JP5732496B2 - Ｄｎａ分子及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、グラム陽性細菌細胞のＤＮＡに変異を導入する分子を用いたＤＮＡ分子及び方法に関し、特にクロストリジウム綱の細胞に関する。

クロストリジウム綱は、クロストリジウム目、ハロアナエロビウム目及びサーモアナエロバクター目を含む。クロストリジウム目はクロストリジウム科を含み、クロストリジウム科はクロストリジウム属を含む。

クロストリジウムは、最も大きなバクテリア属の１つである。クロストリジウムは偏性嫌気性で、グラム陽性であり、胞子を形成する。特定のメンバー、例えば、クロストリジム・サーモセラム及びクロストリジウム・アセトブチリカムは、工業規模の化学燃料の生成に使用されうる。この後者のクロストリジウムの種類は、他の良性の代表的な種類と共に、癌に対する治療薬の搬送手段としての明白なポテンシャルを更に有する。しかしながら、前記属は、例えば、クロストリジウム・ディフィシレ、ボツリヌス菌及びクロストリジウム・パーフリンジェンスが人間や家畜の病気を引き起こすことから、最大の悪評を得るに至っている。

前記属の多大なコマーシャル及び医学的重要性に関わらず、それらが引き起こす病気に対抗する効果的な開発又は合理的取り組みの進展の進行程度は、分子レベルでの有機的組成体の生物学の基本的理解が欠如しているために、大幅に遅れている。これは、有効な遺伝的手段の不存在によるところが大きい。

近年では、すべての主たる種類の完全なゲノム配列は、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ボツリナム及びクロストリジウム・パーフリンジェンスを含む少なくとも１つの代表的なストレインから決定されている。他の細菌種において、このような知識は、より効果的な疾病管理又は改善されたプロセスのプロパティによるストレインの生成のきっかけになりうる。このような取り組みにおける極めて重要な手段は、ＤＮＡをゲノムに合理的に組み込む機能である。このような技術は、（ｉ）生理学及び病因論を理解するのに不可欠な最初の手段としての、機能を個々の遺伝子又は遺伝子セット（に帰着させる）のものとする手段としての特定の突然変異体の生成、（ｉｉ）所望の商業的商品の製造を増進する手段としての、規制又は構造遺伝子の挿入的な不活性化、及び（ｉｉｉ）外来要素をコードする遺伝情報の安定的な導入、に利用しうる。しかしながら、現在のところ、突然変異研究に効果的なインテグレーションベクターはいずれのクロストリジウム種にもなく、前記属の遺伝子を挿入的に不活性にする機能はひどく不十分なままである。

クロストリジウム種において突然変異体を作る従前の試みは、インテグレーションベクター及び宿主染色体の相同的組み換えに依存していた。クロストリジウム・パーフリンジェンス・ストレイン１３、クロストリジウム・バイジェリンキーＮＣＩＭＢ８０５２、クロストリジウム・アセトブチリクムＡＴＣＣ８２４及びクロストリジウム・ディフィシレＣＤ３７において、宿主染色体の領域を運搬するマイナス鎖複製プラスミドの、相同的組み換えによるゲノムのインテグレーションが示されている（Ｓｈｉｍｉｚｕ等（１９９４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：１６１６−２３； Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ及びＹｏｕｎｇ（１９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４０：８９−９５； Ｇｒｅｅｎ等（１９９６）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４２：２０７９−２０８６； Ｌｉｙａｎａｇｅ等（２００１）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：２００４−２０１０）。クロストリジウム・バイジェリンキー及びクロストリジウム・ディフィシレの場合、ベクターはＥ．ｃｏｌｉドナーから集められた。クロストリジウム・パーフリンジェンス及びクロストリジウム・アセトブチリカムでは、プラスミドは形質変換により導入された。受容体ごとに、１０^−６〜１０^−７の頻度で、クロストリジウム・バイジェリンキーの組込み体が生じ、それは複製能の高いプラスミドにより観察された伝達頻度（１０^−４〜１０^−５）より低い２桁を示した（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ及びＹｏｕｎｇ，１９９４、上記と同様）。クロストリジウム・ディフィシレの場合、達成される頻度の兆候は報告されなかった（Ｌｉｙａｎａｇｅ等，２００１、上記と同様）。クロストリジウム・アセトブチリカムの場合、ＤＮＡμｇあたりの０．８〜０．９「コロニー」の頻度で組込み体が生じた（Ｇｒｅｅｎ等，１９９６、上記と同様）。上記の組込み体においては、標的部位におけるプラスミド配列の隣りに、インテグレーションを命令するＤＮＡセグメントの直接反復コピーが配置されていた。結果として、それらは分離的に不安定であり、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカムについて３０生成ごとに１．８〜３．０×１０^−３の間の損失（Ｇｒｅｅｎ等，１９９６、上記と同様）、クロストリジウム・バイジェリンキーについて０．３７〜１．３１０^−３の間の損失（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ及びＹｏｕｎｇ，１９９４、上記と同様）がある。

対立遺伝子の変化の結果得られる組込み体が好ましいということが理解される。したがって、クロストリジウム・パーフリンジェンスにおいてダブルクロスオーバー突然変異体が捜し出され、取得された（Ａｗａｄ等（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５：１９１−２０２； Ｂａｎｎａｍ等（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：５３５−５５１）。しかしながら、対立遺伝子の変化は、標的遺伝子の不活性化に利用される抗生物質対抗性遺伝子の両側にかなり長い（３．０ｋｂ）相同性の領域を含むことで可能となることが確認されるのみだった。更に、この対策によっても突然変異体の単離は非常に変化しやすいことが確認されており（例えば、ｐｌｃ突然変異体は１０回の独立した実験のうち２しか取得されなかった）、多くの突然変異体は単離に最高で６か月かかる可能性があり、他はまったく単離されないこともある。ＤＮＡがこの有機的組織体内に移動しうる高い頻度の結果として、クロストリジウム・パーフリンジェンスにおいてまれなインテグレーションの事例が検知された。他のクロストリジウム種においてダブルクロスオーバー突然変異体を生成する試みは成功しなかった。

