CN111094355A

CN111094355A - 稳定的多特异性抗体

Info

Publication number: CN111094355A
Application number: CN201880029825.2A
Authority: CN
Inventors: E.朱科夫斯基; O.莱格尔; R.J.莫尔斯
Original assignee: Biomunex Pharmaceuticals
Current assignee: Biomunex Pharmaceuticals
Priority date: 2017-03-27
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2020-05-01
Also published as: RU2019134211A; ZA201906981B; JP7432365B2; KR20190141154A; JP2023175760A; RU2019134211A3; AU2018241881A1; SG11201908825TA; IL269559B2; MX2019011585A; US11560437B2; IL269559B1; EP3601366A1; CA3057567A1; WO2018178101A1; CA3057567C; BR112019019998A2; IL269559A; US20200299413A1; JP2020515253A

Abstract

本发明涉及多特异性抗体构建体，其包含在CH1和CL结构域的界面处具有特定突变组的Fab片段，所述突变防止重链/轻链错配。

Description

稳定的多特异性抗体

本发明涉及在医学领域中有用的多特异性抗体分子的生产。

发明背景

双特异性抗体(bsAb)结合了两种抗体的特异性，并同时针对不同的抗原或表位。具有“两个靶标”功能的BsAb可以干扰例如与癌症，增殖或炎症过程相关的多种表面受体或配体。BsAb还可将靶标紧密相邻，以支持一个细胞上蛋白质复合物的形成，或触发细胞之间的接触。“强制连接”功能的实例是支持凝血级联中蛋白质络合的bsAb，或靶向肿瘤的免疫细胞募集者和/或激活剂。经过多年的研究和开发，第一个bsAb于2009年获得批准。

最初，双特异性抗体是通过化学缀合或通过使用产生两种不同mAb的两种杂交瘤细胞系之间融合产生的四交瘤(quadromas)制备的。然而，化学缀合有时可能会改变抗原结合位点，从而导致抗体的生物学特性受损。四交瘤方法具有这样的缺点，即来自两种不同抗体的重链和轻链的随机配对在理论上产生十种同样可能的组合，从而产生免疫球蛋白分子的混合物，其中只有一种是所需的双特异性产物，必须将其与错误配对的产物分开。

遗传改造现已成为生产双特异性抗体的首选方法，并已导致多种不同的重组双特异性抗体形式的开发。这些双特异性抗体中的一些非常简单，它们源自通过适当的肽接头连接的两种(或多种)不同抗体的单链Fv(scFv)片段。这些抗体相对容易生产，并且由于它们由一条多肽链形成并且仅包含亲本抗体的Fv区，因此在链之间不会出现错配的问题。然而，它们小于全长免疫球蛋白，并且没有恒定区，特别是Fc区。尽管在一些应用中可能是有利的，例如当希望避免Fc介导的效应时，但在需要Fc介导的效应功能时却是不利的。而且，由于它们的尺寸小并且缺乏Fc区，它们具有非常短的体内半衰期。

因此，已经设计了其他双特异性重组抗体形式，其更接近地模拟天然存在的免疫球蛋白分子，特别是具有完整的Fc区。它们可以被分为两种主要形式。

在第一种抗体(IgG scFv)中，来自抗体A的scFv片段与抗体B重链的末端(通常为C-末端)融合。所得抗体仅具有一种类型的重链(其包含抗体B的VH、CH1、CH2和CH3结构域以及抗体A的VH和VL结构域)，和一种类型的轻链(其包含抗体B的VL和CL结构域)，不会发生链之间的错配。例如Qu等人(Blood,111,2211-2219,2008)描述了这种形式。

在第二种抗体中，抗体A的重链和轻链与抗体B的重链和轻链配对。这种形式再生了四交瘤产生的双特异性抗体，因此也产生了类似的错配问题。为了解决重链错配对的问题，已经提出了使抗体的CH3结构域突变以促进其异二聚化(即，重链A与重链B配对)并防止其同二聚化。这是通过所谓的“旋钮进入孔(knob into holes)”方法来完成的(Ridgway等人，Protein Eng，9，617-21，1996；美国专利7,695,936)。在抗体A的重链的CH3二聚体界面处引入了“旋钮”突变，该突变由较小的氨基酸替换为较大的氨基酸组成，产生空间位阻，其阻止了同二聚化。同时，为了促进异二聚化，将由大氨基酸被较小氨基酸替换组成的互补“孔”突变引入抗体B的CH3结构域。为了解决重链/轻链错配的问题，已经建议使用不同特异性但共享共同轻链的抗体，该抗体先前已从scFv噬菌体文库中鉴定出来(Merchant等人，Nat Biotechnol,16,677-81,1998；美国专利7,183,076)。该方法的缺点是难以鉴定具有共同轻链的抗体。国际专利申请WO2013/005194提出，可以通过使CH1和CL结构域的界面处的一些关键残基突变来防止重链/轻链错配，并因此确保链的期望配对。

发明概述

本发明人现已发现，一组新的突变可以进一步改善多特异性抗体分子中链的匹配。

本发明涉及多特异性，例如双特异性抗体构建体，其包含在CH1和CL结构域的界面处具有特定组突变的不同Fab片段，所述突变促进重链/轻链的同源配对并防止其错配。

本文中用于CH1和CL结构域的序列位置编号是指Kabat编号(Kabat，EA等人，Sequences of proteins of immunological interest.第5版-US Department of Healthand Human Services，NIH出版物，第91-3242号，第662,680,689页，1991年)。

本文提供选自以下的突变的Fab片段：

a)Fab片段，其由以下组成：

-目的抗体的VH和VL结构域；

-通过CH1结构域的192位上的苏氨酸残基被天冬氨酸取代而衍生自免疫球蛋白的CH1结构域的CH1结构域，和

-通过CL结构域的137位上的天冬酰胺残基被赖氨酸残基取代并且CL结构域的114位上的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代而衍生自免疫球蛋白的CL结构域的CL结构域；和

b)Fab片段，其由以下组成：

-目的抗体的VH和VL结构域；

-通过CH1结构域的124位上的亮氨酸残基被谷氨酰胺取代并且CH1结构域的188位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自免疫球蛋白的CH1结构域的CH1结构域；和

-通过CL结构域的133位上的缬氨酸残基被苏氨酸残基取代并且CL结构域的176位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自免疫球蛋白的CL结构域的CL结构域。

包含这种突变的Fab片段的任何构建体，优选任何蛋白质构建体，都是本发明的一部分。

特别地，提供了多特异性抗原结合片段，其包含具有不同的CH1和CL结构域的至少两个Fab片段，其中每个Fab片段识别不同的目的表位，并且所述Fab片段以任何顺序串联排列，第一Fab片段的CH1结构域的C-末端通过多肽接头与随后的Fab片段的VH结构域的N-末端连接，

其中至少一个Fab片段，更优选两个片段选自：

a)Fab片段，其由以下组成

通过CH1结构域的192位上的苏氨酸残基被天冬氨酸取代而衍生自免疫球蛋白的CH1结构域的CH1结构域，和

b)Fab片段，其由以下组成：

-目的抗体的VH和VL结构域；

根据优选的实施方案，CH1结构域衍生自IgG免疫球蛋白，有利地为IgG1亚型。CL结构域优选是κ型。优选地，用于人类治疗时，从中衍生出突变的CH1和突变的CL结构域的免疫球蛋白是人类免疫球蛋白。

VH和VL结构域可衍生自任何天然或遗传改造的抗体，其识别人们希望靶向的表位。

本发明的突变的Fab片段可用于其中需要促进重链/轻链的同源配对并防止其错配的任何多特异性抗体构建体中。

有利地，突变的Fab片段可以用于包含抗原结合片段的多特异性抗体分子中，所述抗原结合片段中的每一个基本上由接头隔开的串联排列的Fab片段组成。

因此，本发明的另一个目标是多特异性抗原结合片段，其包含选自以下的至少两个，并且高达六个不同的Fab片段：

-包含免疫球蛋白的野生型CH1和CL结构域的Fab片段(在本文中也定义为：“野生型Fab片段”)

-如上文所定义的突变的Fab片段(a)；

-如上文所定义的突变的Fab片段(b)；

每个Fab片段识别不同目的表位，并且所述Fab片段以任意顺序串联排列，第一Fab片段的CH1结构域的C-末端与随后的Fab片段的VH结构域的N-末端连接通过多肽接头连接；

或一个或两个Fab片段以任何顺序串联排列，并通过多肽接头连接CH3结构域的C-末端或铰链序列的C-末端，而另一个Fab或两个串联排列的Fab以任何顺序附着到铰链序列的N-末端。

上述铰链序列通常是获自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgD的天然铰链序列，并且最优选获自IgG1，或者可以是其通过点突变和/或添加氨基而修饰的序列，从而所述修饰的铰链序列由少于80个氨基酸，优选少于60个氨基酸，仍优选少于40个氨基酸组成。

“抗原结合片段”在本文中定义为具有两个或多个抗原结合区域的分子，每个区域识别不同的表位。不同的表位可以由相同的抗原分子或不同的抗原分子携带。

在优选的实施方案中，进一步提供了具有两个相同的抗原结合臂的多特异性抗体，每个臂由多特异性抗原结合片段，即能够结合多个(即，一个以上)抗原的抗原结合片段组成，如上所述。

