JP5735972B2 - グリコシル化リピートモチーフ分子結合体 - Google Patents
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Description
様々なリピートモチーフ分子が、免疫グロブリンのような古典的な抗原結合分子の代替物を提供するために開発されている。
(リピートモチーフ分子−リンカーn)m−(結合パートナー)q−(リンカーo−リピートモチーフ分子)p
のグリコシル化リピートモチーフ分子結合体であり、ここでnおよびoは、互いとは無関係でありかつmおよびpおよびqの各値とは無関係である、0または1の整数値であり、mおよびpは、互いとは無関係である、0または1または2または3または4または5または6または7の整数値であり、qは、n、m、o、およびpの値とは無関係である、0または1の整数値であり、
かつリピートモチーフ分子結合体は、グリコシル化部位に付着した少なくとも1つのオリゴ糖を含み、
かつここで、少なくともm=q=1またはp=q=1である。
((リピートモチーフ分子−リンカーn)m−(結合パートナー)q−(リンカーo−リピートモチーフ分子)p)r
を有することを特徴とし、ここで
(i) n=1、m=1、q=1、p=0、r=1、または
(ii) n=1、m=1、q=1、p=0、r=2、または
(iii) n=0、m=1、q=1、p=0、r=1、または
(iv) n=0、m=1、q=1、p=0、r=2、または
(v) m=0、o=1、q=1、p=1、r=1、または
(vi) m=0、o=1、q=1、p=1、r=2、または
(vii) m=0、o=0、q=1、p=1、r=1、または
(viii) m=0、o=0、q=1、p=1、r=2、または
(ix) m=1、n=0、o=1、q=1、p=1、r=1、または
(x) m=1、n=0、o=1、q=1、p=1、r=2、または
(xi) m=1、n=1、o=1、q=1、p=1、r=1、または
(xii) m=1、n=1、o=1、q=1、p=1、r=1
であり、該結合パートナーは、重鎖CH2ドメインおよびCH3ドメインの天然もしくは改変ペア、重鎖CH1ドメインおよび軽鎖定常ドメインの天然もしくは改変ペア、天然もしくは改変重鎖ヒンジ領域、重鎖ヒンジ領域ならびにCH2ドメインおよびCH3ドメインの天然もしくは改変配列より選択され、
かつリピートモチーフ分子は、アンキリンリピートモチーフ分子である。
m=0、q=1、p=1、およびo=0またはo=1、およびr=1または2
であり、結合パートナーは、N末端のSEQ ID NO:50もしくは51もしくは52とC末端のSEQ ID NO:43もしくは44の結合体との、またはN末端のSEQ ID NO:53もしくは54もしくは55とC末端のSEQ ID NO:45もしくは46との結合体より選択され、かつ
リピートモチーフ分子は、アンキリンリピートモチーフ分子である。
(a) リピートモチーフ分子の結合パートナーがSEQ ID NO:50、51、および52より選択される場合には、N末端のSEQ ID NO:53もしくは54もしくは55とC末端のSEQ ID NO:45もしくは46との結合体2つ、または
(b) リピートモチーフ分子の結合パートナーがSEQ ID NO:53、54、および55より選択される場合には、N末端のSEQ ID NO:50もしくは51もしくは52とC末端のSEQ ID NO:43もしくは44との結合体2つ。
-ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-抗体生殖系列遺伝子の5'非翻訳領域、
-免疫グロブリンの重鎖シグナル配列、
-リピートモチーフ分子結合体のコード配列、
-ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列。
-本明細書において報告される核酸を含む哺乳動物細胞を、リピートモチーフ分子の発現に適した条件下で培養する段階、
-細胞または培地からグリコシル化リピートモチーフ分子を回収し、それによって、グリコシル化リピートモチーフ分子を作製する段階、
-任意で、回収されたグリコシル化リピートモチーフ分子を精製する段階。
[本発明1001]
以下の式
(リピートモチーフ分子−リンカー n ) m −(結合パートナー) q −(リンカー o −リピートモチーフ分子) p
のグリコシル化リピートモチーフ分子結合体であり、ここで、
nおよびoは、互いとは無関係でありかつmおよびpおよびqの各値とは無関係である、0または1の整数値であり、かつ
mおよびpは、互いとは無関係である、0または1または2または3または4または5または6または7の整数値であり、かつ
qは、n、m、o、およびpの値とは無関係である、0または1の整数値であり、
該リピートモチーフ分子結合体が、グリコシル化部位に付着した少なくとも1つのオリゴ糖を含み、かつ
該結合パートナーが、3つのシステイン残基を有する改変抗体重鎖ヒンジ領域を含む、グリコシル化リピートモチーフ分子結合体。
[本発明1002]
