JP5747432B2 - ２置換修飾シクロデキストリンおよびこれを用いた核酸検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、２置換修飾シクロデキストリンおよびこれを用いた核酸検出方法に関する。

近年、ゲノムシークエンシングの進展により、各生物のゲノムの全塩基配列が明らかにされつつある中、この結果を有効に利用する技術が望まれている。
核酸マイクロアレイは、複数の遺伝子を同時に解析できる技術であり、塩基配列を決定するための方法だけではなく、遺伝子の発現量や多型などを効率よく調べる方法として開発され、テーラーメイド医療、菌類などの生物学的分類の特定および疾病の診断などへの技術開発が展開されている。

一般に、テーラーメイド医療、および生物学的分類または変異体の同定に用いられる核酸マイクロアレイは、特定の塩基配列を定性的に検出できれば十分であるため、試験紙のように安価で、使い捨て可能なものが求められている。
例えば、特許文献１には、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）単離物の同定方法に用いる核酸マイクロアレイとして、ラインプローブ（ＬｉＰＡ：Line Probe Assay，イノジジェネティクス社登録商標）法が開示されている。
このアッセイは、ポリアミド膜片上に平行線として核酸プローブが固定されたものである。

このようなアッセイ上での核酸の検出は、主としてＲＩ標識法、蛍光標識法および酵素発色法などを用いて行われる。
これらの方法の中でも、特に、酵素発色法は、安価で簡便な方法であるとして有効とされている。
しかし、この酵素発色法を用いた場合であっても、プライマーをビオチンで修飾する必要があるため、その分コストが高くなるという問題がある。
さらに、酵素発色法では、ストレプトアビジンで修飾したアルカリホスファターゼ、およびストレプトアビジンに対する基質を作用・洗浄する必要があり、検出工程が極めて煩雑となるという問題もある。

一方、高感度かつ簡便な検出方法として、ハイブリダイズした核酸の塩基のπ電子スタッキング構造に作用するインターカレーターに関する研究が盛んになされている（非特許文献１参照）。
しかし、非特許文献１に開示されたインターカレーターは、水に難溶であるためにハイブリダイズした２本鎖の核酸に作用し得るだけの濃度調製が極めて困難であった。また、試薬の保存性が悪いため、工業的手法としては適していなかった。

以上のような問題点を解決する新たな手法として、本発明者らは、水に可溶で、ハイブリダイズした２本鎖の核酸に選択的に吸着し得るモノ置換修飾シクロデキストリンを見出し、既にこれを報告している（特許文献２参照）。
このモノ置換修飾デキストリンを用いることで、１本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡとの間に蛍光強度の違いが生じるため、それを検出することで、それらの判別を安価かつ容易に行えるようになる。
しかし、特許文献２の手法では、１本鎖ＤＮＡの場合でも蛍光強度に変化が生じてしまうため、１本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡとを完全かつ高精度に判別するという点においては不十分であった。

特表平７−５０３１４３号公報 国際公開第２００７／１０５７８６号パンフレット

Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．１６，２００５， Ｐ１５４−１５７

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、２本鎖ＤＮＡと選択的に相互作用する２置換修飾シクロデキストリン、および１本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡとをより高精度に判別し得る核酸検出方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、シクロデキストリンに、特定の中性の２価の有機基をリンカーとして２つの蛍光性発色団を結合させてなる２置換修飾シクロデキストリンが、２本鎖ＤＮＡと選択的に相互作用すること、およびこの化合物を用いることで、上述した従来法よりも、高精度に１本鎖ＤＮＡと２本鎖ＤＮＡとを判別し得ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、
１． 式（１）で示されることを特徴とする２置換修飾シクロデキストリン、

（式中、ＣｙＤは、α−、β−またはγ−シクロデキストリン骨格を、Ａ¹およびＡ²は、互いに独立して、エーテル結合またはチオエーテル結合を含んでいてもよい炭素数１〜１０のアルキレン基を、Ｂ¹およびＢ²は、互いに独立して、単結合、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を、Ｃ¹およびＣ²は、互いに独立して、エーテル結合を含む炭素数１〜２０のアルキレン基を、Ｘ¹およびＸ²は、互いに独立して、ピレン、ナフタレン、ダンシルグリシン、アントラセンおよびローダミンＢから選ばれる少なくとも１種の蛍光性発色団を表す。）
２． 前記蛍光性発色団が、ピレンおよびナフタレンから選ばれる少なくとも１種である１の２置換修飾シクロデキストリン、
３． 式（２）で示される１の２置換修飾シクロデキストリン、

（式中、ＣｙＤ、Ａ¹、Ａ²、Ｂ¹、Ｂ²、Ｃ¹およびＣ²は、前記と同じ意味を表す。）
４． 式（３）で示される３の２置換修飾シクロデキストリン、

（式中、ＣｙＤ、Ｃ¹およびＣ²は、前記と同じ意味を表す。）
５． 式（４）で示される４の２置換修飾シクロデキストリン、

（式中、ｍおよびｎは１〜１０の整数を表し、ｍ＋ｎ≦１９を満足し、ｏおよびｐは１〜１０の整数を表し、ｏ＋ｐ≦１９を満足する。ＣｙＤは、前記と同じ意味を表す。）
６． 式（５）で示される５の２置換修飾シクロデキストリン、