在特定的实施方案中，多特异性抗体具有免疫球蛋白样结构，并包含

-两个相同的抗原结合臂，每个臂由上文定义的此类多特异性抗原结合片段组成；

-免疫球蛋白的二聚化的CH2和CH3结构域；

-IgA、IgG或IgD的铰链区，将抗原结合臂的CH1结构域的C-末端连接到CH2结构域的N-末端。

更特别地，本发明的一个主题是包含两个重链和四个轻链的多特异性，优选双特异性抗体，其中每个重链包含

-包含铰链-CH2-CH3结构域的免疫球蛋白的Fc区，

-所述Fc区通过所述铰链结构域与抗体1(Ab1)的Fab重链CH1-VH连接，

-其继而通过多肽接头序列与抗体2(Ab2)的Fab重链CH1-VH连接，并且该多肽接头序列连接所述Ab1的Fab重链VH结构域的N-末端与所述Ab2的CH1结构域的C-末端，

并且四个轻链包含与它们的同源(cognate)重链结构域相关的Ab1的Fab轻链CL-VL和Ab2的Fab轻链CL-VL；

其中Ab1和Ab2识别不同的表位，

并且其中Ab1或Ab2之一的Fab CH1结构域是突变的结构域，其通过CH1结构域的192位上的苏氨酸残基被天冬氨酸取代而衍生自免疫球蛋白的CH1结构域并且同源CL结构域是突变的结构域，其通过CL结构域的137位上的天冬酰胺残基被赖氨酸残基取代并且CL结构域的114位上的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代而衍生自免疫球蛋白的CL结构域，和/或

其中Ab1或Ab2中一个或另一个的Fab CH1结构域是突变域，其通过CH1结构域的124位上的亮氨酸残基被谷氨酰胺取代并且CH1结构域的第188位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自免疫球蛋白的CH1结构域，并且同源CL结构域是突变的结构域，其通过CL结构域的133位上的缬氨酸残基被苏氨酸残基取代并且CL结构域的176位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自免疫球蛋白的CL结构域。

进一步描述了选自以下的任何蛋白质链：

-本发明的突变的Fab片段的轻链；

-本发明的突变的Fab片段的重链；

-本发明的抗原结合片段的重链；

-本发明的免疫球蛋白样多特异性抗体的重链。

本公开内容进一步提供了包含编码本发明蛋白链的序列的多核苷酸。所述多核苷酸还可以包含另外的序列：特别地，其可以有利地包含编码允许分泌所述蛋白链的前导序列或信号肽的序列。

附图简述

图1显示了在还原和非还原条件下BiXAb-6567的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳道1：在还原条件下BiXAb-6567的迁移；泳道2：分子量标记，指示每个条带的重量；泳道3：在非还原条件下BiXAb-6567的迁移。

图2显示了BiXAb-6567的尺寸排阻色谱分析。

图3显示了通过差示扫描量热法测定的两个亲本抗体(抗CD38和抗PD-L1)和BiXAb-6567的熔解曲线。

图4A显示了直接CD38抗原结合ELISA中两个亲本抗体(抗CD38和抗PD-L1)和BiXAb-6567的结合曲线。图4B显示了直接PD-L1抗原结合ELISA中两个亲本抗体(抗CD38和抗PD-L1)和BiXAb-6567的结合曲线。图4C显示了双重抗原(PD-L1和CD38)结合ELISA中BiXAb-6567的结合曲线。

图5A至5C显示三个不同的细胞系上两个亲本mAb(抗CD38和抗PD-L1)和BiXAb-6567的荧光激活细胞分选曲线，图5A：多发性骨髓瘤RPMI-8226，5B：稳定转染了全长CD38的CHO细胞，和5C：卵巢癌细胞系SKOV-3。

图6显示了两个亲本抗体(抗CD38和抗PD-L1)，BiXAb-6567和阴性对照抗CD20抗体在CHO-CD38细胞系上的滴定结合曲线。

图7显示了在采用多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226作为靶细胞和未分级的非预活化的单核细胞作为效应细胞的ADCC测定中，两个亲本抗体(抗CD38和抗PD-L1)，BiXAb-6567和两个阴性对照抗体抗CD20和抗HER2的细胞毒活性曲线。

图8显示了在利用CHO-CD38细胞系作为靶细胞和未分级的非预活化的单核细胞作为效应细胞的ADCC测定中，两个亲本抗体(抗CD38和抗PD-L1)，BiXAb-6567和两个阴性对照抗体抗CD20和抗HER2的细胞毒活性曲线。

图9显示了在利用SKOV-3细胞系作为靶细胞并且富集的IL-12预活化的NK细胞作为效应细胞的ADCC测定中，两个亲本抗体(抗CD38和抗PD-L1)，BiXAb-6567和两个阴性对照抗体抗CD20和抗HER2的细胞毒活性曲线。

图10显示了在利用SKOV-3细胞系作为靶细胞并且富集的IL-15预活化的NK细胞作为效应细胞的ADCC测定中，两个亲本抗体(抗CD38和抗PD-L1)，BiXAb-6567和两个阴性对照抗体抗CD20和抗HER2的细胞毒活性曲线。

图11是本发明的双特异性抗体的示意图，其包含两个重链和四个轻链，并显示了突变的不同组合。

发明详述

定义：

天然存在的抗体分子的基本结构是由两个相同的重链和两个相同的轻链组成的Y型四聚体四级结构，它们通过非共价相互作用和链间二硫键结合在一起。

在哺乳动物物种中，有五种类型的重链：α、δ、ε、γ和μ，其决定了免疫球蛋白的类别(同种型)：分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。重链N-末端可变域(VH)后是恒定区，在重链γ、α和δ中包含三个结构域(从N-末端到C-末端编号为CH1、CH2和CH3)，而重链μ和ε的恒定区由四个结构域组成(从N-末端到C-末端编号为CH1、CH2、CH3和CH4)。IgA、IgG和IgD的CH1和CH2结构域由柔性铰链隔开，该铰链的长度在不同类型之间变化，对于IgA和lgG，在不同亚型之间是不同的：lgG1、lgG2、IgG3和IgG4分别具有15、12、62(或77)和12个氨基酸的铰链，而IgA1和IgA2分别具有20和7个氨基酸的铰链。

具有两种类型的轻链：λ和κ，其可以与任何重链同种型结合，但是在给定的抗体分子中它们都是同一类型。两个轻链在功能上似乎相同。它们的N-末端可变结构域(VL)之后是恒定区，该恒定区由称为CL的单个结构域组成。

重链和轻链通过CH1和CL结构域之间的蛋白质/蛋白质相互作用，并通过VH/VL相互作用配对，并且两个重链通过其CH3结构域之间的蛋白质/蛋白质相互作用而结合。免疫球蛋白分子的结构通常通过CH1和CL结构域之间以及铰链之间的链间二硫键来稳定。

抗原结合区对应于Y形结构的臂，其由与重链的VH和CH1结构域配对的每个完整的轻链组成，并且称为Fab片段(用于片段抗原结合)。Fab片段首先由木瓜蛋白酶消化天然免疫球蛋白分子产生，该酶在链间二硫键氨基末端侧的铰链区切割抗体分子，从而释放出两个相同的抗原结合臂。其他蛋白酶(例如胃蛋白酶)也可在链间二硫键的羧基末端侧的铰链区切割抗体分子，释放由两个相同Fab片段组成的片段并通过二硫键保持连接；F(ab′)2片段中二硫键的还原产生Fab′片段。

对应于VH和VL结构域的抗原结合区部分称为Fv片段(可变片段)；它包含CDR(互补决定区)，其形成抗原结合位点(也称为互补位)。

负责与效应子分子或细胞结合的抗体的效应子区对应于Y形结构的茎，并包含重链的成对CH2和CH3结构域(或CH2、CH3和CH4结构域，取决于抗体的类别)，并称为Fc(可结晶片段)区域。

由于两个重链和两个轻链的同一性，天然存在的抗体分子具有两个相同的抗原结合位点，并因此同时与两个相同的表位结合。

在本发明的上下文中，“多特异性抗原结合片段”在本文中定义为具有两个或多个抗原结合区的分子，每个区域识别不同的表位。不同的表位可以由相同的抗原分子或不同的抗原分子携带。术语“识别(recognizing)”或“识别(recognizes)”是指该片段特异性结合靶抗原。

“多特异性抗体”包含至少两个多特异性抗原结合片段/臂，并且能够结合两种，三种或多种不同的抗原。

如果与结合其他物质相比，抗体以高亲和力、亲合力(avidity)、更快速和/或更长持续时间结合靶抗原，则所述抗体“特异性结合”靶抗原。“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可包括)排他性结合。一般来说，但不必然，提及结合意指优先结合。

术语“突变的衍生物”、“突变体”或“功能变体”表示通过缺失、取代或***一个或几个氨基酸而不同于其所指的亲本序列的序列。优选地，突变的衍生物优选显示出与天然序列至少80％，优选至少85％，还优选至少90％的同源序列。在特定的实施方案中，突变基本上不影响抗体的功能。

突变的衍生物或功能变体可以包含VH链(其包含与本文所述的任何参考序列具有至少85％(例如90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列)，VL链(其具有与本文所述的任何参考序列具有至少85％(例如90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列，或两者。这些变体能够结合靶抗原。在一些实例中，变体相对于上述参考抗体具有相似的抗原结合亲和力(例如，具有小于1x 10^-7M、10^-8M，优选小于1x 10^-9或1x 10^-10M的KD)。