現在まで、伝統的な相同的組み換えを用いて、クロストリジウム・パーフリンジェンス以外のクロストリジウム種の範囲における、突然変異体の生成は、難しいことが確認されている。したがって、クロストリジウム・アセトブチリカムにおいては５つの突然変異体のみが作られている。複製欠損プラスミドの単一のクロスオーバーインテグレーションにより、４つ（ｂｕｔＫ，ＣＡＣ３０７５；ｐｔａ，ＣＡＣ１７４２；ａａｄＣＡＣＰ０１６２，及び；ｓｏｌＲ，ＣＡＣＰ０６１）が作られ（Ｇｒｅｅｎ等，１９９６、上記と同様；Ｇｒｅｅｎ及びＢｅｎｎｅｔｔ（１９９６）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１３，５７−５８；Ｈａｒｒｉｓ等（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４，３５８６−３５９７）、一方で、成功していないが、複製欠損プラスミドを用いた相互交換によって突然変異の生成を行おうとする戦略により、ｓｐｏ０Ａ（ＣＡＣ２０７１）の５つが単離された（Ｎａｉｒ等（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１，３１９−３３０）。同様に、クロストリジウム・ディフィシレでは３つの特異的突然変異体のみの生成が報告されている。１つの突然変異体（ｇｌｄＡ，ＣＤ０２７４）が、複製欠損プラスミドを用いて生成されたが（Ｌｉｙａｎａｇｅ等，２００１、上記と同様）、この事例は致命的であり、突然変異体細胞は繁殖することができないようだった。他の不活性化された２つの遺伝子（ｒｇａＲ，ＣＤ３２５５及びｒｇｂＲ，ＣＤ１０８９）が、２つの構造遺伝子の内部フラグメントを担持する複製欠損プラスミドの導入に続いて生じる（Ｏ‘Ｃｏｎｎｅｒ等（２００６）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１，１３３５−１３５１）。これら後者のプラスミドは、「若干の問題」と共に導入されたようだが、組込み体が単離されたものの、単離頻度は書きとめられなかった。実際に、突然変異体が生成された頻度の表示が一般的に示されていないことから、双方の有機的組織体で用いられた突然変異生成手順の効率の評価を作るのは困難である。クロストリジウム・アセトブチリカムの場合、「μｇプラスミドＤＮＡにつき１未満の形質変換細胞」になることが認められている（Ｔｈｏｍａｓ等，（２００５）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｏｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ ｃｌｏｓｒｉｄｉａ．Ｉｎ：Ｄｕｒｒｅ，Ｐ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ８１３−８３０）。更に、これらの突然変異体の大部分が単一のクロスオーバーインサーションによって作られるため、プラスミドのエクシジョンのために不安定である。例えば、クロストリジウム・ディフィシレｒｇａＲ突然変異体のサザンブロッティングは、個体群におけるいくつかの細胞のプラスミドを独立して複製し、「ループアウト（ｌｏｏｐｅｄ ｏｕｔ）」の存在を明らかにする（Ｏ‘Ｃｏｎｎｅｒ等，２００６、上記と同様）。

細菌ゲノムの効果的な組み換えをもたらす可動性の遺伝要素を含むシステムを利用する技術が、ますます考え出されている。乳酸連鎖球菌のグループIIイントロンＬ１．ＬｔｒＢは、イントロンコード逆転写酵素（ＬｔｒＡ）及び切り出された投げ縄型ＲＮＡの働きを介して、それ自体の可動性を調整する要素である。更に、それは、イントロンＲＮＡ組み換えを介してほとんどのいかなる所望のＤＮＡ配列をも標的としうる（Ｇｕｏ等（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９：４５２−４５７；Ｍｏｈｒ等（２０００）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：５５９−５７３）。このように、標的化に使用される１５ｂｐ領域のイントロンの個々の塩基を適切に変異させることにより、Ｋａｒｂｅｒｇ等（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）１９：１１６２−１１６７）は、０．１〜２２％の間の頻度で、いくつかの異なるＥ．ｃｏｌｉ遺伝子において区別可能な、決められた位置への要素の挿入を導くことができた。これらの遺伝子のうちの１つ、ｔｈｙＡが破壊されると、生来トリメトプリム耐性のクローンになる。したがって、この組込み体は、トリメトプリムの存在における培養により選択することが可能である。他の遺伝子組込み体は、Ｌ１．ＬｔｒＢイントロンの存在について、個々のコロニーをスクリーニングすることにより識別された。Ｅ．ｃｏｌｉのｔｈｙＡ遺伝子を破壊するのに用いるプラスミドは、Ｓ．フレックスネリ及びＳ．タイフィムリュウムにおけるｔｈｙＡ遺伝子の破壊にも用いられた。トリメトプリム耐性コロニーは、それぞれ１％及び０．３％の頻度で得られた。

