JP5750130B2 - ヒト胚盤胞由来幹細胞に由来する多能性非収縮心臓前駆細胞の新規の集団 - Google Patents
ヒト胚盤胞由来幹細胞に由来する多能性非収縮心臓前駆細胞の新規の集団 Download PDFInfo
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Description
i)細胞の少なくとも1%は未分化細胞に対する1つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはSSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、およびOct−4からなる群より選択される、
ii)細胞の少なくとも1%は、ネスチンまたはGFAPを含む神経系マーカの1つまたはそれ以上のタンパク質発現を示さない、
iii)細胞の少なくとも1%は、ブラキウリ(brachyury)、ビメンチンまたはデスミンを含む中胚葉マーカの1つまたはそれ以上のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
iv)細胞の少なくとも1%は、Flk−1(KDR)のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
本明細書において用いられるASAという用語は、アスピリンの活性物質であるアセチルサリチル酸(Acetyl Salicylic Acid)を意味することが意図される。
本明細書において用いられるフィーダ細胞は、単独または組合せて用いられる支持細胞型を意味することが意図される。さらにこの細胞型はヒトまたは他の種に由来してもよい。フィーダ細胞が由来し得る組織は、胚、胎児、新生児、子供、または成体の組織を含み、さらに***を含む皮膚、臍帯、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、間質または胸部に由来する組織を含む。フィーダ細胞は、ヒトの線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞および上皮細胞からなる群に属する細胞型に由来してもよい。フィーダ細胞を得るために用いられ得る特定の細胞型の例は、胚の線維芽細胞、胚体外の内胚葉細胞、胚体外の中胚葉細胞、胎児の線維芽細胞および/または線維細胞、胎児の筋細胞、胎児の皮膚細胞、胎児の肺細胞、胎児の内皮細胞、胎児の上皮細胞、臍帯の間充織細胞、胎盤の線維芽細胞および/または線維細胞、胎盤の内皮細胞、出生後の***の線維芽細胞および/または線維細胞、出生後の筋細胞、出生後の皮膚細胞、出生後の内皮細胞、成体の皮膚の線維芽細胞および/または線維細胞、成体の筋細胞、成体の卵管内皮細胞、成体の腺の子宮内膜細胞、成体の間質の子宮内膜細胞、成体の乳癌実質細胞、成体の内皮細胞、成体の上皮細胞、または成体のケラチン生成細胞を含む。フィーダ細胞がhBS細胞に由来するとき、その細胞は線維芽細胞であってもよい。
この状況におけるMCP細胞とは、非常に特異な形態および特異的マーカの特徴を有する細胞を意味することが意図される。したがって、本発明は第1の局面において、多能性心臓前駆(MCP)細胞を含む、ヒト胚盤胞由来幹(hBS)細胞に由来する細胞集団に関する。この細胞集団集団は以下の特徴を有する:
i)細胞の少なくとも1%は未分化細胞に対する1つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはSSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、およびOct−4からなる群より選択される、
ii)細胞の少なくとも1%は、ネスチンまたはGFAPを含む神経系マーカの1つまたはそれ以上のタンパク質発現を示さない、
iii)細胞の少なくとも1%は、ブラキウリ、ビメンチンまたはデスミンを含む中胚葉マーカの1つまたはそれ以上のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
iv)細胞の少なくとも1%は、Flk−1(KDR)のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
1.小さく丸い明位相差像を示す細胞のクラスタとして生育し、
2.円形または細長い形のクラスタを形成し、そのクラスタは緩く付着した細胞の塊として現れ、基底細胞上に生育されるときには基底細胞の単層の上にあり、
3.比較的高い核対細胞質の比率を有し、および/または
4.糸に付いた風船の形で現れ、
それらの細胞は以下の特徴をすべて有する:
i)細胞の少なくとも1%は未分化細胞に対する1つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはSSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、およびOct−4からなる群より選択される、
ii)細胞の少なくとも1%は、たとえばネスチンまたはGFAPなどの神経系マーカの1つまたはそれ以上のタンパク質発現を示さない、
iii)細胞の少なくとも1%は、たとえばブラキウリ、ビメンチンまたはデスミンなどの中胚葉マーカの1つまたはそれ以上のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、および
iv)細胞の少なくとも1%は、Flk−1(KDR)のタンパク質および/または遺伝子発現を示す。
新規MCP細胞の非常に重要な特性の1つは、心筋細胞様の細胞に分化できることである。したがって本発明の実施形態の1つにおいて、本発明に従った細胞集団は、少なくとも5日の期間にわたるプレート培養および分化培地の使用によって分化されて、以下の特徴のうち少なくとも1つを有するようになる:
i)細胞の少なくとも1%は、たとえばブラキウリ、ビメンチンまたはデスミンなどの中胚葉マーカの1つまたはそれ以上のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
ii)細胞の少なくとも1%は、たとえばislet−1、GATA−4、Nkx2.5、cTNI、cTNT、またはコネキシン43などの1つまたはそれ以上の心臓マーカのタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
iii)細胞の少なくとも1%は未分化幹細胞に対する1つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはSSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、およびOct−4からなる群より選択される。
基底細胞は、MCP細胞の形成において重要な中間細胞である。基底細胞はそれらが由来するhBS細胞とは異なり、MCP細胞とも形態的に異なる。したがって本発明はヒト胚盤胞由来幹(hBS)細胞に由来する細胞集団にも関し、この細胞集団は基底細胞を含む。この細胞集団は以下の特徴を有する:
i)細胞の少なくとも1%はブラキウリのタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
ii)細胞の少なくとも1%はアルファサルコメリックアクチンのタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
iii)細胞の少なくとも1%はビメンチンのタンパク質発現を示さない、
iv)細胞の少なくとも1%はデスミンのタンパク質発現を示さない、および
v)細胞の少なくとも1%は未分化細胞に対する1つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはSSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、およびOct−4からなる群より選択される。
i)細胞の少なくとも1%は実施例3の表IIに列挙される遺伝子、たとえばバソヌクリン1(Basonuclin 1:BNC1)、ネフロネクチン(nephronectin:NPNT)、フィブリノゲンアルファ鎖(fibrinogen alpha chain:FGA)、アネキシンA8(annexin A8:ANXA8)、マトリックスGlaタンパク質(matrix Gla protein:MGP)、透明帯糖タンパク質4(zona pellucida glycoprotein 4:ZP4)、トロンボモジュリン(thrombomodulin:THBD)、ホメオボックスB7(homeobox B7:HOXB7)、心臓および神経冠誘導体発現1(heart and neural crest derivatives expressed 1:HAND1)、デスモコリン3(desmocollin 3:DSC3)、インターロイキン6シグナルトランスデューサ(interleukin 6 signal transducer:IL6ST)、アクアポリン1(aquaporin 1:AQP1)、Frizzled関連タンパク質(Frizzled−related protein:FRZB)、ブラジキニン受容体B1(bradykinin receptor B1:BDKRB1)、成長ホルモン受容体(growth hormone receptor:GHR)、およびキナーゼ挿入ドメイン受容体(Flk−1)(kinase insert domain receptor:KDR)などのうち少なくとも1つまたはそれ以上の遺伝子発現を示す、