（式中、ＣｙＤは、前記と同じ意味を表す。）
７． 前記ＣｙＤが、γ−シクロデキストリン骨格である１〜６のいずれかの２置換修飾シクロデキストリン、
８． 前記γ−シクロデキストリン骨格を構成する８個のＤ−グルコースの任意の１つをグルコースＡとし、その隣に結合するグルコースから順にグルコースＢ〜Ｈとした場合に、グルコースＡとグルコースＥとがそれぞれ置換されているＡＥ２置換体である７の２置換修飾シクロデキストリン、
９． １〜８のいずれかの２置換修飾シクロデキストリンを用いることを特徴とする核酸検出方法
を提供する。

本発明の２置換修飾シクロデキストリンは、２本鎖ＤＮＡと選択的に相互作用し、その結果、蛍光スペクトルの増大が観察される。
このため、本発明の２置換修飾シクロデキストリンを用いることで、従来法に比べ、高精度かつ簡便に２本鎖ＤＮＡと１本鎖ＤＮＡとを識別することができるようになる。
このような特徴を有する本発明の２置換修飾シクロデキストリンは、ＤＮＡチップ用の試薬など、核酸検出用の標識として好適に利用できる。

実施例１で得られた２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤとｄｓＤＮＡとの混合溶液の蛍光スペクトルを示す図である。 実施例１で得られた２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤとｓｓＤＮＡとの混合溶液の蛍光スペクトルを示す図である。 実施例１で得られた２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤのｄｓＤＮＡへの第１のインターカレーション推定図である。 実施例１で得られた２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤのｄｓＤＮＡへの第２のインターカレーション推定図である。 実施例１で得られた２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤに、アダマンタンカルボン酸ナトリウムを添加した場合のＣＤスペクトルを示す図である。

以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
本発明に係る２置換修飾シクロデキストリンは、式（１）で表されるものである。

式（１）において、ＣｙＤは、α−、β−またはγ−シクロデキストリン骨格を意味する。
シクロデキストリンは、Ｄ−グルコースが環状に１，４−α−グリコシド結合した化合物であり、これを構成するグルコース数の違いによって、α−シクロデキストリン（グルコース６個）、β−シクロデキストリン（グルコース７個）、γ−シクロデキストリン（グルコース８個）に分類され、本発明の２置換修飾シクロデキストリンには、α−、β−、γ−のいずれも使用することができるが、特に、γ−シクロデキストリン骨格が好適である。
また、２置換シクロデキストリンでは、これを構成するグルコース上における２つの置換基の結合位置によって各種位置異性体が存在し、例えば、２置換γ−シクロデキストリンでは、下記に示されるように、ＡＢ体、ＡＣ体、ＡＤ体、ＡＥ体の各２置換体が存在するが、本発明においては、グルコースＡとグルコースＥとがそれぞれ置換されているＡＥ体が好適である。
なお、置換基の結合部位は、グルコースの１級水酸基、２級水酸基のいずれでもよいが、製造コストの観点から、１級水酸基が好ましい。

Ａ¹およびＡ²は、互いに独立して、エーテル結合またはチオエーテル結合を含んでいてもよい炭素数１〜１０のアルキレン基を表すが、特に、炭素数１〜５が好ましい。
その具体例としては、−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−、−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−、−（ＣＨ₂）₃−Ｏ−（ＣＨ₂）₃−、−（ＣＨ₂）₄−Ｏ−（ＣＨ₂）₄−、−（ＣＨ₂）₅−Ｏ−（ＣＨ₂）₅−、−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ₂−、−（ＣＨ₂）₂−Ｓ−（ＣＨ₂）₂−、−（ＣＨ₂）₃−Ｓ−（ＣＨ₂）₃−、−（ＣＨ₂）₄−Ｓ−（ＣＨ₂）₄−、−（ＣＨ₂）₅−Ｓ−（ＣＨ₂）₅−等が挙げられる。

Ｂ¹およびＢ²は、互いに独立して、単結合、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を表すが、特に、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−が好ましい。
なお、単結合の場合は、Ａ¹およびＣ¹、Ａ²およびＣ²が直接結合することになる。

Ｃ¹およびＣ²は、互いに独立して、エーテル結合を含む炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、好ましくは、エーテル結合を含む炭素数２〜１０のアルキレン基であり、より好ましくは、エーテル結合を含む炭素数２〜６のアルキレン基である。
Ｃ¹の具体例としては、−ＣＨ₂−_o（Ｏ_2pＨ_pＣ）−（ｏおよびｐは１〜１０の整数を表し、ｏ＋ｐ≦１９を満足する。）が挙げられるが、特にｐ＝１〜５、ｏ＝１〜５のものが好適である。
Ｃ²の具体例としては、−（Ｃ_nＨ_2nＯ）_m−ＣＨ₂−（ｍおよびｎは１〜１０の整数を表し、ｍ＋ｎ≦１９を満足する。）が挙げられるが、特にｍ＝１〜５、ｎ＝１〜５のものが好適である。