结合的亲和力由术语ka(结合速率常数)、kd(解离速率常数)或KD(平衡解离)定义。通常，当针对抗体使用时特异性结合是指以小于10^-7M，优选小于10^-8M，例如小于10^-9M或10^-10M的亲和力(KD)值特异性结合(“识别”)其靶标的抗体。较低的KD值表示较高的结合亲和力(即较强的结合力)，因此10^-9的KD值表示比10^-8的KD值高的结合亲和力。

使用Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990,如在Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中修改的算法确定两个氨基酸序列的“同一性百分比”。这种算法被并入Altschul等人J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用XNBLAST程序，评分＝50，字长＝3来进行BLAST蛋白检索以获得与目的蛋白分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在空位的情况下，可以如在Altschul等人,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所述利用空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。

在其他实施方案中，本文所述的功能变体可以包含一个或多个突变(例如，保守取代)，其优选不发生在被预测与一个或多个CDR相互作用的残基上。

本文描述了与参考抗体基本上相同的突变衍生物或功能变体。

术语“基本上相同”或“无实质性”是指变体的相关氨基酸序列(例如，在构架区(FR)、CDR、VH或VL结构域中)与参考抗体相比无实质性不同(例如，包括保守的氨基酸取代)，从而所述变体相对于参考抗体具有基本上相似的结合活性(例如，亲和力、特异性或两者)和生物活性。这样的变体可以包括较小的氨基酸变化，例如在指定区域的5个氨基酸序列中的1或2个取代。通常，与CDR区相比，可以在FR区进行更多取代，只要它们不会不利地影响抗体的结合功能(例如，与原始抗体相比将结合亲和力降低50％以上)。在一些实施方案中，在原始抗体和修饰抗体之间，序列同一性可以为约85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在一些实施方案中，修饰的抗体具有相同的结合特异性，并且具有原始抗体的至少50％的亲和力。

保守取代将产生具有与从中进行这种修饰的那些分子相似的功能和化学特性的分子。例如，“保守氨基酸取代”可以涉及用另一个残基取代天然氨基酸残基，从而对该位置上氨基酸残基的极性或电荷具有很小影响或几乎没有影响。期望的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)可以由本领域技术人员确定。例如，氨基酸取代可用于鉴定分子序列的重要残基，或用于增加或降低本文所述分子的亲和力。可以根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备包含一个或多个保守氨基酸取代的变体，例如在汇编此类方法的参考文献中可以找到所述方法，例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook等人，编辑，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York,1989,或Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人，编辑，John Wiley&Sons,Inc.,New York。氨基酸的保守取代包括在以下组内的氨基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；和(g)E、D。

抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的核苷酸变化引入抗体核酸中或通过肽合成来制备。这样的修饰包括，例如，抗体氨基酸序列内的残基的缺失和/或***和/或取代。只要最终构建体具有所需的特征，就可以进行缺失、***和取代的任何组合来获得最终构建体。通过本领域已知的多种方法来制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于抗体的较早制备的变体或非变体(天然)版本的寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变。在一个实施方案中，本发明的抗体的平衡解离常数(KD)值小于10^-7M，特别是小于10^-8M，10^-9M或10^-10M。可以使用本领域已知的技术，例如ELISA或生物特异性相互作用分析(例如使用表面等离子体共振)，或使用本领域已知的其他技术确定结合亲和力。

可以按照常规方法检查本文所述的任何分子以确定其性质，例如抗原结合活性，抗原结合特异性和生物学功能。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，并且是指被评估用于治疗和/或被治疗的哺乳动物。受试者可以是人类，但也包括其他哺乳动物，特别是可用作人类疾病实验室模型的那些哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、狗等。

术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”指的是操作、应用或治疗方法，其中的受试者，包括人类以直接或间接地改善受试者的状况为目的进行医疗救助。特别地，在一些实施方案中，该术语是指减少发病率或减轻症状、消除复发、预防复发、预防发病率、改善症状、改善预后或其组合。本领域技术人员将理解，治疗不一定导致症状的完全缺失或消除。例如，关于癌症，“治疗”或“治疗”可以指减慢肿瘤或恶性细胞的生长、增殖或转移、防止或延迟肿瘤或恶性细胞的生长、增殖或转移的发展，或其一些组合。

优选的多特异性抗体的设计：

本文提供了包含所述片段的多特异性抗原结合片段和多特异性抗体构建体，其中每个多特异性抗原结合片段基本上由串联排列的被本发明的接头分开的Fab片段组成。

此类片段和构建体优选包含来自人免疫球蛋白，优选IgG，仍优选IgG1的链。

在包含两个以上不同Fab片段的多特异性抗原结合片段的情况下，分隔Fab片段的多肽接头可以相同或不同。根据本发明的多特异性抗体的优选实施方案，其具有两个相同的抗原结合臂，每个臂均由能够结合多个(多于一个)抗原的抗原结合片段组成，如上所定义。取决于抗体的预期用途，抗原结合臂可以以多种方式连接在一起。

如果希望获得没有Fc介导的效应的抗体，则该抗体将不包含Fc区。在这种情况下，两个抗原结合臂可以通过以下连接在一起，例如：

-通过抗原结合臂通过由分离Fab片段的多肽接头提供的链间二硫键的同二聚化，如果所述接头含有半胱氨酸残基；和/或

-通过在每个抗原结合臂的C-末端添加含有半胱氨酸残基的多肽延伸，允许形成链间二硫键，和所述多肽延伸的同二聚化，产生铰链状结构；通过非限制性实例，所述多肽延伸可以是例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA或IgD的铰链序列；

-通过半刚性接头，其连接两个抗原结合臂的重链的C-末端以形成单个多肽链并使所述抗原结合臂彼此保持足够的距离。

或者，如果需要效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性吞噬作用(ADP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，则本发明的多特异性抗体可进一步包含提供这些效应子功能的Fc结构域。Fc结构域的选择将取决于所需效应子功能的类型。

在这种情况下，本发明的多特异性抗体具有免疫球蛋白样结构，包含：

-如上定义的两个相同的多特异性抗原结合臂；

-免疫球蛋白的二聚化的CH2和CH3结构域；

-将抗原结合臂的CH1域的C-末端连接到CH2域的N-末端的IgA，IgG或IgD的铰链区，或者当CH3结构域后的CH4结构域来自IgM或IgE时，在这种情况下，抗原结合臂的CH1结构域的C-末端可以直接连接CH2结构域的N-末端。

优选地，CH2和CH3结构域、铰链区和/或CH4结构域衍生自与抗原结合臂的CH1结构域相同的免疫球蛋白或具有相同同种型和亚类的免疫球蛋白。

可以使用来自天然免疫球蛋白的CH2、CH3和任选的CH4结构域，以及铰链区。如果需要的话，也可能使它们突变，例如以便调节抗体的效应子功能。在一些情况下，可以省略CH2或CH3结构域的全部或部分。

本发明更具体地提供了多特异性，优选双特异性四价抗体，其包含其每个靶标的两个结合位点，以及功能性Fc结构域，其允许激活效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用和补体依赖性细胞毒性(CDC)。

本发明的此类优选抗体是全长抗体。它们优选包含来自人免疫球蛋白，优选IgG，还优选IgG1的重链和轻链。

轻链可以是λ或κ轻链，它们优选是κ轻链。

在优选的实施方案中，用于本发明的多肽接头以四-Fab多特异性，优选双特异性抗体形式连接两对IgG Fab结构域，其氨基酸序列包含通过多肽接头连接的至少两个Fab的重链序列，然后是天然铰链序列，然后是IgG Fc序列，其与适当的IgG轻链序列共表达。

图11中显示了具有IgG样结构的本发明优选的双特异性抗体的实例。

在优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体通常包含

-由Fc(铰链-CH2-CH3)构成的连续重链

-随后是抗体1Fab重链(CH1-VH)和抗体2的连续Fab重链(CH1-VH)，后者通过铰链衍生的多肽接头序列连接，

-并且在蛋白质表达过程中，所得的重链装配成二聚体，而共表达的抗体1和抗体2轻链(VL-CL)与它们的同源重链结合，以形成最终的串联F(ab)'2-Fc分子，

抗体1(Ab1)和抗体2(Ab2)是不同的。

在优选的实施方案中，描述了双特异性抗体，其包含

-具有不同突变CH1和突变CL结构域的两个Fab片段，其由以下组成

a)具有衍生自人IgG1/κ的突变CH1和突变C-κ结构域,和Ab1的VH和VL结构域的Fab片段，

b)具有衍生自人IgG1/κ的突变CH1和突变C-κ结构域,和Ab2的VH和VL结构域的Fab片段，

c)衍生自人κ恒定域的突变轻链恒定域，

Fab片段按以下顺序串联排列

-Ab1 Fab片段的突变的CH1结构域的C-末端通过多肽接头与Ab2 Fab片段的VH结构域的N-末端连接，

-人IgG1的铰链区，其将Ab2片段的突变的CH1结构域的C-末端与CH2结构域的N-末端连接，

-人IgG1的二聚化CH2和CH3结构域。

Ab1和Ab2可以是任何目的抗体，尤其是任何治疗目的抗体。

在特定的实施方案中，不同的Ab1和Ab2独立地选自抗CD38抗体(例如daratumumab)和抗PD-L1抗体(例如atezolizumab)。

在另一特定的实施方案中，不同的Ab1和Ab2独立地选自抗EGFR抗体和抗HER2/neu受体。在优选的实施方案中，不同的Ab1和Ab2独立地一方面选自西妥昔单抗(cetuximab)或其突变衍生物，并且另一方面选自曲妥珠单抗(trastuzumab)或其突变衍生物。