乳酸連鎖球菌のグループIIイントロンＬ１．ＬｔｒＢは、クロストリジウム・パーフリンジェンスのｐｌｃ遺伝子においてノックアウトを生成するのに用いられた（Ｃｈｅｎ等（２００５）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：７５４２−７）。とりわけｐｌｃ遺伝子を標的とするように設計された変性Ｌ１．ＬｔｒＢイントロンを含むクロラムフェニコール耐性プラスミドは、電気穿孔処理されてクロストリジウム・パーフリンジェンスに導入された。形質転換細胞は、クロラムフェニコールに基づいて選択され、ＰＣＲによるｐｌｃ遺伝子における挿入の存在のテストを受けた。テストされた３８コロニーのうち、大部分は挿入に対して陰性だったが、２つのコロニーは野生型及びイントロン挿入ｐｌｃ遺伝子の双方を含んでいた。後者のコロニーは、単一の変換された細菌から生じたとみなされ、挿入がおきる子孫と、挿入が起きない子孫とを生じさせた。これらの混合コロニーからの細菌は、１０％がイントロン挿入ｐｌｃ遺伝子を含む、混じり気のないクローンを生じさせた。挿入突然変異体は、形質転換のためのクロラムフェニコール以外の、抗生物質による増殖を選別する必要がない２ラウンドのスクリーニングを介して識別された。つまり、抗生物質対抗性遺伝子のクロモソームへの導入の欠如は、この方法の特定の効果として識別される。特に、著者らは、この方法が、異なる変性Ｌ１．ＬｔｒＢイントロンを担持する同じシャトルプラスミドを用いて、同じ細菌細胞における複数遺伝子の破壊を構成するのに用いられうることを想定している。クロストリジウム・パーフリンジェンスへの移動頻度は高く、他のクロストリジウム種より２桁大きい。更に、（ｐｌｃにおける）遺伝子ノックアウトは、寒天プレートの上ですばやく視覚化され、容易に検知される表現型を生じさせる。

Ｙａｏ等（ＲＮＡ（２００６）１２：１−１１）はブドウ球菌において選択なしに遺伝子を***させるのにＬ１．ＬｔｒＢを用いた。カドミウム誘導性プロモーターがＳ．アウレウスにおけるＬ１．ＬｔｒＢイントロンの表現を命令するのに用いられた；カドミウムによる誘導は、１つの遺伝子において挿入突然変異体を得るのに有益である。突然変異体が他の遺伝子において作られるとき、すべてのコロニーは、カドミウムなしでイントロンの挿入陽性をテストした。

Ｚｈｏｎｇ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００３）３１：１６５６−６４）は、グループIIイントロンへの「レトロ転位活性化選択可能マーカー」又はファージＴ４のｔｄイントロンを含むトリメトプリム（Ｔｐ）耐性カセットを含むＲＡＭの挿入を含む、グループIIイントロンの再標的化について正の選択を行う方法を記載している。Ｔｐ耐性遺伝子は、タイプIIジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする。ｔｄイントロンはグループＩイントロン、つまり自己触媒のＲＮＡ要素であって、正しい向きにおいて、それが位置するＲＮＡ転写物からスプライスすることができる。ｔｄがＴｐ^Ｒに挿入される方向は、遺伝子が転写されるときに要素がスプライスされない方向である。したがって、ｍＲＮＡは突然変異体のままであり、Ｔｐ耐性に必要なタンパク質は生成されない。グループII要素がＲＮＡに転写されるとき、再標的化の間、ＲＡＭの反対側のストランドはＲＮＡの形で存在する。これらの環境下で、ｔｄ要素は正しく方向づけられ、スプライスされる。その結果、グループII要素がクロモソームを再標的化するとき、Ｔｐ^Ｒ遺伝子はそのｔｄ挿入を失い、機能的になる。その結果、再標的化が完了した細胞はＴｐ耐性になる。したがって、それらは直接選択されうる。この方法は、大腸菌細胞に用いられる。

クロストリジウム種は、しばしばトリメトプリムに耐性があり、Ｔｐ耐性カセットに基づくＲＡＭの使用を実行不能にする。例えば、Ｓｗｅｎｓｏｎ等（１９８０）のＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１８：１３−１９の研究において、テストされた分離株の大部分は耐性があった。耐性は、非病原性の工業的に有用な株にも共通である。実は、クロストリジウム・セルロリチカムの固有の耐性は、Ｊｅｎｎｅｒｔ等（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１４６：３０７１−８０における遺伝子導入実験に用いられた接合方法の基礎となっている。

カナマイシン耐性（Ｋｍ^Ｉ）カセットから成るＲＡＭに基づく遺伝子ノックアウトを（主にＥ．ｃｏｌｉにおいて）実行するキットは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈにより「ＴａｒｇｅＴｒｏｎ（商標） Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｙｓｔｅｍ」として販売されている。クロストリジウム種は本来的にカナマイシンに耐性があるため、カナマイシン耐性はクロストリジウムの選択マーカーとして用いることはできない。

クロストリジウムゲノムにおいて、マーカーの相互交換により規定の遺伝子ノックアウトを作製できないことは、クロストリジウム綱、特にクロストリジウム属のメンバーの商業的利用の主な障害である。それはすべてのエリアに影響を与える。したがって、改良された発酵特性により工業的な株を生成するメタボリックエンジニアリングの活用は、現在のところ検討することができない（例えば、クロストリジウム・アセトブチリクム及びアセトン−ブタノール発酵処理；癌治療に有用な、染色体性に配置された治療遺伝子を担持する株を生成することができない（臨床試験の必要条件、例えばクロストリジウム・スポロジェンヌ及びクロストリジウム指向エンザイムプロドラッグ療法））；及び、効果的な対抗手段の定式化の重要な最初のステップである病理学的機構の基本的情報が著しく妨げられている（クロストリジウム・ディフィシレ及び院内感染））。

本明細書における先に発行された文献の列挙又は議論は、必ずしもこの文献が技術水準又は技術常識であると認めるものではないと解釈されるべきである。

発明者は、ＤＮＡのクロストリジウム種のゲノム又はクロストリジウム綱の他の細菌への効果的な挿入を可能とすることにより、ゲノムにおける遺伝子の標的化された突然変異を可能とするＤＮＡ分子及び方法を考え出した。