Ｘ¹およびＸ²は、互いに独立して、蛍光性発色団を表す。この蛍光性発色団としては、蛍光性の置換基であれば特に限定されるものではないが、本発明においては、中性の発色団が好ましい。
発色団の具体例としては、ピレン、ナフタレン、ダンシルグリシン、アントラセン、ローダミンＢ等が挙げられ、これらの中でもエキシマを形成し得るピレン、ナフタレンが好ましく、ピレンがより好ましい。
置換位置を含めた発色団の具体例としては、下記式で示されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

好適な２置換修飾デキストリンとしては、下記式（３）〜（５）で示されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

（式中、ＣｙＤ、Ｃ¹およびＣ²は、上記と同じ意味を表す。ｍおよびｎは１〜１０の整数を表し、ｍ＋ｎ≦１９を満足し、ｏおよびｐは１〜１０の整数を表し、ｏ＋ｐ≦１９を満足する。）

本発明の２置換修飾デキストリンは、公知の有機合成反応を用いて製造することができ、その製造法に制限はない。
デキストリンの１級水酸基への修飾は、例えば、下記スキームに示されるように、これをトシル化することで行うことができる。

この場合、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（ＴｓＣｌ）の使用量は、ＣｙＤ１当量に対して、２〜１０当量程度である。
反応溶媒としては、アミン溶媒が好適であり、例えば、ピリジン等を用いることができる。
反応温度は、０〜５０℃程度であり、反応時間は、０．１〜１０時間程度である。
反応終了後は、水酸化ナトリウム等の塩基で中和し、アセトン等の有機溶媒によって沈殿させることで粗生成物が得られる。
得られた粗生成物は、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー法等によって精製することができる。

上記トシル化されたＣｙＤは、トシル基の脱離性を利用した置換反応によって、所望の側鎖を導入することができる。
例えば、下記スキームに示されるように、メルカプト酢酸と反応させることで、チオ酢酸で置換されたＣｙＤを得ることができる。

この場合、メルカプト酢酸の使用量は、トシル化ＣｙＤ１当量に対して、２〜１０当量程度とすることができる。
反応の際には塩基を用いることが好ましく、その具体例としては、炭酸ナトリウム等が挙げられる。塩基の使用量は、ＣｙＤ１当量に対して、２〜２０当量程度とすることができる。
反応溶媒は、特に限定されるものではないが、ＤＭＦが好ましい。
反応温度は、０〜１００℃程度であるが、５０〜１００℃程度が好ましい。
反応時間は、１〜２４０時間程度である。
反応終了後は、溶媒留去後、塩酸等で中和し、アセトン等の有機溶媒で沈殿させることで、粗生成物が得られる。
得られた粗生成物は、ゲル濾過法等によって精製することができる。

上記チオ酢酸基を有するＣｙＤは、発色団を有するアミンやアルコールと縮合させ、アミド結合やエステル結合を形成させることで、発色団を有するＣｙＤとすることができる。
例えば、下記スキームに示されるように、８−（１−ピレンメトキシ）−３，６−（ジオキサ）オクタ−１−アミンと縮合させてアミド結合を形成させることで、発色団としてピレンを有するＣｙＤが得られる。

この場合、発色団を有するアミンの使用量は、ＣｙＤ１当量に対して、２〜１０当量程度とすることができるが、２〜５当量程度が好ましい。
また、反応の際には、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等の公知の脱水縮合剤を用いることもできる。縮合剤の使用量は、ＣｙＤに対して、２〜１０当量程度とすることができる。
反応溶媒としては、特に限定されるものではないが、ＤＭＦを用いることが好ましい。
反応温度は、０〜１００℃程度である。
反応時間は、１〜２４０時間程度である。
反応終了後は、溶媒を留去し、アセトン等の有機溶媒で沈殿させることで、粗生成物が得られる。
得られた粗生成物は、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー法等によって精製することができる。

なお、発色団を有するアミンの合成法としても、特に限定されるものではなく、例えば、上記８−（１−ピレンメトキシ）−３，６−（ジオキサ）オクタ−１−アミンは、１−ピレンメタノールを、塩基の存在下で１，２−ビス（２−クロロエトキシ）エタンと反応させて得られた８−（１−ピレンメトキシ）−３，６−（ジオキサ）オクタ−１−クロライドをフタルイミド化し、さらにこれを還元する方法などによって製造することができる。
また、以上の説明では、ＣｙＤ側のカルボキシル基と、発色団側のアミノ基とを反応させていたが、この逆でもよい。
さらに、発色団を有するアルコールを用いる場合は、酸や塩基を触媒とした公知のエステル化法を用いればよい。

以上説明した本発明の２置換修飾シクロデキストリンは、２本鎖ＤＮＡと選択的に相互作用し、その蛍光スペクトルが増大されるため、２本鎖ＤＮＡと１本鎖ＤＮＡとを高精度に識別することができる。
したがって、本発明の２置換修飾デキストリンは、ＤＮＡチップ用試薬等の核酸検出のための標識として好適に用いることができ、例えば、基材上に検体核酸または核酸プローブを固定化してアレイを作製する第１工程と、この第１工程で得られたアレイを用いて検体核酸および核酸プローブをハイブリダイズして２本鎖核酸を調製する第２工程と、この第２工程で得られた２本鎖核酸を、本発明の２置換修飾シクロデキストリンで処理する第３工程と、を備えるような核酸検出方法などに好適に用いることができる。