ii)細胞の少なくとも1%は、未分化hBS細胞に比べてダウンレギュレーションされたoct−4およびnanogの遺伝子発現を有する。
1.原始内胚葉に似た形態を有し、
2.上皮様であり、
3.光学顕微鏡法によって明らかにされるとおりに暗位相差像を示し、かつ境界明瞭であり、および/または
4.光学顕微鏡法によって明らかにされるとおりの角張った形を有し、
さらに以下の特徴のうち少なくとも1つを有する:
i)細胞の少なくとも1%はブラキウリのタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
ii)細胞の少なくとも1%はアルファサルコメリックアクチンのタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
iii)細胞の少なくとも1%はビメンチンのタンパク質発現を示さない、および
iv)細胞の少なくとも1%はデスミンのタンパク質発現を示さない、
v)細胞の少なくとも1%は未分化細胞に対する1つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはSSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、およびOct−4からなる群より選択される。
出発材料
本発明に対する出発材料は、好適には未分化hBS細胞系などの多能性未分化hBS細胞である。こうした材料はセラーティス社(Cellartis AB)から得ることができ、NIHの幹細胞登録(stem cell registry)http://stemcells.nih.gov/research/registry/を通じても入手可能である。セラーティス社の2つのhBS細胞系(SA001およびSA002)およびSA002の1つのサブクローン(SA002.5)がNIHを通じて入手可能である。本発明ではこれらのhBS細胞系がしばしば用いられている。
I.懸濁培養
基底細胞およびMCP細胞は、未分化のhBS細胞から得られる。基底細胞を含む細胞集団は、以下のステップを含む方法によって得られる:
i)約1日から約10日、たとえば約1日から約6日などの間、懸濁培養中の分化培地において未分化hBS細胞の1つまたはそれ以上のコロニー切片またはコロニーを培養するステップ、
ii)こうして培養された細胞を続けて増殖および分化するための培養容器に移すステップ、
iii)任意には、光学顕微鏡における形態的基準および/または本明細書において定義される関連マーカの同定によって基底細胞を同定するステップ、
iv)任意には、こうして得られた基底細胞を単離するステップ、および
v)任意には、ステップii)−iv)を繰返すステップ。
基底細胞およびMCP細胞は、未分化のhBS細胞から得られる。基底細胞を含む細胞集団は、以下のステップを含む方法によって得られる:
i)hBS細胞を分離および解離して懸濁液にし、細胞懸濁液をマルチウェル組織培養プレートに分配するステップ、
ii)細胞の強制凝集のために遠心力を加えるステップ、
iii)こうして増強された3Dクラスタ化細胞を、約1日から約20日、たとえば約6日から約8日などの間、マイクロウェル形式の分化培地中で培養するステップ、
iv)任意には、こうして3D培養された細胞を続けて増殖および分化するための培養容器に移すステップ、
v)任意には、光学顕微鏡における形態的基準および/または本明細書において定義される関連マーカの同定によって基底細胞を同定するステップ、
vi)任意には、こうして得られた基底細胞を単離するステップ、および
vii)任意には、ステップiii)−iv)を繰返すステップ。
基底細胞の形成を可能にするためには、懸濁法のステップi)を比較的短期間で行なうことが重要であることを本発明者らは見出した。よって特定の実施形態において、ステップi)は約1日から約6日、たとえば約1日から約4日、約1日から約3日、または約1日から約2日の期間にわたって行なわれる。
単離または非単離基底細胞をMCP細胞の調製に用いることができる。したがって本発明は、MCP細胞を含む細胞集団の調製のための方法にも関し、この方法は基底細胞を得るためのステップ、たとえば上記に定めたステップi)−iii)を含むか、または代替的に、単離または非単離基底細胞の使用および以下のさらなるステップを含む:
vi)MCP細胞の出現が光学顕微鏡および/または本明細書において定義される関連マーカの同定によって明らかにされるまで基底細胞を培養するステップ、
vii)こうして得られたMCP細胞を単離するステップ。
さらに、MCP細胞は、心筋細胞様の細胞を提供するために以下のステップによって分化されてもよい:
i)1つまたはそれ以上の分化因子、たとえばBMPおよびFGFファミリーの成長因子など、B−27、5−アザデオキシシチジン、DMSO、レチノイン酸、ASAおよびアスコルビン酸、ならびに/または分化培地の存在する表面上にMCP細胞を蒔くことによって、分化したMCP細胞を得るステップ。
本発明はキットにも関する。上述の局面の詳細および細部は、必要な変更を加えてキットの局面にも適用される。特定の実施形態は添付の請求項から明らかになる。よって本発明のキットは、基底細胞、MCP細胞またはMCP細胞に由来する心筋細胞様の細胞を含む細胞集団と、ii)心臓分化を起こす1つまたはそれ以上の成熟因子および/または成熟培地と、iii)任意には、使用のための指示書とを含んでもよい。成熟培地は、VitroHES(商標)、bFGFが補われたVitroHES(商標)、自己の予め調整されたVitroHES(商標)、CGM培地、および心臓に特定のその他の培地からなる群より選択されてもよく、1つまたはそれ以上の成熟因子は、bFGFなどのFGF、BMP、5−アザデオキシシチジン、DMSO、レチノイン酸、アスコルビン酸、およびASAからなる群より選択される。このキットは、成熟をモニタするためのツールをさらに含んでもよい。好適なツールは以下を含んでもよい:
i)未分化hBS細胞に対するマーカ、デスミン、アルファサルコメリックアクチン、ブラキウリ、ネスチン、GFAP、Islet−1、Nkx2.5、GATA−4、cTnI、cTnT、α−MHC、およびコネキシン43からなる群より選択される発現マーカをコードする遺伝子のうち少なくとも3つ、たとえば少なくとも4つまたは少なくとも5つに対するPCRプライマ、または
i)未分化hBS細胞に対するマーカ、デスミン、アルファサルコメリックアクチン、ブラキウリ、ネスチン、GFAP、Islet−1、Nkx2.5、GATA−4、cTnI、cTnT、α−MHC、およびコネキシン43からなる群より選択される発現マーカ抗原のうち少なくとも3つ、たとえば少なくとも4つまたは少なくとも5つに対する抗体。
i)基底細胞および/またはMCP細胞、
ii)任意には、インビトロおよび/またはインビボで分化を起こすための因子、
iii)細胞を患者に投与するためのツール、またはこうした細胞を、たとえばすぐに使用できる注射器に入れるなど投与可能な形にしたもの。
実験部分で用いられる材料に関する特定の詳細を以下の部分に示す。以下の略語が用いられている。
出発材料
本発明に対する出発材料は、好適には未分化hBS細胞系などの多能性未分化hBS細胞である。こうした材料はセラーティス社から得ることができ、NIH幹細胞登録http://stemcells.nih.gov/research/registry/を通じて、および英国幹細胞バンクからも入手可能である。セラーティス社の2つのhBS細胞系(SA001およびSA002)およびSA002の1つのサブクローン(SA002.5)がNIHを通じて入手可能である。
1.hBS細胞系の確立およびLOT調製
2.異種成分不含の調製
3.酵素的に継代されたhBS細胞
4.フィーダを含まない培養系に移されたhBS細胞。
hBS細胞系のLOT調製は、培養物中のhBS細胞の拡張およびその後のガラス化法(vitrification)による凍結を構成し、ガラス化法とは、標準化された方法に従って、瞬間凍結によって単一継代における100本より多いストローを結晶状態にすることを意味する(特許出願中、WO2004098285号)。hBS細胞系の形態は、凍結の前後にモニタされ、LOTから細胞を解凍した後の培養における連続的な継代においてもモニタされる。LOT凍結の品質は、解凍回復率を調べることによって確認される。次いで、微生物の安全性およびヒトウイルスに関する安全性試験が凍結された継代における細胞および培地に対して行なわれることにより、細胞が汚染されていないことが確認される。行なわれる特徴付けプログラムは、hBS細胞系の分化状態を確認するための広範囲の方法を含む。最初に、未分化細胞に対する一般的に認められるマーカ(SSEA−1、SSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、Oct−4およびALP)のマーカ発現分析が行なわれる。継代および凍結−解凍サイクルを通じた細胞のゲノム安定性は、核型決定およびFISHを通じて調べられる。テロメラーゼ活性は、Telo TAGGGテロメラーゼPCR ELISAPLUSキットを用いて測定される。hBS細胞の多能性は、胚様体ステップを介したインビトロ分化、および免疫不全SCIDマウスの腎臓皮膜下へのhBS細胞の移植によるインビボ分化によって調べられる。