本発明の第１の側面は、イントロンコード逆転写酵素を発現しないが、変性されたグループIIイントロンと逆方向の変性された選択可能マーカー遺伝子を含む前記変性されたグループIIイントロンであって、前記選択可能マーカー遺伝子は選択可能マーカーをコードする領域及び前記選択可能マーカー遺伝子の領域に動作可能に結合されたプロモーターを有し、前記プロモーターは、前記選択可能マーカー遺伝子の単一のコピーに、前記選択可能マーカーがクロストリジウム綱の細菌性細胞の表現型を、前記選択可能マーカー遺伝子が欠如したクロストリジウム綱の細菌性細胞から識別することができるように変更するのに十分な量でコードされる選択可能マーカーの発現を起こすことができる、前記変性されたグループIIイントロンと、前記変性されたグループIIイントロンの転写のためのプロモーターであって、前記変性されたグループIIイントロンに動作可能に結合された前記プロモーターと、を有し、前記変性された選択可能マーカー遺伝子は、前記選択可能マーカー遺伝子の発現を妨害することができるように、前記変性されたグループIIイントロンに対して前方方向に位置するグループIイントロンを含み、前記ＤＮＡ分子は、前記グループIイントロンが前記変性されたグループIIイントロンの前記ＲＮＡ転写から除去されて前記選択可能マーカーをコードする領域を残すことを可能とし、前記ＲＮＡ転写（又はそのＤＮＡコピー）をクロストリジウム綱の細菌性細胞におけるＤＮＡ分子の部位に挿入することを可能にする、ＤＮＡ分子を提供する。

グループIIイントロンは、真正細菌及びオルガネラにみられる可動遺伝因子である。自然界において、それらは、イントロンをコードする逆転写酵素（ＩＥＲＴ）及び切り出されたイントロンラリアートＲＮＡを含むリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体により媒介されるレトロホーミングと呼ばれる可動機構を使用する。切り出されたイントロンＲＮＡは、逆スプライシング反応により、ダブルストランドのＤＮＡ標的部位の一方のストランドに直接挿入され、一方、ＩＥＲＴも反対のストランドを部位特異的に開裂し、開裂されたストランドの３’末端を、挿入イントロンＲＮＡのＤＮＡプライム逆転写（ＴＰＲＴ）に用いる。その結果、イントロン（及び変性したイントロンに担持されたヌクレオチド酸）は標的のＤＮＡに挿入される。ＴＰＲＴシステムは、ＩＥＲＴ及び切り出されたイントロンＲＮＡのみを必要とする（Ｓａｌｄａｎｈａ等（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８，９０６９−０８３参照）。グループIIイントロンの詳細は、参照によりここに組み込まれるＫａｒｇｅｒｇ等（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９，１１６２−１１６７及びここに挙げられた文献に記載されている。

ＩＥＲＴは、本分野においてイントロンコードタンパク質（ＩＥＰ）としても知られている。ＩＥＰ（ＩＥＲＴ）は、イントロンのコピーをＤＮＡに挿入することを可能とするエンドヌクレアーゼ及びｍａｔｕｒａｓｅ活性と共に、逆転写酵素活性を有する。

ＤＮＡ基質を開裂し、ヌクレオチド酸分子を挿入する処理は、ＲＮＰ複合体のグループIIイントロンＲＮＡのＤＮＡ基質の特定の領域への塩基対合を含む。イントロンコード逆転写酵素及びＤＮＡ基質の認識部位の傍らにある領域との間で追加的な相互作用が起きる。典型的には、グループIIイントロンＲＮＡは、ＤＮＡ基質のトップストランドにあるＩＢＳ１及びＩＢＳ２とハイブリダイズすることができるＥＢＳ１及びＥＢＳ２の２つの配列を有する。典型的には、グループIIイントロンコード逆転写酵素は、基質の認識部位における第１の配列要素及び第２の配列要素と結合する。典型的には、グループIIイントロンＲＮＡは、ＤＮＡ基質のトップストランドの開裂部位に挿入される。認識部位の第１の配列要素は、推定上の開裂部位であるＩＢＳ１配列及びＩＢＳ２配列の上流にある。第１の配列要素は、約１０から約１２のヌクレオチド対を有している。認識部位の第２の配列要素は、推定上の開裂部位の下流にあり、約１０から約１２のヌクレオチドを有している。

ここに示すように、開裂部位の上流に位置するヌクレオチドは、開裂部位に対して（−）ポジションを有し、開裂部位の下流に位置するヌクレオチドは、開裂部位に対して（＋）ポジションを有する。このように、開裂部位は、ダブルストランドＤＮＡ基質のトップストランドの−１ヌクレオチド及び＋１ヌクレオチドの間に位置している。ＩＢＳ１配列及びＩＢＳ２配列は、開裂部位に対してポジション−１あたりからポジション−１４あたりまで延在する認識部位の領域にある。

典型的には、ＥＢＳ１はグループIIイントロンＲＮＡのドメインＩに位置し、基質のＩＢＳ１配列のヌクレオチドにハイブリダイズすることができる約５から７のヌクレオチドを有する。

典型的には、ＥＢＳ２はＥＢＳ１の上流であってグループIIイントロンＲＮＡのドメインＩに位置し、基質のＩＢＳ２配列のヌクレオチドにハイブリダイズすることができる約５から７のヌクレオチドを有する。

基質を効果的に開裂するために、グループIIイントロンＲＮＡのＥＢＳ１の第１のヌクレオチドのすぐ前にくるヌクレオチド又は配列は、基質のトップストランドの＋１にあるヌクレオチドを補完する。

本発明のＤＮＡ分子に含まれる変性されたグループIIイントロンは、ＩＥＲＴを発現しない。好ましくは、グループIIイントロンは、ＩＥＲＴのために機能オープンリーディングフレームを含まない。好ましくは、典型的にＩＥＲＴを含むグループIIイントロンのドメインIVは、ＩＥＲＴを含まないよう部分的に削除される。