ここで、検体核酸とは、検出対象となる核酸を、核酸プローブとは、検体核酸とハイブリダイズし得る核酸をいう。
核酸プローブは、合成されたＤＮＡを用いても、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを用いてもよい。ＤＮＡの合成は、核酸自動合成機によって行うことができる。
核酸プローブの塩基配列は、検体核酸とハイブリダイズし得るものであれば、検体核酸の塩基配列の完全相補配列に対して数塩基が挿入された配列や、完全相補配列の数塩基が変異および欠失した配列であってもよいが、検出精度を考慮すると、完全相補配列が望ましい。

核酸プローブの塩基数は、検出する塩基配列によって変わるものであるため、一概に規定することはできないが、生体から抽出されたゲノムＤＮＡの一塩基レベルの変異を検出することを目的とする場合には、約１０〜３０塩基、特に、１２〜２６塩基が好適である。

一方、検体核酸は、血液、唾液、毛髪などの生体試料から抽出されたゲノムＤＮＡを用いることができる。抽出法としては、例えば、フェノール抽出法、グアニジンチオシアネート抽出法、バナジルリボヌクレオシド複合抽出法などが挙げられる。
また、ゲノムＤＮＡは、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法などの公知の方法によって、検出すべき特定の塩基配列が増幅されたものであってもよい。

上記基材としては、検体核酸または核酸プローブ（以下、併せて核酸ということもある）を固定化し得る材料であればよく、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ニトロセルロース等の有機材料；ガラス、シリカ等の無機材料；金、銀、銅等の金属材料などが挙げられる。これらの中でも、成形加工が容易であることから有機材料が好ましく、特に、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル、ポリアミドが好ましい。
基材の形状も任意であり、板状、フィルム状、チューブ状等適宜な形状とすることができる。

核酸を基材に固定化する手法は、物理的手法でも化学的手法でもよい。
物理的手法としては、核酸溶液を基材にスポッティングする方法が挙げられる。スポッティング法としては、ディスペンサなどを用いた押出法、クーロン力を用いた吸引法、インクジェット法などが挙げられる。
この場合、核酸プローブに無関係な塩基配列を付加し、ＵＶ照射によって基材への核酸プローブへの固定化率を向上させてもよい。核酸プローブに無関係な塩基配列としては、ポリアデニン、ポリシトシン、ポリチミン、ポリグアニン等などが挙げられる。

また、基材を表面処理して、核酸の固定化率を向上させてもよい。
表面処理法としては、ポリリジンなどのポリカチオン性の高分子で基材表面を被覆する方法、シランカップリング剤で無機基材表面を処理する方法、アミノ基を有するチオールやジスルフィド化合物で金属基材表面を処理する方法などが挙げられる。

一方、化学的手法としては、核酸プローブを、基材と共有結合可能な官能基で修飾する方法や、核酸プローブおよび基材の双方を、それぞれ共有結合可能な官能基で修飾する方法などが挙げられる。
その具体例としては、（１）核酸プローブを、トリメトキシシラン、トリエトキシシラン等のシランカップリング反応が可能な官能基で修飾する方法、（２）基材を、アミノエトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤で処理し、一方、核酸プローブをカルボキシル基で修飾する方法などが挙げられる。

なお、核酸を固定化する前に、核酸の固定化量を増大させる目的で、基材をプラズマ処理してもよい。このプラズマ処理は、コロナ放電、アーク放電、グロー放電等を用いて行うことができる。

以上の方法で作製したアレイを用いて検体核酸と核酸プローブとをハイブリダイズする。
ハイブリダイズ法としては、特に限定されるものではなく、一般的な手法を用いればよい。
その具体例としては、核酸プローブまたは検体核酸を固定化したアレイを、検体核酸の溶液または核酸プローブの溶液に浸漬する方法が挙げられる。ハイブリダイズの温度条件は、用いるＤＮＡプローブの熱変性温度を考慮し、適宜設定すればよい。
なお、未反応の核酸は、洗浄によって容易に除去することができる。

以上の方法でハイブリダイズして調製した２本鎖核酸を、本発明の２置換修飾シクロデキストリンで処理し、その蛍光スペクトルの変化を検出する。
２置換修飾シクロデキストリンでの処理方法は特に限定されるものではなく、２置換修飾シクロデキストリンの溶液に核酸を適宜な濃度で添加しても、その逆でもよい。この際、溶媒としては、２置換修飾シクロデキストリンおよび核酸が溶解するものであれば特に制限はないが、本発明においては、ＤＭＳＯ−水の混合溶媒を好適に用いることができる。ＤＭＳＯの濃度は、１〜３０体積％程度が好ましい。

以上の処理によって、本発明の２置換修飾シクロデキストリンと２本鎖核酸とが相互作用をし、その結果、検出される蛍光スペクトルに変化が生じる。
具体的には、後述の実施例で詳細に述べるとおり、２置換修飾シクロデキストリンと２本鎖核酸との相互作用によって、シクロデキストリンが有する蛍光性発色団のモノマー蛍光の強度が増加し、また、蛍光性発色団がエキシマを形成し得るものである場合、それと同時にエキシマ蛍光の強度も増加するが、この現象は１本鎖核酸の場合には観察されない。
この現象の違いによって、２本鎖核酸と１本鎖核酸とを高精度に検出、同定することができる。

