。
トリプルセレクト（ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ）は、インビトロジェン株式会社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）によって販売される、（しばしばブタにおいて得られる）酵素トリプシンに対する組換え型の非動物性代替物を意味することが意図される。
方法
出発材料
本発明に対する出発材料は、好適には未分化ｈＢＳ細胞系などの多能性未分化ｈＢＳ細胞である。こうした材料はセラーティス社から得ることができ、ＮＩＨ幹細胞登録ｈｔｔｐ：／／ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／を通じて、および英国幹細胞バンクからも入手可能である。セラーティス社の２つのｈＢＳ細胞系（ＳＡ００１およびＳＡ００２）およびＳＡ００２の１つのサブクローン（ＳＡ００２．５）がＮＩＨを通じて入手可能である。
セラーティス（商標）ｈＢＳ細胞系ＳＡ００１、ＳＡ００２、ＳＡ０４６、ＳＡ０９４、ＳＡ１１１、ＳＡ１２１、ＳＡ１８１、ＳＡ１９１、ＳＡ１９６、ＳＡ２０２、ＳＡ２１８、ＳＡ２４０、ＳＡ３４８、ＳＡ３５２、ＳＡ３９９、ＳＡ４６１、ＳＡ５０２、ＳＡ５０６、ＳＡ５２１、およびＳＡ５４０は、ＭＲＣ（医学研究会議）における英国幹細胞バンクにも受諾されている。
本発明ではこれらのｈＢＳ細胞系がしばしば用いられている。ｈＢＳ細胞が出発材料として推奨されるのは、以下の特徴のためである：アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、Ｏｃｔ−４に対して陽性、ＳＳＥＡ−１に対して陰性、テロメラーゼ活性、ならびにインビトロおよびインビボにおける多能性（後者は免疫不全マウスにおける奇形腫形成によって示された）（方法およびプロトコルは以前に示される、ハインズ（Ｈｅｉｎｓ）ら、ＷＯ０３０５５９９２号）。
以下に、好適な出発材料を得る４つの異なるやり方を記載する：
１．ｈＢＳ細胞系の確立およびＬＯＴ調製
２．異種成分不含の調製
３．酵素的に継代されたｈＢＳ細胞
４．フィーダを含まない培養系に移されたｈＢＳ細胞。
ＭＣＰ細胞が治療目的に用いられるときには、異種成分不含の調製が特に重要である。
１．ＬＯＴ調製および特徴付けプログラム
ｈＢＳ細胞系のＬＯＴ調製は、培養物中のｈＢＳ細胞の拡張およびその後のガラス化法（ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）による凍結を構成し、ガラス化法とは、標準化された方法に従って、瞬間凍結によって単一継代における１００本より多いストローを結晶状態にすることを意味する（特許出願中、ＷＯ２００４０９８２８５号）。ｈＢＳ細胞系の形態は、凍結の前後にモニタされ、ＬＯＴから細胞を解凍した後の培養における連続的な継代においてもモニタされる。ＬＯＴ凍結の品質は、解凍回復率を調べることによって確認される。次いで、微生物の安全性およびヒトウイルスに関する安全性試験が凍結された継代における細胞および培地に対して行なわれることにより、細胞が汚染されていないことが確認される。行なわれる特徴付けプログラムは、ｈＢＳ細胞系の分化状態を確認するための広範囲の方法を含む。最初に、未分化細胞に対する一般的に認められるマーカ（ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｏｃｔ−４およびＡＬＰ）のマーカ発現分析が行なわれる。継代および凍結−解凍サイクルを通じた細胞のゲノム安定性は、核型決定およびＦＩＳＨを通じて調べられる。テロメラーゼ活性は、Ｔｅｌｏ ＴＡＧＧＧテロメラーゼＰＣＲ ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキットを用いて測定される。ｈＢＳ細胞の多能性は、胚様体ステップを介したインビトロ分化、および免疫不全ＳＣＩＤマウスの腎臓皮膜下へのｈＢＳ細胞の移植によるインビボ分化によって調べられる。
２．異種成分不含の調製
本明細書において用いられる出発材料はさらに、完全に異種成分不含で得られてもよく、それによって再生医療における使用の可能性に対する完全に異種成分不含のＭＣＰが得られることで、移植片拒絶反応の危険性およびヒト以外の病原体の移転の可能性がかなり減少されてもよい。ｈＢＳ細胞の異種成分不含の導出のためには、使用されるすべての培地および基質構成要素、フィーダ細胞およびその他の材料は、いかなるヒト以外の動物材料にも由来または接触してはならない。ｈＢＳ細胞の異種成分不含の導出、さらに異種成分不含のＭＣＰを得るために好適な構成要素は、異種成分不含で得られたヒト線維芽細胞、たとえばヒト***線維芽細胞など、ヒト組換え成長因子、分化因子および／またはその他の可能な添加剤を有する血清を含まない培地またはヒト血清を主成分とする培地、ならびに細胞の解離および増殖のためのヒト組換え酵素または滅菌した機械的ツールである。以下に好適な手順を説明する。
異種成分不含のｈＢＳ細胞の取得および培養
臨床的体外受精（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ＩＶＦ）処置からの余剰のヒト胚が、インフォームドコンセントおよびイェーテボリ大学における地方倫理委員会の許可の後に提供された。提供された胚は、ＩＶＦ処置において伝統的に用いられる培地中で５日齢まで胚盤胞に培養された。この胚盤胞は、ガードナー（Ｇａｒｄｎｅｒ）に従って４ＡＡと等級付けされ、ＷＯ２００３０５５９９２号に従ってＡ品質の胚盤胞と等級付けされた（多くの明瞭な密に詰まったＩＣＭ細胞および多くの細胞を有する凝集性の栄養外胚葉を有する、拡張された胚盤胞）。胚盤胞は、酸性タイロード溶液（メディカルト（Ｍｅｄｉｃｕｌｔ））溶液（すぐに使用できる濃度）で１５〜３０秒間室温にて処理されることによって、透明帯および栄養外胚葉の部分が除去された後、およそ２７０ｍＯｓｍ／ｋｇの容量オスモル濃度のＤＭＥＭに２０％（ｖ／ｖ）のヒト血清、４ｎｇ／ｍｌのヒト組換えｂＦＧＦ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のグルタマックス、０．５ｍｍｏｌ／ｌのβ−メルカプトエタノールおよび１％の可欠アミノ酸（ギブコ・インビトロジェン社（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））が補われた異種成分不含の血清中で、マイトマイシンＣを不活性化した異種成分不含のヒト***線維芽細胞フィーダ上に内部細胞塊細胞が置かれた。次いで胚盤胞は空気中の５％ＣＯ２の中で３７℃にてインキュベートされた。２〜３日ごとに培地の５０％が交換され、１０日後に細胞は新鮮なｈＦＦフィーダに機械的に継代された。継代２から、切断および移動ツールとしてガラスキャピラリを用いて、ｈＢＳ細胞（細胞系ＳＡ６１１）が機械的に継代された。細胞は約１週間に１回継代され、１１継代より多く培養された。
ｈＢＳ細胞系ＳＡ６１１は上述の手順を用いて得られ、さらに３０継代より多く培養された。
ヒト***線維芽細胞フィーダ細胞系（細胞系ｈＦＦ００３など）の確立
ヒト***サンプルは、割礼を受けた８週齢の男児から、２Ｘゲンタマイシンを含有する滅菌ＩＭＤＭ（インビトロジェン）中で無菌的に集められた。皮膚外植片は、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ・インビトロジェン社）、および１０％のヒト血清を含有する２５ｃｍ２プライマリア（ｐｒｉｍａｒｉａ）組織培養フラスコ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））の内側に置かれた。約１０日後に集密的な単層が確立された。細胞は、トリプルセレクト（インビトロジェン）を用いて連続的に継代された。拡張後の細胞は、ヒト病原体（マイコプラズマ、１型および２型のＨＩＶ、Ｂ型およびＣ型の肝炎、サイトメガロウイルス、１型および２型の単純疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス）の標準パネルに対して試験された。
フィーダ層の調製
異種成分不含のヒト線維芽細胞フィーダをプレート培養する前に、組織培養されたウェルは０．１％の組換えヒトゼラチン（フィブロジェン（Ｆｉｂｒｏｇｅｎ））で室温にて最低１時間被覆される。ＩＭＤＭ、１０％のヒト血清および１％のペニシリン−ストレプトマイシンの中で生育された異種成分不含のｈＦＦ００３（第５から第８継代）細胞の集密的な単層は、次いでマイトマイシンＣ（シグマ）で２．５時間処理された。マイトマイシンＣ処理されたフィーダはＩＶＦウェル（ベクトン・ディッキンソン）上に、２．８９ｃｍ２当り２０００００細胞が、ＤＭＥＭ（上記のとおり）を主成分とする１０％（ｖ／ｖ）のヒト血清と、１％のペニシリン−ストレプトマイシンと、１％のグルタマックスと、０．５ｍｍｏｌ／ｌのβ−メルカプトエタノールと、１％の可欠アミノ酸（ギブコ・インビトロジェン社）とが補われた培地に蒔かれた。胚盤胞をその内部細胞塊細胞およびそれに由来する細胞またはｈＢＳ細胞とともに置く前に、培地はＤＭＥＭ（上記のとおり）に今回は２０％（ｖ／ｖ）のヒト血清、１０ｎｇ／ｍＬのヒト組換えｂＦＧＦ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のグルタマックス、０．５ｍｍｏｌ／ｌのβ−メルカプトエタノールおよび１％の可欠アミノ酸（ギブコ・インビトロジェン社）が補われた培地に交換された。（上述の「異種成分不含のｈＢＳ細胞の取得および培養」における培地と同じ。）
血清を主成分とする培地の調製
ヒト血清は、少なくとも１５人の健康な個体からの血液サンプル（Ｂｌｏｄｃｅｎｔｒａｌｅｎ、シャルグレンスカ（Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ）大学病院）から得られ、それは血液をヘパリン非被覆プラスチックバッグに集め、約８℃で１晩置くことによって血清を凝固した材料から分離することによって得られた。血清はさらに滅菌ろ過され、プールされ、好適な部分に分けて凍結された。（使用前に、血液はスウェーデンのＢｌｏｄｃｅｎｔｒａｌｅｎにおいてＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＴＬＶおよび梅毒を含む病原体の標準的一群に対して試験された。）培地は、２０％（ｖ／ｖ）の解凍血清をＤＭＥＭ（上述のとおり）および上述の「異種成分不含のｈＢＳ細胞の取得および培養」に記載されるその他の成分に加えることによって、さらに調製された。
異種成分不含のｈＢＳ細胞のガラス化法による凍結および解凍
ｈＢＳ細胞系ＳＡ６１１はＷＯ２００４０９８２８５号に記載される方法に従って凍結された。２つの溶液ＡおよびＢが調製される（溶液Ａ：極低温ＰＢＳ（Ｃｒｙｏ−ＰＢＳ）中の滅菌ろ過された１０％のエチレングリコール、１０％のＤＭＳＯ；溶液Ｂ：極低温ＰＢＳ中の滅菌ろ過された０．３Ｍのトレハロース、２０％のエチレングリコール、１０％のＤＭＳＯ）。ｈＢＳ細胞系ＳＡ６１１の選択されたコロニーは、幹細胞切断ツール（Ｓｗｅｍｅｄ Ｌａｂｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ビルダル、スウェーデン）を用いて、通常の継代のために細胞を切断するのと同じ態様で切断された。細胞切片は最初に５００ｍｌの予熱された（３７℃）溶液Ａ中で１分間インキュベートされ、次いで２５ｍｌの溶液Ｂに移されて３０秒間インキュベートされ、次いで再び溶液Ｂの新鮮な滴に移されて３０秒間インキュベートされる。その体積は約４０〜５０μｌであった。細胞切片はガラス化法のために調製されたストロー内に吸引され、次いでストローは接着剤で閉じられた。ストローはさらに液体窒素に沈められた。
数日後、凍結ＳＡ６１１を含有するストローは次のように解凍された：２つの溶液ＣおよびＤが調製された（溶液Ｃ：極低温ＰＢＳ中の滅菌ろ過された０．２Ｍのトレハロース；溶液Ｄ：極低温ＰＢＳ中の滅菌ろ過された０．１Ｍのトレハロース）。溶液ＣおよびＤならびにｈＢＳ培地は３７℃に予熱された。ガラス化されたＳＡ６１１を含有する閉じたストローを液体窒素タンクから取出した。ストローは１０秒間室温に保たれ、次いで４０℃の水槽中で急速に解凍された（数秒以内）。オートクレーブしたはさみを用いてストローの塞がれた端部を切開き、注射器を用いて内容物をストローから溶液Ｃ中に押出した。ｈＢＳ細胞は５００μｌの溶液Ｃ中で１分間インキュベートされ、５００μｌの溶液Ｄに移されて５分間インキュベートされた。立体顕微鏡下でｈＢＳ細胞切片を異種成分不含の血清を主成分とする培地中で素早くリンスし、次いで培養皿の血清を主成分とする培地中の異種成分不含のヒト線維芽フィーダ細胞の頂部に接種した。ガラス化後のｈＢＳ細胞の生存能力を検証するために、細胞は次いで培養され（３７℃でのインキュベート）、確立された新コロニーの数が数えられて継代された。
異種成分不含のｈＢＳ細胞系の特徴付け
異種成分不含のＳＡ６１１細胞系は今のところ（上述の）ＬＯＴ調製およびそれに関連する特徴付けをされていないが、これまでに行なわれたかなり詳細な特徴付けを以下の数段落に記載する。ｈＢＳ細胞のコロニー培養物は４％のパラホルムアルデヒド中で固定された後、透過処理された。続く洗浄およびブロッキングステップの後で、細胞は１次抗体とともに４℃にて１晩インキュベートされた。用いられた１次抗体はＯｃｔ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に対して特異的なものだった（サンタクルーズバイオテクノロジー；サンタクルーズ、カリフォルニア州；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）。ＦＩＴＣまたはＣｙ３に結合された２次抗体が検出に用いられた。核はＤＡＰＩによって対比染色された（ベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）；ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バーリンゲーム、カリフォルニア州；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ．ｃｏｍ）。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性は、製造者のプロトコルに従って定められた（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ストックホルム、スウェーデン；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）。３つの異なる胚葉からの細胞を同定するために、上記に概略を述べたとおりの免疫組織化学分析が以下の抗体によって行なわれた。内胚葉の細胞に対してはＨＮＦ３β（サンタクルーズバイオテクノロジー；サンタクルーズ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）が用いられた。中胚葉の細胞はＡＳＭＡ（会社）によって検出され、外胚葉の細胞はβ−チューブリン−ＩＩＩ ｍＡｂ（シグマ−アルドリッチ）によって同定された。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）反応は、商業的キットを用いて製造者のプロトコルに従って検出された（シグマ−アルドリッチ）。ＡＬＰ、Ｏｃｔ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、およびＳＳＥＡ−４に対しては未分化コロニー中の陽性反応が検出されたが、ＳＳＥＡ−１は陰性であった。
