JP2009222635A - 核酸検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】特定の配列を有する核酸を高感度に検出するための核酸検出方法を提供する。
【解決手段】検出すべき核酸に対して特定の配列を有し且つ固相に固定化可能な物質を修飾したプライマーを作製し前記検出すべき核酸と結合させる結合工程と、酵素を用いて前記検出すべき核酸の相補鎖を合成する伸長反応工程と、前記伸長反応工程で合成した合成核酸サンプルに電気化学活性な物質を結合させる結合工程と、前記結合工程で得られた合成核酸サンプルを固相に固定化する固定化工程と、洗浄により固相に固定化された合成核酸サンプルを回収する洗浄工程と、前記固相に固定化された合成核酸サンプルに結合した前記電気化学活性な物質を電気化学的な測定により検出する検出工程と、からなる検体試料中の特定の配列を有する核酸を検出する核酸検出方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、検体試料中の特定の配列を有する核酸を検出する核酸検出方法に関するものである。

従来の核酸検出方法は、まず、ビーズなどの固相に固定したプローブと、電気化学活性な物質を標識した標識プローブと、核酸サンプルとをハイブリダイズさせる。次に、反応液から固相を抽出し、その固相をバッファ等で洗浄することにより、２本鎖形成しなかったプローブを除去する。その後、固相に電圧を印加して、核酸サンプルに結合した標識プローブからの電気化学的な信号を検出することにより、目的とする核酸の有無を検出する（例えば、特許文献１参照）。

また、特許文献１では、基質に固相と結合する物質を修飾させたヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅生成物を合成する。次に、熱変性により増幅生成物を変性させた後、標識プローブとハイブリダイズさせて２本鎖を形成させる。この増幅生成物を固相に固定させて電気化学的な信号を測定することで、目的の核酸を検出する手法も行なっている。

これらの手法は、プローブの５´末端もしくは、３´末端あるいは両末端にのみ標識剤を結合させているだけであるため、信号が弱く、核酸サンプルの増幅を行なわなければ目的の核酸を検出できなかった。

これを解消するために、以下の工程を行なうことにより、標識剤を複数結合させて目的の核酸を高感度化に検出する手法がある。まず、核酸サンプルと電気化学活性な物質とを結合させたサンプルを作製する。次に捕捉プローブと呼ばれる、前記核酸サンプルと相補的な塩基配列を有し、かつ固相に固定化できるように末端を修飾したプローブを用意する。この捕捉プローブと前記電気化学活性な物質結合サンプルとをハイブリダイズさせて２本鎖を形成する。その後、固相に固定して、前記電気化学活性な物質由来の電気化学的な信号を測定することで、目的の核酸サンプルを検出している（例えば、特許文献２参照。）。

この手法では、核酸サンプルに複数個標識剤を標識させるため、核酸サンプルを増幅させなくとも、目的の核酸を検出することが可能である。
特開２００２−３４５６１号公報 特開２００７−３０４０９１号公報

しかしながら、従来の手法では、生検体を直接測定する場合、目的の核酸サンプルの絶対量が不明なため、電気化学活性な物質の添加量を調整できない。そのため電気化学活性な物質が多量に核酸サンプルに結合する場合がある。この電気化学活性な物質が核酸サンプルに多量に結合すると、捕捉プローブとの結合部位にも電気化学活性な物質が結合するため立体障害となり、ハイブリダイズさせる際に２本鎖の形成が阻害される。その結果、核酸サンプルの回収量が低下し、測定感度が低下するという課題を有していた。

本発明は、前記従来の課題を解決するもので、目的の核酸サンプルの絶対量が不明な場合でも、電気化学活性な物質の添加量を調整することなく、目的の核酸を高感度に検出するための核酸検出方法を提供することを目的とする。