前記リピートモチーフ分子がアンキリンリピートモチーフ分子もしくはロイシンリッチリピートモチーフ分子またはアンチカリンであることを特徴とする、本発明1001の結合体。
[本発明1003]
前記アンキリンリピートモチーフ分子がSEQ ID NO:4またはその変異体のアミノ酸配列を有することを特徴とする、本発明1002の結合体。
[本発明1004]
前記リンカーが、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:25〜SEQ ID NO:33より選択されるペプチドリンカーであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの結合体。
[本発明1005]
前記結合パートナーが、多量体形成用結合パートナーであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの結合体。
[本発明1006]
前記多量体形成用結合パートナーが、重鎖CH2ドメインおよびCH3ドメインの天然もしくは改変ペア、重鎖CH1ドメインおよび軽鎖定常ドメインの天然もしくは改変ペア、天然もしくは改変重鎖ヒンジ領域、重鎖ヒンジ領域ならびにCH2ドメインおよびCH3ドメインの天然もしくは改変配列、ロイシンジッパードメイン、イソロイシンジッパードメイン、4ヘリックスバンドル、ならびにp53四量体化ドメインより選択されることを特徴とする、本発明1005の結合体。
[本発明1007]
本発明1001〜1006のいずれかのグリコシル化リピートモチーフ分子結合体を2つ含むことを特徴とする、グリコシル化リピートモチーフ分子結合体。
[本発明1008]
前記多量体形成用結合パートナーが、3つのシステイン残基を有する改変重鎖ヒンジ領域を含む、本発明1007の結合体。
[本発明1009]
以下を特徴とする、前記本発明のいずれかの結合体:
(i) n=1、m=1、q=1、p=0、または
(ii) n=0、m=1、q=1、p=0、または
(iii) m=0、o=1、q=1、p=1、または
(iv) m=0、o=0、q=1、p=1、または
(v) m=1、n=0、o=1、q=1、p=1、または
(vi) m=1、n=1、o=1、q=1、p=1
であり、前記結合パートナーが、重鎖CH2ドメインおよびCH3ドメインの天然もしくは改変ペア、重鎖CH1ドメインおよび軽鎖定常ドメインの天然もしくは改変ペア、ならびに天然もしくは改変重鎖ヒンジ領域、重鎖ヒンジ領域ならびにCH2ドメインおよびCH3ドメインの天然もしくは改変配列より選択され、
前記リピートモチーフ分子が、アンキリンリピートモチーフ分子である。
[本発明1010]
以下を特徴とする、前記本発明のいずれかの結合体:
m=0、q=1、p=1、o=0またはo=1
であり、前記結合パートナーが、N末端のSEQ ID NO:50もしくは51もしくは52とC末端のSEQ ID NO:43もしくは44との結合体、またはN末端のSEQ ID NO:53もしくは54もしくは55とC末端のSEQ ID NO:45もしくは46との結合体より選択され、かつ
前記リピートモチーフ分子が、アンキリンリピートモチーフ分子である。
[本発明1011]
本発明1010のグリコシル化リピートモチーフ分子結合体を2つ含むことを特徴とする、グリコシル化リピートモチーフ分子結合体。
[本発明1012]
以下をさらに含むことを特徴とする、本発明1011のグリコシル化リピートモチーフ分子結合体:
(a)リピートモチーフ分子の結合パートナーがSEQ ID NO:50、51、および52を含む場合には、N末端のSEQ ID NO:53もしくは54もしくは55とC末端のSEQ ID NO:45もしくは46との結合体2つ、または
(b)リピートモチーフ分子の結合パートナーがSEQ ID NO:53、54、および55を含む場合には、N末端のSEQ ID NO:50もしくは51もしくは52とC末端のSEQ ID NO:43もしくは44との結合体2つ。
[本発明1013]
以下の要素を含む、核酸:
-ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-抗体生殖系列遺伝子の5'非翻訳領域、
-免疫グロブリンの重鎖シグナル配列、
-リピートモチーフ分子結合体のコード配列、
-ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列。
[本発明1014]
以下の段階を含む、本発明1001〜1011のいずれかのグリコシル化リピートモチーフ分子結合体を作製するための方法:
-本発明1013の核酸を含む哺乳動物細胞を供給する段階、
-該リピートモチーフ分子結合体の発現に適した条件下で該細胞を培養する段階、
-該細胞または培養培地から該グリコシル化リピートモチーフ分子結合体を回収し、それによって、該グリコシル化リピートモチーフ分子結合体を作製する段階、
-任意で、回収された該グリコシル化リピートモチーフ分子結合体を精製する段階。
[本発明1015]