なお、上記相互作用は、シクロデキストリンの有する蛍光性発色団が、２本鎖ＤＮＡにインターカレートするものであると推測される。
このインターカレートの態様は、置換している蛍光性発色団によってはエキシマ蛍光の増加が確認されることから、１つの蛍光性発色団が２本鎖核酸にインターカレートし、その外側からもう１つの蛍光性発色団がインターカレートしている発色団を固定化しているもの、または、２つの蛍光性発色団へ２本鎖核酸の１つの塩基対間に挿入しているものが考えられる。

以下、合成例および実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。なお、実施例にて使用した分析装置および条件は、下記のとおりである。
［１］¹Ｈ ＮＭＲおよび¹³Ｃ ＮＭＲ
装置：ブルカー：BURUKER-SPECTROSPIN 300
測定溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６
基準物質：テトラメチルシラン
［２］ＩＲ
装置：パーキンエルマー：FT-IR Spectrometer SPECTRUM 2000
［３］ＦＡＢ−ＭＳ
装置：日本電子（ＪＥＯＬ）：JMS-700
［４］元素分析
装置：ヤナコ分析工業（株）：ＣＨＮコーダー
［５］蛍光スペクトル
装置：蛍光光度計 Perkin-Elmer LS 40B Fluorescence Spectrophotometer
セル：標準角型蛍光セル(2500μＬ)
測定条件：Start wavelength:300nm，End wavelength:600nm，Excitation wavelength:343.0nm、Excitation slit:5nm，Emission slit:5nm，Scan speed:100nm/min.
［６］ＣＤスペクトル
装置：日本分光（ＪＡＳＣＯ）：J-720 spectrophotometer

［合成例１］８−（１−ピレンメトキシ）−３，６−（ジオキサ）オクタ−１−クロライドの合成

１−ピレンメタノール（１．０３ｇ，４．４２ｍｍｏｌ）、１，２−ビス（２−クロロエトキシ）エタン（４．８６ｇ，２６．１ｍｍｏｌ）をｄｒｙ−ＴＨＦ５０ｍＬに溶解後、ナトリウムヒドリド（１．６５ｇ，４３．２ｍｍｏｌ）を加え、加熱環流下で６時間反応させた。反応追跡はＴＬＣ（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１（ｖ／ｖ），ＴＬＣ；シリカゲル ６０Ｆ₂₅₄）を用いた。
反応終了後、メタノールを少量加えてナトリウムヒドリドを分解し、溶媒を留去後、水を加え、クロロホルムで３回抽出した。有機相を水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を濃縮後、６０℃で一晩減圧乾燥し、黄色のオイル状の粗生成物４．４５ｇを回収した。
粗生成物を少量のクロロホルムに溶解させ、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。展開溶媒はｎ−ヘキサン−酢酸エチルを用い、徐々に酢酸エチルの比率を上げ、およそ酢酸エチル２６〜３２ｖｏｌ％の溶出物を回収して濃縮後、６０℃で減圧乾燥して黄色のオイル状の目的物０．８６ｇ（収率；５１．１％）を得た。

R_f =0.71(n-hexane: ethyl acetate = 1:1, TLC; silica gel 60F₂₅₄)
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)
δ= 3.5-3.8(12H, m, -OCH₂CH₂O-)，5.2-5.3(2H, s, CH₂ of pyrenemethoxy)，7.9-8.4(9H, m, aromatic H of pyrene)．
¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃)
δ= 41-45(1C,t,-CCl)，67-74(6C, m, -OCH₂-)，122-132(16C, m, aromatic C of pyrene)．
IR(KBr) ν 3041.4(aryl-H), 2865.2(C-H), 1588.6(C=C), 1108.9(C-O-C), 682.3(C-Cl)cm^-1.
FAB-MS(m/z);382.2[M]⁺

［合成例２］８−（１−ピレンメトキシ）−３，６−（ジオキサ）オクタ−１−アミン−フタルイミドの合成

合成例１で得られた８−（１−ピレンメトキシ）−３，６−（ジオキサ）オクタ−１−クロライド（０．８５ｇ，２．２ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム（１．０７ｇ，５．７８ｍｍｏｌ）を、ｄｒｙ−ＤＭＦ１５ｍＬに溶解し、９０℃で６時間反応させた。反応追跡はＴＬＣ（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１（ｖ／ｖ），ＴＬＣ；シリカゲル ６０Ｆ₂₅₄）を用いた。
反応終了後、溶媒を留去し、水を加え、クロロホルムで３回抽出した。有機相を０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液および水で順次洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を濃縮後、６０℃で一晩減圧乾燥し、黄色のオイル状の粗生成物０．９８ｇを回収した。
粗生成物を少量のクロロホルムに溶解させ、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。展開溶媒はｎ−ヘキサン−酢酸エチルを用い、徐々に酢酸エチルの比率を上げ、およそ酢酸エチル３０〜５５ｖｏｌ％の溶出物を回収し、濃縮後、６０℃で減圧乾燥して黄色オイル状の目的物０．４５ｇ（収率；４１．６％）を得た。