本発明の実施に使用できる種々のグループIIイントロンが知られている。これらは、Ｄｉａ及びＺｉｍｍｅｒｌｙ（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：１０９１−１１０２で検討されている真正細菌性イントロンを含み、また、Ｚｉｍｍｅｒｌｙ及びＨａｕｓｎｅｒ及びＷｕ（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：１２３８−１２５０で言及されているミトコンドリア及び葉緑体イントロンを含む。グループIIイントロンが乳酸連鎖球菌Ｌ１．ＬｔｒＢイントロン（Ｍｏｈｒ等（２０００）、上記と同様）であれば好ましい。このグループIIイントロンのＩＥＲＴはＬｔｒＡタンパク質である。サッカロマイシス・セレヴィシエのａＩ１及びａＩ２ヌクレオチドインテグラーゼも適している。

他の代替物は、クロストリジウム接合トランスポゾンＴｎ５３９７からのグループIIイントロンである（Ｒｏｂｅｒｔｓ等（２００１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：１２９６−１２９９）。

ＬｔｒＡ ＲＮＰ複合体は、切り出された、野生型の又は変性された、乳酸連鎖球菌ＬｔｒＢ遺伝子のグループＬ１．ＬｔｒＢグループIIイントロンＲＮＡであって、以下「Ｌ１．ＬｔｒＢイントロン」と呼ばれるものを含み、また、野生型の又は変性されたＬ１．ＬｔｒＢイントロンコード逆転写酵素であって、以下ＬｔｒＡタンパク質と呼ばれるものを含む。Ｌ１．ＬｔｒＢイントロンＲＮＡのＥＢＳ１は、７ヌクレオチドを含み、４５７から４６３のポジションに位置する。野生型Ｌ１．ＬｔｒＢイントロンＲＮＡのＥＢＳ１配列は、配列５´‐ＧＵＵＧＵＧＧ（配列番号１）を有する。Ｌ１．ＬｔｒＢイントロンＲＮＡのＥＢＳ２は、６ヌクレオチドを含み、４０１から４０６を含むポジションに位置する。野生型Ｌ１．ＬｔｒＢイントロンＲＮＡのＥＢＳ２配列は、配列５´‐ＡＵＧＵＧＵ（配列番号２）を有する。

本発明のＤＮＡ分子におけるグループIIイントロンは、変性された選択可能なマーカー遺伝子を含むように変性されてきている。選択可能なマーカー遺伝子は、それが発現される細菌細胞に変化した表現型を与える遺伝子である。変性された選択可能なマーカー遺伝子は、選択可能なマーカーの発現を妨げるグループＩイントロンを含むことにより（変性されない選択可能なマーカー遺伝子と比較して）変性される。「変性されない選択可能なマーカー遺伝子」という用語は、プロモーターを含む遺伝子及び遺伝子のコード領域であって、プロモーターが自然発生的な遺伝子のプロモーターではないものを含む。また、「変性されない選択可能なマーカー遺伝子」は、プロモーターが自然発生的な遺伝子のプロモーターであるものも含む。選択可能なマーカー遺伝子の変性の更なる詳細は後述するが、基本的に、グループＩイントロンの存在が選択可能なマーカーの発現を妨げるが、グループＩイントロンの切除により、結果として生じるヌクレオチド酸（すなわち変性されない選択可能なマーカー遺伝子）は選択可能なマーカーを発現することができる。好ましくは、選択可能なマーカー遺伝子は、グループIIイントロンのドメインIVに位置する。

選択可能なマーカーの発現が、グループＩイントロンの存在によって妨げられる限り、グループＩイントロンは選択可能なマーカー遺伝子のいずれの場所に位置することもできることが好ましい。グループＩイントロンは、プロモーターの範囲内、例えば、プロモーターの−１０及び−３５要素の間や、プロモーターとコード領域の間又はコード領域内に位置することが好ましい。

グループＩイントロン（すなわち変性された選択可能なマーカー遺伝子）を含む選択可能なマーカー遺伝子は、レトロ転位活性マーカー（ＲＡＭ）と考えることができる。

グループＩイントロンは、切除されるためにタンパク質等の補助因子を要求することができ、又は要求することができないセルフスプライシングイントロンである。本発明の実施に使用可能な種々のグループＩイントロンは、バクテリオフォージイントロン（Ｓａｎｄｅｇｒａｎ及びＳｊｏｇｅｒｂ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２２２１８−２２２２７）及びテトラヒメナグループＩイントロン（Ｒｏｍａｎ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５：２１３４−２１３９）を含むことが知られている。グループＩイントロンは、切除されるためにタンパク質等の補助因子を要求しないことが望ましい。グループＩイントロンが、ファージＴ４からのｔｄグループＩイントロンであれば望ましい。

ＤＮＡ分子内の種々の構成要素の方向が非常に重要であることが望ましい。したがて、図２から、変性された選択可能なマーカー遺伝子は、グループIIイントロンの逆方向においてグループIIイントロン内に存在することになる。また、グループＩイントロンは、変性された選択可能なマーカー遺伝子において、選択可能なマーカー遺伝子と逆方向であって、グループIIイントロンと同じ前方向を向いて存在することになる。グループＩイントロンが選択可能なマーカー遺伝子と同じ方向であると、イントロンは選択可能なマーカー遺伝子のｍＲＮＡ転写体から切り取られることが可能となり、選択可能なマーカーに与えられる表現型は、選択可能なマーカーを含むグループIIイントロンが染色体を再標的化するか否かにかかわらず存在する。したがって、グループＩイントロン及び選択可能なマーカー遺伝子は逆方向でなければならない。

選択可能なマーカー遺伝子がグループIIイントロンと同じ方向であった場合は、上記の論理に従い、グループＩイントロンはグループIIイントロンと反対方向になる。しかしながら、この方向では、ｍＲＮＡ転写体から切り取られることが不可能であり、グループIIイントロンが染色体を再標的化したとしても、選択可能な表現型がないことになる。

種々の構成要素が図２に示すように方向づけられたときだけ、グループIIイントロンの染色体への再標的化が必要となり、選択可能なマーカーの表現型を発現するのに十分となる。