遺伝子の特徴付けに対して指定されたｈＢＳ細胞は、２継代の間マウス胚線維芽細胞に再び移されるか、またはマトリゲルプレート（ベクトン・ディッキンソン）に移されて約１０日間さらに培養された。細胞は次いでカリキュリンＡの存在下でインキュベートされ、遠心分離によって集められ、低張処理によって溶解され、エタノールおよび氷酢酸を用いて固定された。染色体はトリプシン−ギームザまたはＤＡＰＩ染色を用いて視覚化された。蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＦＩＳＨ）分析に対しては、製造者の指示を少し変更したものに従って、染色体１２、１３、１７、１８、２０、２１および性染色体（ＸおよびＹ）に対するプローブを含有する商業的に入手可能なキットが用いられた。スライドは、適切なフィルタおよびソフトウェアを備えた倒立顕微鏡において分析された（ＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ；アプライドイメージング（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ）；サンタクララ、カリフォルニア州；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｉｍａｇｉｎｇｃｏｒｐ．ｃｏｍ）。ｈＢＳ細胞系ＳＡ６１１は継代９〜１０において遺伝学的に特徴付けされた。核型分析によって示されるとおり、ｈＢＳ細胞系ＳＡ６１１は、２倍体の正常な核型を有する。その核型は４６ＸＹである。選択された染色体におけるＦＩＳＨ分析によってこの発見が確認された。ＳＡ６１１の核型は正常であることが確認されている。
ＳＡ６１１の多能性は、最初にインビトロで、ｈＢＳ細胞コロニーをフィーダ上で自発的に分化させることによって、または未分化のｈＢＳ細胞コロニーをマトリゲルＴＭ被覆プレート（ベクトン・ディッキンソン）に移してそこで自発的に分化させることによって試験された。どちらの場合にも、分化を誘導するときには培地がＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、クングスバッカ、スウェーデン）に切換えられた。３〜４週間培養した後、免疫組織化学によってコロニーを分析して３つの異なる胚葉からの細胞を同定した。初期内胚葉マーカＨＮ３ベータ（時にはＦｏｘａ１とも呼ばれる）、外胚葉マーカβ−チューブリンおよびＡＳＭＡ（アルファ平滑筋アクチン（ａｌｐｈａ−ｓｍｏｏｔｈ−ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ））に対して陽性反応が同定された。
３．酵素的に継代されたｈＢＳ細胞
この手順においては、ヒト線維芽細胞フィーダは異種成分不含である必要がない。したがって異なる手順を用いてフィーダを得ることができる。以下に２つの異なるやり方を記載するが、異種成分不含の培養条件が望ましいかまたは必要なときには、実際に選択されたやり方を培養条件の要求に対応させることができる。
ヒト***線維芽細胞フィーダの培養
商業的に入手可能なｈＦＦは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＣＲＬ−２４２９ ＡＴＣＣ、マナッサス、ヴァージニア州）から得られ、イスコフＤＭＥＭ（ギブコ・インビトロジェン社、ペーズリー、スコットランド；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）に１０％のＦＢＳ（インビトロジェン）および１％のペニシリン−ストレプトマイシンが補われた培地で培養された。細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡ（インビトロジェン）を用いて１：２から１：８の間の分割で規則的に（毎週）継代された。ＨＦＦの集密的な単層は、マイトマイシンＣ（シグマ）で処理され（１０μｇ／ｍｌにて２．５時間）、０．１％のゼラチン（シグマ）で被覆されたＩＶＦ皿上で７００００〜８００００細胞／ｃｍ２の密度で、４ｎｇ／ｍｌのｈｒ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｒｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ｈｒｂＦＧＦ、インビトロジェン）が補われたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培地に蒔かれた。ｈＦＦ細胞は継代４から継代１２の間でフィーダとして使用された。
ｈＦＦ細胞系およびそのフィーダ層調製は、上述の「異種成分不含の調製」において記載されたように行なわれてもよい。
ｈＢＳ細胞の酵素的増殖培地への移動
ｈＢＳ細胞系ＳＡ００１およびＳＡ１２１（セラーティス社、イェーテボリ、スウェーデン、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ）は、以前に記載されたとおり［ハインズ、ノアクソン（Ｎｏａｋｓｓｓｏｎ）］およびＷＯ０３０５５９９２号のとおりに確立および特徴付けされた。実験前、細胞系は、ＩＶＦ皿内のマイトマイシンＣ不活性化ｍＥＦフィーダ層上で、４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦが補われたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社、クングスバッカ、スウェーデン、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ．ｃｏｍ）中で維持され、切断および移動ツールとしてマイクロキャピラリを用いて手動で切断された。ｈＢＳ細胞を伝統的な培養から酵素的解離に移すために、使用された培地を除去して培養皿をＰＢＳ（インビトロジェン）で１回洗浄した。次いで体積０．５ｍＬのトリプル（商標）セレクト（インビトロジェン）またはトリプシン／ＥＤＴＡ（インビトロジェン）を各ＩＶＦ皿に加えた。ｈＢＳ細胞コロニーの外側領域がフィーダ層から切上がり始めるまで、皿を３７℃でインキュベートした。次いで細胞シートをピペットにより繰返し粉砕することによってばらばらに壊して単一細胞懸濁液にし、遠心管に移して４００ｇで５分間遠心分離した。上清は捨てられ、ｈＢＳ細胞ペレットは新鮮なＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培地に再懸濁され、単一細胞懸濁液は不活性化ｈＦＦの密集フィーダ層を含有するＩＶＦ皿に接種された。
単一細胞懸濁液として継代を用いたｈＢＳ細胞の酵素的増殖
酵素的増殖のために、ｈＢＳ細胞は、高密度のｈＦＦフィーダ細胞およびＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培地に４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦが補われたものからなる培養系において維持された。培養皿をＰＢＳ（インビトロジェン）で洗浄して培地を除去することによって、酵素的解離を開始させた。次いで体積０．５ｍＬのトリプル（商標）セレクト（インビトロジェン）またはトリプシン／ＥＤＴＡ（インビトロジェン）を各皿に加えた。ｈＢＳ細胞コロニーの外側領域がフィーダ層から切上がり始めるまで、皿を３７℃でインキュベートした。次いで細胞シートをピペットにより繰返し粉砕することによってばらばらに壊して単一細胞懸濁液にした。その後細胞懸濁液を遠心管に移して４００ｇで５分間遠心分離した。上清は捨てられ、ｈＢＳ細胞ペレットは新鮮なＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）培地に再懸濁された。次いで細胞は、１：５から１：５００の間の分割比率で不活性化ｈＦＦの密集フィーダ層を含有する新鮮なＩＶＦ皿に接種された。低い方の分割比率は、新たな系における１番最初の継代の際の、いわゆる調整手順の際に用いられた。５継代以内の終了後にｈＢＳ細胞系は１：２０から１：５００の間の分割比率で分割された。培養は、３７℃および９５％の湿度のインキュベータ中で維持された。用いられた培地は、２〜３日ごとに新鮮なＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）＋４ｎｇ／ｍｌのｈｒｂＦＧＦで置換された。個々のｈＢＳ細胞系の生育速度に依存して、細胞は６〜１２日ごとに継代された。ＳＡ００１およびＳＡ１２１どちらの系も正常な核型を維持しながら２０継代よりも多く培養され、さらに１０％のＤＭＳＯが補われた通常の培地中で従来の緩速凍結法に従って凍結および解凍された。
酵素的に継代されたｈＢＳ細胞の特徴付け
ｈＢＳ細胞培養物は４％のパラホルムアルデヒド中で１５分間固定され、０．５％のトリトン溶液（シグマ−アルドリッチ）中で５分間透過処理された後、ＰＢＳ（インビトロジェン）中の５％のＦＢＳによってブロッキングされた。細胞は１次抗体溶液とともに４℃にて１晩インキュベートされた。用いられた１次抗体はＯｃｔ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に対して特異的なものだった（サンタクルーズバイオテクノロジー；サンタクルーズ、カリフォルニア州；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）。ＦＩＴＣまたはＣｙ３に結合された２次抗体（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅｒａｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））とのインキュベーションが室温（ＲＴ）にて６０分間行なわれた。細胞核はＤＡＰＩ（シグマ）によって対比染色された。アルカリホスファターゼの活性は、アルカリホスファターゼ活性検出キットを用いて、製造者の指示に従って定められた（シグマ−アルドリッチ）。染色は、ニコンエクリプス（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ）ＴＥ−２０００Ｕ蛍光顕微鏡を用いて評価および記録された。ＳＡ００１およびＳＡ１２１はどちらも、２０継代を超えた後も上述のｈＢＳ細胞の特徴をすべて示した。
核型分析のために、ｈＢＳ細胞はコルセミド存在下でインキュベートされ、トリプシン処理され、固定されてガラススライド上に載せられた。染色体はＤＡＰＩ染色によって視覚化され、適切なフィルタおよびソフトウェアを備えた倒立顕微鏡を用いて配置および記録された（ＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ；アプライドイメージング（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ）；サンタクララ、カリフォルニア州；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｉｍａｇｉｎｇｃｏｒｐ．ｃｏｍ）。
蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析に対しては、製造者の指示を少し変更したものに従って、染色体１２、１３、１７、１８、２１、ＸおよびＹに対するプローブを含有する商業的に入手可能なキットが用いられた。スライドは、適切なフィルタおよびソフトウェアを備えた倒立顕微鏡において分析された（ＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ）。ＳＡ００１およびＳＡ１２１はどちらも、この系において２０継代より多く培養された後も正常な核型を示した。ＦＩＳＨはもっと高い継代においても正常であることが確認された。多能性は、前述のようにＳＣＩＤマウスにおける奇形腫形成によって評価された［ハインズら］。簡単に述べると、未分化のｈＢＳ細胞コロニーが機械的に切断されて２００×２００μｍ切片にされ、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの腎臓皮膜下に外科的に置かれた（Ｃ．Ｂ−１７／ｌｃｒＣｒｌ−ｓｃｉｄＢＲ；チャールズリバーラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））。マウスは８週間後に殺され、腫瘍が切除されて４％のパラホルムアルデヒド中で固定された。ヘマトキシリンおよびエオシン染色されたパラフィン部分に対して、３つの胚の胚葉すべてに由来する分化したヒト組織、たとえば神経外胚葉、軟骨、および腸様上皮などの存在が組織学的に評価された。
この系において２０継代より多く培養されたＳＡ００１およびＳＡ１２１の両方からの奇形腫において、３つの胚葉すべてが確認された。
ＳＡ６１１などの異種成分不含の細胞系は、もちろんこの章に上述されたのと類似の態様で酵素的継代系に移されて２次培養されてもよい。
４．フィーダを含まない培養系に予め移されたｈＢＳ細胞
本発明において用いられ得るｈＢＳ細胞のさらなる例は、フィーダを含まない培養系に予め移されたｈＢＳ細胞である（ＷＯ２００４０９９３９４およびシェーグレン−ヤンソン Ｅ（Ｓｊｏｇｒｅｎ−Ｊａｎｓｓｏｎ Ｅ）ら）。