R_f =0.39(n-hexane: ethyl acetate=1:1, TLC; silica gel 60F₂₅₄)
¹H NMR (300MHz, CDCl₃)
δ= 3.6-3.9(12H, m, -OCH₂CH₂O-), 5.2-5.3(2H, s, CH₂ of pyrenemethoxy), 7.4-7.8(4H, m, aromatic H of phthalimide), 7.9-8.4(9H, m, aromatic H of pyrene).
¹³C NMR (75MHz, CDCl₃)
δ= 35-40(1C, t, -CN), 65-74(6C, m, -OCH₂-), 121-135(22C, m, aromatic C of pyrene and phthalimide), 168-169(2C, s, C=O).
IR(KBr) ν 3042.3(aryl-H), 2865.5(C-H), 1772.8(C=O), 1707.6(C=O), 1603.4(C=C), 1106.2(C-O-C)cm^-1.
FAB-MS(m/z);493.3[M]⁺

［合成例３］８−（１−ピレンメトキシ）−３，６−（ジオキサ）オクタ−１−アミンの合成

合成例２で得られた８−（１−ピレンメトキシ）−３，６−（ジオキサ）オクタ−１−アミン−フタルイミド（１．７６ｇ，３．５７ｍｍｏｌ）をアセトン７５ｍＬに溶解後、８０％ヒドラジン一水和物７５ｍＬを加え、加熱環流下で１時間反応させた。反応追跡はＴＬＣ（アセトン：アンモニア水（２８％）＝２０：１（ｖ／ｖ），ＴＬＣ；シリカゲル ６０Ｆ₂₅₄）を用いた。
反応終了後、１Ｍ塩酸で中和後、溶媒を留去し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで３回抽出した。有機相を１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液および水で順次洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を濃縮後、６０℃で一晩減圧乾燥し、黄色オイル状の目的物１．０６ｇ（収率；８１．３％）を回収した。

R_f =0.61[acetone:ammonia_aq(28%)=20:1,TLC; silica gel 60F₂₅₄]
¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)
δ= 1.5-1.7(2H, s, NH₂)， 2.7-2.9(2H, t, -CH₂N)， 3.4-3.8(10H, m, -CH₂OCH₂-)， 5.2-5.3(2H, s, CH₂ of pyrenemethoxy)， 7.9-8.5(9H, m, aromatic H of pyrene).
¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃)
δ= 39-44(1C, t, -CN)， 67-74(6C, m, -OCH₂-)， 122-132(16C, m, aromatic C of pyrene ).
IR(KBr) ν 3397.2(NH), 3040.9(aryl-H), 1587.5(C=C), 1090.1(C-O-C)cm^-1.
Calcd. for 3C₂₃H₂₅NO₃・H₂O: C;74.76, H;7.01, N;3.79%.；Found: C;74.89, H;6.83, N;3.64%.
FAB-MS(m/z);364.2[M+H]⁺

［合成例４］ジ−６^A，６^E−ｐ−トルエンスルホニルオキシ−γ−ＣｙＤの合成

γ−ＣｙＤ（５．０９６０ｇ，３．９３ｍｍｏｌ）を、ピリジン１００ｍＬに完全に溶解させ、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（４．７１０１ｇ，２４．７ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間反応させた。反応追跡は、ＴＬＣ（１−ブタノール：エタノール：水＝５：４：３（ｖ／ｖ／ｖ），ＴＬＣ；シリカゲル ６０Ｆ₂₅₄）を用いた。
反応終了後、ある程度溶媒を留去し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で中和し、アセトン５００ｍＬで再沈した。沈殿物を吸引濾過し、３０℃で減圧乾燥後、白色結晶の粗生成物９．７２７０ｇを回収した。
粗生成物をｄｒｙ−ＤＭＦ３０ｍＬに溶解させ、不溶解物を桐山ロート（（有）桐山製作所製）で濾過し、濾液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｌｏｂａｒ ｃｏｌｕｍｎ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−１８，メルク製，３１０ｍｍ×１０ｍｍ）で精製した。展開溶媒はメタノール−水を用い、徐々にメタノールの比率を上げ、メタノール４０％の溶出物を回収した。濃縮後、アセトンを加えて結晶化し、沈殿物を吸引濾過後、３０℃で減圧乾燥して白色結晶の目的物０．２０４０ｇ（収率；３．２３％）を得た。

R_f=0.58(1-butanol: ethanol: water=5:4:3, TLC; silica gel 60F₂₅₄)
¹H NMR (300MHz, DMSO-d₆)
δ= 4.5-4.6(6H, w, C¹H of CyD), 5.7-5.9(16H, s, OH of C² and C³ of CyD), 7.4-7.5(4H, d, aromatic H of benzene), 7.7-7.8(4H, d, aromatic H of benzene).