本発明のＤＮＡ分子が、（以下により詳細に記載するように）ヌクレオチド酸分子をクロストリジウム綱の細菌性細胞におけるＤＮＡ分子の部位に導入するのに用いられるとき、グループＩイントロンは、選択可能なマーカーをコードする領域を残して、変性されたグループIIイントロンから生成されたＲＮＡ転写体から除去され、ＲＮＡ転写体（又はそのＤＮＡコピー）は、クロストリジウム綱の細菌性細胞におけるＤＮＡ分子の部位に導入される。このようにして、クロストリジウム綱の細菌性細胞におけるＤＮＡ分子に導入されるヌクレオチド酸は、細菌性細胞において選択可能なマーカーを発現することができる選択可能なマーカー遺伝子を有する。

好ましい実施形態では、変性されたグループIIイントロンは、グループIIイントロンのＲＮＡ転写体のスプライシングを可能とするエクソンの傍らに配置されている。

選択可能なマーカー遺伝子のプロモーターは、それが選択可能なマーカー遺伝子が欠如したクロストリジウム綱の細菌性細胞から区別することができるように、選択可能なマーカーがクロストリジウム綱の細菌性細胞の表現型を変更するのに十分な量で、それが選択可能なマーカー遺伝子の単一配列によりコードされるとき、選択可能なマーカーを発現させることができる。例えば、プロモーターが細菌性染色体の単一配列に存在するとき、及び選択可能なマーカーのコード領域と動作可能に連携しているとき、プロモーターは、検出量の選択可能なマーカーを発現するものでありうる。選択可能なマーカー遺伝子のプロモーターは、クロストリジウム綱の細菌性細胞において機能的なものであり、上述のように単一配列に存在するとき、十分な発現を起こすものである。プロモーターは、クロストリジウム種において機能的であることが望ましい。適当なプロモーターは、クロストリジウム・パーフリンジェンスのｆｄｘ遺伝子プロモーター（Ｔａｋａｍｉｚａｗａ等（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３６：７０−７５）；クロストリジウム・アセトブチリカムのｐｔｂ，ｔｈｌ及びａｄｃプロモーター（Ｔｕｍｍａｌａ等（１９９９）Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３７９３−３７９９）及びクロストリジウム・パーフリンジェンスのｃｐｅプロモーター（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，Ｌａｂｂｅ及びＳｏｎｅｎｓｈｅｉｎ（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ６２：５５５０−５５５８）及びクロストリジウム・アセトブチリカムからのチオラーゼプロモーター（Ｗｉｎｚｅｒ等（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：５３１−５４１）を含む。

プロモーターが本発明の選択可能なマーカーとして効果的になりやすいか否かをテストするために、ＲＡＭのスプライスした変異体（すなわちグループＩイントロンは除去されているので選択可能なマーカーをコードする）は、その転写調節下におかれてもよく、標的であるクロストリジウムに、低いコピー数、好ましくは染色体のコピー数と同等のコピー数で導入されてもよい。これは、Ｓｗｉｎｆｉｅｌｄ等（１９９０）Ｇｅｎｅ．８７：７９−９０に記載されたプラスミドｐＡＭβ１の低いコピー数の誘導体等の低いコピー数のプラスミドを用いることにより、又はより好ましくは接合トランスポゾン並びにＭｕｌｌａｎｙ等（Ｐｌａｓｍｉｄ（１９９４）３１：３２０−３２３）及びＲｏｂｅｒｔ等（Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００３）５５：６１７−６２４）に記載された方法を用いることにより達成することができる。後者を達成するために、評価段階にあるプロモーターと共にスプライスされたＲＡＭを、グラム陽性の細菌にで複製することができないが抗生物質対抗性遺伝子（すなわちｃａｔＰ）及びＴｎ９１６等の接合トランスポゾンから派生したＤＮＡのセグメントを担持するベクター内に複製してもよい。その後、プラスミドは、適当な接合トランスポゾンをそのゲノム（Ｔｎ９１６）において担持する枯草菌細胞に導入され、クロラムフェニコールを含むプレートに基づいて形質転換細胞が選択される。プラスミドは複製できないため、クロラムフェニコール耐性コロニーが生じる唯一の場合は、プラスミドが、Ｔｎ９１６及びプラスミドに担持されるホモロジーの領域の相同的組み換えの結果としてゲノムに組み入れられる場合である。これは、スプライスされたＲＡＭ及びテストされているプロモーターを担持するトランスポゾン：：プラスミドがゲノム中に単一コピー存在するような共挿入をもたらす。得られた枯草菌細胞トランス接合体は、標的とされるクロストリジウムと抱合したドナーとして用いることができる。これらの接合により、トランスポゾン：：プラスミド共挿入のクロストリジウム受容体への転移はチアンフェニコールへの耐性の取得に基づいて選択することができる。取得されるとすぐに、トランス接合体はＲＡＭでコードされる耐性、すなわちエリスロマイシンを試験されてもよい。

変性されたグループIIの転写を調整するプロモーターは、クロストリジウム綱の細菌性細胞において機能的ないかなる適当なプロモーターであってもよい。プロモーターは、構成性プロモーター又は誘導型プロモーターであってもよい。誘導型プロモーターは、構成的なやり方で発現を促進するように活性化されてもよい。実施例に記載された特定の実験において、発明者は、変性されたグループIIの調整された発現型は、構成的な発現と比較して、高いイントロン挿入頻度を可能とするのに何ら効果をもたらさないことを発見した。しかしながら、他の状況では、それは変性されたグループIIの発現型の調整をかのうとするのに有用でありうる。当業者であれば、十分なイントロン挿入率を可能とするのに適した特定のプロモーターであるか否かを決定するための試験を行うことが可能である。