此类抗体可用作药物，更特别地用于治疗癌症。

在特定的实例中，双特异性分子是双特异性抗CD38，抗PD-L1抗体，其包含以下项，优选地由其组成：a)两个重链，每个包含SEQ ID NO：7，优选地由其组成和b)四个轻链，两个包含SEQ ID NO：15,优选由其组成，另外两个包含SEQ ID NO：18，优选由其组成。这样的双特异性抗体称为BiXAb-6567。

SEQ ID NO：7(重链)为：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPQAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVDVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

该重链序列包含

-daratumumab的VH(SEQ ID NO：8)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSS

-daratumumab Fab的CH1结构域(G1m(3)同种异型的人IgG1，具有突变L124Q和S188V)(SEQ ID NO：9)

ASTKGPSVFPQAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLVSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV-AP接头(SEQ ID NO：3)

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG

-atezolizumab的VH(SEQ ID NO：10)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS

-CH1结构域(Fab atezolizumab的G1m(3)同种异型的人IgG1，具有突变T192D(SEQID NO：11)

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVDVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV-人IgG1的铰链(SEQ ID NO：12)

EPKSCDKTHTCPPCP

-人IgG1的CH2结构域(SEQ ID NO：13)

APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK

-G1m(3)同种异型的人IgG1的CH3结构域(SEQ ID NO：14)

GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

轻链SEQ ID NO：15(daratumumab)为EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

该轻链序列包含

-daratumumab的VL(SEQ ID NO：16)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK

-具有突变V133T和S176V的daratumumab的CKappa结构域(SEQ ID NO：17)RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVTCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLVSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

轻链SEQ ID NO：18(atezolizumab)为DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

该轻链序列包含

-atezolizumab的VL(SEQ ID NO：19)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK

-具有突变S114A和N137K的atezolizumab的CKappa结构域(SEQ ID NO：20)

RTVAAPAVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLKNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

第三对Fab结构域(针对与第一对和第二对Fab结构域不同的抗原靶标)也可以与相同或不同的多肽接头连接：i)通过所述第三对Fab结构域的重链的C-末端与外部(即Fc远端)Fab结构域的重链的N-末端，ii)或通过所述第三对Fab结构域的重链的C-末端或N-末端与Fab结构域的两个重链的C-末端。

可将本文所述的任何分子修饰为包含本领域已知且容易获得的额外非蛋白质部分，例如通过PEG化或高糖基化。包括可以提高血清半衰期或针对蛋白水解降解的稳定性的修饰。

本发明的抗体可以被糖基化或不被糖基化，或可以显示多种糖基化谱。在优选的实施方案中，抗体在重链的可变区上未被糖基化，但是在Fc区上被糖基化。

可以使用参考非人类抗体的人源化形式。在人源化方法中，将来自供体可变区的互补决定区(CDR)和某些其他氨基酸移植到人可变受体区中，然后将其与人恒定区相连。参见，例如，Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；美国专利号5,225,539。

本发明的构建体的另一个实例是不包含Fc结构域的双特异性抗原结合片段Fab-Fab。

这样的Fab-Fab构建体通常包含两个不同的Fab结构域。此类抗体仅具有各自与抗原1和抗原2结合的一个Fab结构域。它们具有与相应的BiXAb抗体相同的轻链；然而，Fab-Fab的重链以这种方式缩短，使得它们的最C-末端残基为半胱氨酸220(根据EU编号)。

本发明的构建体的另一个实例是二聚化的Fab-Fab构建体(例如，通过接头中的二硫键或通过在C-末端近端Fab结构域的C-末端处的铰链的天然二硫键)。

接头的设计

多肽接头，也命名为“铰链衍生的多肽接头序列”或“伪铰链接头”，包含选自优选人类起源的IgA，IgG和IgD的一种或多种免疫球蛋白的铰链区的全部或部分序列。所述多肽接头可包含仅一种免疫球蛋白的铰链区的全部或部分序列。在这种情况下，所述免疫球蛋白可以与衍生邻近CH1结构域的免疫球蛋白属于相同的同种型和亚类，或者属于不同的同种型或亚类。或者，所述多肽接头可包含不同同种型或亚类的至少两个免疫球蛋白的铰链区的全部或部分序列。在这种情况下，直接在CH1结构域之后的多肽接头的N-末端部分优选由免疫球蛋白的全部或部分铰链区组成，所述铰链区与衍生所述CH1结构域的免疫球蛋白属于相同的同种型和亚类。

任选地，所述多肽接头可以进一步包含免疫球蛋白的CH2结构域的2至15个，优选5至10个N-末端氨基酸的序列。

多肽接头序列通常由少于80个氨基酸，优选少于60个氨基酸，仍优选少于40个氨基酸组成。

在一些情况下，可以使用来自天然铰链区的序列；在其他情况下，可以对这些序列进行点突变，特别是用丙氨酸或丝氨酸替代天然IgG1、IgG2或IgG3铰链序列中的一个或多个半胱氨酸残基，以避免不想要的链内或链间二硫键。

在特定的实施方案中，多肽接头序列包含以下氨基酸序列或由氨基酸序列组成：EPKX₁CDKX₂HX₃X₄PPX₅PAPELLGGPX₆X₇PPX₈PX₉PX₁₀GG(SEQ ID NO:1)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X10相同或不同，是任何氨基酸。特别地，多肽接头序列可以包含选自以下的序列或由其组成：

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG(SEQ ID NO:2)；

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG(SEQ ID NO:3)；

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG(SEQ ID NO:4)；

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:5)和EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:6)。

在特定的实施方案中，X₁、X₂和X₃相同或不同，为苏氨酸(T)或丝氨酸(S)。

在另一个特定的实施方案中，X₁、X₂和X3相同或不同，选自Ala(A)、Gly(G)、Val(V)、Asn(N)、Asp(D)和Ile(I)，仍优选X₁，X2和X₃相同或不同，可以是Ala(A)或Gly(G)。

或者，X₁、X₂和X₃相同或不同，可以是Leu(L)、Glu(E)、Gln(Q)、Met(M)、Lys(K)、Arg(R)、Phe(F)、Tyr(T)、His(H)、Trp(W)，优选Leu(L)、Glu(E)或Gln(Q)。

在特定的实施方案中，X₄和X₅相同或不同，是选自丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)和甘氨酸(G)的任何氨基酸。

在优选的实施方案中，X₄是丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)。

在优选的方面，X₅是丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)。

在特定的实施方案中，X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀相同或不同，是除苏氨酸(T)或丝氨酸(S)以外的任何氨基酸。优选地，X₆、X₇、X₈、X₉、X10相同或不同，选自Ala(A)、Gly(G)、Val(V)、Asn(N)、Asp(D)和Ile(I)。

或者，X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀相同或不同，可以是Leu(L)、Glu(E)、Gln(Q)、Met(M)、Lys(K)、Arg(R)、Phe(F)、Tyr(T)、His(H)、Trp(W)，优选Leu(L)、Glu(E)或Gln(Q)。

在优选的实施方案中，X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀相同或不同，选自Ala(A)和Gly(G)。

在又一个优选的实施方案中，X 6和X 7是相同的，并且优选选自Ala(A)和Gly(G)。

在优选的实施方案中，多肽接头序列包含序列SEQ ID NO：1或由其组成，其中

X₁、X₂和X₃相同或不同，为苏氨酸(T)、丝氨酸(S)；

X₄为丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)；

X₅为丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)；

X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀相同或不同，选自Ala(A)和Gly(G)。

在另一优选的实施方案中，多肽接头序列包含序列SEQ ID NO：1或由其组成，其中

X₁、X₂和X₃相同或不同，为Ala(A)或Gly(G)；

X₄为丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)；

X₅为丙氨酸(A)或半胱氨酸(C)；

X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀相同或不同，选自Ala(A)和Gly(G)。

在包含两个以上不同的Fab片段的多特异性抗原结合片段的情况下，分隔Fab片段的多肽接头可以相同或不同。

多特异性抗体的产生：

技术人员可以参考国际专利申请WO2013/005194，其表达多特异性抗体的一般技术通过引用并入本文。

另外，本文描述了包含编码本发明的分子或抗体的蛋白质链的序列的多核苷酸。所述多核苷酸还可以包含额外的序列：具体地，其可以有利地包含编码允许分泌所述蛋白链的前导序列或信号肽的序列。还公开了用所述多核苷酸转化的宿主细胞。

通常，任选地在针对哺乳动物表达的密码子优化之后，使用不同单克隆抗体的氨基酸序列来设计DNA序列。对于重链，合成DNA，其编码信号肽，Fab1的可变区和恒定CH1结构域，随后是铰链接头和Fab2的可变区和恒定CH1结构域以及侧翼序列用于限制酶消化。对于轻链，合成DNA，其编码信号肽以及可变和恒定κ区。

将编码本发明抗体的重链和轻链的核酸***表达载体中。可以将轻链和重链克隆在相同或不同的表达载体中。编码免疫球蛋白链的DNA区段与表达载体中的控制序列(其确保免疫球蛋白多肽的表达)有效连接。这样的控制序列包括信号序列、启动子、增强子和转录终止序列。表达载体在宿主生物体中通常可作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体将含有选择标志物(例如四环素或新霉素)以允许检测用期望DNA序列转化的那些细胞。