［合成例５］ジ−６^A，６^E−デオキシ−６^A，６^E−チオ酢酸−γ−ＣｙＤの合成

合成例４で得られたジ−６^A，６^E−ｐ−トルエンスルホニルオキシ−γ−ＣｙＤ（０．２０４０ｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、メルカプト酢酸（０．０６２３ｇ，０．６６ｍｍｏｌ）を、ｄｒｙ−ＤＭＦ１５ｍＬに溶解後、炭酸ナトリウム（０．１４６７ｇ，１．３８ｍｍｏｌ）を溶解した水３．８ｍＬを滴下し、７０℃で４日間反応させた。反応追跡はＴＬＣ（１−ブタノール：エタノール：水＝５：４：３（ｖ／ｖ／ｖ），ＴＬＣ；シリカゲル ６０Ｆ₂₅₄）を用いた。
反応終了後、溶媒を留去し、水を少量加えて炭酸ナトリウムを溶解後、１Ｍ塩酸で中和した。濃縮後、アセトン３００ｍＬで再沈した。沈殿物を吸引濾過し、６０℃で減圧乾燥後、白色結晶の粗生成物０．３２９５ｇを回収した。
粗生成物を少量の水に溶解させ、セファデックスＧ−１５のオープンカラム（１００ｃｍ×１．８ｃｍ）で精製した。溶出溶媒は水を用いた。目的の溶出物を回収し、濃縮後、アセトンを加えて結晶化した。沈殿物を吸引濾過後、６０℃で減圧乾燥して白色結晶の目的物０．１２６６ｇ（収率；６８．７％）を得た。

R_f =0.33(1-BuOH :EtOH :H₂O=5:4:3,TLC; silica gel 60F₂₅₄)
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆)
δ= 4.7-5.0(8H, w, C¹H of CyD), 5.5-5.9(16H, s, OH of C² and C³ of CyD).
IR(KBr) ν 3430.4(O-H), 2934.8(C-H), 1635.4(C=O), 1029.6(C-O-C)cm^-1.

［実施例１］ジ−６^A，６^E−デオキシ−６^A，６^E−［｛８−（１−ピレンメトキシ）−３，６−（ジオキサ）オクタ−１−アミノ｝−（チオアセチル）］−γ−ＣｙＤの合成

合成例５で得られたジ−６^A，６^E−デオキシ−６^A，６^E−チオ酢酸−γ−ＣｙＤ（０．１４７９ｇ，０．１０ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ＨＯＢｔ，０．０６２６ｇ，０．４６ｍｍｏｌ）を、ｄｒｙ−ＤＭＦ１５ｍＬに溶解した。この溶液を窒素気流下で０℃に冷却後、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，０．０８７９ｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を加えた。２時間反応後、合成例３で得られた８−（１−ピレンメトキシ）−３，６−（ジオキサ）オクタ−１−アミン（０．１６４６ｇ，０．４５ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後、徐々に室温に戻して１日反応させた後、熱をかけ（８１．２℃）、３日間反応させた。反応追跡はＴＬＣ（１−ブタノール：エタノール：水＝５：４：３，ＴＬＣ；シリカゲル ６０Ｆ₂₅₄）を用いた。
反応終了後、溶媒を留去し、アセトン２００ｍＬで再沈した。沈殿物を吸引濾過し、６０℃で減圧乾燥後、白色結晶の粗生成物０．１６２８ｇを回収した。
粗生成物を少量のｄｒｙ−ＤＭＦと水に溶解させ、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｌｏｂａｒ ｃｏｌｕｍｎ ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ−１８，メルク製，３１０ｍｍ×１０ｍｍ）で精製した。展開溶媒はメタノール−水を用い、徐々にメタノールの比率を上げ、メタノール８０〜１００ｖｏｌ％の溶出物を回収した。濃縮後、アセトンを加えて結晶化した。沈殿物を吸引濾過後、６０℃で減圧乾燥して白色結晶の目的物０．０１３４ｇ（ｙｉｅｌｄ；６．１４％）を得た。

R_f =0.56(1-BuOH: EtOH: H₂O=5:4:3,TLC;silica gel 60F₂₅₄)
¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆)
δ =4.5-4.7(6H, m, OH of C⁶ of CyD), 4.8-5.0(8H, d, H of C¹ of CyD), 5.1-5.3(2H, s, CH₂ of pyrenemethoxy), 5.8-6.2(16H, s, OH of C² and C³ of CyD), 7.9-8.0(2H, t, H of amide), 8.0-8.5(18H, m, aromatic H of pyrene).
IR(KBr) ν 3423.5(O-H), 2923.5(C-H), 1655.1(C=C), 1634.9(C=O), 1029.8(C-O)cm^-1.

［実施例２］蛍光スペクトル測定
以下の全ての手順において、溶媒には１０％ＤＭＳＯ水溶液を用いた。
〈ｄｓＤＮＡとの相互作用〉
実施例１で得られたジ−６^A，６^E−デオキシ−６^A，６^E−［｛８−（１−ピレンメトキシ）−３，６−（ジオキサ）オクタ−１−アミノ｝−（チオアセチル）］−γ−ＣｙＤ（以下、２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤという）を、濃度３×１０^-7Ｍとなるように調整した。
そこへ、市販のｄｓＤＮＡ（２００Ｍｅｒ）を溶媒にて所定濃度に調整したものを、蛍光セル中でＤＮＡ濃度が０，０．９３７５×１０^-10，１．８７５×１０^-10，３．７５×１０^-10，７．５×１０^-10，１５×１０^-10，３０×１０^-10，６０×１０^-10，１２０×１０^-10，２５０×１０^-10Ｍとなるように加え、蛍光スペクトルの測定を行った。結果を図１に示す。