本明細書において用いられる出発材料はさらに、完全に異種成分不含で得られてもよく、それによって再生医療における使用の可能性に対する完全に異種成分不含のMCPが得られることで、移植片拒絶反応の危険性およびヒト以外の病原体の移転の可能性がかなり減少されてもよい。hBS細胞の異種成分不含の導出のためには、使用されるすべての培地および基質構成要素、フィーダ細胞およびその他の材料は、いかなるヒト以外の動物材料にも由来または接触してはならない。hBS細胞の異種成分不含の導出、さらに異種成分不含のMCPを得るために好適な構成要素は、異種成分不含で得られたヒト線維芽細胞、たとえばヒト***線維芽細胞など、ヒト組換え成長因子、分化因子および/またはその他の可能な添加剤を有する血清を含まない培地またはヒト血清を主成分とする培地、ならびに細胞の解離および増殖のためのヒト組換え酵素または滅菌した機械的ツールである。以下に好適な手順を説明する。
臨床的体外受精(in vitro fertilization:IVF)処置からの余剰のヒト胚が、インフォームドコンセントおよびイェーテボリ大学における地方倫理委員会の許可の後に提供された。提供された胚は、IVF処置において伝統的に用いられる培地中で5日齢まで胚盤胞に培養された。この胚盤胞は、ガードナー(Gardner)に従って4AAと等級付けされ、WO2003055992号に従ってA品質の胚盤胞と等級付けされた(多くの明瞭な密に詰まったICM細胞および多くの細胞を有する凝集性の栄養外胚葉を有する、拡張された胚盤胞)。胚盤胞は、酸性タイロード溶液(メディカルト(Medicult))溶液(すぐに使用できる濃度)で15〜30秒間室温にて処理されることによって、透明帯および栄養外胚葉の部分が除去された後、およそ270mOsm/kgの容量オスモル濃度のDMEMに20%(v/v)のヒト血清、4ng/mlのヒト組換えbFGF、1%のペニシリン−ストレプトマイシン、1%のグルタマックス、0.5mmol/lのβ−メルカプトエタノールおよび1%の可欠アミノ酸(ギブコ・インビトロジェン社(Gibco Invitrogen Corporation))が補われた異種成分不含の血清中で、マイトマイシンCを不活性化した異種成分不含のヒト***線維芽細胞フィーダ上に内部細胞塊細胞が置かれた。次いで胚盤胞は空気中の5%CO2の中で37℃にてインキュベートされた。2〜3日ごとに培地の50%が交換され、10日後に細胞は新鮮なhFFフィーダに機械的に継代された。継代2から、切断および移動ツールとしてガラスキャピラリを用いて、hBS細胞(細胞系SA611)が機械的に継代された。細胞は約1週間に1回継代され、11継代より多く培養された。
ヒト***サンプルは、割礼を受けた8週齢の男児から、2Xゲンタマイシンを含有する滅菌IMDM(インビトロジェン)中で無菌的に集められた。皮膚外植片は、IMDM培地(インビトロジェン)、1%のペニシリン−ストレプトマイシン(ギブコ・インビトロジェン社)、および10%のヒト血清を含有する25cm2プライマリア(primaria)組織培養フラスコ(ベクトン・ディッキンソン(Becton Dickinson))の内側に置かれた。約10日後に集密的な単層が確立された。細胞は、トリプルセレクト(インビトロジェン)を用いて連続的に継代された。拡張後の細胞は、ヒト病原体(マイコプラズマ、1型および2型のHIV、B型およびC型の肝炎、サイトメガロウイルス、1型および2型の単純疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス)の標準パネルに対して試験された。
異種成分不含のヒト線維芽細胞フィーダをプレート培養する前に、組織培養されたウェルは0.1%の組換えヒトゼラチン(フィブロジェン(Fibrogen))で室温にて最低1時間被覆される。IMDM、10%のヒト血清および1%のペニシリン−ストレプトマイシンの中で生育された異種成分不含のhFF003(第5から第8継代)細胞の集密的な単層は、次いでマイトマイシンC(シグマ)で2.5時間処理された。マイトマイシンC処理されたフィーダはIVFウェル(ベクトン・ディッキンソン)上に、2.89cm2当り200000細胞が、DMEM(上記のとおり)を主成分とする10%(v/v)のヒト血清と、1%のペニシリン−ストレプトマイシンと、1%のグルタマックスと、0.5mmol/lのβ−メルカプトエタノールと、1%の可欠アミノ酸(ギブコ・インビトロジェン社)とが補われた培地に蒔かれた。胚盤胞をその内部細胞塊細胞およびそれに由来する細胞またはhBS細胞とともに置く前に、培地はDMEM(上記のとおり)に今回は20%(v/v)のヒト血清、10ng/mLのヒト組換えbFGF、1%のペニシリン−ストレプトマイシン、1%のグルタマックス、0.5mmol/lのβ−メルカプトエタノールおよび1%の可欠アミノ酸(ギブコ・インビトロジェン社)が補われた培地に交換された。(上述の「異種成分不含のhBS細胞の取得および培養」における培地と同じ。)
ヒト血清は、少なくとも15人の健康な個体からの血液サンプル(Blodcentralen、シャルグレンスカ(Sahlgrenska)大学病院)から得られ、それは血液をヘパリン非被覆プラスチックバッグに集め、約8℃で1晩置くことによって血清を凝固した材料から分離することによって得られた。血清はさらに滅菌ろ過され、プールされ、好適な部分に分けて凍結された。(使用前に、血液はスウェーデンのBlodcentralenにおいてB型肝炎、C型肝炎、HIV、HTLVおよび梅毒を含む病原体の標準的一群に対して試験された。)培地は、20%(v/v)の解凍血清をDMEM(上述のとおり)および上述の「異種成分不含のhBS細胞の取得および培養」に記載されるその他の成分に加えることによって、さらに調製された。
hBS細胞系SA611はWO2004098285号に記載される方法に従って凍結された。2つの溶液AおよびBが調製される(溶液A:極低温PBS(Cryo−PBS)中の滅菌ろ過された10%のエチレングリコール、10%のDMSO;溶液B:極低温PBS中の滅菌ろ過された0.3Mのトレハロース、20%のエチレングリコール、10%のDMSO)。hBS細胞系SA611の選択されたコロニーは、幹細胞切断ツール(Swemed Labs International、ビルダル、スウェーデン)を用いて、通常の継代のために細胞を切断するのと同じ態様で切断された。細胞切片は最初に500mlの予熱された(37℃)溶液A中で1分間インキュベートされ、次いで25mlの溶液Bに移されて30秒間インキュベートされ、次いで再び溶液Bの新鮮な滴に移されて30秒間インキュベートされる。その体積は約40〜50μlであった。細胞切片はガラス化法のために調製されたストロー内に吸引され、次いでストローは接着剤で閉じられた。ストローはさらに液体窒素に沈められた。
異種成分不含のSA611細胞系は今のところ(上述の)LOT調製およびそれに関連する特徴付けをされていないが、これまでに行なわれたかなり詳細な特徴付けを以下の数段落に記載する。hBS細胞のコロニー培養物は4%のパラホルムアルデヒド中で固定された後、透過処理された。続く洗浄およびブロッキングステップの後で、細胞は1次抗体とともに4℃にて1晩インキュベートされた。用いられた1次抗体はOct−4、TRA−1−60、TRA−1−81、SSEA−1、SSEA−3、およびSSEA−4に対して特異的なものだった(サンタクルーズバイオテクノロジー;サンタクルーズ、カリフォルニア州;http://www.southernbiotech.com)。FITCまたはCy3に結合された2次抗体が検出に用いられた。核はDAPIによって対比染色された(ベクタシールド(Vectashield);ベクターラボラトリーズ(Vector Laboratories)、バーリンゲーム、カリフォルニア州;http://www.vectorlabs.com)。アルカリホスファターゼ(ALP)の活性は、製造者のプロトコルに従って定められた(シグマ−アルドリッチ(Sigma−Aldrich)、ストックホルム、スウェーデン;http://www.sigmaaldrich.com)。3つの異なる胚葉からの細胞を同定するために、上記に概略を述べたとおりの免疫組織化学分析が以下の抗体によって行なわれた。内胚葉の細胞に対してはHNF3β(サンタクルーズバイオテクノロジー;サンタクルーズ;http://www.southernbiotech.com)が用いられた。中胚葉の細胞はASMA(会社)によって検出され、外胚葉の細胞はβ−チューブリン−III mAb(シグマ−アルドリッチ)によって同定された。アルカリホスファターゼ(ALP)反応は、商業的キットを用いて製造者のプロトコルに従って検出された(シグマ−アルドリッチ)。ALP、Oct−4、Tra−1−60、Tra−1−81、およびSSEA−4に対しては未分化コロニー中の陽性反応が検出されたが、SSEA−1は陰性であった。
この手順においては、ヒト線維芽細胞フィーダは異種成分不含である必要がない。したがって異なる手順を用いてフィーダを得ることができる。以下に2つの異なるやり方を記載するが、異種成分不含の培養条件が望ましいかまたは必要なときには、実際に選択されたやり方を培養条件の要求に対応させることができる。