前記従来の課題を解決するために、本発明の核酸検出方法は、検出すべき核酸に対して特定の配列を有し且つ固相に固定化可能な物質を修飾したプライマーを作製し前記検出すべき核酸と結合させる結合工程と、酵素を用いて前記検出すべき核酸の相補鎖を合成する伸長反応工程と、前記伸長反応工程で合成した合成核酸サンプルに電気化学活性な物質を結合させる結合工程と、前記結合工程で得られた合成核酸サンプルを固相に固定化する固定化工程と、洗浄により固相に固定化された合成核酸サンプルを回収する洗浄工程と、前記固相に固定化された合成核酸サンプルに結合した前記電気化学活性な物質を電気化学的な測定により検出する検出工程からなることを特徴としたものである。

さらに、検体試料中の特定の配列を有する核酸を検出する核酸検出方法において、検出すべき核酸に対して特定の配列を有するプライマーを作製し前記検出すべき核酸と結合させる結合工程と、固相に固定化可能な物質を修飾した基質を用いて前記検出すべき核酸の相補鎖を酵素反応で合成する伸長反応工程と、前記伸長反応工程で合成した合成核酸サンプルに電気化学活性な物質を結合させる結合工程と、前記結合工程で得られた合成核酸サンプルを固相に固定化する固定化工程と、洗浄により固相に固定化された合成核酸サンプルを回収する洗浄工程と、前記固相に固定化された合成核酸サンプルに結合した前記電気化学活性な物質を電気化学的な測定により検出する検出工程からなることを特徴としたものである。

本発明の核酸検出方法によれば、伸長工程で特有の配列を有する核酸のみを合成し、また、固相に固定化可能な物質を修飾したプライマーを使用して核酸合成を行なうことから、生成した合成核酸サンプルのみでも固相に固定できる。そのため、合成核酸サンプルと捕捉プローブとをハイブリダイズにより固相に固定化させる必要がなくなるので、サンプルの回収率が向上する。また、立体障害を気にすることなく、電気化学活性な物質を合成核酸サンプルに多量に結合させることができるため、従来法よりも検出感度が向上する。

（実施の形態１）
以下に、本発明の核酸検出方法の実施の形態を図１とともに詳細に説明する。

なお、以下の実施の形態における核酸サンプルとは、例えば、血液、白血球、血清、尿、糞便、***、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他核酸を含有する任意の試料から、細胞を破壊してＲＮＡ若しくはＤＮＡを遊離させたものである。また、制限酵素で切断して電気泳動による分離等で精製した核酸断片を用いるのでもよい。

（ステップ１）
まず、図１（ａ）に示すプライマーを作製する。ここで使用するプライマーは、目的の核酸に対して特異的な配列を有する。このプライマーは、生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸を用いることができるが、化学合成で作製する方がより確実で好ましい。

（ステップ２）
次に、図１（ｂ）に示すように、前記プライマーを固相に固定化するため、５´末端に官能基あるいは抗原を修飾する。このプライマー末端の官能基あるいは抗原の種類は、特に限定されないが、一例を挙げると、固相にアミノ基を修飾させている場合では、官能基にはカルボン酸若しくはアルデヒド基を修飾する。また、固相にアビジンを修飾させている場合では、プライマーにはビオチンを修飾する。ただし、プライマーの修飾にチオール基やアミノ基を使用する場合は、後述するハロゲンとの求核置換反応により、合成核酸サンプルと結合する可能性があるので、なるべく避けた方が良い。なお、プライマーに官能基あるいは抗原を修飾する手法は公知なので、ここでは省略する。一例として、図１（ｂ）にはビオチンを修飾させたプライマーを示す。

（ステップ３）
上述した核酸サンプルに、前記プライマー、伸長酵素、基質、バッファを加え、任意の温度をかけることで、図１（ｃ）に示すように核酸サンプルと前記プライマーとを結合させる。その後、前記核酸サンプルを鋳型として、任意の温度で前記プライマーを伸長させ図１（ｄ）、前記核酸サンプルの相補鎖である合成核酸サンプルを完成させる。なお、前記プライマーは、検出すべき核酸のみが有する特異的な配列に対して、相補的な配列を持つため、目的としない核酸サンプルは、このプライマーと結合せず、伸長反応は起こらない。