ｈＢＳ細胞のコロニーは次いで、たとえばコラゲナーゼＩＶなどのコラゲナーゼなどの好適な酵素を用いて、または切断および移動ツールとしてたとえばガラスキャピラリなどを用いた機械的切開を用いて解離されて切片にされ、さらに以下の「実施例」部分に記載される方法に供されてもよい。
（実施例１）
未分化ｈＢＳ細胞からの基底細胞の導出
懸濁培養
未分化ｈＢＳ細胞はインビトロで維持および増殖された。継代の４〜５日後に、幹細胞切断ツール（ａ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｏｏｌ）を用いて未分化ｈＢＳ細胞コロニーを手動で切開し、懸濁培養の分化培地（ＫＯ−ＤＭＥＭに１ｍＭのグルタマックス、０．１ｍＭのβ−ＭｅＯＨ、１％のＮＥＡＡ、１％のＰｅＳＴおよび２０％のＦＢＳを補ったもの）の中に置いた。細胞は懸濁液中で１〜６日間維持された後、ゼラチン被覆された組織培養皿に移されて、分化する細胞クラスタの付着ならびに細胞の継続的な増殖および分化が導かれた。プレート培養の４日後に、分化するｈＢＳ細胞の付着性のクラスタから細胞の単層が現れる。これらの細胞は、迷路に似た外観を有する特徴的な密集した網状組織中で生育するため、基底細胞の領域は光学顕微鏡法を用いて容易に区別できる。基底細胞の形態は原始内胚葉に類似しており、これらの細胞は上皮様である。加えて、個々の細胞は暗位相差像を示し、境界明瞭であり、通常は角張った形をしている。（図１に例示される。）
強制凝集
ここに記載される別のアプローチを用いても、未分化ｈＢＳ細胞から基底細胞を得ることができる。未分化ｈＢＳ細胞はインビトロで維持および増殖された。継代の４〜５日後に、３７℃にて１０〜１５分間コラゲナーゼＩＶ（２００Ｕ／ｍｌ）とともにインキュベートすることによって、未分化ｈＢＳ細胞コロニーをフィーダ層から分離した。細胞懸濁液を１５ｍｌの管に移し、細胞が沈殿した後に上清を除去した。コロニーは、ノックアウト（Ｋｎｏｃｋ Ｏｕｔ）ＤＭＥＭに２０％のＦＢＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のグルタマックス、０．５ｍｍｏｌ／ｌのβ−メルカプトエタノールおよび１％の可欠アミノ酸（すべてインビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州より）を補った培地に再懸濁され、ピペットを用いて小さいクラスタ（０．２〜０．４ｍｍ）に機械的に解離された。この細胞懸濁液を９６ウェルｖ底プレート（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｉｎｃｏｒｐｏｒｔａｔｅｄ）、ニューヨーク州、米国）に、ウェル当り約４〜６コロニーの濃度で分配し（２００μｌ／ウェル）、４００×ｇで５分間遠心分離した。次いでプレートを３７℃にて６〜８日間インキュベートした。形成された３Ｄ構造を、培地を含有するゼラチン被覆皿（上述と同じ）に移した。プレート培養の４日後に、分化するｈＢＳ細胞の付着性のクラスタから基底細胞が現れる。培地は２日から３日目ごとに交換された。
（実施例２）
基底細胞の特徴付け
基底細胞は、上述のとおり未分化のｈＢＳ細胞から得られた。基底細胞は分化培地（ＫＯ−ＤＭＥＭに１ｍＭのグルタマックス、０．１ｍＭのβ−ＭｅＯＨ、１％のＮＥＡＡ、１％のＰｅＳＴおよび２０％のＦＢＳが補われたもの）中で最高３７日間培養された。細胞はさまざまな時点でＰＦＡ中で固定され、免疫組織化学によって評価された（ノアクソン（Ｎｏａｋｓｓｏｎ）ら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２００５年）。用いられた抗原マーカは、ビメンチン、デスミン、α−サルコメリックアクチン、およびブラキウリであった。基底細胞はα−サルコメリックアクチンおよびブラキウリを発現したが（図９）、ビメンチンおよびデスミンは発現しなかった。用いられた細胞系はＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２（継代２６）、ＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５（継代３２）およびＳＡ４６１、ＬＯＴＢＦ４６１（継代３３）であった。
表Ｉは、基底細胞のＩＨＣ分析によって得られた結果をまとめたものである。
形態の視覚的特徴付けに基づくと、基底細胞は内皮細胞に似ている。起こり得る内皮反応を調べるために、基底細胞を１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（１，１’−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３，３，３’，３’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ：Ｄｉｌ）でラベルされたアセチル化（ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ）ＬＤＬ（Ｄｉｌ−ＡｃＬＤＬ）に露出させた。この色素は血管内皮細胞およびマクロファージの両方をラベルするものであり、混合細胞集団におけるこれらの細胞を特異的に同定するために用いられ得る。
基底細胞およびＭＣＰ細胞は、上述のとおり未分化のｈＢＳ細胞から得られた。導出のために用いられた細胞系はＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２（継代２７）であった。培養の３〜２７日後、基底細胞およびＭＣＰ細胞を含む混合細胞を含有する細胞皿を、３７℃にて４時間、分化培地（ＫＯ−ＤＭＥＭに１ｍＭのグルタマックス、０．１ｍＭのβ−ＭｅＯＨ、１％のＮＥＡＡ、１％のＰｅＳＴおよび２０％のＦＢＳが補われたもの）中で１０μｇ／ｍｌのＤｉｌ−ＡｃＬＤＬ（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）によって処理した。細胞は温かい（３７℃）ＰＢＳで３回洗浄され、組込まれた染色が蛍光顕微鏡によって調べられた。これらの条件下では基底細胞およびＭＣＰ細胞のどちらに対する特異的染色も観察されなかった。このことは、これらの細胞が分化した内皮細胞ではないことを示す。しかし、これらの細胞がＤｉｌ−ＡｃＬＤＬで染色されないもっと初期のもっと未熟な形の内皮細胞を構成する可能性は残る。
（実施例３）
基底細胞のマイクロアレイ分析
細胞培養および分化
ｈＢＳ細胞系ＳＡ００２（セラーティス社、イェーテボリ、スウェーデン、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ）が増殖され、細胞は上記実施例１の強制凝集に記載されるとおりに基底細胞に分化された。光学顕微鏡法を用いて基底細胞のクラスタが同定され、幹細胞ツール（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｏｏｌ）を用いて機械的に単離された。マイクロアレイ実験における比較の目的のために、未分化ｈＢＳ細胞のサンプル、分化したｈＢＳ細胞の混合集団からのサンプル（すなわち基底細胞は存在しない）、およびｈＢＳ細胞に由来する自発的に収縮する心筋細胞様の細胞からのサンプル（ノールシュトローム（Ｎｏｒｓｔｒｏｍ）ら、２００６年；ケハットら、２００１年）が集められて分析に含められた。
サンプル：
１．未分化ｈＢＳ細胞（継代３３、３６、３７、３９、および４０）
２．基底細胞（継代２２、２３、２６〜２８、３２、３３、３６、および３７）
３．分化したｈＢＳの混合集団（継代２２、２８、および３２）
４．心筋細胞様の細胞１（継代２３〜２５、２９、および３５）
５．心筋細胞様の細胞２（継代３９〜４１）
ＲＮＡ抽出およびマイクロアレイ実験
Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて細胞から総ＲＮＡが抽出され、その後５４，６７５転写産物を標的としたＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０）（アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ）、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）を用いたマイクロアレイ実験に用いられた。ＲＮＡサンプルは２サイクルのインビトロ転写（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ＩＶＴ）を用いて増幅された。ＲＮＡの品質および濃度は、それぞれアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）２１００バイオアナライザおよびナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）ＮＤ−１０００を用いて測定された。総ＲＮＡは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現３’−増幅試薬２サイクルｃＤＮＡ合成キット（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ３’−Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｔｗｏ−ｃｙｃｌｅ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ）＊＊の指示（アフィメトリクス社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）に従って処理されることによって２本鎖ｃＤＮＡが生成された。このｃＤＮＡは、製造者の仕様書に従ってビオチンを標的とするｃＲＮＡを生成するための鋳型として用いられた。１５マイクログラムのビオチンラベルされたｃＲＮＡが、３５塩基から２００塩基の長さの鎖に断片化され、そのうちの１０マイクログラムが、標準的手順を用いて、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ハイブリダイゼーションオーブン（Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ｏｖｅｎ）６４００中でＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ１３３プラス２．０（アフィメトリクス社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）上に一晩ハイブリダイゼーションされた。アレイは洗浄され、次いでＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）フルイディクスステーション（Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ）４５０中で染色された。ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）スキャナ（Ｓｃａｎｎｅｒ）３０００による走査が行なわれ、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）オペレーティングソフトウェア（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて画像分析が行なわれた。Ｓｗｅｇｅｎｅ ＭＡＲＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｗｅｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）が、品質管理、ＲＮＡ処理およびアレイのハイブリダイゼーションを実施した。未分化ｈＢＳ細胞、基底細胞、および分化したｈＢＳ細胞の混合集団を表わすサンプルがアレイにハイブリダイゼーションされた。アレイは２重にされた。付加的な比較の目的のために、未分化ｈＢＳ細胞に由来する自発的に収縮する心筋細胞様の細胞を表わす２つのサンプルもマイクロアレイによって分析された。これらのサンプルはそれぞれＣＭ１およびＣＭ２と表示される。
データ分析
基底細胞中でアップレギュレーションされる遺伝子のファミリーを定めるために、未分化ｈＢＳと基底細胞との間の遺伝子発現における倍数変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ：ＦＣ）が算出された。すべてのサンプルにおいて「存在しない（Ａｂｓｅｎｔ）」とＭＡＳソフトウェアにみなされた遺伝子は除去されて、さらなる分析には含まれなかった。サンプル中の１７，４３６プローブが「存在しない」とみなされた。最初に、基底細胞に対するＦＣ値が算出された。平均ＦＣ値＜２の遺伝子はデータ組から除去され、残りの遺伝子のみがさらなる分析に対して考慮された。
混合分化ｈＢＳ細胞集団またはＣＭ１およびＣＭ２サンプルではなく、基底細胞において特異的にアップレギュレーションされた遺伝子を同定するために、以下のパラメータが算出された：
１）基底細胞と未分化ｈＢＳ細胞との間の遺伝子発現における倍数変化（ＦＣ）（ＦＣＢＣ）
２）混合分化ｈＢＳ細胞と未分化ｈＢＳ細胞との間の遺伝子発現におけるＦＣ（ＦＣＭＣ）
３）心筋細胞様の細胞と未分化ｈＢＳ細胞との間の遺伝子発現におけるＦＣ（ＦＣＣＭ）。算出には心筋細胞様の細胞の２つの調製物の平均が用いられた。
その後、以下の戦略を用いて、基底細胞において特異的にアップレギュレーションされた遺伝子のみを選別した：
１）基底細胞における発現値＜１００の遺伝子は除去された。
２）ＦＣＢＣ＜３の遺伝子は除去された。
３）ＦＣＢＣ／ＦＣＭＣ比率＜５の遺伝子は除去された。
４）ＦＣＢＣ／ＦＣＣＭ比率＜３の遺伝子は除去された。
残った１２５遺伝子が表ＩＩに列挙されており、これらは基底細胞に対する好適なマーカ遺伝子を表わしている。この遺伝子群の特徴的遺伝子発現パターンをさらに強調して例示するために、これらの遺伝子の部分集合を図１２にもプロットしている。上に示した基準と同様に、図１２中の遺伝子は、絶対的な遺伝子発現レベルと、参照細胞集団（すなわち未分化ｈＢＳ細胞、混合分化ｈＢＳ細胞、およびｈＢＳ細胞に由来する心筋細胞様の細胞）と比較した倍数変化（ＦＣ）とに基づいて選択された。１つの遺伝子（ＺＰ４）を除いて、すべての遺伝子は５００を超える遺伝子発現レベルを示す。ＺＰ４はその特異性（すなわち参照細胞集団における発現が著しく低い）に基づいてここに含まれた。さらに、図１２中の遺伝子はＦＣＢＣ＞２０およびＦＣＢＣ／ＦＣＭＣ比率＞７を示すものであり、これは表ＩＩをまとめるために用いられた基準よりも厳しい包含基準を表わす。加えて、これらの遺伝子のいくつかは以前に胚の発達に関連付けられている（例、ＤＳＣ３、ＡＱＰ１、ＺＰ４、ＦＲＺＢ、ＨＡＮＤ１）。