在一个实例中，重链和轻链编码序列(例如，编码VH和VL，VH-CH1和VL-CL或全长重链和全长轻链的序列)均为包含在一个表达载体中。在另一个实例中，将抗体的每个重链和轻链克隆到单独的载体中。在后一种情况下，可以将编码重链和轻链的表达载体共转染到一个宿主细胞中以表达两条链，其可以在体内或体外组装以形成完整的抗体。或者，可以将编码重链的表达载体和/或编码轻链的那些引入不同的宿主细胞中以表达重链和轻链中的每一个，然后可以将其纯化和组装以在体外形成完整的抗体。

在特定的实施方案中，用三个独立的表达载体(例如质粒)共转染宿主细胞，导致所有三个链(分别称为重链HC和两个轻链LC1和LC2)的共同产生，以及多特异性例如双特异性抗体的分泌。

更特别地，可以有利地以以下2：1：1(HC：LC1：LC2)的分子比率使用这三个载体。

可以进一步用编码两个不同轻链的至少两个多核苷酸转化用包含编码如本文定义的重链的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞：第一轻链，其与所述重链的第一个VH/CH1区特异性配对；第二轻链，其与所述重链的第二个VH/CH1区域特异性配对。

在其他实施方案中，可以用编码第三轻链的多核苷酸额外转化宿主细胞，所述第三轻链不同于第一和第二轻链，并且与所述重链的第三VH/CH1区特异性配对。

用于表达本文描述的抗体的重组载体通常包含编码与组成型或诱导型启动子有效连接的抗体氨基酸序列的核酸。载体可适合在原核生物，真核生物或两者中复制和整合。典型的载体包含可用于调节编码抗体的核酸表达的转录和翻译终止子，起始序列和启动子。载体任选地包含通用表达盒，其包含至少一个独立的终止子序列，允许该盒在真核生物和原核生物中复制的序列，即穿梭载体，以及用于原核和真核***的选择标志物。

如本文所述的多特异性例如双特异性抗体可以在原核或真核表达***，例如细菌，酵母，丝状真菌，植物昆虫(例如使用杆状病毒载体)和哺乳动物细胞中产生。本发明的重组抗体不必在真核细胞中被糖基化或表达；然而，通常优选在哺乳动物细胞中表达。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是人胚胎肾系(293细胞)、小仓鼠肾细胞(BHK细胞)、中国仓鼠卵巢细胞/-或+DHFR(CHO,CHO-S,CHO-DG44,Flp-in CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(VERO细胞)和人肝细胞(Hep G2细胞)。

优选哺乳动物组织细胞培养物来表达和产生多肽，因为本领域已经开发了能够分泌完整免疫球蛋白的许多合适的宿主细胞系，其包括CHO细胞系、多种Cos细胞系、HeLa细胞，优选骨髓瘤细胞系(例如NS0)或转化的B细胞或杂交瘤。

在最优选的实施方案中，本发明的多特异性例如双特异性抗体是通过使用CHO细胞系，最有利地是CHO-S或CHO-DG-44细胞系或其衍生物来产生的。

这些细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子，以及必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛***瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。

可通过众所周知的方法将含有目标多核苷酸序列(例如，重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体转移至宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(一般参见Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,第二版，1989)。当在单独的表达载体上克隆重链和轻链时，将载体共转染以获得完整的免疫球蛋白的表达和组装。

用载体(例如，通过化学转染或电穿孔方法)转化或转染宿主细胞，并将其在常规营养培养基(或适当时修改的培养基)中培养以诱导启动子，选择转化子或扩增编码所需序列的基因。

抗体的表达可以是瞬时的或稳定的。

优选地，通过稳定表达的方法产生多特异性,例如双特异性抗体，在所述稳定表达方法中,用编码多特异性,例如双特异性抗体,例如BiXAb-6567的所有多肽链的DNA稳定转染的细胞系能够持续表达,其使得可以制备治疗剂。例如，在CHO细胞系中的稳定表达是特别有利的。

一旦表达，就可以进一步分离或纯化本发明的完整抗体、其二聚体、单个轻链和重链或其他免疫球蛋白形式，以获得基本上均质的制剂，用于进一步的测定和应用。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。例如，合适的纯化程序可包括在免疫亲和柱或离子交换柱上分级、乙醇沉淀、高效液相色谱(HPLC)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、硫酸铵沉淀和凝胶过滤(一般参见Scopes,Protein Purification(Springer-Verlag,N.Y.,1982)。对于药物用途，优选至少约90-95％同质性的基本上纯的组合物，并且最优选98-99％或更高的同质性。

体外生产允许按比例放大以产生大量所需的本发明的多特异性，例如双特异性抗体。这样的方法可以在例如气升反应器或连续搅拌反应器中采用均质悬浮培养，或在琼脂糖微珠或陶瓷筒上例如在中空纤维、微胶囊中采用固定或截留(entrapped)细胞培养。

应用

本发明的蛋白质构建体或多特异性抗体可用于多特异性抗体的所有应用中。特别地，它们可用于获得这样的药物,其在患者中(结合放射性、荧光、化学发光或任何其他标记)或在体外(例如采用免疫组织化学、免疫印迹和免疫荧光技术用于细胞和组织染色)用于广泛治疗应用和诊断医学应用。这些药物或诊断产品也是本发明目标的一部分。

本发明的其他方面是药物组合物，其包含根据本发明的蛋白质构建体或抗体。本发明的另一方面是根据本发明的蛋白质构建体或抗体在制备药物组合物中的用途。本发明的其他方面是用于制造包含根据本发明的蛋白质构建体或抗体的药物组合物的方法。

在另一方面，本发明提供了包含与药物载体一起配制的本文定义的蛋白质构建体或抗体的组合物，例如药物组合物。

本发明的组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。

通过举例提供以下实施例，并且其不旨在限制本发明。

实施例

实施例1：本发明的双特异性抗体BiXAb-6567的制备

基因合成

在为哺乳动物表达进行密码子优化后，使用GeneScript程序使用抗CD38(daratumumab)和抗PDL1(atezolizumab)的氨基酸序列设计DNA序列。这些抗体被称为“亲本”抗CD38和“亲本”抗PD-L1 mAb。

重链的DNA构建体是这样设计的：信号肽，然后是序列SEQ ID NO：7[由以下组成：可变区，然后是Fab1(抗CD38)的恒定CH1结构域，其中分别在Kabat位置124和188处引入突变Leu至Gln和Ser至Val，然后是接头，随后是可变区，接着是Fab2(抗PD-L1)的恒定CH1结构域，其中在Kabat位置192处引入突变Thr至Asp]；用于限制酶消化的侧翼序列被引入重链DNA构建体的两端。轻链的DNA构建体是这样设计的：信号肽(SEQ ID NO：21)，接着是可变区，接着是恒定κ区。对于抗CD38轻链(SEQ ID NO：15)，在恒定κ结构域的Kabat位置143(Leu至Gln)和188(Ser至Val)处引入突变。对于抗PDL1轻链(SEQ ID NO：18)，将Kabat位置133(Val至Thr)和176(Ser至Val)处的突变引入恒定κ结构域。所有DNA构建体均由Gene Art合成。

使用PfuTurbo Hot Start进行PCR反应以扩增***片段，然后对于重链和轻链分别用NotI和ApaI，以及NotI和HindIII消化所述***片段。将双重消化的重链片段与NotI和ApaI处理的pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)连接，所述表达载体中已经***了人IgG1铰链和CH2-CH3结构域。将双重消化的轻链片段与NotI和HindIII处理的pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)连接。通过双链DNA测序验证质粒DNA。

表达和纯化

在适应悬浮液中无血清的培养基(CHO SFM-II培养基，Life Technologies^TM)中，通过以2:1:1＝HC:LC1:LC2分子比(1个连续重链(HC)和2个轻链(LC))共转染在单独的载体上编码的3个基因使用瞬时基因表达产生双特异性抗体BiXAb-6567。通常，对于50mL规模表达，将总计50μg质粒DNA(25μg重链，12.5μg抗CD38轻链和12.5μg抗PD-L1轻链)在1.5mLEppendorf管中混合，然后加入含有25μL的3mg/mL PEI转染试剂pH7.0(Polyplus)的1mLCHO SFM培养基，并将反应在室温下温育20分钟。随后将DNA-PEI混合物添加到125mL摇瓶中的49mL的Life Technologies的Invitrogen FreeStyle^TMCHO-S细胞中

摇动细胞6天。通过3,000rpm离心15分钟收集上清液。使用ForteBio的蛋白A生物传感器(

Systems)确定上清液中BiXAb-6567的表达效价。然后在蛋白A亲和树脂(MabSelectSuRe,GE Healthcare Life Sciences)上纯化BiXAb-6567。使用0.1M甘氨酸pH 3.5从蛋白A洗脱抗体，并用1M TRIS中和洗脱液。将Dulbecco的PBS(Lonza)中的纯化抗体进行无菌过滤(0.2μM无菌过滤器，Techno Plastic Products AG)，并通过读取280nm的光密度(OD)来确定最终浓度(Eppendorf

)。

BiXAab-6567通常在瞬时CHO表达中表现出良好的表达效价(>180mg/L)。该表达水平与常规单克隆抗体所见的表达水平相当。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

为了评估纯化的BiXAb-6567的质量，我们进行了SDS-PAGE(Experion^TM自动电泳***，BioRad)。在运行缓冲液中存在十二烷基硫酸钠(SDS)时，抗体在凝胶中迁移的速率主要取决于其大小，从而可以确定分子量。该测定在非还原条件和还原条件下进行；后者允许破坏二硫键，并因此使单个多肽链(轻链和重链)可视化。