（ステップ４）
図１（ｅ）に示すように前記伸長反応により得られた合成核酸サンプルの塩基にハロゲンを付加させる。ハロゲンを付加させる物質は、特に限定されるものではなく、核酸の塩基にハロゲンを付加させられるものであればどれでも良く、一例としてクロロスクシンイミド、ブロモスクシンイミド、ヨードスクシンイミドなどを挙げることができる。このハロゲン化合物の溶液を、前記合成核酸サンプルに適量添加し、穏やかに撹拌させることにより、前記合成核酸サンプルの塩基にハロゲンを結合させることができる。

（ステップ５）
次に、電気化学活性な物質（以下、「標識剤」と称する）を添加して、図１（ｆ）に示す通り、前記合成核酸サンプルに結合したハロゲンと標識剤とを置換させて前記標識剤を前記合成核酸サンプルに共有結合させる。

この標識剤は、酸化還元性を有する物質であれば、特に限定されない。一例を挙げると、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエン、フェロセン、カテコールアミン、ビオロゲン、キノン、トリスビピリジンルテニウム錯体、トリスフェナントロリンルテニウム錯体、トリスビピリジンオスミウム錯体、トリスフェナントロリンオスミウム錯体等が挙げられる。

また、この標識剤は、前述した合成核酸サンプルの塩基に結合したハロゲン基と求核置換反応する官能基をもち、特に限定されないが、アミン類、アルコール類、エーテル類、チオール類、オキシド類から選ばれる。

この標識剤の溶液を、前記ハロゲン結合合成核酸サンプルに加えて、任意の温度で撹拌若しくは静置させることにより、求核置換反応が生じて標識剤結合合成核酸サンプルが生成する。

（ステップ６）
洗浄により標識剤が結合したプライマー、標識剤が結合した基質及び、未反応の標識剤を除去し、標識剤結合合成核酸サンプルを抽出する。この精製法は特に限定されないが、一例を挙げると、高濃度の塩をサンプルに添加させることで標識剤結合合成核酸サンプルを凝集させ、これをシリカゲルカラムなどにより分取する手法や、ゲルろ過を用いて分子量の差で目的物の標識剤結合合成核酸サンプルを採取する手法を挙げることができる。

（ステップ７）
図１（ｇ）に示すように、抽出した標識剤結合合成核酸サンプルを固相に固定化させる。

固定化手法は、（ステップ２）で記述したように、前記プライマーの官能基がカルボン酸、若しくはアルデヒド基の場合、固相にはアミノ基を表面に修飾した物質を用い、アミド結合にて標識剤結合合成核酸サンプルを結合させる。プライマーにビオチンを修飾した場合、アビジンを修飾した固相を使用し、アビジン‐ビオチン結合により標識剤結合合成核酸サンプルを固定化する。一例として図１（ｇ）はアビジンを修飾した固相に標識剤結合合成核酸サンプルを固定させている。このように標識剤結合合成核酸サンプルを固相に固定化させた後、洗浄処理を行い、核酸サンプルなどを除去する。

（ステップ８）
最後に、前記固相に固定された標識剤結合合成核酸サンプルに結合した標識剤由来の電気化学的な信号を測定することにより、目的の核酸を検出することが出来る。その結果、標識剤結合後に捕捉プローブとハイブリダイズを行なう必要が無くなるため、サンプルの回収率が向上する。また、立体障害を気にすることなく、標識剤を合成核酸サンプルに多量に結合させることができるため、従来法よりも目的の核酸を高感度に検出することができる。

なお、標識剤由来の電気化学的な信号は、添加する種類により異なるが、酸化還元電流を生じる標識剤を用いた場合には、ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、電気化学発光を生じる標識剤を用いた場合には、フォトマルチプライヤー等を用いて計測が可能である。