商業的に入手可能なhFFは、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)(CRL−2429 ATCC、マナッサス、ヴァージニア州)から得られ、イスコフDMEM(ギブコ・インビトロジェン社、ペーズリー、スコットランド;http://www.invitrogen.com)に10%のFBS(インビトロジェン)および1%のペニシリン−ストレプトマイシンが補われた培地で培養された。細胞は、トリプシン−EDTA(インビトロジェン)を用いて1:2から1:8の間の分割で規則的に(毎週)継代された。HFFの集密的な単層は、マイトマイシンC(シグマ)で処理され(10μg/mlにて2.5時間)、0.1%のゼラチン(シグマ)で被覆されたIVF皿上で70000〜80000細胞/cm2の密度で、4ng/mlのhr塩基性線維芽細胞増殖因子(hrbasic fibroblast growth factor:hrbFGF、インビトロジェン)が補われたVitroHES(商標)培地に蒔かれた。hFF細胞は継代4から継代12の間でフィーダとして使用された。
hBS細胞系SA001およびSA121(セラーティス社、イェーテボリ、スウェーデン、http://www.cellartis.com)は、以前に記載されたとおり[ハインズ、ノアクソン(Noakssson)]およびWO03055992号のとおりに確立および特徴付けされた。実験前、細胞系は、IVF皿内のマイトマイシンC不活性化mEFフィーダ層上で、4ng/mlのhrbFGFが補われたVitroHES(商標)培地(Vitrolife社、クングスバッカ、スウェーデン、http://www.vitrolife.com)中で維持され、切断および移動ツールとしてマイクロキャピラリを用いて手動で切断された。hBS細胞を伝統的な培養から酵素的解離に移すために、使用された培地を除去して培養皿をPBS(インビトロジェン)で1回洗浄した。次いで体積0.5mLのトリプル(商標)セレクト(インビトロジェン)またはトリプシン/EDTA(インビトロジェン)を各IVF皿に加えた。hBS細胞コロニーの外側領域がフィーダ層から切上がり始めるまで、皿を37℃でインキュベートした。次いで細胞シートをピペットにより繰返し粉砕することによってばらばらに壊して単一細胞懸濁液にし、遠心管に移して400gで5分間遠心分離した。上清は捨てられ、hBS細胞ペレットは新鮮なVitroHES(商標)培地に再懸濁され、単一細胞懸濁液は不活性化hFFの密集フィーダ層を含有するIVF皿に接種された。
酵素的増殖のために、hBS細胞は、高密度のhFFフィーダ細胞およびVitroHES(商標)培地に4ng/mlのhrbFGFが補われたものからなる培養系において維持された。培養皿をPBS(インビトロジェン)で洗浄して培地を除去することによって、酵素的解離を開始させた。次いで体積0.5mLのトリプル(商標)セレクト(インビトロジェン)またはトリプシン/EDTA(インビトロジェン)を各皿に加えた。hBS細胞コロニーの外側領域がフィーダ層から切上がり始めるまで、皿を37℃でインキュベートした。次いで細胞シートをピペットにより繰返し粉砕することによってばらばらに壊して単一細胞懸濁液にした。その後細胞懸濁液を遠心管に移して400gで5分間遠心分離した。上清は捨てられ、hBS細胞ペレットは新鮮なVitroHES(商標)培地に再懸濁された。次いで細胞は、1:5から1:500の間の分割比率で不活性化hFFの密集フィーダ層を含有する新鮮なIVF皿に接種された。低い方の分割比率は、新たな系における1番最初の継代の際の、いわゆる調整手順の際に用いられた。5継代以内の終了後にhBS細胞系は1:20から1:500の間の分割比率で分割された。培養は、37℃および95%の湿度のインキュベータ中で維持された。用いられた培地は、2〜3日ごとに新鮮なVitroHES(商標)+4ng/mlのhrbFGFで置換された。個々のhBS細胞系の生育速度に依存して、細胞は6〜12日ごとに継代された。SA001およびSA121どちらの系も正常な核型を維持しながら20継代よりも多く培養され、さらに10%のDMSOが補われた通常の培地中で従来の緩速凍結法に従って凍結および解凍された。
hBS細胞培養物は4%のパラホルムアルデヒド中で15分間固定され、0.5%のトリトン溶液(シグマ−アルドリッチ)中で5分間透過処理された後、PBS(インビトロジェン)中の5%のFBSによってブロッキングされた。細胞は1次抗体溶液とともに4℃にて1晩インキュベートされた。用いられた1次抗体はOct−4、TRA−1−60、TRA−1−81、SSEA−1、SSEA−3、およびSSEA−4に対して特異的なものだった(サンタクルーズバイオテクノロジー;サンタクルーズ、カリフォルニア州;http://www.southernbiotech.com)。FITCまたはCy3に結合された2次抗体(ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ(Jackson Immunoreserach Laboratories))とのインキュベーションが室温(RT)にて60分間行なわれた。細胞核はDAPI(シグマ)によって対比染色された。アルカリホスファターゼの活性は、アルカリホスファターゼ活性検出キットを用いて、製造者の指示に従って定められた(シグマ−アルドリッチ)。染色は、ニコンエクリプス(Nikon Eclipse)TE−2000U蛍光顕微鏡を用いて評価および記録された。SA001およびSA121はどちらも、20継代を超えた後も上述のhBS細胞の特徴をすべて示した。
本発明において用いられ得るhBS細胞のさらなる例は、フィーダを含まない培養系に予め移されたhBS細胞である(WO2004099394およびシェーグレン−ヤンソン E(Sjogren−Jansson E)ら)。
未分化hBS細胞からの基底細胞の導出
懸濁培養
未分化hBS細胞はインビトロで維持および増殖された。継代の4〜5日後に、幹細胞切断ツール(a Stem Cell Cutting Tool)を用いて未分化hBS細胞コロニーを手動で切開し、懸濁培養の分化培地(KO−DMEMに1mMのグルタマックス、0.1mMのβ−MeOH、1%のNEAA、1%のPeSTおよび20%のFBSを補ったもの)の中に置いた。細胞は懸濁液中で1〜6日間維持された後、ゼラチン被覆された組織培養皿に移されて、分化する細胞クラスタの付着ならびに細胞の継続的な増殖および分化が導かれた。プレート培養の4日後に、分化するhBS細胞の付着性のクラスタから細胞の単層が現れる。これらの細胞は、迷路に似た外観を有する特徴的な密集した網状組織中で生育するため、基底細胞の領域は光学顕微鏡法を用いて容易に区別できる。基底細胞の形態は原始内胚葉に類似しており、これらの細胞は上皮様である。加えて、個々の細胞は暗位相差像を示し、境界明瞭であり、通常は角張った形をしている。(図1に例示される。)
ここに記載される別のアプローチを用いても、未分化hBS細胞から基底細胞を得ることができる。未分化hBS細胞はインビトロで維持および増殖された。継代の4〜5日後に、37℃にて10〜15分間コラゲナーゼIV(200U/ml)とともにインキュベートすることによって、未分化hBS細胞コロニーをフィーダ層から分離した。細胞懸濁液を15mlの管に移し、細胞が沈殿した後に上清を除去した。コロニーは、ノックアウト(Knock Out)DMEMに20%のFBS、1%のペニシリン−ストレプトマイシン、1%のグルタマックス、0.5mmol/lのβ−メルカプトエタノールおよび1%の可欠アミノ酸(すべてインビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州より)を補った培地に再懸濁され、ピペットを用いて小さいクラスタ(0.2〜0.4mm)に機械的に解離された。この細胞懸濁液を96ウェルv底プレート(コーニング社(Corning incorportated)、ニューヨーク州、米国)に、ウェル当り約4〜6コロニーの濃度で分配し(200μl/ウェル)、400×gで5分間遠心分離した。次いでプレートを37℃にて6〜8日間インキュベートした。形成された3D構造を、培地を含有するゼラチン被覆皿(上述と同じ)に移した。プレート培養の4日後に、分化するhBS細胞の付着性のクラスタから基底細胞が現れる。培地は2日から3日目ごとに交換された。
基底細胞の特徴付け
基底細胞は、上述のとおり未分化のhBS細胞から得られた。基底細胞は分化培地(KO−DMEMに1mMのグルタマックス、0.1mMのβ−MeOH、1%のNEAA、1%のPeSTおよび20%のFBSが補われたもの)中で最高37日間培養された。細胞はさまざまな時点でPFA中で固定され、免疫組織化学によって評価された(ノアクソン(Noaksson)ら、Stem Cells、2005年)。用いられた抗原マーカは、ビメンチン、デスミン、α−サルコメリックアクチン、およびブラキウリであった。基底細胞はα−サルコメリックアクチンおよびブラキウリを発現したが(図9)、ビメンチンおよびデスミンは発現しなかった。用いられた細胞系はSA002、LOTAL002(継代26)、SA002.5、LOTBE002.5(継代32)およびSA461、LOTBF461(継代33)であった。
基底細胞のマイクロアレイ分析
細胞培養および分化