在图1中呈现了SDS-PAGE数据。在非还原条件下，抗体的四级结构得以维持，并且观察到的分子量应代表不同重链和轻链的分子量之和。本发明的双特异性抗体(BiXAb-6567)由六个链组成：两个重链和四个轻链。BiXab-6567的理论分子量为244.40kDa，不考虑翻译后修饰(PTM)，例如天冬酰胺297处Fc中的N-糖基化。使用已知分子量的标准物的混合物对凝胶进行校准。非还原数据显示一条主条带接近250kDa分子量标准，这与计算的分子量和Fc结构域297位上的两个天冬酰胺的预期糖基化一致。在还原条件下，二硫苏糖醇(DTT)通过还原二硫键并破坏四级结构进一步使BiXAb-6567变性，因此六个多肽链应根据其分子量在凝胶中分别迁移。BiXAb-6567的两个相同的重链作为一条带共迁移，而由于其分子量几乎相同，两对轻链则作为第二条带共迁移。因此，基于分子量标准的迁移率，数据显示在约75kDa和25kDa处呈现两个主条带。每个重链在天冬酰胺297处共有一个N-糖基化位点，这解释了较高分子量条带的宽度，并且观察到的分子量略高于所计算的分子量(75.44kDa)；这种加宽对糖基化蛋白而言是典型的。抗CD38(23.40kDa)和抗PD-L1(23.36kDa)轻链的计算分子量非常相似，因此导致它们的共迁移。

总之，当考虑到重链中存在N-糖基化位点时，BiXAb-6567的SDS-PAGE在非还原和还原条件下均表现出预期的谱，并且与计算的理论分子量一致。

尺寸排阻色谱分析

在改造的蛋白质分子中经常观察到蛋白质聚集。我们进行了分析尺寸排阻色谱(SEC)，以测定一步亲和纯化的BiXAb-6567制剂的高分子量种类含量(参见变体的表达和纯化)。我们使用了SEC-s3000(300x 7.8mm)柱(BioSep)和Aktapurifier 10***(GEHealthcare)；使用PBS缓冲液pH 7.4以1mL/min的流速进行测定。

图2中呈现的SEC色谱图证明，主峰对应于单体BiXAb-6567的预期大小；该峰占总样品的98.2％。此外，观察到小峰，对应于较高分子量的种类(可能是二聚体)；该峰占总样品的1.8％。因此，我们得出的结论是，较高分子量种类的百分比含量很小，并且类似于CHO表达***中产生的常规单克隆抗体。单体峰的窄而对称的形状提示BiXAb-6567已正确组装并由单个种类代表。

实施例2：通过差示扫描量热法(DSC)对BiXAb-6567的表征

差示扫描量热法(DSC)用于比较BiXAb-6567，亲本抗CD38 mAb和亲本抗PD-L1 mAb的热稳定性。MicrocalTM VP-Capillary DSC***(Malvern Instruments)用于进行差示扫描量热实验。

将所有样品离心(20,000xg，5分钟，4℃)，并在使用IgG分析程序的Nanodrop ND-1000分光光度计(Thermo Scientific)进行DSC分析之前，对它们的蛋白质含量进行定量。为了测定，所有样品均在PBS中稀释至终浓度1mg/mL

预平衡时间为3分钟，并在20至110℃之间以60℃/h的扫描速率，25秒的过滤时间和中等反馈获得所得的热分析图。在样品分析之前，测量5次缓冲液/缓冲液扫描以稳定仪器，并在每次蛋白质/缓冲液扫描之间进行缓冲液/缓冲液扫描。数据符合非2态解折叠模型，通过减去基线来调整转变前和转变后。

图3中呈现的DSC曲线(覆盖50至100℃的范围)证明其中各个Fv区可导致不同的Fab解折叠谱的方式；该实验还证明Fv区决定了Fab的表观稳定性。抗CD38 mAb的DSC谱展示两个转变：具有170Kcal/mole/℃的Cp max和70.9℃的Tm1的大峰，对应于CH2和Fab结构域两者的解折叠，和具有20Kcal/mole/℃的Cp max和81.5℃的Tm2的小峰，对应于CH3结构域的解折叠。抗PD-L1 mAb的DSC谱展示两个转变：具有20Kcal/mole/℃的Cp max和69.9℃的Tm1的小峰，对应于CH2结构域的解折叠，和具有160Kcal/mole/℃的Cp max和83.4℃的Tm2的大峰，对应于CH3和Fab结构域的解折叠。

BiXAb-6567的DSC谱还展示了具有两个大峰的两个转变。第一个峰具有130Kcal/mole/℃的Cp max和71.5℃的Tm1，并且对应于抗CD38 mAb的CH2和Fab结构域的解折叠。第二个峰具有170Kcal/mole/℃的Cp max和81.5℃的Tm2，并且对应于抗PD-L1 mAb的CH3和Fab结构域的解折叠。因此，BiXAb-6567的DSC谱类似于两个亲本mAb的两个DSC谱的叠加，并且说明了BiXAb-6567的出色组装和稳定性。BiXAb-6567的Tonset(63.3℃)与亲本mAb的Tonset相似(抗CD38 Tonset＝63.5℃，而抗PD-L1 Tonset＝63.2℃)，表明BiXAb-6567具有与亲本抗体的稳定性性质相似的稳定性性质。BiXAb-6567的计算ΔH为1560kcal/mol，反映了双特异性分子相对于两个亲本抗体的更大尺寸(抗CD38ΔH＝963kcal/mol，而抗PD-L1ΔH＝820kcal/mol)。

定义：

Tm或变性/熔化温度是解折叠和折叠的物质的浓度相等的点，并且是解折叠转变的中点。作为参数，它描述了蛋白质对热变性的敏感性，并因此与蛋白质的稳定性有关。Tm越高，蛋白质越稳定。

Tonset是解折叠转变开始的温度。此参数的值通常比Tm低5至10℃。它也是描述蛋白质稳定性的参数，但与对热变性的抗性有关。

ΔH是解折叠的量热焓，并且反映了蛋白质中分子内相互作用的破坏(即破坏结构域内和结构域间相互作用)。热解折叠过程是吸热的，并因此产生正的焓值。量热焓(ΔH)是热解折叠转变峰以下的面积。

实施例3：BiXAb-6567的无细胞结合特性

直接CD38抗原结合平板ELISA测定

通过用PBS pH 7.4稀释制备的各自浓度为3μg/mL的100μl亲本mAb，抗CD38或抗PDL1用于在4℃下过夜包被Maxisorp平板。另外，通过用PBS pH 7.4稀释制备的浓度为5μg/mL的BiXAb-6567用于在4℃下过夜包被Maxisorp板。用含0.05％Tween-20的1x PBS(PBST)洗涤平板5次，然后在室温下用200μL/孔的1x PBS中的1％BSA封闭200小时。随后将平板用1x PBST洗涤5次。制备了在1x PBS中以1μg/mL开始的重组CD38 His/Flag标记的(CreativeBiomart)的7点3倍稀释系列；每个测定孔中加入100μL每个稀释步骤。将平板在室温下温育1小时，并用1x PBST洗涤5次。加入在1x PBS中稀释10,000倍的100μL/孔的抗-Flag-tag抗体-缀合的HRP(Abcam)，并将平板在室温下温育1小时。用1x PBST洗涤5次后，加入100xL/孔的1x PBS中的TMB底物进行比色读数，并将平板在室温下温育15分钟以显色。使用Victor2酶标仪(Perkin Elmer)在650nm下收集测定数据。

BiXAb-6567表现出与亲本抗CD38抗体非常相似的剂量依赖性结合曲线(图4A)。CD38对两个抗体的结合的EC50如下：EC50[BiXAb-6567]＝171ng/mL，而EC50[抗CD38]＝199ng/mL。该结果表明BiXAb-6567具有正确组装的抗CD38 Fab结构域，因为它表现出与亲本抗CD38 mAb相似的结合。如预期的，用作阴性对照的亲本抗PDL1 mAb没有表现出任何结合。

直接PDL1抗原结合平板ELISA分析。

通过用1x PBS pH7.4稀释制备的浓度为1μg/mL的100μL生物素化人PD-L1蛋白(AcroBiosystems)用于在4℃过夜包被Maxisorp板。将平板用PBST洗涤5次，然后在室温下用200μL/孔的1x PBS中的1％BSA封闭2小时。随后将平板用1x PBST洗涤5次。制备1x PBS溶液中的抗CD38 mAb(以0.3mg/mL开始)或抗PD-L1 mAb(以0.3mg/mL开始)或BiXAb-6567(以0.5mg/mL开始)的7点3倍稀释系列；每个测定孔中加入100μL每个稀释步骤。将平板在室温下温育1小时，并用1x PBST洗涤5次。加入在1x PBS中稀释5,000倍的100μL/孔的抗人抗体(IgG H&L)缀合的HRP(Abliance)，并将平板在室温下温育1小时。用1x PBST洗涤5次后，加入100xL/孔的1x PBS中的TMB底物进行比色读数，并将平板在室温下温育15分钟以显色。使用Victor2酶标仪(Perkin Elmer)在650nm下收集测定数据。