前記哺乳動物細胞が、CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、Per.C6細胞、およびHEK293細胞より選択される、本発明1014の方法。
以下の一般式のグリコシル化リピートモチーフ分子結合体(GEMOC)が、本明細書において報告される:
(リピートモチーフ分子−リンカーn)m−(結合パートナー)q−(リンカーo−リピートモチーフ分子)p
ここで、nおよびoは、互いとは無関係でありかつmおよびpの各値とは無関係である、0または1の整数値であり、mおよびpは、互いとは無関係である、0または1または2または3または4または5または6または7の整数値であり、qは、独立に0または1であり、
結合パートナーは少なくとも1つのグリコシル化部位を含み、GEMOCは哺乳動物細胞において発現される。
ここで、「x」は全面的に変更可能な位置を示し、
括弧内に与えられるアミノ酸は、この位置に存在可能な特定の変種(variant)を示し、
「a」は、無極性(apolar)側鎖を有するアミノ酸を示し、
「p」は、極性側鎖を有するアミノ酸残基を示し、
「1」は、アミノ酸残基A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、およびY(一文字記号)からなる群より選択されるアミノ酸残基を示し、かつ
「2」は、アミノ酸残基H、N、およびYからなる群より選択されるアミノ酸残基を示す。
中のセリンのように10〜20の間の回数だけ繰り返された単一のアミノ酸から構成されている。1つの態様において、リンカーは、
より選択される。
-リピートモチーフ分子結合体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を供給する段階、
-リピートモチーフ分子の発現に適した条件下で細胞を培養する段階、
-細胞または培養培地からグリコシル化リピートモチーフ分子を回収し、それによって、該グリコシル化リピートモチーフ分子を作製する段階、
-任意で、回収された該グリコシル化リピートモチーフ分子を精製する段階。
-ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-抗体生殖系列遺伝子の5'非翻訳領域、
-免疫グロブリンの重鎖シグナル配列、
-リピートモチーフ分子結合体のコード配列、
-ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列。
1)リーダーペプチド-リピートモチーフ分子-ヘキサヒスチジンタグ、
2)リーダーペプチド-リピートモチーフ分子-免疫グロブリンFc断片、
3)リーダーペプチド-免疫グロブリンFc断片-リピートモチーフ分子、
4)リーダーペプチド-免疫グロブリンFab断片-リピートモチーフ分子。
SEQ ID NO:01 アンキリンリピートモチーフ分子のアミノ酸のコンセンサス配列1。
SEQ ID NO:02 アンキリンリピートモチーフ分子のアミノ酸のコンセンサス配列2。
SEQ ID NO:03 アンキリンリピートモチーフ分子のアミノ酸のコンセンサス配列3。
SEQ ID NO:04 アンキリンリピートモチーフ分子のアミノ酸のコンセンサス配列4。
SEQ ID NO:05 アンキリンリピートモチーフ分子のアミノ酸のコンセンサス配列5。
SEQ ID NO:06 アンキリンリピートモチーフ分子のアミノ酸のコンセンサス配列6。
SEQ ID NO:07 アンキリンリピートモチーフ分子のアミノ酸のコンセンサス配列7。
SEQ ID NO:08 アンキリンリピートモチーフ分子のアミノ酸のコンセンサス配列8。
SEQ ID NO:09 アンキリンリピートモチーフ分子のアミノ酸のコンセンサス配列9。
SEQ ID NO:10 ヘキサヒスチジンタグアミノ酸配列がC末端に結合したリピートモチーフ分子モデルH10-2-G3。
SEQ ID NO:11 IgG1 Fc部分がC末端に結合したリピートモチーフ分子モデルH10-2-G3。
SEQ ID NO:12 ヘキサヒスチジンタグアミノ酸配列がC末端に結合したリピートモチーフ分子モデル9-26。
SEQ ID NO:13 IgG1 Fc部分がC末端に結合したリピートモチーフ分子モデル9-26。
SEQ ID NO:14〜33 ペプチドリンカー配列。
SEQ ID NO:34 ヒンジ領域中に2つのジスルフィド結合を有するIgG1 Fc部分がC末端に結合したリピートモチーフ分子モデルH10-2-G3。
SEQ ID NO:35 ヒンジ領域中に2つのジスルフィド結合を有するIgG1 Fc部分がC末端に結合したリピートモチーフ分子モデル9-26。
SEQ ID NO:36 CH3ノブドメインを有するIgG1 Fc部分がC末端に結合したリピートモチーフ分子モデルH10-2-G3。
SEQ ID NO:37 CH3ホールドメインを有するIgG1 Fc部分がC末端に結合したリピートモチーフ分子モデル9-26。
SEQ ID NO:38 リピートモチーフ分子モデル9-26がC末端に結合したリピートモチーフ分子モデルH10-2-G3。