注目すべきことに、Ｏｃｔ−４およびＮａｎｏｇの遺伝子発現レベルは、未分化ｈＢＳ細胞に比べて混合分化細胞、基底細胞および心筋細胞様の細胞（ＣＭ１およびＣＭ２）においてかなりダウンレギュレーションされており（図１７）、細胞調製物の分化された表現型をさらに示している。
表ＩＩ中の遺伝子の部分集合の遺伝子発現の概観は図１２にもプロットされている。遺伝子発現の概観は、未分化ｈＢＳ細胞と分化ｈＢＳ細胞の混合集団とにおける低い遺伝子発現を特徴とする。遺伝子発現は基底細胞において高く、心筋細胞様の細胞調製物においては低レベルから中間レベルである。図１２に示される遺伝子は次のとおりである：バソヌクリン１（ＢＮＣ１）、ネフロネクチン（ＮＰＮＴ）、フィブリノゲンアルファ鎖（ＦＧＡ）、アネキシンＡ８（ＡＮＸＡ８）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、透明帯糖タンパク質４（ＺＰ４）、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）、ホメオボックスＢ７（ＨＯＸＢ７）、心臓および神経冠誘導体発現１（ＨＡＮＤ１）、デスモコリン３（ＤＳＣ３）、インターロイキン６シグナルトランスデューサ（ＩＬ６ＳＴ）、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＦＲＺＢ）、ブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１）、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（Ｆｌｋ−１）（ＫＤＲ）。
さらに、初期の心筋再生（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｇｅｎｉｃ）プログラムの開始を示す遺伝子が基底細胞において同定され、これらの遺伝子の発現レベルが図１３に示される。示される遺伝子は次のとおりである：ミオシン重ポリペプチド６（ＭＹＨ６）、ホスホランバン（ＰＬＮ）、チチン（ＴＴＮ）、ＧＡＴＡ結合タンパク質６（ＧＡＴＡ６）、ＧＡＴＡ結合タンパク質４（ＧＡＴＡ４）、Ｔボックス５（ＴＢＸ５）、Ｔボックス２（ＴＢＸ２）、アクチニンアルファ２（ＡＣＴＮ２）、心臓ＬＩＭタンパク質（ＣＳＲＰ３）、トロポニンＴタイプ２（ＴＮＮＴ２）、ミオシン重ポリペプチド７（ＭＨＹ７）、ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）、ミオシン軽ポリペプチド４（ＭＹＬ４）、ミオシン軽ポリペプチド７（ＭＹＬ７）、トロポモジュリン１（ＴＭＯＤ１）、ミオシン軽ポリペプチド３（ＭＹＬ３）、ＬＩＭドメイン結合３（ＬＤＢ３）、ミオゼニン２（ＭＹＯＺ２）、クレアチンキナーゼ（ＣＫＭ）、ミオグロビン（ＭＢ）、およびミオメシン１（ＭＹＯＭ１）。注目すべきことに、これらの遺伝子は未分化ｈＢＳ細胞と分化ｈＢＳ細胞の混合集団とにおいて低レベルで発現されている。しかし、これらの遺伝子は基底細胞において中間レベルで発現されており、心筋細胞様の細胞調製物（ＣＭ１およびＣＭ２）においては高度に発現されている。まとめると、基底細胞は未成熟の表現型でありながら、心筋細胞系統に向けて分化できることを示す分子プロセスを開始したことをこれらのデータは示している。
（実施例４）
基底細胞においてアップレギュレーションされる遺伝子のプロモータ分析
表ＩＩに列挙される遺伝子に対する共通の調節要素を同定するために、これらの遺伝子のプロモータ領域を調査した。これらの遺伝子に対応するＲｅｆＳｅｑＩＤｓ（ｍＲＮＡ転写産物識別子）が集められて、デフォルト設定を用いたツールＰｒｏｍｏＳｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｇｔ．ｂｕ．ｅｄｕ／ｐａｇｅ／Ｐｒｏｍｏｓｅｒ＿ａｂｏｕｔ）に対する入力として用いられた（ハリース（Ｈａｌｅｅｓ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２００３年、３１：ｐ．３５５４−３５５９）。特定の品質基準を満たす、コード配列の１０００ｂｐ上流および５０ｂｐ下流のプロモータ配列は、１４０の転写産物に対して抽出できた。これらのプロモータ配列は、共調節される遺伝子の配列組における転写結合部位を見出すように設計されたウィーダ（Ｗｅｅｄｅｒ）アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／１５９．１４９．１０９．１６：８０８０／ｗｅｅｄｅｒＷｅｂ／）を用いて、共通モチーフに対して走査された（パヴェシ（Ｐａｖｅｓｉ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２００４年、３２：Ｗ１９９−２０３）。このアルゴリズムによって同定された共通モチーフがヒトゲノムにおいて実験的に証明された結合部位と一致するかどうかをさらに調査するために、ウィーダによって同定されたモチーフを、ツールＰａｔｃｈＴＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ｃｏｍ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｕｂ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｐａｔｃｈ／ｂｉｎ／ｐａｔｃｈ．ｃｇｉ）を用いて、「スコア（ｓｃｏｒｅ）」閾値を８０に設定し、「許容ミスマッチ（ａｌｌｏｗｅｄ ｍｉｓｍａｔｃｈ）」を１に設定して、Ｔｒａｎｓｆａｃ（登録商標）データベースに対して検索した。ヒトゲノムと一致したモチーフのみが考慮され、表ＩＩＩにおいて報告される。表ＩＩＩの「結合因子列」に示されるとおり、我々は、Ｔｒａｎｓｆａｃ（登録商標）を通じて同定された結合部位が公知の関連結合タンパク質を有するかどうかも調査した。
まとめると、転写因子ＧＡＴＡ−１、Ｓｐ１、ＬＦ−Ａ１、ＶＤＲ、ＰＯＵ２Ｆ１、およびＥ１２は、表ＩＩに列挙される遺伝子の部分集合の発現調節に関与している可能性があることがこの結果から示唆される。ＧＡＴＡ−１は造血（血液形成）に関与することが報告されているため、ＧＡＴＡ−１の役割は特に注目される（フーバーおよびゾン、１９９８年、１０（２）：ｐ．１０３−１０９、Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ）。ＧＡＴＡ−１は、発達の際に起こる初期細胞プロセスを調節することによって心臓発生と造血との生物学的結び付きを提供できると我々は提案する。血管細胞および血液細胞の元となる血管芽細胞は、心臓前駆体と共通の発達経路を有し、やはり初期胚の中胚葉に由来する。
（実施例５）
基底細胞の低温保存
未分化ｈＢＳ細胞から得られ、視覚的観察下での機械的切開によって単離された基底細胞は、たとえばコラゲナーゼ、ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）またはトリプシンなどの酵素によって解離されてより小さなクラスタにされて、標準的な緩速凍結技術または閉ストロー中でのガラス化法（ＷＯ２００４０９８２８５号）のいずれかを用いて低温保存されてもよい。
（実施例６）
未分化ｈＢＳ細胞からのＭＣＰ細胞の導出
未分化ｈＢＳ細胞はインビトロで維持および増殖された。継代の４〜５日後に、幹細胞切断ツールを用いて未分化ｈＢＳ細胞コロニーを手動で切開し、懸濁培養の分化培地（ＫＯ−ＤＭＥＭに１ｍＭのグルタマックス、０．１ｍＭのβ−ＭｅＯＨ、１％のＮＥＡＡ、１％のＰｅＳＴおよび２０％のＦＢＳを補ったもの）の中に置いた。細胞は懸濁液中で１〜６日間維持された後、ゼラチン被覆された組織培養皿に移されて、分化する細胞クラスタの付着ならびに細胞の継続的な増殖および分化が導かれた。プレート培養の４日後に、分化するｈＢＳ細胞の付着性のクラスタから細胞の単層が現れる。これらの細胞は、迷路に似た外観を有する特徴的な密集した網状組織中で生育するため、基底細胞の領域は光学顕微鏡法を用いて容易に区別できる。基底細胞の形態は原始内胚葉に類似しており、これらの細胞は上皮様である。加えて、個々の細胞は暗位相差像を示し、境界明瞭であり、通常は角張った形をしている。これらの基底細胞からＭＣＰ細胞のクラスタが現れた。ＭＣＰ細胞は光学顕微鏡法を用いて視覚化でき、ＭＣＰ細胞は小さく丸い明位相差像を示す細胞のクラスタとして生育し、基底細胞の単層の上にある緩く付着した細胞の塊として現れる（図２）。ＭＣＰ細胞は核対細胞質の比率が高い。クラスタの典型的な特徴は、「糸に付いた風船」に似ていることである。ＭＣＰ細胞クラスタは円形または細長い形のいずれであってもよい。用いられた細胞系はＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２（継代３４、４２、４８、５５＋ＥＤ３、６５）、ＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５（継代２６、４２＋ＥＤ１０）、ＳＡ１２１、ＬＯＴＢＤ１２１（継代１４６＋ＥＤ１０、１４６＋ＥＤ１１、１４６＋ＥＤ１８）、ＳＡ４６１、ＬＯＴＢＦ４６１（継代２２、３３）、およびＳＡ１６７、継代３２であった。
ここに記載される別のアプローチを用いても、未分化ｈＢＳ細胞からＭＣＰ細胞を得ることができる。未分化ｈＢＳ細胞はインビトロで維持および増殖された。継代の４〜５日後に、３７℃にて１０〜１５分間コラゲナーゼＩＶ（２００Ｕ／ｍｌ）とともにインキュベートすることによって、未分化ｈＢＳ細胞コロニーをフィーダ層から分離した。実施例１に記載される強制凝集に従って、細胞懸濁液を１５ｍｌの管に移し、細胞が沈殿した後に上清を除去した。コロニーは、ノックアウトＤＭＥＭに２０％のＦＢＳ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のグルタマックス、０．５ｍｍｏｌ／ｌのβ−メルカプトエタノールおよび１％の可欠アミノ酸（すべてインビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州より）を補った培地に再懸濁され、ピペットを用いて小さいクラスタ（０．２〜０．４ｍｍ）に機械的に解離された。この細胞懸濁液を９６ウェルｖ底プレート（コーニング社、ニューヨーク州、米国）に、ウェル当り約４〜６コロニーの濃度で分配し（２００μｌ／ウェル）、４００×ｇで５分間遠心分離した。次いでプレートを３７℃にて６〜８日間インキュベートした。形成された３Ｄ構造を、培地を含有するゼラチン被覆皿（上述と同じ）に移した。プレート培養の４日後に、分化するｈＢＳ細胞の付着性のクラスタから基底細胞が現れ、これらの基底細胞からＭＣＰ細胞のクラスタが現れた。培地は２日から３日目ごとに交換された。
ＭＣＰ細胞は、異なるｈＢＳ細胞系（例、ＳＡ００２、ＳＡ００２．５、ＳＡ４６１、ＳＡ１２１）から生成されてもよく、さまざまな培養条件（例、ＭＥＦまたはｈＦＦ上での培養）で維持されるｈＢＳ細胞から生成されてもよい。
ＭＣＰ細胞の濃縮は、分化培地をＣＧＭ培地（基本培地は３５％のＩＭＤＭおよび６５％のＤＭＥＭ：Ｆ１２からなり、そこに１％のＰｅＳＴおよびグルタマックスが補われて、３．５％のＦＢＳ、２％のＢ−２７、０．１ｍＭのβ−ＭｅＯＨ、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、４ｎＭのカルディオトロフィン１、および４０ｎＭのトロンビンの最終濃度にされる）に変えることによって達成できる。この培地中で基底細胞の単層を維持することによって、ＭＣＰ細胞の数は標準的分化培地に比べて増加する。
（実施例７）
分化したｈＢＳ細胞に由来するＭＣＰ細胞の単離
ＭＣＰ細胞は、明確な形態を有する基底細胞型の上にある緩く付着した細胞クラスタとして現れた。ＭＣＰ細胞クラスタは、幹細胞切断ツールを用いた機械的切開によって単離できた。加えて、さまざまな時点でＭＣＰ細胞のいくつかのより大きなクラスタが下にある細胞層から自発的に分離し、それらのクラスタは培地に浮かんでいるときに回収された。穏やかな酵素処理を用いてＭＣＰ細胞を回収することも可能である。ＭＣＰ細胞は、ＰＢＳによる２つの洗浄液をプールすることによって集められ、洗浄液の１つは０．５ｍＭのＥＤＴＡ（１〜２分）を有し、洗浄液の１つはトリプシン−ＥＤＴＡ（２〜３分）を有し、洗浄は視覚的制御下で室温で行なわれた。用いられた細胞系はＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２（継代３４、４２、４８）、ＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５（継代２６、４２＋ＥＤ１０）、ＳＡ１２１、ＬＯＴＢＤ１２１（継代１５６＋ＥＤ１０、１５６＋ＥＤ１１）、およびＳＡ４６１、ＬＯＴＢＦ４６１（継代２２、３３）であった。
（実施例８）
フィーダ細胞上のＭＣＰ細胞の増殖
上述（強制凝集）のとおりＭＣＰ細胞が導出および単離された後、心臓間充織細胞またはＥＮＤ２細胞上で培養されることによって、単離された前駆細胞の増殖および／または分化のための共培養系が作られた。心臓間充織を得るために、ヒト心臓生検外植片（ｄｘ ａｕｒｉｃｕｌｕｓ）の副産物に由来する細胞が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％のＰｅＳＴ、１ｍＭのグルタマックスおよび１０％のＦＢＳを含有する培地中で１００００細胞／ｃｍ２の密度で培養された。これらの細胞は心臓間充織細胞と呼ばれる。この細胞は、０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ処理によって約８０％の集密度で継代された。
ＥＮＤ２細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％のＰｅＳＴ、１％のＮＥＡＡ、１ｍＭのグルタマックスおよび７．５％のＦＢＳを含有する培地中で培養された。細胞は１００％の集密度に近づくと０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡによって解離され、３日から４日目ごとに一般的に１：６〜１：８に分割された。