BiXAb-6567表现出与亲本抗PD-L1抗体非常相似的剂量依赖性结合曲线(图4B)。PD-L1对两个抗体的结合的EC50如下：EC50[BiXAb-6567]＝93ng/mL，而EC50[抗-PD-L1]＝72ng/mL。该结果表明BiXAb-6567具有正确组装的抗PD-L1 Fab结构域，因为它显示出与亲本抗PD-L1 mAb相似的结合。如预期的，用作阴性对照的亲本抗CD38 mAb没有表现出任何结合。

双重抗原结合ELISA测定

通过用1x PBS pH7.4稀释制备的2μg/mL的100μL重组人Fc标记的CD38(CreativeBioMart)用于在4℃下过夜包被Maxisorp平板。将平板用1x PBST洗涤5次，然后在室温下用200μL/孔的1x PBS中的1％BSA封闭2小时。将平板用1x PBST洗涤5次。制备了1x PBS中BiXAb-6567的7点3倍稀释系列(以1μg/mL开始)，并且每个测定孔中加入100μL每个稀释步骤。将平板在室温下温育1小时，随后用1x PBST洗涤5次。加入在1x PBS中的100μL/孔的1μg/mL生物素化的人PD-L1(AcroBiosystems)，并将平板在室温下温育1小时。用1x PBST洗涤5次后，加入通过1x PBS稀释制备的100μL/孔的0.1μg/mL的链霉抗生物素蛋白偶联的HRP(Biotechne)。将平板在室温下温育1小时。用1x PBST洗涤5次后，加入100xL/孔的1x PBS中的TMB底物进行比色读数，并将平板在室温下温育15分钟以显色。使用Victor2酶标仪(Perkin Elmer)在650nm下收集测定数据。

BiXAb-6567在双重ELISA形式中表现出剂量依赖性结合曲线，表明它具有正确组装的抗CD38和抗PD-L1 Fab结构域(图4C)。这表明BiXAb-6567是双特异性抗体，其能够以EC50＝144ng/mL同时结合CD38和PD-L1。正如预期的，两个亲本mAb抗CD38或抗PDL1在这种双重ELISA形式中均未表现出任何结合。

实施例4：通过荧光激活的细胞分选术(FACS)测定相对结合活性

在补充有100μg/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10％胎牛血清和500μg/ml遗传霉素的DMEM-Glutamax-I培养基中培养CHO-CD38细胞(用全长人CD38稳定转染的CHO细胞)。在添加了100μg/ml青霉素，100μg/ml链霉素和10％的胎牛血清的RPMI 1640-Glutamax-I培养基中培养SKOV-3细胞和RPMI-8226细胞。

每个样品使用3x105个细胞(CHO-CD38或SKOV-3或RPMI-8226)。用PBA溶液(补充有1％BSA和0.05％叠氮化钠的PBS)洗涤细胞1次。为了确定FACS谱，以30μl的体积中50μg/ml的浓度的各抗体染色细胞。为了滴定BiXAb-6567和亲本抗CD38抗体，以及随后确定结合参数，用30μl的体积中指示浓度的各抗体染色CHO-CD38细胞。将细胞在冰上温育30分钟，然后用1ml的PBA溶液洗涤2次。细胞与荧光标记的抗人κ或抗人IgG Fcγ特异性二级抗体在黑暗中于冰上温育30分钟，然后用1ml PBA溶液洗涤2次；最后，将细胞重悬于最终体积为500μl的PBA溶液中。使用Epics-XL或Navios流式细胞仪(Beckman Coulter)分析样品。在每个实验中获得10.000个事件。

在图5A-C中呈现了BiXAb-6567与亲本抗CD38和抗PD-L1亲本抗体的结合谱。我们选择测试多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226，其表达高水平的CD38和可忽略水平的PD-L1(图5A)；由于稳定转染的全长CD38而表达非常高水平的CD38的CHO-CD38细胞系(图5B)；和卵巢癌细胞系SKOV-3，已知其表达PD-L1(图5C)。这些谱显示了BiXAb-6567的单个峰，这与3种细胞系上的两个亲本抗体的谱非常相似。这表明BiXAb-6567正确折叠并具有与亲本抗体相似的结合特性。如所预期的，CHO-CD38仅表达CD38而不表达PD-L1，而SKOV-3仅表达PD-L1而不表达CD38。

为了定量证实BiXAb-6567的结合特性与亲本抗CD38抗体的结合特性相似，使用CHO-CD38细胞进行BiXAb-6567和抗CD38亲本抗体的滴定，如图6所呈现。BiXAb-6567的EC50被确定为17.1nM，而亲本抗CD38的EC50为8.5nM，证实了BiXAb-6567和亲本抗CD38抗体中抗CD38 Fab结构域的相似结合特性。如预期的，该实验中的阴性对照(抗PD-L1和抗CD20抗体)未证明与CHO-CD38细胞的结合。

实施例5：利用未分级的非预先活化单核细胞(MNC)的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)

如以上实施例4中所述培养CHO-CD38、SKOV-3和RPMI-8226细胞。

为了制备MNC，采用以下程序。用柠檬酸盐抗凝新鲜抽取的外周血。随后，将5mlFicoll-Paque PLUS溶液与6ml抗凝全血分层。样品在室温下以2500rpm离心20分钟，随后没有离心机破裂。从血浆/Ficoll界面收集MNC。将MNC细胞悬浮液在PBS中按1:10稀释，并在室温下以1800rpm离心5分钟。除去上清液，并通过向细胞悬浮液中加入45ml冰冷的蒸馏水30秒来裂解红细胞，之后加入5ml的10x PBS。将细胞在室温下以1800rpm离心5分钟，并用1xPBS洗涤3次以除去血小板。最后，将细胞重悬于5ml细胞培养基中。在ADCC测定中调整细胞数以达到40:1＝效应细胞：肿瘤细胞比例。

对于ADCC⁵¹铬释放测定，将1x10⁶个靶细胞(RPMI 8226，SKOV-3或CHO-CD38)与100μCi 51铬在200μl PBS中在37℃和5％CO2下温育2小时。2小时温育后，将细胞用7ml培养基洗涤3次，并最后以0.1×106细胞/ml的浓度重悬浮。将靶细胞(5,000细胞/孔)和MNC在存在抗体的情况下在96孔微量滴定板(200μl测定体积)中于37℃和5％CO2下温育3小时。为了确定最大靶细胞裂解(＝最大cpm)，加入了Triton X-100。为了确定基础⁵¹铬的释放(＝基础cpm)，不对靶细胞进行进一步处理。温育4小时后，将微量滴定板在2000rpm下离心5分钟，并将25μl上清液与125μl Optiphase Supermix(Perkin Elmer)混合，并在振荡温育箱中温育1分钟。在MicroBeta TriLux(Perkin Elmer)β-计数器仪器中测定样品。使用以下公式计算靶细胞裂解：

裂解百分比＝(实验性cpm–基础cpm)/(最大cpm-基础cpm)x 100。

所有测量均一式三份进行。

使用非预先活化的MNC作为效应细胞进行CD38+细胞(RPMI-8226和CHO-CD38)的ADCC测定(图7和8)。该测定显示对RPMI-8226细胞分别具有0.8nM和0.3nM的EC50的BiXAb-6567和抗CD38抗体具有强大的细胞毒性；在CHO-CD38细胞上，BiXAb-6567和抗CD38抗体的细胞毒性分别具有0.2nM和0.07nM的EC50。抗PD-L1在两种细胞系中均显示最小的活性；正如预期的，两个阴性对照mAb(抗CD20和抗HER2)没有促进任何裂解。这些结果证明了BMX-6567对CD38+细胞的强大ADCC活性，其类似于亲本抗CD38抗体的活性。

实施例6：利用富集的预先活化的NK细胞的ADCC

如实施例4所述培养SKOV3细胞，RPMI 8226和CHO-CD38细胞。如实施例5中所述制备MNC。根据制造商的说明，使用“NK细胞分离试剂盒，人”(Miltenyi)，通过阴性选择从MNC分离NK细胞。在补充了10％胎牛血清的RPMI培养基中，以2x10⁶个细胞/ml的接种密度过夜培养NK细胞。加入IL-12或IL-15至终浓度为10ng/ml。如实施例5中概述进行ADCC测定，不同之处在于将效应细胞：肿瘤细胞的比例保持在10:1，并且反应持续时间减少至3小时。

在PD-L1+细胞系SKOV-3上使用IL-12或IL-15预先活化的富集NK细胞测定BiXAb-6567的抗PD-L1部分的ADCC性质。结果呈现于图9和10中。该实验将BiXAb-6567的ADCC性质与亲本抗PD-L1抗体的ADCC性质进行了比较；由于SKOV-3细胞是PD-L1+/HER2+/CD20-/CD38-，因此使用抗HER2抗体作为阳性对照，并且使用抗CD20抗体和亲本抗CD38抗体作为阴性对照。图9和10证明了BiXAb-6567和亲本抗PD-L1抗体的强大ADCC活性，不依赖于在培养NK细胞中使用IL-12或IL-15。当使用IL-12时，BiXAb-6567和亲本抗PD-L1抗体的EC50分别为0.007nM和0.03nM。当使用IL-15时，情况甚至更相似；然而，曲线拟合没有收敛，因此妨碍了EC50值的计算。这些结果证明了BMX-6567对PD-L1+细胞的强大ADCC活性，其类似于亲本抗PD-L1抗体的ADCC活性。

序列表

<110> 拜奥穆尼克斯制药(BIOMUNEX Pharmaceuticals)