以下に実施の形態１の方法で大腸菌測定を行なった（以下、実施法１と称する。）ので、その手順の詳細を説明する。

（核酸サンプルの抽出）
核酸サンプルは、大腸菌を１コロニー採取し、液体培地にて３７℃、２時間培養した後、プロメガ社のＲＮＡ抽出キットにて抽出した大腸菌ＲＮＡを使用した。

（プライマーの準備）
ポジティブコントロール（ポジティブ）のプライマーには、５´末端よりＣＧＴＣＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴ（配列番号１）の配列を有する、５´末端のリン酸基を介してビオチンを修飾した２０塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。このプライマーの配列は、大腸菌１６ＳｒＲＮＡの４６５から４８４番目に対して相補な配列であるので、伸長反応により、大腸菌の核酸サンプルと相補な核酸を合成することが出来る。このプライマーをＲＮａｓｅが混入していない純水（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水）で１０μＭに調製した。

また、ここでネガティブコントロール（ネガティブ）として、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２）の配列を有する５´末端のリン酸基を介してビオチンを修飾した２０塩基のオリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして使用した。このプライマーは、大腸菌の核酸サンプルとは非相補であるので、伸長反応は起こらない。

（合成核酸サンプルの合成）
前述した大腸菌ＲＮＡを鋳型として、大腸菌ＲＮＡと相補な合成核酸サンプルを合成した。なお、この合成には、ＴＡＫＡＲＡ社製のキット（１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ）を使用した。

まず、前記プライマーを１．０μＬ、１０ｍＭに調整した原料である基質（ｄＮＴＰ）を１．０μＬ、前記大腸菌ＲＮＡを４．５μＬ、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水３．５μＬをチューブに加え、６５℃で５分間加温させた後、５分間氷冷することによりアニーリング処理を行なった。

その後、キットに付属されているバッファを４．０μＬ、ＲＮａｓｅ阻害剤０．５μＬ、逆転写酵素１．０μＬ、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水４．５μＬを前記チューブにさらに加え、穏やかに撹拌させた後、４３℃で１時間伸長反応を行った。反応後、９５℃で５分間加熱させることにより酵素を失活させた後、氷上で冷却することにより合成核酸サンプルを得た。

（標識剤の合成）
標識剤（化１）は、以下のようにして得た。まず、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ：ＴＨＦ）６０．０ｍLに溶解させた４，４´−ジメチル−２，２´ビピリジン２．５０ｇ（１３．５ｍｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２７．０ｍｍｏｌ）を滴下し、氷冷しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に、１，３−ジブロモプロパン４．２ｍＬ（４１．１ｍｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬとを加え、氷冷しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液をゆっくり滴下させて２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ａを得た（収率４７．２％）。

次に窒素雰囲気の容器に、前記生成物Ａ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌ）、及びジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬ及び蒸留水２００ｍＬで洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｂを得た（収率６１．５％）。

塩化ルテニウム(III)（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）、及び２，２´−ビピリジン（
３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍL）中で６時間還
流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、１８時間４℃に冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後、塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに１６時間４℃で静置した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｃを得た(収率６８．２％)。

窒素置換した容器に、前記生成物Ｂ０．５０ｇ(１．３５ｍｍｏｌ)、前記生成物Ｃ０．
７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ）、及びエタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還
流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。
この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｄを得た（収率８１．６％）。

さらに、前記生成物Ｄ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ）、及びメタノール７０．０ｍＬを
１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍ
ｏｌ）を加え再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去
した。

次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を４℃で１６時間静置し、析出した不純物を自然ろ過で除去した。

これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、蒸留水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、目的物である標識剤（化１）を得た(収率７１．４％)。

表１は、前述のようにして得た標識剤（化１）の１Ｈ-ＮＭＲ結果である。

（核酸サンプルへの標識剤結合）
炭酸バッファで７．３ｍＭに調整したＮ−ブロモスクシンイミド（Ｎ−ｂｒｏｍｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＢＳ）５．０μＬを、上述した合成核酸サンプルに添加し、４℃で３時間静置させることにより、合成核酸サンプルの塩基にブロモ基を修飾させた。