細胞***を止めるために、心臓間充織細胞およびＥＮＤ２細胞は、最終濃度１０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを含有する培地で約３時間処理された。細胞はＰＢＳで３回洗浄され、次いで０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡによって解離された。遠心分離後、ペレットはそれぞれの培地に溶解され、ＥＮＤ２細胞に対しては０．１％のゼラチンで被覆されたプラスチック上に、５００００〜７００００細胞／ｃｍ２の密度で接種された。
ＭＣＰ細胞は未分化ｈＢＳ細胞から得られ、上述のとおり幹細胞切断ツールを用いた機械的切開によって単離された。前駆細胞の導出のために用いられた細胞系はＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２（継代５８および６１）であった。単離されたＭＣＰ細胞クラスタは、フィーダ細胞としてのマイトマイシンＣ処理された心臓間充織細胞またはＥＮＤ２細胞とともに皿に蒔かれた。前駆細胞は両方のフィーダ層に付着し、数日間付着し続けた。フィーダ細胞を有さないゼラチン被覆された対照と比較して、ＭＣＰ細胞はフィーダ細胞と接触しながらより長時間平らになることなく付着し続けた。心臓間充織細胞に移された１つの鼓動するクラスタは、再プレート培養後も鼓動した。これらの観察をまとめると、前駆細胞は、前駆体を分化させずに元の状態のままでいさせるための支持またはシグナルを前駆細胞に与える他の細胞型（またはそれが排出する生成物）と密に結合して生育する必要があることが示唆される。しかし、条件を変えることによって前駆体は増殖するか、または心臓もしくはその他の系統に向けての分化を開始し得る。
（実施例９）
ミトコンドリア染色によるＭＣＰ細胞の同定および／または分離
ＭｉｔｏＦｌｕｏｒ（商標）緑色色素（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）は、原形質膜を横切って拡散し、活動中のミトコンドリア内に蓄積してそこで蛍光性になることにより、生細胞のミトコンドリアを選択的に染色する。ＭＣＰ細胞をこの色素に露出することによって、その染色パターンを調査した。
ＭＣＰ細胞は上述のとおり、実施例１の強制凝集によって未分化ｈＢＳ細胞から得られた。導出に用いられた細胞系はＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２（継代２１、２３および３１）およびＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５（継代４４）であった。培養の９〜２０日後に培養皿の培地は除去され、最終濃度５０〜２００ｎＭのＭｉｔｏＦｌｕｏｒ（商標）プローブを含有する予熱された（３７℃）生育培地（ＤＭＥＭ／グルタマックス、０．１ｍＭのβ−ＭｅＯＨ、１％のＮＥＡＡ、１％のＰｅＳＴおよび２０％のＦＢＳ）が加えられた。実験の１つにおいては、細胞が通常の生育条件下で１５分、３０分または４５分間インキュベートされた後、投入溶液が染色色素を有さない新鮮な予熱された培地に置換された。色素を異なる期間蓄積させて、染色後の異なる時点において、蛍光顕微鏡を用いて蛍光が観察された。別の実験においては、染色時間が４５分から１９時間まで変動され、各時点後の蛍光がモニタされた。２００ｎＭの色素で３０〜４５分間染色されたＭＣＰ細胞中のミトコンドリアは染色の直後に明るい緑色の蛍光を特定的に示した（図１４）。この染色は、蓄積時間を増加させても合計染色インキュベーション時間を増やしても、強くなったりより特定的になったりすることはなかった。１００ｎＭのＭｉｔｏＦｌｕｏｒ（商標）緑色色素で処理された細胞は、２００ｎＭの色素での染色と同じパターンを示すために、４５分よりも長い染色または色素を蓄積させるための時間を必要とした。５０ｎＭの染色色素では、細胞は最長露出／蓄積時間の場合を除いて弱くしか染色されなかった。これらの結果は、ＭｉｔｏＦｌｕｏｒ（商標）緑色色素を用いることによってＭＣＰ細胞を他の細胞型と区別できることを示すものである。よって、この色素を用いて混合細胞集団からＭＣＰ細胞を同定および／または単離することができる。特に、ＦＡＣＳを用いて、ＭｉｔｏＦｌｕｏｒ（商標）緑色色素によって染色されたＭＣＰ細胞の細胞集団を濃縮できる。
（実施例１０）
単離されたＭＣＰ細胞の再プレート培養
吸引されるかまたは手動で切開された、単離されたＭＣＰ細胞は、新しい組織培養皿に移された。ＭＣＰ細胞クラスタは細胞の単層に付着して広がった。異なるクラスタからさまざまな形態の細胞を観察できる（図３）。いくつかのクラスタは、心筋細胞様の形態を有する自発的に収縮する産物の元となる。注目すべきことに、いくつかのクラスタは、元々ＭＣＰ細胞を単離した基底細胞として説明される細胞型にも分化する（実施例１を参照）。培養されて数日以内に、新たなＭＣＰ細胞が基底細胞上にあるのが観察できる（図４）。このことは、ＭＣＰ細胞の少なくとも細分画は、後に新たなＭＣＰ細胞の元となる基底細胞型に分化できることを示す。用いられた細胞系はＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２（継代３４、４８、５５＋ＥＤ３）、ＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５（継代２６、４２＋ＥＤ４）、ＳＡ１２１、ＬＯＴＢＤ１２１（継代１５６＋ＥＤ１０、１５６＋ＥＤ１１）、およびＳＡ４６１、ＬＯＴＢＦ４６１（継代２２、３３）であった。
（実施例１１）
ＭＣＰ細胞の分化
ＭＣＰ細胞を単離し、移して新たな培養皿に再プレート培養できることによって、ＭＣＰ細胞はさまざまな物質、成長因子および化合物が細胞分化に与える影響を試験するためのモデルを組立てるために大変適したものとなる。ＭＣＰ細胞はさまざまな培地において再プレート培養できる。上述のとおり、ＭＣＰ細胞は２０％のＦＢＳを含有する分化培地において再プレート培養できる。血清を含まない分化培地においてＭＣＰ細胞を再プレート培養することも可能である。血清含有培地においてはＭＣＰ細胞はさまざまな形態の単層に分化するが、血清の不在下ではより均質な分化が起こることが示され、ＭＣＰ細胞クラスタのほとんどは図６に示されるような形態を獲得する。用いられた細胞系はＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２（継代５５＋ＥＤ３）、ＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５（継代２６）およびＳＡ４６１、ＬＯＴＢＦ４６１（継代３３）であった。
たとえば収縮する心筋細胞などの特定の細胞型へのＭＣＰ細胞の分化を刺激するために、さまざまな培養条件を試験して評価することができる。たとえば、ＭＣＰ細胞クラスタが接種される表面は、修飾されない組織培養皿であっても、またはさまざまな細胞外基質成分（例、マトリゲル、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンなど）によって皿が被覆されていてもよい。加えて、培地の構成要素が単独または組合せで試験されてもよい（例、血清濃度、培地の補足物の存在、たとえばＫ−ＳＲ、ＩＴＳ、およびＢ−２７など、ＦＧＦおよびＢＭＰファミリーの構成員などの成長因子、５−アザデオキシシチジン、ＤＭＳＯ、レチノイン酸、アスコルビン酸、およびＡＳＡ）。
（実施例１２）
Ｂ−２７含有培地中でのＭＣＰ細胞の培養
未分化ｈＢＳ細胞コロニー（細胞系ＳＡ４６１ ＬｏｔＢＦ４６１）は、ノックアウトＤＭＥＭと、１ｍＭのグルタマックスと、０．１ｍＭのβ−ＭｅＯＨと、１％の可欠アミノ酸と、１％のＰＥＳＴと、２０％のＦＢＳとを含有する分化培地中の懸濁培養に機械的に移された。２日後、分化しているｈＢＳ細胞クラスタがプレート培養され、ＩＶＦ皿の分化培地中で維持された。２日目ごとに培地交換が行なわれ、このとき培地体積の半分が新鮮な培地に置換された。プレート培養の９日後（ｄａｙ ９）に基底細胞の領域が観察され、ｄａｙ １２にＭＣＰがはっきりと基底細胞の上に出現した。ｄａｙ １９にＭＣＰクラスタが機械的に単離され、新たなＩＶＦ皿の、Ｂ２７（ノックアウトＤＭＥＭ、１ｍＭのグルタマックス、０．１ｍＭのβ−ＭｅＯＨ、１％の可欠アミノ酸、１％のＰＥＳＴ、２％のＢ２７）が補われた血清を含まない培地中に移された。細胞はこの培地中で１０日間維持され、培地交換は２日目ごとに、体積の半分を新鮮な培地で置換することによって行なわれた。図１０は、ＭＣＰ細胞を移した後のｄａｙ １、２、４、７、および１０における細胞の形態を示す。ｄａｙ １０にＰＦＡを用いて細胞を固定し、ブラキウリに対して向けられた抗体を用いて染色した。Ｂ２７培地において維持された細胞の形態に基づいて、ＭＣＰ細胞は適切な培養条件において、元々ＭＣＰ細胞を単離した基底細胞型の元となり得ることが示される。この結論は、図１１に示されるブラキウリに対する陽性の免疫染色によってさらに強められる。
（実施例１３）
ＭＣＰ細胞の心臓分化
自発的に収縮する細胞は、主に３つの異なるやり方でＭＣＰ細胞から得ることができる。
ｉ）１つは、緩く付着したＭＣＰ細胞の自発的に収縮するクラスタが視覚的に同定されたときに、単純にそれを機械的切開によって単離することによるものである。
ｉｉ）第２に、自由に浮遊するＭＣＰ細胞（すなわち分離されたＭＣＰ細胞）の収縮するクラスタを吸引によって単離することもできる。これらの手順のいずれかによって単離された収縮する細胞クラスタは、新たな組織培養皿に移してプレート培養できる。それらのクラスタは付着して増殖および分化を続け、収縮性の能力を維持しながら少なくとも２０日間インビトロで維持され得る。図５は、増殖しかつ自発的に収縮するクラスタの形態を例示している。
ｉｉｉ）最後に、鼓動していないＭＣＰ細胞を単離して新たな皿に移し、そこで付着して広がらせてもよい。数日後に、単離および再プレート培養されたＭＣＰ細胞クラスタの分画において、自発的な収縮が開始される。用いられた細胞系はＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２（継代３４、４２、５５＋ＥＤ３）、ＳＡ１２１、ＬＯＴＢＤ１２１（継代１５６＋ＥＤ１０、１５６＋ＥＤ１１）、およびＳＡ４６１、ＬＯＴＢＦ４６１（継代３３）であった。
（実施例１４）
ＭＣＰ細胞の生培養物の微速度撮影分析
未分化ｈＢＳ細胞に由来する基底細胞およびＭＣＰ細胞（上述）は、その後微速度撮影された。細胞は分化培地で１５日間培養され、微速度撮影研究が開始される前に培地がＣＧＭ培地に置換された。この実施例においては細胞系ＢＥ００２．５、継代２６が用いられた。培養物は培養チャンバ（３７℃、５％のＣＯ２および９５％の湿度）に入れられ、７２時間にわたり５分ごとに写真が撮影された。微速度撮影技術によって、ＭＣＰ細胞クラスタの発端の研究およびそれを時間ごとに追うことが可能となる。ＭＣＰ細胞クラスタは基底細胞から自発的に分離し、次いで同じ細胞に付着してプレート培養されてその形態を得た。ＭＣＰ細胞は、他の細胞上に、または直接プラスチックに付着できる。
（実施例１５）
ＭＣＰ細胞の特徴付け
上述のとおり、ＭＣＰ細胞は分化するｈＢＳ細胞から得られた。単離されたＭＣＰ細胞クラスタは採取されてすぐに集められ、製造者の指示に従ったサイトスピンを用いたガラススライド上での免疫組織化学的評価のために、ＰＦＡを用いて固定された。各ガラススライド上に３〜４個のＭＣＰ細胞クラスタが集められ、各抗体染色に対して少なくとも３枚の個別のガラススライドが用いられた（下記を参照）。用いられた細胞系はＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２（継代５５＋ＥＤ３）およびＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５（継代２６）であった。
ＭＣＰ細胞はどのような態様で未分化のｈＢＳ細胞と異なるのかを定めるために、ｈＢＳ細胞マーカ（ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、およびＯｃｔ−４）および初期分化マーカＳＳＥＡ−１に対して向けられた抗体を用いて、固定ＭＣＰ細胞の免疫組織化学染色が行なわれた。免疫組織化学は前述のとおりに行なわれた（ノアクソン（Ｎｏａｋｓｓｏｎ）ら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２００５年）。ＭＣＰ細胞はこれらどのマーカも発現していなかったが、未分化のｈＢＳ細胞はＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−８１、およびＯｃｔ−４を発現していた。ＳＳＥＡ−１は初期分化ｈＢＳ細胞によって発現されたが、ＭＣＰ細胞では発現されなかった。まとめると、これらのデータは、ＭＣＰ細胞がｈＢＳ細胞とは表現型が異なる別のものであることを示している。
分化した細胞に対する付加的なマーカも試験された。以下の抗原に対して向けられた抗体が評価された：ビメンチン、デスミン、α−サルコメリックアクチン、ネスチン、およびｉｓｌｅｔ−１。これらのうち、ビメンチンのみがＭＣＰ細胞で発現されていた（図７）。注目すべきことに、ネスチンを発現しないことによって、ＭＣＰ細胞は以前記載された神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）から区別される。
表ＩＶは単離されたＭＣＰ細胞のＩＨＣ分析の結果をまとめたものである。
（実施例１６）
リアルタイムＲＴ ＰＣＲによるＭＣＰ細胞の特徴付け
ＭＣＰ細胞は上述のとおり、実施例１の強制凝集によって未分化ｈＢＳ細胞から得られた。ＭＣＰ細胞クラスタはプレート培養の９〜１８日後に、幹細胞切断ツールを用いて緩く付着した細胞クラスタを機械的に切開することによって、または自由に浮遊するクラスタを吸引することによって採取された。これら２つのタイプの細胞クラスタは、理論上はＭＣＰ細胞の異なる発達段階を表わし得る。ＭＣＰ細胞は約５０〜２００細胞ずつ管に移され、氷冷ＰＢＳで洗浄された。細胞は４００×ｇで１０分間遠心分離された。上清は除去され、細胞ペレットは液体窒素中で凍結された。細胞は分析されるまでｉ−８０℃にて保存された。前駆細胞の導出のために用いられた細胞系はＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２（継代２４、２７および２８）、マウス胚線維芽細胞（ｍＥＦ）上で培養されたＳＡ３４８（継代２７）、およびヒト***線維芽細胞（ｈＦＦ）上で培養されたＥ３−ＳＡ００２（継代１０）であった。未分化細胞（ＳＡ００２、継代７４、およびＥ３−ＳＡ００２、継代１０）、ｍＥＦ上で培養された混合分化細胞（ＳＡ００２、継代７５、プレート培養後２０日）およびｈＦＦ細胞は、前述のとおりに採取および処理されて、これらのサンプル中の遺伝子発現レベルがＭＣＰ細胞と比較された。