<120> 稳定的双特异性抗体

<130> B2466

<160> 21

<170> PatentIn version3.5

<210> 1

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列1

<220>

<221> misc_特征

<222> (4)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (10)..(11)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (14)..(14)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (24)..(25)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (28)..(28)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (30)..(30)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_特征

<222> (32)..(32)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 1

Glu Pro Lys Xaa Cys Asp Lys Xaa His Xaa Xaa Pro Pro Xaa Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Xaa Xaa Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa

20 25 30

Gly Gly

<210> 2

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列2

<400> 2

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Pro Gly Pro Gly

20 25 30

Gly Gly

<210> 3

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列3

<400> 3

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala

20 25 30

Gly Gly

<210> 4

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列4

<400> 4

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Gly Pro Ala Pro Gly

20 25 30

Gly Gly

<210> 5

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列5

<400> 5

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser

20 25 30

Gly Gly

<210> 6

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头序列6

<400> 6

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser

20 25 30

Gly Gly

<210> 7

<211> 702

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Gln Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Val Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ala Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ala Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Gly Gly Glu Val

245 250 255

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

260 265 270

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile

275 280 285

His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp

290 295 300

Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

305 310 315 320

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln

325 330 335

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

340 345 350

Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

355 360 365

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

370 375 380

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

405 410 415

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

420 425 430

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Asp Val Pro Ser Ser Ser Leu

435 440 445

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

450 455 460

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

465 470 475 480

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

485 490 495

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

500 505 510

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

515 520 525

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

530 535 540

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

545 550 555 560

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

565 570 575

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

580 585 590

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

595 600 605

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

610 615 620

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

625 630 635 640

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

645 650 655

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

660 665 670

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

675 680 685

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

690 695 700

<210> 8

<211> 122

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> daratumumab的CH1

<400> 9

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Gln Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Val Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val

<210> 10

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> atezolizumab的VH

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> atezolizumab的CH1

<400> 11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Asp Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 13

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 15

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC daratumumab

<400> 15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Thr Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Val

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> daratumumab的Ckappa

<400> 17

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Thr Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Val Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 18

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LC atezolizumab

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL atezolizumab

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Ckappa atezolizumab

<400> 20

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 21

Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

Claims

1.蛋白质构建体，其包含选自以下的突变的Fab片段：

a)Fab片段，其由以下组成：

-目的抗体的VH和VL结构域；

-CH1结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的192位上的苏氨酸残基被天冬氨酸取代而衍生自所述CH1结构域，和

-CL结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的137位上的天冬酰胺残基被赖氨酸残基取代并且所述CL结构域的114位上的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域；和

b)Fab片段，其由以下组成：

-目的抗体的VH和VL结构域；

-CH1结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的124位上的亮氨酸残基被谷氨酰胺取代并且所述CH1结构域的188位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CH1结构域；和

-CL结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的133位上的缬氨酸残基被苏氨酸残基取代并且所述CL结构域的176位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域。

2.权利要求1的蛋白质构建体，其包含多特异性抗原结合片段或由多特异性抗原结合片段组成，所述多特异性抗原结合片段包含具有不同CH1和CL结构域的至少两个Fab片段，其中每个Fab片段识别不同的目的表位，并且所述Fab片段以任何顺序串联排列，第一Fab片段的CH1结构域的C-端末端通过多肽接头与随后的Fab片段的VH结构域的N-端末端连接，

其中至少一个Fab片段由如权利要求1所定义的突变的Fab片段组成，优选地，其中两个Fab片段是如权利要求1所定义的突变的Fab片段。

3.权利要求2的蛋白质构建体，其是具有两个相同抗原结合臂的多特异性抗体，每个臂由如权利要求2所定义的多特异性抗原结合片段组成。

4.权利要求3的蛋白质构建体，其具有免疫球蛋白样结构，包括：

-两个相同的抗原结合臂，每个臂由如权利要求1所定义的多特异性抗原结合片段组成；

-免疫球蛋白的二聚化的CH2和CH3结构域；

-IgA，IgG或IgD的铰链区，其连接所述抗原结合臂的CH1结构域的C-端末端和所述CH2结构域的N-端末端。

5.权利要求4的蛋白质构建体，其优选是双特异性抗体，并且包含至少两个重链和四个轻链，

其中每个重链包含

a.包含铰链-CH2-CH3结构域的免疫球蛋白的Fc区，

b.所述Fc区通过所述铰链结构域与抗体1(Ab1)的Fab重链CH1-VH连接，

c.其继而通过多肽接头序列与抗体2(Ab2)的Fab重链CH1-VH连接，并且多肽接头序列连接所述Ab1的Fab重链VH结构域的N-末端与所述Ab2的CH1结构域的C-末端，

其中Ab1和Ab2识别不同的表位，

并且其中Ab1或Ab2之一的Fab CH1结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的192位上的苏氨酸残基被天冬氨酸取代而衍生自所述CH1结构域，并且同源CL结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的137位上的天冬酰胺残基被赖氨酸残基取代并且所述CL结构域的114位上的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域，和/或

其中Ab1或Ab2中一个或另一个的Fab CH1结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的124位上的亮氨酸残基被谷氨酰胺取代并且所述CH1结构域的188位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CH1结构域，并且同源CL结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的133位上的缬氨酸残基被苏氨酸残基取代并且所述CL结构域的176位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域。

6.权利要求5的蛋白质构建体，其中Ab1的所述Fab CH1结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的192位上的苏氨酸残基被天冬氨酸取代而衍生自所述CH1结构域，并且同源CL结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的137位上的天冬酰胺残基被赖氨酸残基取代并且所述CL结构域的114位上的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域，并且其中Ab2的所述Fab CH1结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的124位上的亮氨酸残基被谷氨酰胺取代并且所述CH1结构域的188位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CH1结构域，并且所述同源CL结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的133位上的缬氨酸残基被苏氨酸残基取代并且所述CL结构域的176位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域。

7.权利要求5的蛋白质构建体，其中Ab2的所述Fab CH1结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的192位上的苏氨酸残基被天冬氨酸取代而衍生自所述CH1结构域，并且同源CL结构域是突变的结构域，其通过CL结构域的137位上的天冬酰胺残基被赖氨酸残基取代并且CL结构域的114位上的丝氨酸残基被丙氨酸残基取代而衍生自免疫球蛋白的CL结构域，并且其中Ab1的Fab CH1结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CH1结构域的124位上的亮氨酸残基被谷氨酰胺取代并且所述CH1结构域的188位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CH1结构域，并且同源CL结构域是突变的结构域，其通过免疫球蛋白的CL结构域的133位上的缬氨酸残基被苏氨酸残基取代并且所述CL结构域的176位上的丝氨酸残基被缬氨酸残基取代而衍生自所述CL结构域。

8.权利要求2至7中任一项的蛋白质构建体，其中所述多肽接头序列包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：EPKX₁CDKX₂HX₃X₄PPX₅PAPELLGGPX₆X₇PPX₈PX₉PX₁₀GG(SEQ ID NO:1)，其中X₁、X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、X₇、X₈、X₉、X₁₀是相同或不同的任何氨基酸。

9.权利要求8的蛋白质构建体，其中所述多肽接头序列包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGGG(SEQ ID NO:2)；

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG(SEQ ID NO:3)；

EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG(SEQ ID NO:4)；

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:5)和

EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG(SEQ ID NO:6)。

10.权利要求1至9中任一项的蛋白质构建体，其识别EGFR和HER2/neu两者。

11.权利要求10的蛋白质构建体，其为多特异性抗体，优选为双特异性抗体，其中Ab1和Ab2不同，其独立地一方面选自西妥昔单抗或其突变的衍生物，或另一方面选自曲妥珠单抗或其突变的衍生物。

12.权利要求1至9中任一项的蛋白质构建体，其识别CD38和PD-L1两者。

13.权利要求12的蛋白质构建体，其为多特异性抗体，优选为双特异性抗体，其中Ab1和Ab2不同，其独立地一方面选自daratumumab或其突变的衍生物，另一方面选自atezolizumab或其突的变衍生物。

14.权利要求12的蛋白质构建体，其是双特异性抗体，其包含以下，优选由以下组成：a)两个重链，每个重链包含SEQ ID NO：7，优选由SEQ ID NO：7组成；b)四个轻链，其中两个包含SEQ ID NO：15，优选由SEQ ID NO：15组成，另外两个包含SEQ ID NO：18，优选由SEQ IDNO：18组成。

15.多肽，其包含如权利要求2至14中任一项所定义的抗原结合片段的重链或多特异性抗体的重链，优选由如权利要求2至14中任一项所定义的抗原结合片段的重链或多特异性抗体的重链组成。

16.包含编码权利要求15的多肽的序列的多核苷酸。

17.用包含权利要求16的多核苷酸的表达载体转染的宿主细胞。

18.权利要求17的宿主细胞，进一步用编码两个不同轻链的至少两个多核苷酸转化：第一轻链与所述重链的第一VH/CH1区域特异性配对；第二轻链与所述重链的第二VH/CH1区域特异性配对。

19.产生如权利要求2至14中任一项所定义的抗原结合片段或多特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：a)在合适的培养基和培养条件中培养表达如权利要求2至14中任一项所定义的抗体重链和如权利要求2至14中任一项所定义的抗体轻链的宿主细胞；和b)从培养基或所述培养细胞中回收所述产生的抗体。

20.如权利要求2至14中任一项所定义的多特异性抗原结合片段或多特异性抗体，其用作药物。