次に、蒸留水で１０ｍＭに調整した標識剤溶液２．４μＬを前記ブロモ基が修飾した合成核酸サンプルに添加し、１２時間、室温で静置させることにより、合成核酸サンプルに標識剤を結合させた。反応後、プロメガ社製の核酸抽出キット（Ｗｉｚａｒｄ（Ｒ） ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて標識剤結合サンプルを抽出した。

（標識剤結合核酸サンプルの磁気ビーズ固定）
固相には、磁気ビーズを使用した。磁気ビーズは、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製のＣＭ０１Ｎ／５８９６ストレプトアビジン磁気ビーズを用いた（粒径０．３５μｍ）。この磁気ビーズ液を５．０μＬ採取し、前記標識剤結合核酸サンプルを含む溶液に添加して４２℃，１時間穏やかに撹拌させて前記標識剤結合核酸サンプルを磁気ビーズに固定させた。固定後、リン酸バッファでこのサンプル結合磁気ビーズを洗浄することにより、核酸サンプル等の残渣を除去した。

（測定）
磁気ビーズに固定した前記標識剤結合核酸サンプルを電極に固定した。電極は金電極を使用した。金電極は、ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍ厚を下地に金２００ｎｍ厚を形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで準備した。この電極を６０℃に加熱したホットプレート上に置き、作用極上に前記磁気ビーズを２．０μL滴下して５分間加熱することにより、前記磁気ビーズを電極上に乾燥固定させた。

この電極に、０．１Ｍのリン酸バッファ、及び０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解液を８０μＬ滴下した。その後、電極に電圧を印加し、このときに生じた電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、３秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を計測した。

一方、比較対象とした従来法は、下記の工程とした。

（核酸サンプルの抽出）
従来法による核酸サンプルは、上述した実施法１で行なった大腸菌測定と同様にして抽出した大腸菌ＲＮＡを使用した。

（プライマーの準備）
プライマーには５´末端よりＣＣＣＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＡＴＴＴＧＡＧ（配列番号３）の配列を有する、２０塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。なお、このプライマーの配列は、大腸菌１６ＳｒＲＮＡの９１０から９２９番目に対して相補な配列である。

このプライマーをＲＮａｓｅが混入していない純水（ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水）で１０μＭに調製した。

（合成核酸サンプルの合成）
合成核酸サンプルの合成手法は、実施法１と同様なので、ここでは省略する。

（合成核酸サンプルへの標識剤結合）
合成核酸サンプルへの標識剤結合についても実施法１と同様に行ったので、ここでは省略する。

（捕捉プローブの準備）
ポジティブの捕捉プローブは、５´末端よりＡＡＴＡＣＣＴＴＴＧＣＴＣＡＴＴＧＡＣＧ（配列番号４）の配列を有する、５´末端のリン酸基を介してビオチンを修飾した２０塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用し、前述した合成核酸サンプルを捕捉する。なお、このプローブの配列は、大腸菌１６ＳｒＲＮＡの４６５から４８４番目の配列である。つまり、合成核酸サンプルと相補な配列なので、２本鎖を組むことが出来る。

また、ここでネガティブの捕捉プローブとして、実施の形態１に示す、配列番号２のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。このプライマーは、合成核酸サンプルとは非相補であるので、二本鎖を形成しない。これらのプライマーを純水で１０μＭに調製した。

（標識剤結合核酸サンプルと捕捉プローブとのハイブリダイゼーション反応）
前述の標識剤が結合した合成核酸サンプルに、５ＸＳＳＣを９．５μＬ、１０μＬに調整した捕捉プローブを１．０μＬそれぞれ添加し、４４℃で１８時間穏やかに撹拌させた。反応後、前述した核酸抽出キットを用いて合成核酸サンプルを抽出した。
（磁気ビーズへの固定）
上記核酸サンプルを磁気ビーズに固定した。実施法１と同様の磁気ビーズを５．０μＬ採取し、前記合成核酸サンプルの反応液に添加して３７℃で１時間静置させることにより、前記合成核酸サンプルに結合した捕捉プローブを磁気ビーズに固定した。固定後、０．１Ｍのリン酸バッファにて洗浄した。