製造者の指示に従ってＲＮｅａｓｙマイクロおよびミニキットを用いた後にＤＮアーゼ処理を行なうことによって、細胞から総ＲＮＡを調製した（キアゲン）。高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ）（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））によってｃＤＮＡの合成が行なわれた。少量の細胞を含有するサンプルから調製されたｃＤＮＡは、製造者の指示に従ったタックマン（ＴａｑＭａｎ）分析の前に予め増幅された（アプライドバイオシステムズ）。
ＭＣＰ細胞のｍＲＮＡフィンガプリントを得るために、異なるタイプの細胞に対して特異的な遺伝子のパネルをタックマンリアルタイムＲＴ ＰＣＲによって分析した：幹細胞／前駆細胞（Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｆｌｋ−１（ＫＤＲ）、Ｎｏｔｃｈ−１およびＩｓｌｅｔ−１）、初期心臓細胞（Ｎｋｘ２．５およびＧＡＴＡ４）、心筋細胞（トロポニンＴ２）、内皮細胞（ＣＤ３１）および平滑筋細胞（ＡＣＴＡ２）。内因性の対照としてＣＲＥＢＢＰが用いられた。ＭＣＰ細胞サンプルに対する各遺伝子の発現レベルが参照サンプルと比較された。
Ｏｃｔ−４およびＮａｎｏｇのｍＲＮＡ発現レベルはどちらも未分化細胞においては高かったが、ＭＣＰ細胞および混合分化細胞またはｈＦＦにおいては非常に低かった（図１５Ａおよび図１６Ａ）。これら２つの遺伝子のＭＣＰ細胞におけるＲＮＡレベルが検出できなかったことは、ｍＥＦおよびｈＦＦ培養系のどちらからのＭＣＰ細胞も未分化ｈＢＳ細胞とは明瞭に区別されることを示す。
Ｆｌｋ−１のｍＲＮＡは、未分化細胞および混合分化細胞またはｈＦＦの両方に比べてＭＣＰ細胞において特異的に高発現されている（図１５Ｂおよび図１６Ｂ）。このことは、Ｆｌｋ−１（ＫＤＲ）がＭＣＰ細胞を選択的に同定および／または単離するための特異的マーカとして用いられ得ることを示唆している。Ｎｏｔｃｈ−１の遺伝子発現レベルも、未分化細胞、ｈＦＦおよび混合分化細胞に比べてＭＣＰ細胞の方が高かったが、その差はＦｌｋ−１ほど著しくなかった（図１５Ａおよび図１６Ａ）。Ｎｏｔｃｈ−１は多くの異なるシグナリング経路に関与しているため、この遺伝子はさまざまなタイプの分化した細胞において一般的に発現していることが予期される。Ｉｓｌｅｔ−１の遺伝子発現レベルは、未分化細胞に比べてＭＣＰ細胞の方が高かった。しかし、混合分化細胞およびｈＦＦにおけるｉｓｌｅｔ−１のｍＲＮＡレベルは、未分化細胞およびＭＣＰ細胞のどちらよりも高かった（図１５Ａおよび図１６Ａ）。Ｉｓｌｅｔ−１は多くの異なる細胞の発達経路に関わっているため、これは予想外のことではない。
初期心臓段階を表わすＮｋｘ２．５およびＧＡＴＡ４、ならびに分化した心筋細胞を表わすトロポニンＴ２の遺伝子発現レベルは、未分化ｈＢＳ細胞、ｈＦＦフィーダ細胞、および混合分化細胞に比べて、ｈＦＦおよびｍＥＦ上で培養されたＭＣＰ細胞において増加していた（図１５Ｂおよび図１６Ｂ）。これらの細胞においては、通常内皮細胞マーカとして用いられるＣＤ３１に対しても同じパターンが見られた（図１５Ｂおよび図１６Ｂ）。平滑筋細胞マーカであるα−平滑筋アクチンについては、ＭＣＰ細胞における遺伝子発現は未分化ｈＢＳ細胞よりも高かったが、ｈＦＦおよび混合分化細胞よりも低かった（図１５Ｂおよび図１６Ｂ）。ｈＦＦおよび混合分化細胞は、やはりα−平滑筋アクチンを発現する線維芽細胞様の細胞をかなりの割合で含有するため、これは予想外のことではない。注目すべきことに、ＭＣＰ細胞における心臓遺伝子の発現と同様に、ＣＤ３１およびα−平滑筋アクチンのｍＲＮＡレベルは未分化細胞に比べてＭＣＰ細胞の方が増加していた。これは、ＭＣＰ細胞の心臓／内皮／平滑筋前駆体の表現型を示している。結論として、ＭＣＰ細胞は未分化ｈＢＳ細胞に対するマーカ遺伝子を発現しておらず、異なる発達経路を取り始めており、ＭＣＰ細胞の多能性の特徴が支持されている。
（実施例１７）
ＭＣＰ細胞から分化した細胞の特徴付け
ＭＣＰ細胞は、上述のとおり未分化ｈＢＳ細胞から得られた。ＭＣＰ細胞クラスタは単離され、新たな培養皿に移された。その後、ＭＣＰ細胞は分化培地中で最大１６日間培養中に維持された。細胞はさまざまな時点で固定され、免疫組織化学を用いて評価された（ノアクソンら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、２００５年）。用いられた細胞系はＳＡ００２、ＬＯＴＡＬ００２（継代４８）、ＳＡ００２．５、ＬＯＴＢＥ００２．５（継代４２＋ＥＤ４）、ＳＡ１２１、ＬＯＴＢＤ１２１（継代１５６＋ＥＤ１０、１５６＋ＥＤ１１）およびＳＡ４６１、ＬＯＴＢＦ４６１（継代２２）であった。表Ｖは実験および得られた結果をまとめたものである。
中胚葉系統のマーカ（例、デスミン、ビメンチン、α−サルコメリックアクチン）が初期に出現することは、ＭＣＰ細胞が中胚葉の細胞型に優先的に分化することを示唆している。加えて、神経系マーカ（ネスチンおよびＧＦＡＰ）の発現がないことは、ＭＣＰ細胞がレイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）およびワイス（Ｗｅｉｓｓ）によって元々記載された神経球細胞とは異なるものであることを示している（レイノルズＢＡ、ワイスＳ（１９９２年）「成体哺乳動物中枢神経系の単離細胞からのニューロンおよび星状細胞の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）。」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：ｐ．１７０７−１７１０）。神経球の大部分は、関与する前駆体が分化した星状細胞およびニューロンと混合されたもので構成されている。最後に、Ｎｋｘ２．５の発現は、ＭＣＰ細胞が初期段階の心筋細胞に分化できることを例示している。
図８は、分化したＭＣＰ細胞の免疫組織化学分析によって得られた結果を例示する。
（実施例１８）
ＭＣＰ細胞の低温保存
上述のとおり導出および単離されたＭＣＰ細胞は、前に記載された閉ストローおよびガラス化法（ＷＯ２００４０９８２８５号）を用いて低温保存できる。加えて、伝統的な緩速凍結も選択肢となり得る。
（実施例１９）
バイオリアクタ培養
ＭＣＰ細胞および基底細胞は３−Ｄ空間で生育されてもよく、その空間はたとえば人工中空線維キャピラリ膜などで区画分けされてもよい。この系は細胞がキャピラリの間でより大きな細胞の固まりに生育することを可能にし、培地および酸素などの気体の灌流によって最適化された自然な環境を提供する。より大量の細胞（最大１０＾１１細胞）を生成するため、および細胞の機能的特性の可能な維持を支持するために、閉バイオリアクタ系が開発されてもよい。酵素灌流を介した細胞単離によって、次いで閉ＧＭＰ系におけるスケールアップが可能になる。次いで、たとえば膜抗原発現などに基づくたとえばＦＡＣソーティングなどを用いて、または密度勾配培地および遠心分離を用いて、細胞精製が行なわれてもよい。
（実施例２０）
分離技術
ＭＣＰ細胞および基底細胞は、表面に発現されるマーカに対する抗原検出およびその後のＦＡＣソーティングを用いて精製されてもよい。抗原に基づくソーティングの別の代替案は、培養皿を特定の抗体で被覆し、培地中の細胞をその皿に加えて、正しい抗原を有する細胞を結合させ、残りの細胞を捨てて、結合した細胞を採取してさらに使用するというものである。この方法はときにイムノパニング（ｉｍｍｕｎｏｐａｎｎｉｎｇ）と呼ばれ、陰性選択にも用いることができる。すなわち、必要としない細胞型を被覆抗原に結合させて、上清の必要なＭＣＰ細胞または基底細胞を有する培地を取るというものである。このアプローチは、いわゆるＭＡＣソーティングと呼ばれるような磁気ビーズに対して、またはカラムクロマトグラフィを用いて同様に行なわれてもよい。特定の特徴を有するＭＣＰ細胞または基底細胞などの細胞を精製するさらに別の方法は、遠心分離下の浮遊密度またはサイズに基づく細胞分離のための密度勾配培地の使用を含む。
（実施例２１）
再生医療におけるＭＣＰ細胞および基底細胞の使用
ＭＣＰ細胞および基底細胞はどちらも多能性を有し、自発的に収縮する心筋細胞様の細胞に分化する能力を有することから、再生医療において非常に有用であることが明らかになった。特定的には、ＭＣＰ細胞を心臓関連の疾患の処置に用いることが考えられる。心筋梗塞になった心臓の機能を回復させるためには、心筋細胞および新たな血管を交換する必要がある。臨床的に適合したｈＢＳ細胞系が入手可能なときは、これらの細胞をＭＣＰ細胞または基底細胞の導出に用いて、後にその細胞を移植してヒトにおける使用の可能性を評価することが可能である。その合間に動物モデルにおいて原理の証明（ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）の実験を行なうことができる。ＳＣＩＤマウスにおける心筋梗塞の誘導に対する標準モデルを用いて（例、低温損傷（ｃｒｙｏ−ｄａｍａｇｅ）またはＬＡＤライゲーション）、ＭＣＰ細胞または基底細胞が損傷部位に注入されてもよい。その後マウスを短期間（最長２〜３週間）または長期間（＞３週間）モニタし、標準的技術を用いて心臓の改善を測定する。実験の最後にマウスを殺して心臓を回収し、その後組織学的評価を行なう。ヒト特異的抗原またはＤＮＡに対して向けられた抗体またはプローブを用いて、マウス心臓におけるヒト細胞の植付を測定できる。
（実施例２２）
再生医療、細胞療法におけるＭＣＰ細胞および基底細胞の使用
ＭＣＰ細胞および基底細胞はさらに、たとえば壊死心筋、アポトーシス心筋、損傷した心筋、機能不全の心筋、または形態的に異常な心筋などに関連する障害を処置するために用いられてもよい。こうした障害は、虚血性心疾患、心筋梗塞、リウマチ性心疾患、心内膜炎、自己免疫性心疾患、心臓弁膜疾患、先天性の心臓障害、心臓リズム異常、および心臓機能不全を含むがそれに限定されない。
マーカ分析によってもはや未分化ｈＢＳ細胞ではないことが示され、したがってインビボで腫瘍形成の元とならないＭＣＰ細胞および基底細胞は、増殖できて心臓の細胞型（心筋細胞、内皮細胞および平滑筋細胞を含む）に分化する可能性があり、したがって心筋梗塞の結果起こる虚血によってもたらされる心臓の損傷を逆転、阻害または防止することによって大部分の心臓障害および疾患を処置するために好適であり得る。
さらなる局面において、ＭＣＰ細胞および基底細胞は、たとえば心臓不整脈などの異常な心臓リズムによって特徴付けられる心臓障害を処置するために用いられてもよい。
その処置は、好ましくは心臓への注射によって、対象の心臓に治療上有効な用量の細胞を投与することによって行なわれることが好ましい。治療上有効な用量とは、有益な、または所望の臨床的結果を生じさせるために十分な量のことであり、その用量は１回またはそれ以上の投与において投与されてもよい。必要とされる心臓組織修復のタイプに依存して、注射は心臓のさまざまな領域に投与されてもよい。投与は、胸郭を開いた後のカテーテルに基づくアプローチを用いて、またはあらゆる好適な血管を通じて入れることによって行なわれてもよい。細胞の有効用量は、たとえば重量、年齢、生理的状態、病歴、梗塞部のサイズ、および虚血の開始からの経過時間などの因子に基づいてもよい。ＭＣＰ細胞および／または基底細胞の投与は、拒絶反応を阻害するために、好ましくはこうした投与の前に、対象を免疫抑制性の摂生によって処置することを含むことが好ましい。
（実施例２３）
薬物の発見におけるＭＣＰ細胞および基底細胞の使用
薬物の発見の適用におけるＭＣＰ細胞または基底細胞の使用は広範囲であってもよく、細胞の特徴に基づいている。ここでは心臓再生に影響をもたらす可能性のある化合物を発見するための適用を記載する。ＭＣＰ細胞または基底細胞はｈＢＳ細胞から導出および単離され、マルチウェル形式の培養皿（例、９６ウェルまたは３８４ウェルプレート）に移されてもよい。次いで、ライブラリからの化合物が、定められた培地（選択的に血清を含まない）の存在下で細胞に加えられる。細胞は、異なる濃度の化合物の存在下でさまざまな時点まで維持されてもよい。化合物の影響の可能性は、細胞の分化、増殖および機能性を測定することによってモニタできる。特定的には、遺伝子発現分析が用いられてもよく、典型的に心筋再生に関連する遺伝子の発現が測定されてもよい。加えて、レポータ遺伝子構成が作られて、たとえば蛍光ラベルされたレポータタンパク質が容易にモニタできるようにされてもよい。
（実施例２４）
毒性試験におけるＭＣＰ細胞および基底細胞の使用
ＭＣＰ細胞および基底細胞は、上述のとおりｈＢＳ細胞から得られ、ＭＥＡ（マルチチャンネルシステムズ（Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ドイツ）に細胞を蒔く前または後に、自発的に収縮する心筋細胞様の細胞にさらに分化される。ＭＥＡに物質を直接加えて異なる時点まで細胞をインキュベートすることによって、さまざまな化合物または化学物質の影響を定めることができる。ＭＥＡシステムを用いて細胞外電位を定めることができ、培養物中で非侵襲的に有害な影響を測定できる。このことは、物質の急性の影響および長期の影響の両方の研究を可能にする。プラットホームのさらなる改善点は、複数のサンプルを同時に実行できるという主な利点とともに、ＱＴスクリーンシステム（マルチチャンネルシステムズ、ドイツ）の９６ウェルプレートに直接細胞を接種することであろう。
ＭＣＰ細胞を用いて、さまざまな化学物質または化合物の発達に対する影響の評価に対するさらなる適用が考えられる。たとえば、ＭＣＰ細胞が自発的に収縮する細胞（心筋細胞様の細胞）に分化する際に、試験される化合物が培養物に加えられてもよい。化合物の影響は、たとえば遺伝子およびタンパク質の発現の変化ならびに収縮する細胞への分化能力の消失など、いくつかの異なる表示を用いて定めることができる。
（実施例２５）
心臓発生を調節する分子機構の研究におけるＭＣＰ細胞および基底細胞の使用