Ｇｉｒｃａｌ等（２００３）のＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：４９８５-４９８８は、ブドウ球菌キシロサスキシローゼオペロンプロモーターリプレッサー規制システムに基づき、クロストリジウム・アセトブチルカムにおいて好ましいキシロース誘導プロモーターを記載している。適した誘導プロモーターはＩＰＴＧ又はキシロース誘導である。好都合なことに、例えばＤＮＡ分子がクロストリジウム細胞に用いられるものである場合は、プロモーターはＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃ オペロンのｌａｃオペレーター領域の制御下にあるクロストリジウム・パスツリアヌム・フェレドキシン遺伝子のプロモーター領域である。好都合なことに、ＤＮＡ分子はＥ．ｃｏｌｉのｌａｃＩ遺伝子を更に有する。

変性されたグループIIイントロンの転写を調整するプロモーターは、構成的プロモーターでありうる。当業者であれば、一般に、すべてのプロモーターが、その条件が未知であったとしても、１つの又は他の条件下で調整されることを理解するであろう。したがって、我々は「構成的プロモーター」を、再標的化プロトコルに用いられる標準的培地条件の下、プロモーターによって駆動される発現を活性化させる薬剤を添加する必要もなく、クロストリジウム細胞において活性なプロモーターを含むものとして、広く解釈する意図である。一次代謝に不可欠な遺伝子のプロモーターは、適当な「構成的プロモーター」となりうる。例えば、実施例に記載されたチオラーゼプロモーター、ｔｈｌは適当なプロモーターである。他の適当なプロモーターは、クロストリジウム・アセトブチルカムプロモーターｈｂｄ，ｃｒｔ，ｅｔｆＡ，ｅｔｆＢ及びｂｃｄである（Ａｌｓａｋｅｒ及びＰａｐｏｕｔｓａｋｉｓ（２００５）Ｊ Ｂａｔｅｒｉｏｌ １８７：７１０３-７１１８）。ＲＡＭの変性された選択可能マーカーの発現を駆動するのに適するものとして挙げられるプロモーターもまた、適している。

誘導プロモーターの使用は、後述のＲＡＭの細菌性染色体への再標的化後、グループＩイントロンに妨害された選択可能なマーカー遺伝子を含むグループIIイントロン（ＲＡＭと呼んでもよい）の転写のスイッチオフを可能にする。ＲＡＭが誘導プロモーターから転写されると、選択可能マーカーの発現が効果を有しなくなる。これは染色体から転写されたコーディングストランドの転写体及びＤＡＮ分子から転写された非コードストランドの間の二重鎖形成に起因すると考えられる。

本発明のＤＮＡ分子は、クロストリジウム綱の細菌性細胞における複製が可能であることが望ましい。より好ましくは、条件付きの複製を行うことができる。好都合なことに、ＤＮＡ分子は、グラム陽性細菌性細胞における複製を可能とする適当な複製起点及び複製遺伝子（すなわち適用なｒｅｐ遺伝子）を含んでいる。好ましくは、ＤＮＡはプラスミドである。そうでない場合は、ＤＮＡは直鎖状であり、又はＭ１３のような繊維状ファージである。好都合なことに、ＤＮＡ分子は、大腸菌等のグラム陰性細菌性細胞において複製及び繁殖を可能とし、グラム陽性細胞、特にクロストリジウム綱、より詳しくはクロストリジウム属の細胞における複製を可能とするシャトルベクターである。追加的又は代替的に、本発明のＤＮＡ分子は１つの細菌性細胞からクロストリジウム綱の細菌性細胞への接合伝達を可能とする領域を含んでいる。これは特に、ＤＮＡ分子が、Ｅ．ｃｏｌｉ及びクロストリジウム綱、より詳しくはクロストリジウム属の細菌の間の接合伝達を可能とする領域を含んでいる場合に好ましい。例えば、ＤＮＡ分子は、ｔｒａＪ遺伝子を含むｏｒｉＴ（転移の起点）領域を含んでもよい。

クロストリジウムにおける形質転換又は接合方法は、Ｄａｖｉｓ，Ｉ，Ｃａｒｔｅｒ，Ｇ，Ｙｏｕｎｇ，Ｍ ａｎｄ Ｍｉｎｔｏｎ，ＮＰ（２００５）“Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ”，Ｉｎ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ（Ｄｕｒｒｅ Ｐ，ｅｄ）ｐａｇｅｓ ３７−５２，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＵＳＡにおいて提供されている。

選択可能なマーカーは、選択可能なマーカーを含むクロストリジウム綱の細胞において発現される又は前記細胞を選択するのに適したいかなる選択可能なマーカーであってもよい。適当な選択可能なマーカーは、プロドラッグ変換エンザイム等の毒を解毒するエンザイムを含む。また、選択可能なマーカーは、原栄養遺伝子（対応する栄養要求性変異株に使用する）を含む。好ましくは、選択可能なマーカーは、それが発現されるクロストリジウム綱の細菌性細胞に増殖優位性を与えるものである。したがって、典型的には、与えられた成長条件の下、選択可能なマーカーを発現する細菌性細胞が、選択可能なマーカーを発現しない同等の細胞と比べて成長することができる（又はより早く成長することができる）。

便利な選択可能なマーカーは、抗生物質対抗性要因を含んでいる。したがって、選択可能なマーカー遺伝子は、適当にクロストリジウム綱の細菌性細胞に抗生物質対抗性を与えるものである。

抗生物質対抗性遺伝子のすべてが、クロストリジウム綱のすべての細胞に使用できるとは限らない。例えば、クロストリジウム種は、本来的にカナマイシンに耐性があり、しばしばトリメトプリムにも耐性がある。したがって、選択可能なマーカー遺伝子は、特に細菌性細胞がクロストリジウム属である場合は、カナマイシン耐性遺伝子又はトリメトプリム耐性遺伝子でないことが好ましい。クロストリジウム種等のクロストリジウム細胞に用いるのに適当な抗生物質対抗性遺伝子は、エリスロマイシン耐性遺伝子（Ｅｒｍ等）及びクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｐＰ等）を含む。他の適当な抗生物質対抗性遺伝子はｔｅｔＭであり、例えば、大便連鎖球菌Ｔｎ９１６共役トランスポソンからのｔｅｔＭである（Ｒｏｂｅｒｔ等（２００１）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４７：１２４３−１２５１）。他の適当な抗生物質対抗性遺伝子で、クロストリジウム綱の細菌に広く用いられるものは、スペクチノマイシンアデニル転移酵素ａａｄである（Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ等（２００４）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０，６０７６−６０８５）。