hBS細胞系SA002(セラーティス社、イェーテボリ、スウェーデン、http://www.cellartis.com)が増殖され、細胞は上記実施例1の強制凝集に記載されるとおりに基底細胞に分化された。光学顕微鏡法を用いて基底細胞のクラスタが同定され、幹細胞ツール(Stem Cell Tool)を用いて機械的に単離された。マイクロアレイ実験における比較の目的のために、未分化hBS細胞のサンプル、分化したhBS細胞の混合集団からのサンプル(すなわち基底細胞は存在しない)、およびhBS細胞に由来する自発的に収縮する心筋細胞様の細胞からのサンプル(ノールシュトローム(Norstrom)ら、2006年;ケハットら、2001年)が集められて分析に含められた。
1.未分化hBS細胞(継代33、36、37、39、および40)
2.基底細胞(継代22、23、26〜28、32、33、36、および37)
3.分化したhBSの混合集団(継代22、28、および32)
4.心筋細胞様の細胞1(継代23〜25、29、および35)
5.心筋細胞様の細胞2(継代39〜41)
Rneasy(登録商標)ミニキット(Mini Kit)(キアゲン(Qiagen))を用いて細胞から総RNAが抽出され、その後54,675転写産物を標的としたGeneChip(登録商標)ヒトゲノムU133プラス2.0(Human Genome U133 Plus 2.0)(アフィメトリクス社(Affymetrix Inc)、サンタクララ、カリフォルニア州、米国)を用いたマイクロアレイ実験に用いられた。RNAサンプルは2サイクルのインビトロ転写(in−vitro transcription:IVT)を用いて増幅された。RNAの品質および濃度は、それぞれアジレント(Agilent)2100バイオアナライザおよびナノドロップ(Nanodrop)ND−1000を用いて測定された。総RNAは、GeneChip(登録商標)発現3’−増幅試薬2サイクルcDNA合成キット(Expression 3’−Amplification Reagents Two−cycle cDNA synthesis kit)**の指示(アフィメトリクス社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国)に従って処理されることによって2本鎖cDNAが生成された。このcDNAは、製造者の仕様書に従ってビオチンを標的とするcRNAを生成するための鋳型として用いられた。15マイクログラムのビオチンラベルされたcRNAが、35塩基から200塩基の長さの鎖に断片化され、そのうちの10マイクログラムが、標準的手順を用いて、GeneChip(登録商標)ハイブリダイゼーションオーブン(Hybridisation oven)6400中でGeneChip(登録商標)ヒトゲノムU133プラス2.0(アフィメトリクス社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国)上に一晩ハイブリダイゼーションされた。アレイは洗浄され、次いでGeneChip(登録商標)フルイディクスステーション(Fluidics Station)450中で染色された。GeneChip(登録商標)スキャナ(Scanner)3000による走査が行なわれ、GeneChip(登録商標)オペレーティングソフトウェア(Operating Software)を用いて画像分析が行なわれた。Swegene MARC(http://www.swegene.org/microarray/index.html)が、品質管理、RNA処理およびアレイのハイブリダイゼーションを実施した。未分化hBS細胞、基底細胞、および分化したhBS細胞の混合集団を表わすサンプルがアレイにハイブリダイゼーションされた。アレイは2重にされた。付加的な比較の目的のために、未分化hBS細胞に由来する自発的に収縮する心筋細胞様の細胞を表わす2つのサンプルもマイクロアレイによって分析された。これらのサンプルはそれぞれCM1およびCM2と表示される。
基底細胞中でアップレギュレーションされる遺伝子のファミリーを定めるために、未分化hBSと基底細胞との間の遺伝子発現における倍数変化(fold change:FC)が算出された。すべてのサンプルにおいて「存在しない(Absent)」とMASソフトウェアにみなされた遺伝子は除去されて、さらなる分析には含まれなかった。サンプル中の17,436プローブが「存在しない」とみなされた。最初に、基底細胞に対するFC値が算出された。平均FC値<2の遺伝子はデータ組から除去され、残りの遺伝子のみがさらなる分析に対して考慮された。
1)基底細胞と未分化hBS細胞との間の遺伝子発現における倍数変化(FC)(FCBC)
2)混合分化hBS細胞と未分化hBS細胞との間の遺伝子発現におけるFC(FCMC)
3)心筋細胞様の細胞と未分化hBS細胞との間の遺伝子発現におけるFC(FCCM)。算出には心筋細胞様の細胞の2つの調製物の平均が用いられた。
1)基底細胞における発現値<100の遺伝子は除去された。
2)FCBC<3の遺伝子は除去された。
3)FCBC/FCMC比率<5の遺伝子は除去された。
4)FCBC/FCCM比率<3の遺伝子は除去された。
基底細胞においてアップレギュレーションされる遺伝子のプロモータ分析
表IIに列挙される遺伝子に対する共通の調節要素を同定するために、これらの遺伝子のプロモータ領域を調査した。これらの遺伝子に対応するRefSeqIDs(mRNA転写産物識別子)が集められて、デフォルト設定を用いたツールPromoSer(http://cagt.bu.edu/page/Promoser_about)に対する入力として用いられた(ハリース(Halees)ら、Nucleic Acids Res、2003年、31:p.3554−3559)。特定の品質基準を満たす、コード配列の1000bp上流および50bp下流のプロモータ配列は、140の転写産物に対して抽出できた。これらのプロモータ配列は、共調節される遺伝子の配列組における転写結合部位を見出すように設計されたウィーダ(Weeder)アルゴリズム(http://159.149.109.16:8080/weederWeb/)を用いて、共通モチーフに対して走査された(パヴェシ(Pavesi)ら、Nucleic Acids Res、2004年、32:W199−203)。このアルゴリズムによって同定された共通モチーフがヒトゲノムにおいて実験的に証明された結合部位と一致するかどうかをさらに調査するために、ウィーダによって同定されたモチーフを、ツールPatchTM(http://www.gene−regulation.com/cgi−bin/pub/programs/patch/bin/patch.cgi)を用いて、「スコア(score)」閾値を80に設定し、「許容ミスマッチ(allowed mismatch)」を1に設定して、Transfac(登録商標)データベースに対して検索した。ヒトゲノムと一致したモチーフのみが考慮され、表IIIにおいて報告される。表IIIの「結合因子列」に示されるとおり、我々は、Transfac(登録商標)を通じて同定された結合部位が公知の関連結合タンパク質を有するかどうかも調査した。
基底細胞の低温保存
未分化hBS細胞から得られ、視覚的観察下での機械的切開によって単離された基底細胞は、たとえばコラゲナーゼ、ディスパーゼ(dispase)またはトリプシンなどの酵素によって解離されてより小さなクラスタにされて、標準的な緩速凍結技術または閉ストロー中でのガラス化法(WO2004098285号)のいずれかを用いて低温保存されてもよい。
未分化hBS細胞からのMCP細胞の導出
未分化hBS細胞はインビトロで維持および増殖された。継代の4〜5日後に、幹細胞切断ツールを用いて未分化hBS細胞コロニーを手動で切開し、懸濁培養の分化培地(KO−DMEMに1mMのグルタマックス、0.1mMのβ−MeOH、1%のNEAA、1%のPeSTおよび20%のFBSを補ったもの)の中に置いた。細胞は懸濁液中で1〜6日間維持された後、ゼラチン被覆された組織培養皿に移されて、分化する細胞クラスタの付着ならびに細胞の継続的な増殖および分化が導かれた。プレート培養の4日後に、分化するhBS細胞の付着性のクラスタから細胞の単層が現れる。これらの細胞は、迷路に似た外観を有する特徴的な密集した網状組織中で生育するため、基底細胞の領域は光学顕微鏡法を用いて容易に区別できる。基底細胞の形態は原始内胚葉に類似しており、これらの細胞は上皮様である。加えて、個々の細胞は暗位相差像を示し、境界明瞭であり、通常は角張った形をしている。これらの基底細胞からMCP細胞のクラスタが現れた。MCP細胞は光学顕微鏡法を用いて視覚化でき、MCP細胞は小さく丸い明位相差像を示す細胞のクラスタとして生育し、基底細胞の単層の上にある緩く付着した細胞の塊として現れる(図2)。MCP細胞は核対細胞質の比率が高い。クラスタの典型的な特徴は、「糸に付いた風船」に似ていることである。MCP細胞クラスタは円形または細長い形のいずれであってもよい。用いられた細胞系はSA002、LOTAL002(継代34、42、48、55+ED3、65)、SA002.5、LOTBE002.5(継代26、42+ED10)、SA121、LOTBD121(継代146+ED10、146+ED11、146+ED18)、SA461、LOTBF461(継代22、33)、およびSA167、継代32であった。
分化したhBS細胞に由来するMCP細胞の単離