基礎研究におけるＭＣＰ細胞および基底細胞両方の使用は広範囲であってもよく、それは細胞の多能性と、心筋細胞に似た自発的に収縮する細胞を形成できるという本質的な能力とに基づいている。たとえば、ＭＣＰ細胞はｈＢＳ細胞から導出および単離され、マルチウェル形式の培養皿に移され得る。細胞は異なる培養条件でさまざまな時点まで維持されてもよい。心筋再生に対する影響の可能性は、ＭＣＰ細胞および／または基底細胞の分化、増殖および機能性を測定することによってモニタできる。特定的には、遺伝子発現分析を用いることができ、典型的に心筋再生に関連する遺伝子の発現を測定できる。加えて、レポータ遺伝子構成が作られて、たとえば蛍光ラベルされたレポータタンパク質が容易にモニタできるようにされてもよい。加えて、ｓｉＲＮＡ構成および関連のトランスフェクション技術が用いられて、心筋再生プログラムに対する特定の遺伝子の影響が研究されてもよい。
参考文献
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項目
ＭＣＰ細胞
１．ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞に由来する細胞集団であって、多能性心臓前駆（ＭＣＰ）細胞を含む、細胞集団。
２．細胞集団は、以下の特徴：
ｉ）細胞の少なくとも１％は未分化細胞に対する１つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４からなる群より選択される、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％は、たとえばネスチンまたはＧＦＡＰなどの神経系マーカの１つまたはそれ以上のタンパク質発現を示さない、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％は、たとえばブラキウリ、ビメンチンまたはデスミンなどの中胚葉マーカの１つまたはそれ以上のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、および
ｉｖ）細胞の少なくとも１％は、たとえばｉｓｌｅｔ−１、ｃＴＮＩ、ｃＴＮＴ、Ｎｋｘ２．５、アルファＭＨＣまたはコネキシン４３などの１つまたはそれ以上の初期段階心臓マーカのタンパク質発現を示さない、
のうち少なくとも１つを有する、項目１に記載の細胞集団。
３．細胞集団は、小さく丸い明位相差像を示す細胞のクラスタとして生育するＭＣＰ細胞を含む、項目１または２に記載の細胞集団。
４．ＭＣＰ細胞のクラスタは円形または細長い形である、項目３に記載の細胞集団。
５．ＭＣＰ細胞のクラスタは緩く付着した細胞の塊として現れ、基底細胞上に生育されるときには基底細胞の単層の上にある、項目３または４に記載の細胞集団。
６．ＭＣＰ細胞は核対細胞質の比率が比較的高い、項目１から５のいずれかに記載の細胞集団。
７．ＭＣＰ細胞は糸に付いた風船の形で現れる、項目１から６のいずれかに記載の細胞集団。
８．ＭＣＰ細胞の少なくとも５０％が
１．小さく丸い明位相差像を示す細胞のクラスタとして生育し、
２．円形または細長い形のクラスタを形成し、そのクラスタは緩く付着した細胞の塊として現れ、基底細胞上に生育されるときには基底細胞の単層の上にあり、
３．比較的高い核対細胞質の比率を有し、および／または
４．糸に付いた風船の形で現れ、
それらの細胞は以下の特徴：
ｉ）細胞の少なくとも１％は未分化細胞に対する１つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４からなる群より選択される、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％は、たとえばネスチンまたはＧＦＡＰなどの神経系マーカの１つまたはそれ以上のタンパク質発現を示さない、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％は、たとえばブラキウリ、ビメンチンまたはデスミンなどの中胚葉マーカの１つまたはそれ以上のタンパク質および／または遺伝子発現を示す、および
ｉｖ）細胞の少なくとも１％は、たとえばｉｓｌｅｔ−１、ｃＴＮＩ、ｃＴＮＴ、Ｎｋｘ２．５、アルファＭＨＣまたはコネキシン４３などの１つまたはそれ以上の初期段階心臓マーカのタンパク質および／または遺伝子発現を示さない、
のうち少なくとも１つを有する、項目１から７のいずれかに記載の細胞集団。
９．ＭＣＰ細胞の少なくとも５０％が４つの特徴のうち少なくとも２つを有する、項目８に記載の細胞集団。
１０．ＭＣＰ細胞の少なくとも５０％が４つの特徴のうち少なくとも３つを有する、項目８または９に記載の細胞集団。
１１．ＭＣＰ細胞の少なくとも５０％が４つの特徴すべてを有する、項目８−１０のいずれかに記載の細胞集団。
１２．特徴ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）および／またはｉｖ）は、細胞の少なくとも５５％、たとえば少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である、項目８−１１のいずれかに記載の細胞集団。
１３．細胞集団は少なくとも特徴ｉ）を有する、項目１−１２のいずれかに記載の細胞集団。
１４．細胞集団は少なくとも、特徴ｉ）に示されるマーカのうち少なくとも２つ、たとえば少なくとも３つまたは少なくとも４つに対して特徴ｉ）を有する、項目１−１３のいずれかに記載の細胞集団。
１５．細胞集団は少なくとも、特徴ｉ）に示されるすべてのマーカに対して特徴ｉ）を有する、項目１４に記載の細胞集団。
１６．細胞集団は少なくとも、特徴ｉｉ）に示される両方のマーカに対して特徴ｉｉ）を有する、項目１−１５のいずれかに記載の細胞集団。
１７．細胞集団は少なくとも、特徴ｉｉｉ）に示されるマーカのうち２つまたは３つに対して特徴ｉｉｉ）を有する、項目１−１６のいずれかに記載の細胞集団。
１８．細胞集団は少なくとも、特徴ｉｖ）に示されるマーカのうち少なくとも２つ、たとえば２、３、４、５または６つに対して特徴ｉｖ）を有する、項目１−１７のいずれかに記載の細胞集団。
１９．細胞集団は４つの特徴のうち少なくとも２つを有する、項目１−１８のいずれかに記載の細胞集団。
２０．細胞集団は４つの特徴のうち少なくとも３つを有する、項目１−１９のいずれかに記載の細胞集団。
２１．細胞集団は４つの特徴すべてを有する、項目１−２０のいずれかに記載の細胞集団。
２２．特徴ｉ）は細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である、項目１−２１のいずれかに記載の細胞集団。
２３．特徴ｉｉ）は細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である、項目１−２２のいずれかに記載の細胞集団。
２４．特徴ｉｉｉ）は細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である、項目１−２３のいずれかに記載の細胞集団。
２５．特徴ｉｖ）は細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である、項目１−２４のいずれかに記載の細胞集団。
２６．特徴ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）および／またはｉｖ）は細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である、項目１−２５のいずれかに記載の細胞集団。
２７．細胞集団は異種成分不含である、項目１−２６のいずれかに記載の細胞集団。
分化したＭＣＰ細胞
２８．少なくとも５日の期間にわたり分化培地を用いてプレート培養による分化を受けた後に、以下の特徴：
ｉ）細胞の少なくとも１％は、たとえばブラキウリ、ビメンチンまたはデスミンなどの１つまたはそれ以上の中胚葉マーカのタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％は、たとえばｉｓｌｅｔ−１、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、ｃＴＮＩ、ｃＴＮＴまたはコネキシン４３などの１つまたはそれ以上の心臓マーカのタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％は未分化幹細胞に対する１つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４からなる群より選択される、
のうち少なくとも１つを有する、項目１−２７のいずれかに記載の細胞集団。
２９．分化を受けた後の細胞集団は少なくとも特徴ｉ）を有する、項目２８に記載の細胞集団。
３０．分化を受けた後の細胞集団は少なくとも、特徴ｉ）に示されるマーカのうち２つまたは３つに対して特徴ｉ）を有する、項目２８または２９に記載の細胞集団。
３１．分化を受けた後の細胞集団は少なくとも、特徴ｉｉ）に示されるマーカのうち少なくとも２つ、たとえば２、３、４、５または６つに対して特徴ｉｉ）を有する、項目２８−３０のいずれかに記載の細胞集団。
３２．分化を受けた後の細胞集団は少なくとも、特徴ｉｉｉ）に示されるマーカのうち少なくとも２つ、たとえば２、３、４または５つに対して特徴ｉｉｉ）を有する、項目２８−３１のいずれかに記載の細胞集団。
３３．分化を受けた後の細胞集団は３つの特徴のうち少なくとも２つを有する、項目２８−３２のいずれかに記載の細胞集団。
３４．分化を受けた後の細胞集団は３つの特徴すべてを有する、項目２８−３３のいずれかに記載の細胞集団。
３５．特徴ｉ）は細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である、項目２８−３４のいずれかに記載の細胞集団。
３６．特徴ｉｉ）は細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である、項目２８−３５のいずれかに記載の細胞集団。
３７．特徴ｉｉｉ）は細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である、項目２８−３６のいずれかに記載の細胞集団。
３８．特徴ｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）は細胞の少なくとも２％、たとえば少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である、項目２８−３７のいずれかに記載の細胞集団。
基底細胞
３９．ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞に由来する細胞集団であって、基底細胞を含む、細胞集団。
４０．細胞集団は、以下の特徴：
ｉ）細胞の少なくとも１％はブラキウリのタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％はアルファサルコメリックアクチンのタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％はビメンチンのタンパク質発現を示さない、および
ｉｖ）細胞の少なくとも１％はデスミンのタンパク質発現を示さない、
ｖ）細胞の少なくとも１％は未分化細胞に対する１つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４からなる群より選択される、
のうち少なくとも１つを有する、項目３９に記載の細胞集団。
４１．基底細胞は原始内胚葉に似た形態を有し、かつその細胞は上皮様である、項目３９または４０に記載の細胞集団。
４２．基底細胞は、光学顕微鏡法によって明らかにされるとおり暗位相差像を示し、境界明瞭である、項目３９−４１のいずれかに記載の細胞集団。
４３．基底細胞は、光学顕微鏡法によって明らかにされるとおりの角張った形を有する、項目３９−４２のいずれかに記載の細胞集団。
４４．基底細胞の少なくとも５％は
１．原始内胚葉に似た形態を有し、
２．上皮様であり、
３．光学顕微鏡法によって明らかにされるとおりに暗位相差像を示し、かつ境界明瞭であり、および／または
４．光学顕微鏡法によって明らかにされるとおりの角張った形を有し、
さらに以下の特徴：
ｉ）細胞の少なくとも１％はブラキウリのタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉ）細胞の少なくとも１％はアルファサルコメリックアクチンのタンパク質および／または遺伝子発現を示す、
ｉｉｉ）細胞の少なくとも１％はビメンチンのタンパク質発現を示さない、および
ｉｖ）細胞の少なくとも１％はデスミンのタンパク質発現を示さない、
ｖ）細胞の少なくとも１％は未分化細胞に対する１つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４からなる群より選択される、
のうち少なくとも１つを有する、項目３９−４３のいずれかに記載の細胞集団。
４５．基底細胞の少なくとも５％は５つの特徴のうち少なくとも２つを有する、項目４４に記載の細胞集団。
４６．その２つの特徴とはｉ）およびｉｖ）である、項目４５に記載の細胞集団。
４７．基底細胞の少なくとも５％は５つの特徴のうち少なくとも３つを有する、項目４４−４６のいずれかに記載の細胞集団。
４８．基底細胞の少なくとも５％は５つの特徴のうち少なくとも４つを有する、項目４４−４７のいずれかに記載の細胞集団。
４９．基底細胞の少なくとも５％は５つの特徴すべてを有する、項目４４−４８のいずれかに記載の細胞集団。
５０．それらの特徴は細胞の少なくとも１０％、たとえば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％に対して有効である、項目４４−４９のいずれかに記載の細胞集団。
５１．細胞集団は少なくとも特徴ｉ）を有する、項目３９−５０のいずれかに記載の細胞集団。
５２．細胞集団は５つの特徴のうち少なくとも２つを有する、項目３９−５１のいずれかに記載の細胞集団。
５３．その２つの特徴とはｉ）およびｉｖ）である、項目５２に記載の細胞集団。
５４．細胞集団は５つの特徴のうち少なくとも３つを有する、項目３９−５３のいずれかに記載の細胞集団。
５５．細胞集団は５つの特徴のうち少なくとも４つを有する、項目３９−５４のいずれかに記載の細胞集団。
５６．細胞集団は５つの特徴すべてを有する、項目３９−５５のいずれかに記載の細胞集団。