（測定）
実施法１と同様にして前記磁気ビーズに固定した合成核酸サンプルを電極に固定した。その後、電極に電圧を印加し、生じた電気化学発光の最大発光量を計測した。

本手法における、実施法１、及び従来法の大腸菌測定結果を図２に示す。図２に示す通り、従来法では、ネガティブ（目的の合成核酸サンプルと非相補である捕捉プローブを用いた測定結果）と、ポジティブ（目的の合成核酸サンプルと相補である捕捉プローブを用いた測定結果）との差異が出なかった。これは伸長反応で合成した合成核酸サンプルに標識剤が多量に結合してしまい、捕捉プローブとの結合部位にも標識剤が複数個結合してしまったため、ハイブリダイズが阻害されて２本鎖を形成しなかったからである。

一方、実施法１では、ポジティブとネガティブとを明確に識別できた。これは、大腸菌核酸サンプルと特異的に結合する配列を有するプライマーにより、ポジティブのみ目的の合成核酸サンプルが合成でき、また、合成核酸サンプルが直接磁気ビーズに結合できるよう、プライマーにビオチンを修飾させたため、ハイブリダイズを行なわなくても目的の核酸サンプルのみを高収率に回収することができたからである。また、標識剤が目的の核酸サンプルに多量に結合したため、発光量が向上したことも要因として挙げられる。

以上のことから、本発明の手法により、目的の核酸サンプルの絶対量が不明な場合でも、標識剤の添加量を調整することなく、目的の核酸を高感度に検出することができる。

（実施の形態２）
以下に、固相に固定化可能な物質を修飾した基質を用いた核酸検出法の実施の形態を図３とともに説明する。なお、実施の形態１との差異は、実施の形態１では、固相に固定化可能な物質をプライマーに修飾していたが、ここでは、基質に修飾させている点である。

（ステップ１）
実施の形態１と同様にプライマーを作製する。作製法については、実施の形態１で詳述したので、ここでは省略する。

（ステップ２）
核酸サンプルにプライマー、伸長酵素、基質、バッファを加え、図３（ａ）のように任意の温度で前記核酸サンプルとプライマーとを結合させた後、図３（ｂ）に示すとおり、前記核酸サンプルを鋳型として、任意の温度でプライマーを伸長させて核酸サンプルの相補鎖である合成核酸サンプルを合成する。ここでは、基質の一部に、固相に固定化可能な官能基を修飾した基質を使用する。固相に固定化可能な官能基は、実施の形態１で記述した通りである。

なお、一例として、図３（ｂ）では、基質にビオチンを修飾させた。前記プライマーは、検出すべき核酸のみに有する特異的な配列に対して、相補的な配列を持つため、目的としない核酸サンプルは、このプライマーと結合せず、伸長反応が起こらない。

（ステップ３）
次に、図３（ｃ）に示すように、前記伸長反応により得られた合成核酸サンプルの塩基にハロゲンを付加させる。ハロゲンの付加反応については、（実施の形態１）に記述しているので、ここでは省略する。その後、標識剤を添加することにより、前記ハロゲンが結合した核酸サンプルと標識剤とを求核置換反応させることにより、図３（ｄ）に示すように標識剤を結合させる。この結合手法についても、実施の形態１で詳述したので、ここでは省略する。

（ステップ４）
標識剤が結合したプローブ、標識剤が結合した基質及び、未反応の標識剤をゲルろ過や抽出キットにて除去し、標識剤が結合した標識剤結合合成核酸サンプルを抽出する。詳細は実施の形態１に記述している。