SEQ ID NO:39 リピートモチーフ分子モデル9-26がC末端に結合されヒンジ領域中に2つのジスルフィド結合を有するIgG1 Fc部分がC末端に結合した、リピートモチーフ分子モデルH10-2-G3。
SEQ ID NO:40 ヘキサヒスチジンタグがC末端に結合したリピートモチーフ分子モデル9-26がC末端に結合した、リピートモチーフ分子モデルH10-2-G3。
SEQ ID NO:41 ヘキサヒスチジンタグがC末端に結合したリピートモチーフ分子モデルH10-2-G3がC末端に結合した、リピートモチーフ分子モデル9-26。
SEQ ID NO:42 ヘキサヒスチジンタグがC末端に結合したリピートモチーフ分子9-26二量体モデル。
SEQ ID NO:43 ヒトIgG1定常領域。
SEQ ID NO:44 ヒトIgG4定常領域。
SEQ ID NO:45 ヒトκ定常領域。
SEQ ID NO:46 ヒトλ定常領域。
SEQ ID NO:47 N末端キャッピングリピート。
SEQ ID NO:48 C末端キャッピングリピート。
SEQ ID NO:49 CMVプロモーター配列。
SEQ ID NO:50 抗Aβ抗体可変重鎖ドメイン(variable heavy chain domain)アミノ酸配列。
SEQ ID NO:51 抗Aβ抗体可変重鎖ドメインアミノ酸配列。
SEQ ID NO:52 抗Aβ抗体可変重鎖ドメインアミノ酸配列。
SEQ ID NO:53 抗Aβ抗体可変軽鎖ドメイン(variable light chain domain)アミノ酸配列。
SEQ ID NO:54 抗Aβ抗体可変軽鎖ドメインアミノ酸配列。
SEQ ID NO:55 抗Aβ抗体可変軽鎖ドメインアミノ酸配列。
SEQ ID NO:56 ヘキサヒスチジンタグアミノ酸配列がC末端に結合し、Cキャッピングリピートの最初の位置に改変グリコシル化部位が導入されたリピートモチーフ分子モデルH10-2-G3。
SEQ ID NO:57 IgG1 Fc部分がC末端に結合し、そのC末端に膜アンカードメインが結合したリピートモチーフ分子モデルH10-2-G3。
SEQ ID NO:58 ヘキサヒスチジンタグアミノ酸配列がC末端に結合し、Cキャッピングリピートの最初の位置に改変グリコシル化部位が導入されたリピートモチーフ分子モデル9-26。
SEQ ID NO:59 IgG1 Fc部分がC末端に結合し、そのC末端に膜アンカードメインが結合したリピートモチーフ分子モデル9-26。
SEQ ID NO:60 ヘキサヒスチジンタグアミノ酸配列がC末端に結合し、C末端領域中にグリコシル化タグを有する、リピートモチーフ分子モデルH10-2-G3。
SEQ ID NO:61 ヘキサヒスチジンタグアミノ酸配列がC末端に結合し、C末端領域中にグリコシル化タグを有する、リピートモチーフ分子モデル9-26。
SEQ ID NO:62 ヘキサヒスチジンタグアミノ酸配列およびグリコシル化タグがC末端に結合したリピートモチーフ分子モデルH10-2-G3。
SEQ ID NO:63 ヘキサヒスチジンタグアミノ酸配列およびグリコシル化タグがC末端に結合したリピートモチーフ分子モデル9-26。
SEQ ID NO:64 ヘキサヒスチジンタグを有するアンチカリンA-44を含む結合体モデル。
SEQ ID NO:65 Fcタグおよびヒンジ領域中の3つのジスルフィド架橋を有するアンチカリンA-44モデル。
SEQ ID NO:66 Fcタグおよびヒンジ領域中の2つのジスルフィド架橋を有するアンチカリンA-44モデル。
プラスミド構築
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989において説明されているように、標準的方法を用いてDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の取扱い説明書に従って使用した。遺伝子合成によって、所望の遺伝子セグメントを調製した。合成した遺伝子断片を指定の発現ベクター中にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列をDNA配列決定によって確認した。
SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:12の結合体をコードする遺伝子セグメントを、独特な制限部位BsmIおよびBpu10Iを介して指定の発現プラスミド中にクローニングした。発現プラスミドは、例えばHEK293細胞における発現とその後の精製のために、結合体のコード配列とC末端ヘキサヒスチジンタグを組み合わせるように設計した。結合体の発現カセットのほかに、プラスミドは以下を含む:
-大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする、ベクターpUC18由来の複製起点、および
-大腸菌にアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
-ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト抗体生殖系列遺伝子の5'非翻訳領域、
-シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列(シグナル配列1、イントロン、シグナル配列2[L1-イントロン-L2])およびL2の3'末端の独特な制限部位BsmI、
-結合体のコード配列、
-結合体のコード配列の3'末端の独特なBpu10Iをコードし、結合体のコード配列とインフレームであるGSGリンカー、
-GSGリンカーの3'末端にあり、結合体のコード配列およびGSGリンカーとインフレームである、ヘキサヒスチジンタグ
-ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列、ならびに
-発現される配列の3'末端の独特な制限部位NheIおよびEagI。
SEQ ID NO:11またはSEQ ID NO:13の結合体をコードする遺伝子セグメントを、独特な制限部位HindIIIおよびPmlIを介して指定の発現プラスミド中にクローニングした。発現プラスミドは、クラスIgG1免疫グロブリンのヒンジ領域のN末端に結合体を結合し、それによって、天然のVHドメインおよびCH1ドメインと入れ替わるように設計した。結果として生じる発現プラスミドは、例えばHEK293細胞においてそれぞれSEQ ID NO:11および13の結合体を発現させるために有用であった。IgG1のヒンジ、CH2配列、およびCH3配列に結合したリピートモチーフ分子の発現カセットのほかに、プラスミドは以下を含む:
-大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする、ベクターpUC18由来の複製起点、および
-大腸菌にアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
-ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒトサイトメガロウイルスのイントロンA配列、
-ヒト抗体生殖系列遺伝子の5'非翻訳領域、
-シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列(シグナル配列1、イントロン、シグナル配列2[L1-イントロン-L2])およびL2の3'末端の独特な制限部位BsmI、
-結合体のコード配列、
-ヒトIgG1のヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインをコードし、結合体のコード配列のクローニングを可能にする独特なPmlI制限部位をヒンジ領域中に有する配列、ならびに
-ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列。
ヘキサヒスチジンタグを有していないSEQ ID NO:10および12のリピートモチーフ分子と結合させることができる抗体の例は、アミロイドβ-A4ペプチドに対する抗体(抗Aβ抗体)である。このような抗体および対応する核酸配列は、例えば、WO 2003/070760またはUS 2005/0169925において報告されている。結合体をコードする遺伝子セグメントを、独特な制限部位MroIおよびNheIを介して指定の発現プラスミド中にクローニングした。発現プラスミドは、サブクラスIgG1のヒト免疫グロブリン重鎖のC末端にポリペプチドを結合するように設計した(ゲノムが組織化された(genomically organized)発現カセット;エキソン-イントロン構成(organization))。結果として生じる発現プラスミドは、例えばHEK293細胞において結合体を発現させるために有用であった。モノクローナル抗体の重鎖-リピートモチーフ分子結合体の発現カセットのほかに、プラスミドは以下を含む:
-大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする、ベクターpUC18由来の複製起点、および
-大腸菌にアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
-ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト抗体生殖系列遺伝子の5'非翻訳領域、
-シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列(シグナル配列1、イントロン、シグナル配列2[L1-イントロン-L2])、
-スプライス供与部位および3'末端の独特なBamHI制限部位と共に配列された、抗Ab抗体可変重鎖ドメインをコードするセグメント、
-イントロンで隔てられた、ヒトγ1定常ドメインCH1、ヒンジ、CH2、およびCH3をコードする核酸、
-CH3ドメインの3'末端にインフレームで融合された(G4S)3リンカー、
-リンカーのC末端にインフレームなポリペプチドのクローニングを可能にする、リンカーの3'末端の独特な制限部位MroIおよびNheI、ならびに
-ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列。
抗体軽鎖の発現のために、プラスミド5170を使用した。プラスミド5170は、例えば、HEK293細胞において抗体軽鎖を一過性発現させるための発現プラスミドである(ゲノムが組織化された(genomically organized)発現カセット;エキソン-イントロン構成(organization))。
-選択マーカーとしてのネオマイシン(neomycine)耐性遺伝子、
-大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする、ベクターpUC18由来の複製起点、および
-大腸菌にアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子。
-ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト抗体生殖系列遺伝子の5'非翻訳領域、
-シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列(シグナル配列1、イントロン、シグナル配列2[L1-イントロン-L2])、
-スプライス供与部位および3'末端の独特なBamHI制限部位、短縮されたヒトκ軽鎖イントロン2と共に配列された、抗Aβ抗体可変軽鎖ドメインをコードするセグメント、
-ヒトκ軽(light)遺伝子定常ドメイン
-ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列、ならびに
-3'末端の独特な制限部位AscIおよびSgrAI。
一過性のトランスフェクションおよび発現
実施例1において例示した本発明による組換え結合体を、懸濁液中で増殖するHEK293-Freestyle細胞(ヒト胎児由来腎臓細胞株(human embryonic kidney cell line 293)、Invitrogen)の一過性トランスフェクションによって得た。30ml〜250ml培地の規模、振盪フラスコ中、37℃、8%CO2で、6mMグルタミン(Ultra-Glutamine(Biowhittake/Lonza)またはL-Glutamine(Sigma)のいずれか)を添加したF17培地(Gibco)またはFreestyle 293培地(Invitrogen)において、トランスフェクトされた細胞を培養した。トランスフェクションのために、Fectin(Invitrogen)を試薬(μl)とDNA(μg)の比率4:3で使用した。抗体重鎖のC末端への結合体の場合、軽鎖をコードするプラスミドと重鎖をコードするプラスミドをそれぞれ1:2〜2:1の範囲のモル比で用いて、2つの異なるプラスミドから軽鎖および重鎖を発現させた。結合体を含む細胞培養物上清を、トランスフェクション後6〜8日目に回収した。例えばHEK293細胞におけるヒト免疫グロブリンの組み換え発現に関する一般的情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203において与えられる。
SDS-PAGEを用いた発現解析
LDS試料用緩衝液、4倍濃縮物(4×LDS):4gグリセロール、0.682g TRIS(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(tris-(hydroxymethyl)-aminomethane))、0.666g TRIS-HCl(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(tris-(hydroxymethyl)-aminomethane-hydrochloride))、0.8g LDS(lithium dodecyl sulfate)、0.006g EDTA(ethylene diamin tetra acid)、1重量%(w/w)のServa Blue G250水溶液0.75ml、1重量%(w/w)のフェノールレッド水溶液0.75ml、水を加えて総体積10mlにする。
アフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過クロマトグラフィーによるタンパク質精製
Fc結合体および抗体結合体
発現され分泌されたFc結合体および抗体結合体を、プロテインA親和性材料MabSelectSure(GE Healthcare)を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。簡単に説明すると、遠心分離(10,000gで10分間)および0.45μmフィルターによるろ過後、結合体を含む清澄にした培養上清を、PBS緩衝液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl、および2.7mM KCl、pH7.4)で平衡にしたMabSelectSureカラムに添加した。平衡緩衝液で洗浄することによって、未結合タンパク質を除去した。