５７．特徴ｉ）は細胞の少なくとも５％、たとえば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％に対して有効である、項目３９−５６のいずれかに記載の細胞集団。
５８．特徴ｉｉ）は細胞の少なくとも５％、たとえば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％に対して有効である、項目３９−５７のいずれかに記載の細胞集団。
５９．特徴ｉｉｉ）は細胞の少なくとも５％、たとえば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％に対して有効である、項目３９−５８のいずれかに記載の細胞集団。
６０．特徴ｉｖ）は細胞の少なくとも５％、たとえば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％に対して有効である、項目３９−５９のいずれかに記載の細胞集団。
６１．特徴ｖ）は細胞の少なくとも５％、たとえば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％に対して有効である、項目３９−６０のいずれかに記載の細胞集団。
６２．特徴ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）および／またはｖ）は細胞の少なくとも５％、たとえば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％に対して有効である、項目３９−６１のいずれかに記載の細胞集団。
６３．細胞集団は異種成分不含である、項目３９−６２のいずれかに記載の細胞集団。
６４．ＭＣＰ細胞を提供するための、項目３９−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
６５．薬物の発見プロセスにおいて用いるための、項目１−６４のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
６６．心臓細胞型に影響する可能性のある薬物を研究するための、インビトロモデルにおける項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
６７．たとえば初期心臓発生などの心臓発生を研究するための、インビトロモデルにおける項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
６８．ヒト心臓変性障害を研究するための、インビトロモデルにおける項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
６９．インビトロの心臓毒性試験のための、項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
７０．再生医療における、項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
７１．医学における、項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
７２．たとえば心臓組織の変性などの組織変性によってもたらされる病状および／または疾患の予防および／または処置のための医薬製品を製造するための、項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
７３．心臓障害の処置のための医薬製品を製造するための、項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
７４．たとえば壊死心筋、アポトーシス心筋、損傷した心筋、機能不全の心筋、または形態的に異常な心筋に関係する障害などの心臓障害の予防および／または処置のための医薬製品を製造するための、項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
７５．たとえば虚血性心疾患、心筋梗塞、リウマチ性心疾患、心内膜炎、自己免疫性心疾患、心臓弁膜疾患、先天性の心臓障害、心臓リズム異常、および／または心臓機能不全などの疾患の処置および／または予防のための医薬製品を製造するための、項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団の使用。
７６．心筋細胞様の細胞を得るための、項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団からの１つまたはそれ以上の細胞の使用。
７７．心筋細胞様の細胞に向かう成熟を研究するための、項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団からの１つまたはそれ以上の細胞の使用。
７８．心臓細胞（ｃａｒｄｉｏｃｅｌｌｕｌａｒ）毒性に対して化合物をスクリーニングする方法であって、項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団からの細胞を化合物に露出させるステップと、その化合物が細胞に対して毒性であるかどうかを定めるステップとを含む、方法。
７９．化合物の心臓細胞機能を調節する能力に対して化合物をスクリーニングする方法であって、項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団からの細胞を化合物に露出させるステップと、その化合物との接触によってもたらされる細胞のあらゆる表現型または代謝の変化を定めるステップと、その変化を心臓細胞機能を調節する能力と相関させるステップとを含む、方法。
基底細胞およびＭＣＰ細胞の方法
８０．項目３９−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団を調製する方法であって、
ｉ）約１日から約１０日、たとえば約１日から約６日などの間、懸濁培養中の分化培地において未分化ｈＢＳ細胞の１つまたはそれ以上のコロニー切片またはコロニーを培養するステップと、
ｉｉ）こうして培養された細胞を続けて増殖および分化するための培養容器に移すステップと、
ｉｉｉ）光学顕微鏡における形態的基準および／または本明細書において定義される関連マーカの同定によって基底細胞を同定するステップと、
ｉｖ）任意には、こうして得られた基底細胞を単離するステップと、
ｖ）任意には、ステップｉｉ）−ｉｖ）を繰返すステップと
を含む、方法。
８１．項目１−３９のいずれかにおいて定義される細胞集団を調製する方法であって、項目８０において定義されるステップｉ）−ｉｉｉ）を含み、さらに
ｖｉ）ＭＣＰ細胞の出現が光学顕微鏡および／または本明細書において定義される関連マーカの同定によって明らかにされるまで基底細胞を培養するステップと、
ｖｉｉ）こうして得られたＭＣＰ細胞を単離するステップと
を含む、方法。
８２．たとえば保存、心臓分化に対する使用、特徴付け、薬物の発見における使用、毒性試験における使用、再生医療における使用、および／または基底細胞の入手などのために、ＭＣＰ細胞を２次培養するステップをさらに含む、項目８１に記載の方法。
８３．ＭＣＰ細胞の新たな（ｄｅ ｎｏｖｏ）単離をさらに含む、項目８１に記載の方法。
８４．ステップｉ）はｈＢＳ細胞の未分化コロニーの切片を用いて行なわれる、項目８０−８３のいずれかに記載の方法。
８５．ステップｉ）における懸濁培養は、たとえばＦＢＳまたはヒト血清などの血清中で行なわれる、項目８０−８４のいずれかに記載の方法。
８６．血清の濃度は少なくとも２％、たとえば約２％から約３０％、約５％から約２５％または約２０％である、項目８５に記載の方法。
８７．ステップｉ）は約１日から約６日、たとえば約１日から約４日、約１日から約３日、または約１日から約２日の期間にわたって行なわれる、項目８０−８６のいずれかに記載の方法。
８８．ステップｉｉ）は同じ培地または異なる培地において行なわれる、項目８０−８７のいずれかに記載の方法。
８９．培地は、たとえばＦＢＳもしくはヒト血清などの血清を含有するか、または血清を含まない培地である、項目８８に記載の方法。
９０．血清が存在するとき、血清の濃度は少なくとも２％、たとえば約２％から約３０％、約５％から約２５％または約２０％である、項目８９に記載の方法。
９１．ステップｉｉ）は、培養容器の表面上または細胞外基質成分上に直接細胞を蒔くことによって行なわれる、項目８０−９０のいずれかに記載の方法。
９２．ステップｉｉ）は約２日から約２０日、たとえば約２日から約１５日、約２日から約１０日、約２日から約６日、または約２日から約４日の期間にわたって行なわれる、項目８０−９１のいずれかに記載の方法。
９３．ステップｉｖ）は約２日から約２５日、たとえば約２日から約２０日、約２日から約１５日、約２日から約１０日、約２日から約５日、または約２日から約４日の期間にわたって行なわれる、項目８０−９２のいずれかに記載の方法。
９４．ｉ）分化因子および／または分化培地の存在する表面上にＭＣＰ細胞を蒔くステップ
を含むことによって、分化したＭＣＰ細胞を得る方法。
キット
９５．ｉ）項目１−６３のいずれかにおいて定義される細胞集団と、ｉｉ）１つまたはそれ以上の成熟因子および／または成熟培地と、ｉｉｉ）任意には、使用のための指示書とを含む、キット。
９６．成熟培地は、ＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、ｂＦＧＦが補われたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、自己の予め調整されたＶｉｔｒｏＨＥＳ（商標）、ＣＧＭ培地、および心臓に特定のその他の培地からなる群より選択される、項目９５に記載のキット。
９７．１つまたはそれ以上の成熟因子は、ｂＦＧＦなどのＦＧＦ、ＢＭＰ、５−アザデオキシシチジン、ＤＭＳＯ、レチノイン酸、アスコルビン酸、およびＡＳＡからなる群より選択される、項目９５または９６に記載のキット。
９８．成熟をモニタするためのツールをさらに含む、項目９５−９７のいずれかに記載のキット。
９９．成熟をモニタするためのツールは、
ｉ）未分化ｈＢＳ細胞に対するマーカ、デスミン、アルファサルコメリックアクチン、ブラキウリ、ネスチン、ＧＦＡＰ、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４、ｃＴｎＩ、ｃＴｎＴ、α−ＭＨＣ、およびコネキシン４３からなる群より選択される発現マーカをコードする遺伝子のうち少なくとも３つ、たとえば少なくとも４つまたは少なくとも５つに対するＰＣＲプライマと、
ｉｉ）使用者のマニュアルと
を含む、項目９８に記載のキット。
１００．成熟をモニタするためのツールは、
ｉ）未分化ｈＢＳ細胞に対するマーカ、デスミン、アルファサルコメリックアクチン、ブラキウリ、ネスチン、ＧＦＡＰ、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４、ｃＴｎＩ、ｃＴｎＴ、α−ＭＨＣ、およびコネキシン４３からなる群より選択される発現マーカ抗原のうち少なくとも３つ、たとえば少なくとも４つまたは少なくとも５つに対する抗体と、
ｉｉ）使用者のマニュアルと
を含む、項目９８または９９に記載のキット。
１０１．再生医療のためのキットであって、
ｉ）基底細胞および／またはＭＣＰ細胞と、
ｉｉ）任意には、インビトロおよび／またはインビボで分化を起こすための因子と、
ｉｉｉ）細胞を患者に投与するためのツール、または細胞を、たとえばすぐに使用できる注射器に入れるなど投与可能な形にしたものと
を含む、キット。

Claims (10)

  1. ヒト胚盤胞由来幹（ｈＢＳ）細胞に由来する多能性非収縮心臓前駆細胞を含む細胞集団であって、前記多能性非収縮心臓前駆細胞が
    ａ）小さく丸い明位相差像を示す細胞のクラスタとして生育し、該クラスタは糸に付いた風船の形で現れ、かつ
    ｂ）それらの細胞は以下の４つの特徴
    ｉ）細胞は未分化細胞であるＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびＯｃｔ−４に対するマーカについて抗原発現を示さない、
    ｉｉ）細胞は、ネスチンのタンパク質発現を示さない、
    ｉｉｉ）細胞は、ビメンチンの中胚葉マーカのタンパク質発現を示すが、中胚葉マーカであるデスミンおよびα−サルコメア・アクチンのタンパク質発現を示さない、および
    ｉｖ）細胞は、ｉｓｌｅｔ−１の初期段階心臓マーカのタンパク質発現を示さない、
    をすべて有する細胞集団。
  2. 前記多能性非収縮心臓前駆細胞がＦｌｋ−１の遺伝子および／またはタンパク質発現を示す、
    請求項１に記載の細胞集団。
  3. 再生医療のための薬剤の製造を目的とする、
    請求項１あるいは２に記載の細胞集団。
  4. 心臓疾患の予防および／または処置のための医薬製品の製造を目的とする、薬剤のスクリーニング、心臓細胞型に影響する可能性のある薬物を研究するためのインビトロのモデル、初期心臓発生などの心臓発生を研究するためのインビトロのモデル、ヒトの心臓変性障害を研究するためのインビトロのモデルのための、
    請求項１あるいは２に記載の細胞集団の使用方法。
  5. 心臓疾患の予防および／または処置のための医薬製品の製造を目的とする、インビトロの心臓毒性試験のための、
    請求項１あるいは２に記載の細胞集団の使用方法。
  6. 心臓疾患の予防および／または処置のための医薬製品の製造を目的として、心筋様細胞を取得、または心筋様細胞へと成熟する過程を研究するための、
    請求項１あるいは２に記載の細胞集団から１つまたはそれ以上の基底細胞の使用方法。
  7. 分化した多能性非収縮心臓前駆細胞を得るための方法であって、
    １つの分化因子、および／または分化培地の存在する表面上に請求項１あるいは２に記載の多能性非収縮心臓前駆細胞を蒔くこと
    を含む、方法。
  8. ｉ）請求項１あるいは２に記載の細胞集団と、ｉｉ）１つまたはそれ以上の成熟因子および／または成熟培地とを含む、キット。
  9. 再生医療のためのキットであって、
    ｉ）請求項１あるいは２に記載の細胞集団と、
    ｉｉ）細胞を患者に投与するためのツール、または細胞を、すぐに使用できる注射器に入れ投与可能な形にしたものと
    を含む、キット。
  10. インビトロおよび／またはインビボで分化を起こすための因子をさらに含む請求項９に記載のキット。
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