MCP細胞は、明確な形態を有する基底細胞型の上にある緩く付着した細胞クラスタとして現れた。MCP細胞クラスタは、幹細胞切断ツールを用いた機械的切開によって単離できた。加えて、さまざまな時点でMCP細胞のいくつかのより大きなクラスタが下にある細胞層から自発的に分離し、それらのクラスタは培地に浮かんでいるときに回収された。穏やかな酵素処理を用いてMCP細胞を回収することも可能である。MCP細胞は、PBSによる2つの洗浄液をプールすることによって集められ、洗浄液の1つは0.5mMのEDTA(1〜2分)を有し、洗浄液の1つはトリプシン−EDTA(2〜3分)を有し、洗浄は視覚的制御下で室温で行なわれた。用いられた細胞系はSA002、LOTAL002(継代34、42、48)、SA002.5、LOTBE002.5(継代26、42+ED10)、SA121、LOTBD121(継代156+ED10、156+ED11)、およびSA461、LOTBF461(継代22、33)であった。
フィーダ細胞上のMCP細胞の増殖
上述(強制凝集)のとおりMCP細胞が導出および単離された後、心臓間充織細胞またはEND2細胞上で培養されることによって、単離された前駆細胞の増殖および/または分化のための共培養系が作られた。心臓間充織を得るために、ヒト心臓生検外植片(dx auriculus)の副産物に由来する細胞が、DMEM/F12、1%のPeST、1mMのグルタマックスおよび10%のFBSを含有する培地中で10000細胞/cm2の密度で培養された。これらの細胞は心臓間充織細胞と呼ばれる。この細胞は、0.25%のトリプシン/EDTA処理によって約80%の集密度で継代された。
ミトコンドリア染色によるMCP細胞の同定および/または分離
MitoFluor(商標)緑色色素(インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)は、原形質膜を横切って拡散し、活動中のミトコンドリア内に蓄積してそこで蛍光性になることにより、生細胞のミトコンドリアを選択的に染色する。MCP細胞をこの色素に露出することによって、その染色パターンを調査した。
単離されたMCP細胞の再プレート培養
吸引されるかまたは手動で切開された、単離されたMCP細胞は、新しい組織培養皿に移された。MCP細胞クラスタは細胞の単層に付着して広がった。異なるクラスタからさまざまな形態の細胞を観察できる(図3)。いくつかのクラスタは、心筋細胞様の形態を有する自発的に収縮する産物の元となる。注目すべきことに、いくつかのクラスタは、元々MCP細胞を単離した基底細胞として説明される細胞型にも分化する(実施例1を参照)。培養されて数日以内に、新たなMCP細胞が基底細胞上にあるのが観察できる(図4)。このことは、MCP細胞の少なくとも細分画は、後に新たなMCP細胞の元となる基底細胞型に分化できることを示す。用いられた細胞系はSA002、LOTAL002(継代34、48、55+ED3)、SA002.5、LOTBE002.5(継代26、42+ED4)、SA121、LOTBD121(継代156+ED10、156+ED11)、およびSA461、LOTBF461(継代22、33)であった。
MCP細胞の分化
MCP細胞を単離し、移して新たな培養皿に再プレート培養できることによって、MCP細胞はさまざまな物質、成長因子および化合物が細胞分化に与える影響を試験するためのモデルを組立てるために大変適したものとなる。MCP細胞はさまざまな培地において再プレート培養できる。上述のとおり、MCP細胞は20%のFBSを含有する分化培地において再プレート培養できる。血清を含まない分化培地においてMCP細胞を再プレート培養することも可能である。血清含有培地においてはMCP細胞はさまざまな形態の単層に分化するが、血清の不在下ではより均質な分化が起こることが示され、MCP細胞クラスタのほとんどは図6に示されるような形態を獲得する。用いられた細胞系はSA002、LOTAL002(継代55+ED3)、SA002.5、LOTBE002.5(継代26)およびSA461、LOTBF461(継代33)であった。
B−27含有培地中でのMCP細胞の培養
未分化hBS細胞コロニー(細胞系SA461 LotBF461)は、ノックアウトDMEMと、1mMのグルタマックスと、0.1mMのβ−MeOHと、1%の可欠アミノ酸と、1%のPESTと、20%のFBSとを含有する分化培地中の懸濁培養に機械的に移された。2日後、分化しているhBS細胞クラスタがプレート培養され、IVF皿の分化培地中で維持された。2日目ごとに培地交換が行なわれ、このとき培地体積の半分が新鮮な培地に置換された。プレート培養の9日後(day 9)に基底細胞の領域が観察され、day 12にMCPがはっきりと基底細胞の上に出現した。day 19にMCPクラスタが機械的に単離され、新たなIVF皿の、B27(ノックアウトDMEM、1mMのグルタマックス、0.1mMのβ−MeOH、1%の可欠アミノ酸、1%のPEST、2%のB27)が補われた血清を含まない培地中に移された。細胞はこの培地中で10日間維持され、培地交換は2日目ごとに、体積の半分を新鮮な培地で置換することによって行なわれた。図10は、MCP細胞を移した後のday 1、2、4、7、および10における細胞の形態を示す。day 10にPFAを用いて細胞を固定し、ブラキウリに対して向けられた抗体を用いて染色した。B27培地において維持された細胞の形態に基づいて、MCP細胞は適切な培養条件において、元々MCP細胞を単離した基底細胞型の元となり得ることが示される。この結論は、図11に示されるブラキウリに対する陽性の免疫染色によってさらに強められる。
MCP細胞の心臓分化
自発的に収縮する細胞は、主に3つの異なるやり方でMCP細胞から得ることができる。
i)1つは、緩く付着したMCP細胞の自発的に収縮するクラスタが視覚的に同定されたときに、単純にそれを機械的切開によって単離することによるものである。
ii)第2に、自由に浮遊するMCP細胞(すなわち分離されたMCP細胞)の収縮するクラスタを吸引によって単離することもできる。これらの手順のいずれかによって単離された収縮する細胞クラスタは、新たな組織培養皿に移してプレート培養できる。それらのクラスタは付着して増殖および分化を続け、収縮性の能力を維持しながら少なくとも20日間インビトロで維持され得る。図5は、増殖しかつ自発的に収縮するクラスタの形態を例示している。
iii)最後に、鼓動していないMCP細胞を単離して新たな皿に移し、そこで付着して広がらせてもよい。数日後に、単離および再プレート培養されたMCP細胞クラスタの分画において、自発的な収縮が開始される。用いられた細胞系はSA002、LOTAL002(継代34、42、55+ED3)、SA121、LOTBD121(継代156+ED10、156+ED11)、およびSA461、LOTBF461(継代33)であった。
MCP細胞の生培養物の微速度撮影分析
未分化hBS細胞に由来する基底細胞およびMCP細胞(上述)は、その後微速度撮影された。細胞は分化培地で15日間培養され、微速度撮影研究が開始される前に培地がCGM培地に置換された。この実施例においては細胞系BE002.5、継代26が用いられた。培養物は培養チャンバ(37℃、5%のCO2および95%の湿度)に入れられ、72時間にわたり5分ごとに写真が撮影された。微速度撮影技術によって、MCP細胞クラスタの発端の研究およびそれを時間ごとに追うことが可能となる。MCP細胞クラスタは基底細胞から自発的に分離し、次いで同じ細胞に付着してプレート培養されてその形態を得た。MCP細胞は、他の細胞上に、または直接プラスチックに付着できる。
MCP細胞の特徴付け
上述のとおり、MCP細胞は分化するhBS細胞から得られた。単離されたMCP細胞クラスタは採取されてすぐに集められ、製造者の指示に従ったサイトスピンを用いたガラススライド上での免疫組織化学的評価のために、PFAを用いて固定された。各ガラススライド上に3〜4個のMCP細胞クラスタが集められ、各抗体染色に対して少なくとも3枚の個別のガラススライドが用いられた(下記を参照)。用いられた細胞系はSA002、LOTAL002(継代55+ED3)およびSA002.5、LOTBE002.5(継代26)であった。
リアルタイムRT PCRによるMCP細胞の特徴付け
MCP細胞は上述のとおり、実施例1の強制凝集によって未分化hBS細胞から得られた。MCP細胞クラスタはプレート培養の9〜18日後に、幹細胞切断ツールを用いて緩く付着した細胞クラスタを機械的に切開することによって、または自由に浮遊するクラスタを吸引することによって採取された。これら2つのタイプの細胞クラスタは、理論上はMCP細胞の異なる発達段階を表わし得る。MCP細胞は約50〜200細胞ずつ管に移され、氷冷PBSで洗浄された。細胞は400×gで10分間遠心分離された。上清は除去され、細胞ペレットは液体窒素中で凍結された。細胞は分析されるまでi−80℃にて保存された。前駆細胞の導出のために用いられた細胞系はSA002、LOTAL002(継代24、27および28)、マウス胚線維芽細胞(mEF)上で培養されたSA348(継代27)、およびヒト***線維芽細胞(hFF)上で培養されたE3−SA002(継代10)であった。未分化細胞(SA002、継代74、およびE3−SA002、継代10)、mEF上で培養された混合分化細胞(SA002、継代75、プレート培養後20日)およびhFF細胞は、前述のとおりに採取および処理されて、これらのサンプル中の遺伝子発現レベルがMCP細胞と比較された。
MCP細胞から分化した細胞の特徴付け