0.1Mクエン酸緩衝液、pH3.3で結合体を溶出させ、生成物を含む画分を1M TRIS pH9.0で中和した。その後、溶液を4℃でPBS緩衝液に対して透析し、Amicon Centricon濃縮装置を用いて濃縮し、0℃で氷水を入れた水槽中に保存した。解析的サイズ排除クロマトグラフィーによって、Fc結合体および抗体結合体の凝集を解析した。高分子量の凝集物を示す画分を分取用サイズ排除クロマトグラフィーに供した。簡単に説明すると、Centricon装置(Amicon)中で濃縮および希釈を繰り返すことによって、結合体の緩衝液をヒスチジン緩衝液(20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0)に交換した。1〜4mlに濃縮した後、結合体を含む溶液を、同じヒスチジン緩衝液で平衡にしたSuperdex200 High Loadカラム(GE HealthCare)に添加した。1mlの画分を採取した。解析的SEC(Superdex200、GE HealthCare)によって全画分を解析し、単量体だけ(purely)の結合体を有する画分を集めた。以前のパラグラフで説明したように、還元剤の存在下および不在下でクーマシーブリリアントブルーによって染色するSDS-PAGEによって、結合体の完全性を解析した。
ヘキサヒスチジンタグを含む発現され分泌された結合体(SEQ ID NO:10および12)を、公知の方法に従って、ニッケルキレート化親和性材料Ni-Sepharose HP HighTrap(GE Healthcare)を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。簡単に説明すると、遠心分離(10,000gで10分間)および0.45μmフィルターによるろ過後、結合体を含む清澄にした培養上清を、リン酸緩衝液(50mM Na3PO4、300mM NaCl、pH8.0)で平衡にしたNi-Sepharoseカラムに添加した。20mMイミダゾールを含むリン酸平衡緩衝液で洗浄することによって、未結合タンパク質を除去した。導電率勾配(conductivity gradient)を用いて、結合体を溶出させた。その後、結合体を含む溶液を4℃でヒスチジン緩衝液(20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0)に対して徹底的に(extensively)透析し、Amicon Centricon濃縮装置を用いて濃縮し、0℃で氷水を入れた水槽中に保存した。解析的サイズ排除クロマトグラフィーによって、Fc結合体および抗体結合体の凝集を解析した。高分子量の凝集物を示す画分を、公知の方法に従う分取用サイズ排除クロマトグラフィーに供した。簡単に説明すると、結合体を含む濃縮された溶液を、上記に報告したように、同じヒスチジン緩衝液で平衡にしたSuperdex200 High Loadカラム(GE HealthCare)に添加した。1mlの画分を採取した。解析的SEC(Superdex200、GE HealthCare)によって全画分を解析し、単量体だけの結合体を有する画分を集めた。以前のパラグラフで説明したように、還元剤の存在下および不在下でクーマシーブリリアントブルーによって染色するSDS-PAGEによって、結合体の完全性を解析した。
BIAcoreによる結合アッセイ法
表面プラズモン共鳴測定はすべて、BIAcore 3000機器(GE Healthcare Biosciences AB、Sweden)を用いて25℃で実施した。泳動用緩衝液および希釈緩衝液は、PBS(1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、105mM NaCl、2.7mM KCl)、pH6.0、0.005%(v/v) Tween 20であった。可溶性プロテインAを10mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0中で希釈し、標準的なアミンカップリングキット(GE Healthcare Biosciences AB、Sweden)を用いてCM5バイオセンサーチップ上に固定して、約1000 RUのプロテインA表面密度を得た。HBS-P(10mM HEPES、pH7.4、118mM NaCl、0.005%サーファクタントP20;GE Healthcare Biosciences AB、Sweden)を固定化中の泳動用緩衝液として使用した。問題のFc結合体および抗体結合体を、PBS、0.005%(v/v) Tween 20、pH6.0で濃度が450nMになるまで希釈し、30μl/分の流速で3分間に渡って注入した。次いで、可溶性リガンドを同じ緩衝液中で70〜680nMの間の様々な濃度に希釈し、30μl/分の流速で3分間に渡って注入した。その後、PBS、pH8.0、0.005%(v/v) Tween 20で1分間、センサーチップを再生した。BIAevaluationソフトウェア(BIAcore、Sweden)を用いてデータ解析を実施した(図19を参照されたい)。
ELISAによる結合アッセイ法
ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)試験を用いて、Fc結合体および抗体結合体の結合を測定した。本明細書においては、ストレプトアビジン/ビオチン技術に基づいたサンドイッチアッセイ法を使用した。ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレートをこのアッセイ法のために使用した。
FACSによる結合アッセイ法
HER2を過剰発現する安定な細胞株SK-BR-3(ATCC番号HTB-30)を、10%ウシ胎児血清(FCS)および2mM L-グルタミンを添加したマッコイ5a培地(PAN)中で培養した。本発明による結合体によって細胞表面のHER2を検出するために、ブロッキング試薬として1%FCSを添加したPBSで細胞を洗浄した。PBS/1% FCS中、4℃で15分間、結合体を細胞と共にインキュベートし、洗浄し、結合体を検出する適切な蛍光標識二次抗体と共にインキュベートした。標識された細胞を、蛍光支援型細胞選別(fluorescence assisted cell sorting)(FACS)により、細胞への結合体の結合に関して選別した。
Claims (8)
- 以下の式
(リピートモチーフ分子−リンカーn)m−(結合パートナー)q−(リンカーo−リピートモチーフ分子)p
のグリコシル化リピートモチーフ分子結合体であり、ここで、
n=1、m=1、q=1およびp=0であり、
該リピートモチーフ分子結合体が、グリコシル化部位に付着した少なくとも1つのオリゴ糖を含み、
該結合パートナーが、3つのシステイン残基を有する改変抗体重鎖ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含み、
該ヒンジ領域の3つのシステイン残基は、ヒンジ領域中に3つの鎖間ジスルフィドを形成して、グリコシル化リピートモチーフ分子結合体の二量体を形成するものであり、且つ
該リピートモチーフ分子が、アンキリンリピートモチーフ分子である、
グリコシル化リピートモチーフ分子結合体。 - 以下の式
(リピートモチーフ分子−リンカーn)m−(結合パートナー)q−(リンカーo−リピートモチーフ分子)p
のグリコシル化リピートモチーフ分子結合体であり、ここで、
n=0、m=1、q=1およびp=0であり、
該リピートモチーフ分子結合体が、グリコシル化部位に付着した少なくとも1つのオリゴ糖を含み、
該結合パートナーが、3つのシステイン残基を有する改変抗体重鎖ヒンジ領域、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを含み、
該ヒンジ領域の3つのシステイン残基は、ヒンジ領域中に3つの鎖間ジスルフィドを形成して、グリコシル化リピートモチーフ分子結合体の二量体を形成するものであり、且つ
該リピートモチーフ分子が、アンキリンリピートモチーフ分子である、
グリコシル化リピートモチーフ分子結合体。 - 前記アンキリンリピートモチーフ分子がSEQ ID NO:4のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1または2記載の結合体。
- 前記リンカーが、SEQ ID NO:14およびSEQ ID NO:25〜SEQ ID NO:33より選択されるペプチドリンカーであることを特徴とする、請求項1または3記載の結合体。
- 請求項1〜4のいずれか一項記載のグリコシル化リピートモチーフ分子結合体を2つ含むことを特徴とする、グリコシル化リピートモチーフ分子結合体。
- 以下の要素を含む、核酸:
-ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-抗体生殖系列遺伝子の5'非翻訳領域、
-免疫グロブリンの重鎖シグナル配列、
-請求項1〜4のいずれか一項記載のグリコシル化リピートモチーフ分子結合体のコード配列、
-ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列。 - 以下の段階を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のグリコシル化リピートモチーフ分子結合体を作製するための方法:
-請求項6記載の核酸を含む哺乳動物細胞を供給する段階、
-該グリコシル化リピートモチーフ分子結合体の発現に適した条件下で該細胞を培養する段階、
-該細胞または培養培地から該グリコシル化リピートモチーフ分子結合体を回収し、それによって、該グリコシル化リピートモチーフ分子結合体を作製する段階、
-任意で、回収された該グリコシル化リピートモチーフ分子結合体を精製する段階。 - 前記哺乳動物細胞が、CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、Per.C6細胞、およびHEK293細胞からなる群より選択される、請求項7記載の方法。
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