〈ｓｓＤＮＡとの相互作用〉
実施例１で得られた２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤを、濃度３×１０^-7Ｍとなるように調整した。
そこへ、市販のｓｓＤＮＡ（４０Ｍｅｒ）を溶媒にて所定濃度に調整したものを、蛍光セル中で、ＤＮＡ濃度が０，４．６８７５×１０^-10，９．３７５×１０^-10，１８．７５×１０^-10，３７．５×１０^-10，７５×１０^-10，１５０×１０^-10，３００×１０^-10，６００×１０^-10，１２００×１０^-10Ｍとなるように加え、蛍光スペクトルの測定を行った。結果を図２に示す。

図１に示されるように、２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤにｄｓＤＮＡを添加した場合、ピレンのモノマー蛍光（３７７ｎｍ）およびエキシマ蛍光（４７９ｎｍ）の強度が、それぞれ増加していることがわかる。
なお、蛍光強度増加の度合いは、ｄｓＤＮＡを７．５×１０^-10Ｍ添加するまで急激に増加し、その後、さらにｄｓＤＮＡを添加しても蛍光強度はほぼ変化しなかった。
一方、図２に示されるように、ｓｓＤＮＡを添加しても、２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤの蛍光強度は増加していないことがわかる。
これは、ｄｓＤＮＡを添加した場合には、２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤのピレン部位がｄｓＤＮＡの疎水性の塩基対間に挿入され、１０％ＤＭＳＯ水溶液中よりも安定な状態となったため、蛍光強度が増加したと考えられる。

２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤのｄｓＤＮＡへのインターカレートの態様は、上述のように、ピレンのエキシマ蛍光の増加が確認されたことから、図３に示されるように、片方のピレンがｄｓＤＮＡにインターカレートし、外側からもう片方のピレンがインターカレートしているピレンを固定化している、または、図４に示されるように、２つのピレンが１つの塩基対間へ挿入しているものと推察される。

また、２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤ（３．０×１０^-5Ｍ，１０％ＤＭＳＯ水溶液で希釈）に、ＣｙＤ空孔に包接され易い、アダマンタンカルボン酸ナトリウム（４８×１０^-5Ｍ，１０％ＤＭＳＯ水溶液で希釈）を添加し、ＣＤスペクトルを測定したところ、図５に示されるように、スペクトルに大きな変化はみられなかった。
これより、２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤは１０％ＤＭＳＯ水溶液中では自己包接していないことがわかる。
以上説明したとおり、２置換ピレン修飾γ−ＣｙＤを用いることによって、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡを高精度に識別でき、核酸の検出に好適に利用できることがわかる。

Claims (9)

1. 式（１）で示されることを特徴とする２置換修飾シクロデキストリン。
   

   

   （式中、ＣｙＤは、α−、β−またはγ−シクロデキストリン骨格を、
   Ａ¹およびＡ²は、互いに独立して、エーテル結合またはチオエーテル結合を含んでいてもよい炭素数１〜１０のアルキレン基を、
   Ｂ¹およびＢ²は、互いに独立して、単結合、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を、
   Ｃ¹およびＣ²は、互いに独立して、エーテル結合を含む炭素数１〜２０のアルキレン基を、
   Ｘ¹およびＸ²は、互いに独立して、ピレン、ナフタレン、ダンシルグリシン、アントラセンおよびローダミンＢから選ばれる少なくとも１種の蛍光性発色団を表す。）
2. 前記蛍光性発色団が、ピレンおよびナフタレンから選ばれる少なくとも１種である請求項１記載の２置換修飾シクロデキストリン。
3. 式（２）で示される請求項１記載の２置換修飾シクロデキストリン。
   

   

   （式中、ＣｙＤ、Ａ¹、Ａ²、Ｂ¹、Ｂ²、Ｃ¹およびＣ²は、前記と同じ意味を表す。）
4. 式（３）で示される請求項３記載の２置換修飾シクロデキストリン。
   

   

   （式中、ＣｙＤ、Ｃ¹およびＣ²は、前記と同じ意味を表す。）
5. 式（４）で示される請求項４記載の２置換修飾シクロデキストリン。
   

   

   （式中、ｍおよびｎは１〜１０の整数を表し、ｍ＋ｎ≦１９を満足し、ｏおよびｐは１〜１０の整数を表し、ｏ＋ｐ≦１９を満足する。ＣｙＤは、前記と同じ意味を表す。）
6. 式（５）で示される請求項５記載の２置換修飾シクロデキストリン。
   

   

   （式中、ＣｙＤは、前記と同じ意味を表す。）
7. 前記ＣｙＤが、γ−シクロデキストリン骨格である請求項１〜６のいずれか１項記載の２置換修飾シクロデキストリン。
8. 前記γ−シクロデキストリン骨格を構成する８個のＤ−グルコースの任意の１つをグルコースＡとし、その隣に結合するグルコースから順にグルコースＢ〜Ｈとした場合に、グルコースＡとグルコースＥとがそれぞれ置換されているＡＥ２置換体である請求項７記載の２置換修飾シクロデキストリン。
9. 請求項１〜８のいずれか１項記載の２置換修飾シクロデキストリンを用いることを特徴とする核酸検出方法。

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