MCP細胞は、上述のとおり未分化hBS細胞から得られた。MCP細胞クラスタは単離され、新たな培養皿に移された。その後、MCP細胞は分化培地中で最大16日間培養中に維持された。細胞はさまざまな時点で固定され、免疫組織化学を用いて評価された(ノアクソンら、Stem Cells、2005年)。用いられた細胞系はSA002、LOTAL002(継代48)、SA002.5、LOTBE002.5(継代42+ED4)、SA121、LOTBD121(継代156+ED10、156+ED11)およびSA461、LOTBF461(継代22)であった。表Vは実験および得られた結果をまとめたものである。
MCP細胞の低温保存
上述のとおり導出および単離されたMCP細胞は、前に記載された閉ストローおよびガラス化法(WO2004098285号)を用いて低温保存できる。加えて、伝統的な緩速凍結も選択肢となり得る。
バイオリアクタ培養
MCP細胞および基底細胞は3−D空間で生育されてもよく、その空間はたとえば人工中空線維キャピラリ膜などで区画分けされてもよい。この系は細胞がキャピラリの間でより大きな細胞の固まりに生育することを可能にし、培地および酸素などの気体の灌流によって最適化された自然な環境を提供する。より大量の細胞(最大10^11細胞)を生成するため、および細胞の機能的特性の可能な維持を支持するために、閉バイオリアクタ系が開発されてもよい。酵素灌流を介した細胞単離によって、次いで閉GMP系におけるスケールアップが可能になる。次いで、たとえば膜抗原発現などに基づくたとえばFACソーティングなどを用いて、または密度勾配培地および遠心分離を用いて、細胞精製が行なわれてもよい。
分離技術
MCP細胞および基底細胞は、表面に発現されるマーカに対する抗原検出およびその後のFACソーティングを用いて精製されてもよい。抗原に基づくソーティングの別の代替案は、培養皿を特定の抗体で被覆し、培地中の細胞をその皿に加えて、正しい抗原を有する細胞を結合させ、残りの細胞を捨てて、結合した細胞を採取してさらに使用するというものである。この方法はときにイムノパニング(immunopanning)と呼ばれ、陰性選択にも用いることができる。すなわち、必要としない細胞型を被覆抗原に結合させて、上清の必要なMCP細胞または基底細胞を有する培地を取るというものである。このアプローチは、いわゆるMACソーティングと呼ばれるような磁気ビーズに対して、またはカラムクロマトグラフィを用いて同様に行なわれてもよい。特定の特徴を有するMCP細胞または基底細胞などの細胞を精製するさらに別の方法は、遠心分離下の浮遊密度またはサイズに基づく細胞分離のための密度勾配培地の使用を含む。
再生医療におけるMCP細胞および基底細胞の使用
MCP細胞および基底細胞はどちらも多能性を有し、自発的に収縮する心筋細胞様の細胞に分化する能力を有することから、再生医療において非常に有用であることが明らかになった。特定的には、MCP細胞を心臓関連の疾患の処置に用いることが考えられる。心筋梗塞になった心臓の機能を回復させるためには、心筋細胞および新たな血管を交換する必要がある。臨床的に適合したhBS細胞系が入手可能なときは、これらの細胞をMCP細胞または基底細胞の導出に用いて、後にその細胞を移植してヒトにおける使用の可能性を評価することが可能である。その合間に動物モデルにおいて原理の証明(proof−of−principle)の実験を行なうことができる。SCIDマウスにおける心筋梗塞の誘導に対する標準モデルを用いて(例、低温損傷(cryo−damage)またはLADライゲーション)、MCP細胞または基底細胞が損傷部位に注入されてもよい。その後マウスを短期間(最長2〜3週間)または長期間(>3週間)モニタし、標準的技術を用いて心臓の改善を測定する。実験の最後にマウスを殺して心臓を回収し、その後組織学的評価を行なう。ヒト特異的抗原またはDNAに対して向けられた抗体またはプローブを用いて、マウス心臓におけるヒト細胞の植付を測定できる。
再生医療、細胞療法におけるMCP細胞および基底細胞の使用
MCP細胞および基底細胞はさらに、たとえば壊死心筋、アポトーシス心筋、損傷した心筋、機能不全の心筋、または形態的に異常な心筋などに関連する障害を処置するために用いられてもよい。こうした障害は、虚血性心疾患、心筋梗塞、リウマチ性心疾患、心内膜炎、自己免疫性心疾患、心臓弁膜疾患、先天性の心臓障害、心臓リズム異常、および心臓機能不全を含むがそれに限定されない。
薬物の発見におけるMCP細胞および基底細胞の使用
薬物の発見の適用におけるMCP細胞または基底細胞の使用は広範囲であってもよく、細胞の特徴に基づいている。ここでは心臓再生に影響をもたらす可能性のある化合物を発見するための適用を記載する。MCP細胞または基底細胞はhBS細胞から導出および単離され、マルチウェル形式の培養皿(例、96ウェルまたは384ウェルプレート)に移されてもよい。次いで、ライブラリからの化合物が、定められた培地(選択的に血清を含まない)の存在下で細胞に加えられる。細胞は、異なる濃度の化合物の存在下でさまざまな時点まで維持されてもよい。化合物の影響の可能性は、細胞の分化、増殖および機能性を測定することによってモニタできる。特定的には、遺伝子発現分析が用いられてもよく、典型的に心筋再生に関連する遺伝子の発現が測定されてもよい。加えて、レポータ遺伝子構成が作られて、たとえば蛍光ラベルされたレポータタンパク質が容易にモニタできるようにされてもよい。
毒性試験におけるMCP細胞および基底細胞の使用
MCP細胞および基底細胞は、上述のとおりhBS細胞から得られ、MEA(マルチチャンネルシステムズ(Multichannel Systems)、ドイツ)に細胞を蒔く前または後に、自発的に収縮する心筋細胞様の細胞にさらに分化される。MEAに物質を直接加えて異なる時点まで細胞をインキュベートすることによって、さまざまな化合物または化学物質の影響を定めることができる。MEAシステムを用いて細胞外電位を定めることができ、培養物中で非侵襲的に有害な影響を測定できる。このことは、物質の急性の影響および長期の影響の両方の研究を可能にする。プラットホームのさらなる改善点は、複数のサンプルを同時に実行できるという主な利点とともに、QTスクリーンシステム(マルチチャンネルシステムズ、ドイツ)の96ウェルプレートに直接細胞を接種することであろう。
心臓発生を調節する分子機構の研究におけるMCP細胞および基底細胞の使用
基礎研究におけるMCP細胞および基底細胞両方の使用は広範囲であってもよく、それは細胞の多能性と、心筋細胞に似た自発的に収縮する細胞を形成できるという本質的な能力とに基づいている。たとえば、MCP細胞はhBS細胞から導出および単離され、マルチウェル形式の培養皿に移され得る。細胞は異なる培養条件でさまざまな時点まで維持されてもよい。心筋再生に対する影響の可能性は、MCP細胞および/または基底細胞の分化、増殖および機能性を測定することによってモニタできる。特定的には、遺伝子発現分析を用いることができ、典型的に心筋再生に関連する遺伝子の発現を測定できる。加えて、レポータ遺伝子構成が作られて、たとえば蛍光ラベルされたレポータタンパク質が容易にモニタできるようにされてもよい。加えて、siRNA構成および関連のトランスフェクション技術が用いられて、心筋再生プログラムに対する特定の遺伝子の影響が研究されてもよい。
・ハインズ(Heins)N、イングルンド(Englund)MCO、シェーブロム(Sjoblom)Cら、「ヒト胚幹細胞の導出、特徴付けおよび分化(Derivation, characterization, and differentiation of human embryonic stem cells)。」STEM CELLS、2004年;22:p.367−76。
MCP細胞
1.ヒト胚盤胞由来幹(hBS)細胞に由来する細胞集団であって、多能性心臓前駆(MCP)細胞を含む、細胞集団。
i)細胞の少なくとも1%は未分化細胞に対する1つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはSSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、およびOct−4からなる群より選択される、
ii)細胞の少なくとも1%は、たとえばネスチンまたはGFAPなどの神経系マーカの1つまたはそれ以上のタンパク質発現を示さない、
iii)細胞の少なくとも1%は、たとえばブラキウリ、ビメンチンまたはデスミンなどの中胚葉マーカの1つまたはそれ以上のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、および
iv)細胞の少なくとも1%は、たとえばislet−1、cTNI、cTNT、Nkx2.5、アルファMHCまたはコネキシン43などの1つまたはそれ以上の初期段階心臓マーカのタンパク質発現を示さない、
のうち少なくとも1つを有する、項目1に記載の細胞集団。
1.小さく丸い明位相差像を示す細胞のクラスタとして生育し、
2.円形または細長い形のクラスタを形成し、そのクラスタは緩く付着した細胞の塊として現れ、基底細胞上に生育されるときには基底細胞の単層の上にあり、
3.比較的高い核対細胞質の比率を有し、および/または
4.糸に付いた風船の形で現れ、
それらの細胞は以下の特徴:
i)細胞の少なくとも1%は未分化細胞に対する1つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはSSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、およびOct−4からなる群より選択される、
ii)細胞の少なくとも1%は、たとえばネスチンまたはGFAPなどの神経系マーカの1つまたはそれ以上のタンパク質発現を示さない、
iii)細胞の少なくとも1%は、たとえばブラキウリ、ビメンチンまたはデスミンなどの中胚葉マーカの1つまたはそれ以上のタンパク質および/または遺伝子発現を示す、および
iv)細胞の少なくとも1%は、たとえばislet−1、cTNI、cTNT、Nkx2.5、アルファMHCまたはコネキシン43などの1つまたはそれ以上の初期段階心臓マーカのタンパク質および/または遺伝子発現を示さない、
のうち少なくとも1つを有する、項目1から7のいずれかに記載の細胞集団。
28.少なくとも5日の期間にわたり分化培地を用いてプレート培養による分化を受けた後に、以下の特徴:
i)細胞の少なくとも1%は、たとえばブラキウリ、ビメンチンまたはデスミンなどの1つまたはそれ以上の中胚葉マーカのタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
ii)細胞の少なくとも1%は、たとえばislet−1、GATA−4、Nkx2.5、cTNI、cTNTまたはコネキシン43などの1つまたはそれ以上の心臓マーカのタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
iii)細胞の少なくとも1%は未分化幹細胞に対する1つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはSSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、およびOct−4からなる群より選択される、
のうち少なくとも1つを有する、項目1−27のいずれかに記載の細胞集団。
39.ヒト胚盤胞由来幹(hBS)細胞に由来する細胞集団であって、基底細胞を含む、細胞集団。
i)細胞の少なくとも1%はブラキウリのタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
ii)細胞の少なくとも1%はアルファサルコメリックアクチンのタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
iii)細胞の少なくとも1%はビメンチンのタンパク質発現を示さない、および
iv)細胞の少なくとも1%はデスミンのタンパク質発現を示さない、
v)細胞の少なくとも1%は未分化細胞に対する1つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはSSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、およびOct−4からなる群より選択される、
のうち少なくとも1つを有する、項目39に記載の細胞集団。
1.原始内胚葉に似た形態を有し、
2.上皮様であり、
3.光学顕微鏡法によって明らかにされるとおりに暗位相差像を示し、かつ境界明瞭であり、および/または
4.光学顕微鏡法によって明らかにされるとおりの角張った形を有し、
さらに以下の特徴:
i)細胞の少なくとも1%はブラキウリのタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
ii)細胞の少なくとも1%はアルファサルコメリックアクチンのタンパク質および/または遺伝子発現を示す、
iii)細胞の少なくとも1%はビメンチンのタンパク質発現を示さない、および
iv)細胞の少なくとも1%はデスミンのタンパク質発現を示さない、
v)細胞の少なくとも1%は未分化細胞に対する1つまたはそれ以上のマーカの抗原発現を示さず、そのマーカはSSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、およびOct−4からなる群より選択される、
のうち少なくとも1つを有する、項目39−43のいずれかに記載の細胞集団。
80.項目39−63のいずれかにおいて定義される細胞集団を調製する方法であって、
i)約1日から約10日、たとえば約1日から約6日などの間、懸濁培養中の分化培地において未分化hBS細胞の1つまたはそれ以上のコロニー切片またはコロニーを培養するステップと、
ii)こうして培養された細胞を続けて増殖および分化するための培養容器に移すステップと、
iii)光学顕微鏡における形態的基準および/または本明細書において定義される関連マーカの同定によって基底細胞を同定するステップと、
iv)任意には、こうして得られた基底細胞を単離するステップと、
v)任意には、ステップii)−iv)を繰返すステップと
を含む、方法。
vi)MCP細胞の出現が光学顕微鏡および/または本明細書において定義される関連マーカの同定によって明らかにされるまで基底細胞を培養するステップと、
vii)こうして得られたMCP細胞を単離するステップと
を含む、方法。
を含むことによって、分化したMCP細胞を得る方法。
95.i)項目1−63のいずれかにおいて定義される細胞集団と、ii)1つまたはそれ以上の成熟因子および/または成熟培地と、iii)任意には、使用のための指示書とを含む、キット。
i)未分化hBS細胞に対するマーカ、デスミン、アルファサルコメリックアクチン、ブラキウリ、ネスチン、GFAP、Islet−1、Nkx2.5、GATA−4、cTnI、cTnT、α−MHC、およびコネキシン43からなる群より選択される発現マーカをコードする遺伝子のうち少なくとも3つ、たとえば少なくとも4つまたは少なくとも5つに対するPCRプライマと、
ii)使用者のマニュアルと
を含む、項目98に記載のキット。
i)未分化hBS細胞に対するマーカ、デスミン、アルファサルコメリックアクチン、ブラキウリ、ネスチン、GFAP、Islet−1、Nkx2.5、GATA−4、cTnI、cTnT、α−MHC、およびコネキシン43からなる群より選択される発現マーカ抗原のうち少なくとも3つ、たとえば少なくとも4つまたは少なくとも5つに対する抗体と、
ii)使用者のマニュアルと
を含む、項目98または99に記載のキット。
i)基底細胞および/またはMCP細胞と、
ii)任意には、インビトロおよび/またはインビボで分化を起こすための因子と、
iii)細胞を患者に投与するためのツール、または細胞を、たとえばすぐに使用できる注射器に入れるなど投与可能な形にしたものと
を含む、キット。
Claims (10)
- ヒト胚盤胞由来幹(hBS)細胞に由来する多能性非収縮心臓前駆細胞を含む細胞集団であって、前記多能性非収縮心臓前駆細胞が
a)小さく丸い明位相差像を示す細胞のクラスタとして生育し、該クラスタは糸に付いた風船の形で現れ、かつ
b)それらの細胞は以下の4つの特徴
i)細胞は未分化細胞であるSSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、およびOct−4に対するマーカについて抗原発現を示さない、
ii)細胞は、ネスチンのタンパク質発現を示さない、
iii)細胞は、ビメンチンの中胚葉マーカのタンパク質発現を示すが、中胚葉マーカであるデスミンおよびα−サルコメア・アクチンのタンパク質発現を示さない、および
iv)細胞は、islet−1の初期段階心臓マーカのタンパク質発現を示さない、
をすべて有する細胞集団。 - 前記多能性非収縮心臓前駆細胞がFlk−1の遺伝子および/またはタンパク質発現を示す、
請求項1に記載の細胞集団。 - 再生医療のための薬剤の製造を目的とする、
請求項1あるいは2に記載の細胞集団。 - 心臓疾患の予防および/または処置のための医薬製品の製造を目的とする、薬剤のスクリーニング、心臓細胞型に影響する可能性のある薬物を研究するためのインビトロのモデル、初期心臓発生などの心臓発生を研究するためのインビトロのモデル、ヒトの心臓変性障害を研究するためのインビトロのモデルのための、
請求項1あるいは2に記載の細胞集団の使用方法。 - 心臓疾患の予防および/または処置のための医薬製品の製造を目的とする、インビトロの心臓毒性試験のための、
請求項1あるいは2に記載の細胞集団の使用方法。 - 心臓疾患の予防および/または処置のための医薬製品の製造を目的として、心筋様細胞を取得、または心筋様細胞へと成熟する過程を研究するための、
請求項1あるいは2に記載の細胞集団から1つまたはそれ以上の基底細胞の使用方法。 - 分化した多能性非収縮心臓前駆細胞を得るための方法であって、
1つの分化因子、および/または分化培地の存在する表面上に請求項1あるいは2に記載の多能性非収縮心臓前駆細胞を蒔くこと
を含む、方法。 - i)請求項1あるいは2に記載の細胞集団と、ii)1つまたはそれ以上の成熟因子および/または成熟培地とを含む、キット。
- 再生医療のためのキットであって、
i)請求項1あるいは2に記載の細胞集団と、
ii)細胞を患者に投与するためのツール、または細胞を、すぐに使用できる注射器に入れ投与可能な形にしたものと
を含む、キット。 - インビトロおよび/またはインビボで分化を起こすための因子をさらに含む請求項9に記載のキット。
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