（ステップ５）
抽出後、図３（ｅ）に示すように、上述した手法で得られた標識剤結合合成核酸サンプルを固相に固定化させる。固定化手法の詳細は、実施の形態１で記述したので、ここでは省略する。

（ステップ６）
固相に固定された標識剤結合合成核酸サンプルを洗浄した後、標識剤の電気化学的な信号を測定することにより、目的の核酸の有無を測定することができる。なお、測定手法の詳述は、実施の形態１で記述したので、ここでは省略する。

以下に実施の形態２の方法で大腸菌測定を行なったので、手順を詳細に説明する。

（核酸サンプルの抽出）
核酸サンプルは、実施例１に示した大腸菌ＲＮＡを使用した。

（プライマーの準備）
まず、ポジティブコントロール（ポジティブ）として、大腸菌核酸サンプルと結合するプライマーを用意する。このプライマーとして、５´末端よりＣＧＴＣＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＧＴＡＴＴ（配列番号５）の配列を有する、２０塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。なお、このプライマーの配列は、大腸菌１６ＳｒＲＮＡの４６５から４８４番目に対して相補な配列である。

また、伸長反応が起こらない、ネガティブコントロール（ネガコン）のプライマーとして、ＣＧＴＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＡＧＧＴＡＴＴ（配列番号６）の配列を有する、２０塩基のオリゴデオキシヌクレオチドを使用した。なお、このプライマーの配列は緑膿菌１６ＳｒＲＮＡの４６５から４８４番目に対して相補な配列である。
このプライマーをＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水で１０μＭに調製した。

（合成核酸サンプルの合成）
前述した大腸菌ＲＮＡを鋳型として、大腸菌ＲＮＡと相補な合成核酸サンプルを合成した。なお、この合成は、実施法１と同様にＴＡＫＡＲＡ社製のキット（１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ）を使用した。また、固相に固定化可能な物質を修飾した基質は、ビオチンを修飾したｄＵＴＰ（ロッシュ社製）を使用した。

まず、前記プライマーを１．０μＬ、１ｍＭに調整した原料である基質（ｄＮＴＰ）を４．０μＬ、ビオチン修飾ｄＵＴＰを１．０μＬ、前記大腸菌ＲＮＡを４．５μＬチューブに加え、６５℃で５分間加温させた後、５分間氷冷することによりアニーリング処理を行なった。

その後、キットに付属されているバッファを４μＬ、ＲＮａｓｅ阻害剤０．５μＬ、逆転写酵素１．０μＬ、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水４．５μＬを前記チューブにさらに加え、穏やかに撹拌させた後、４３℃で１時間伸長反応を行った。反応後、９５℃で５分間加熱させることにより酵素を失活させた後、氷上で冷却することにより合成核酸サンプルを得た。

（標識剤の合成）
標識剤は実施法１に記述した試薬を使用したので、ここでは省略する。以降の工程、核酸サンプルへの標識剤結合、標識剤結合核酸サンプルの磁気ビーズ固定、測定についても実施法１と同様であるので、省略する。

本手法における、大腸菌測定結果を図４に示す。図４に示す通り、ポジティブとネガティブの差異が明確であった。これは、大腸菌核酸サンプルと特異的に結合する配列を有するプライマーにより、ポジティブのみ目的の合成核酸サンプルが合成でき、また、合成核酸サンプルが直接磁気ビーズに結合できるよう、基質の一部（ｄＵＴＰ）にビオチンを修飾し、それを原料として合成核酸サンプルを合成する。そのため、ハイブリダイズを行なわなくても目的の核酸サンプルのみを高収率に回収できたからである。また、標識剤が目的の核酸サンプルに多量に結合したため、発光量が向上したことも第２の要因として挙げられる。

以上のことから、本発明の手法により、目的の核酸サンプルの絶対量が不明な場合でも、標識剤の添加量を調整することなく、目的の核酸を高感度に検出することができる。

本発明にかかる核酸検出法は、伸長工程で特有の配列を有する核酸のみを合成し、また、固相に固定化可能な物質を修飾したプライマーを使用して核酸合成を行なう。この合成した核酸に標識剤を結合させることにより、試料中に存在する特定の核酸を高感度に検出することができ、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途等に適用できる。

本発明の実施の形態１における核酸検出方法を示す図 本発明の実施の形態１の方法の核酸検出方法を用いた大腸菌測結果を示す図 本発明の実施の形態２における核酸検出方法を示す図 本発明の実施の形態２の方法の核酸検出方法を用いた大腸菌測結果を示す図

符号の説明

１ プライマー
２ ビオチン
３ 核酸サンプル
４ 合成核酸サンプル
５ ハロゲン
６ 電気化学活性な物質
７ アビジン
８ 固相
９ ビオチン
１０ 合成核酸サンプル

Claims (10)

1. 検出すべき核酸に対して特定の配列を有し且つ固相に固定化可能な物質を修飾したプライマーを作製し前記検出すべき核酸と結合させる結合工程と、
   酵素を用いて前記検出すべき核酸の相補鎖を合成する伸長反応工程と、
   前記伸長反応工程で合成した合成核酸サンプルに電気化学活性な物質を結合させる結合工程と、
   前記結合工程で得られた合成核酸サンプルを固相に固定化する固定化工程と、
   洗浄により固相に固定化された合成核酸サンプルを回収する洗浄工程と、
   前記固相に固定化された合成核酸サンプルに結合した前記電気化学活性な物質を電気化学的な測定により検出する検出工程と、からなる検体試料中の特定の配列を有する核酸を検出する核酸検出方法。
2. 検出すべき核酸に対して特定の配列を有するプライマーを作製し前記検出すべき核酸と結合させる結合工程と、
   固相に固定化可能な物質を修飾した基質を用いて前記検出すべき核酸の相補鎖を酵素反応で合成する伸長反応工程と、
   前記伸長反応工程で合成した合成核酸サンプルに電気化学活性な物質を結合させる結合工程と、
   前記結合工程で得られた合成核酸サンプルを固相に固定化する固定化工程と、
   洗浄により固相に固定化された合成核酸サンプルを回収する洗浄工程と、
   前記固相に固定化された合成核酸サンプルに結合した前記電気化学活性な物質を電気化学的な測定により検出する検出工程と、からなる検体試料中の特定の配列を有する核酸を検出する核酸検出方法。
3. 前記結合工程は、前記合成核酸サンプル中の塩基にハロゲンを付加させた後電気化学活性な物質を添加し前記電気化学活性な物質に含まれる官能基と前記合成核酸サンプル中の塩基に付加したハロゲンとの求核置換反応により前記合成核酸サンプルと前記電気化学活性な物質とを結合させる工程である、請求項１または２に記載の核酸検出方法。
4. 前記固定化工程における前記合成核酸サンプルと前記固相との結合は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、スルフィド結合、カルボニル結合、イミノ結合、抗原抗体結合、アビジン‐ビオチン結合のいずれかである請求項１または２に記載の核酸検出方法。
5. 前記結合工程後に、得られた合成核酸サンプルを抽出する抽出工程を含む請求項１及び２に記載の核酸検出方法。
6. 前記電気化学活性な物質は、酸化還元性を有する化合物である請求項１及び２に記載の核酸検出方法。
7. 前記酸化還元性を有する化合物は、配位子に複素環式化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエン、フェロセン、カテコールアミン、ビオロゲン、キノンのいずれかである請求項６に記載の核酸検出方法。
8. 前記配位子に複素環式化合物を有する金属錯体は、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である請求項７に記載の遺伝子検出方法。
9. 前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体は、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体のいずれかである請求項８に記載の遺伝子検出方法。
10. 前記配位子に複素環式化合物を有する金属錯体の中心金属は、ルテニウム、オスミウムである請求項９に記載の遺伝子検出方法。

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