本発明の方法及びＤＮＡ分子は、機能が知られていない遺伝子の研究に用いることもできる。例えば、本発明のＤＮＡ分子は、タグとしての固有のオリゴヌクレオチド配列であって、クロストリジウム綱の細胞のＤＮＡに導かれるものを含むように構成されてもよい。好都合なことに、本発明の、各々が異なるタグ配列を含む複数のＤＮＡ分子が生成されている。ＤＮＡが細菌性染色体に挿入されるとき、タグはゲノムのＤＮＡに存在し、例えば、タグの部分を補完する配列を有する領域のある標識オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズして増幅することにより検出されてもよい。増幅及びハイブリダイズに適当なタグ、プローブ及び方法は、Ｈｅｎｓｅｌ等（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：４００−４０３に記載されている。複数の突然変異体は、各々が異なる遺伝子に挿入されるＤＮＡを有し、各々が固有のタグにより識別されうる本発明の方法により生成されうる。典型的には、各々の異なる再標的化核酸は、それをクロストリジウム綱の細胞のＤＮＡにおける異なる遺伝子に向ける標的化領域を含んでいる。複数の突然変異体は一定時間内に環境に導入されうる。その後、突然変異体は環境から回収される。突然変異体の回収プールで検知される個々のタグの機能は、特定の突然変異体が他の突然変異体と同様に成長又は存続することができるか否かを示す。これにより、環境において成長又は存続することが要求されている遺伝子を識別することができる。Ｈｅｎｓｅｌ等（１９９５；上記と同様）は、サルモネラの毒性遺伝子を識別するのに同様の方法を用いている。

上記方法の組み換えでは、同じタグを有するが、異なる任意抽出グループIIイントロン標的化部分及び対応するエクソン配列を有する本発明のＤＮＡ分子を生成し、プールし、使用して細菌突然変異体を作ることができる。任意抽出標的化部分を有するグループIIイントロンは、ＷＯ０１／２９０５９に記載されている。ＤＮＡ分子の多くは細菌ゲノムのどこにでも挿入できるわけではない。しかしながら、いくつかは、標的部分の配列によって制御される細菌ゲノムの未知の部分に挿入されることができる。本発明のＤＮＡ分子の十分に大きいプールは、ＤＮＡが染色体に挿入された一以上のコロニーを取得する方法に使用することができる。単一のクローンを選択することができる。この処理を、異なる固有のタグを有する本発明のＤＮＡ分子のプールに繰り返して、固有のタグを有する他の単一の突然変異体細菌クローンを取得してもよい。これにより、各々が固有のタグを有する複数の細菌突然変異体が生成される。複数の突然変異体は、上述のように環境にさらされて、その環境における成長又は存続のために損なわれる特定の突然変異体を識別することができる。このようなスクリーンから識別される突然変異体は、その後、どの遺伝子にＤＮＡ挿入されたかを決定するように特徴づけられうる。

選択可能なマーカーの発現を妨害するグループＩイントロンを含む、変性された選択可能なマーカーをコードする遺伝の更なる詳細は、以下に示される。

選択可能なマーカー遺伝子又はそのコード領域は、染色体に組み込まれた後、例えば選択可能なマーカー遺伝子またはそのコード領域の切除を可能とするＤＮＡの領域の傍らに配置されるＤＮＡの領域と関連付けられてよい。したがって、選択可能なマーカーを発現する突然変異体クロストリジウム細胞のクローンは、選択され、操作されて選択可能なマーカー遺伝子の除去を可能とする。リコンビナーゼは、ＤＮＡの領域を切除するのに用いられうる。典型的には、リコンビナーゼは、切除される領域の傍らの特定のＤＮＡ配列を認識する。Ｃｒｅリコンビナーゼ又はＦＬＰリコンビナーゼが好ましいリコンビナーゼである。若しくは、非常に珍しい切断の制限エンザイムを用いて、選択可能なマーカー又はそのコード領域の傍らにある導入された制限部位のＦＮＡを切断することができる。好ましい制限エンザイムはＩ−ＳｃｅＩである。

選択可能なマーカー遺伝子が切除される突然変異体細菌性細胞は、グループIIイントロン挿入を保持する。したがって、それは、選択可能なマーカー遺伝子を伴う又は伴わない挿入により同じ表現型を有する。このような突然変異体細菌性細胞は、ＲＡＭに存在する選択可能なマーカー遺伝子が欠如していることから、本発明の方法による更なる突然変異の対象となることができる。

本発明のＤＮＡ分子における変性されたグループIIイントロンは、ＩＥＲＴを発現せず、好都合なことに、ＤＡＮ分子は他の位置にＩＥＲＴを発現することができる遺伝子を含む。

グループIIイントロンが挿入されるクロストリジウム細胞が、グループIIイントロンと異なる遺伝コード及び関連するグループIIイントロンコード逆転写酵素を使用する場所では、グループIIイントロンコード逆転写酵素の配列は、ホスト細胞の遺伝コードに対応するコドンを含むように変性されることが望ましい。

本発明の特に好ましい実施形態は、変性されたグループIIイントロンが標的部分を有することである。典型的には、標的部分は、変性されたグループIIイントロンのＲＮＡ転写物の、クロストリジウム綱細胞のＤＮＡ分子内の部位への挿入を可能とする。典型的には、この部位は選択された部位であり、変性されたグループIIイントロンの標的部分は選択された部位を標的化するのに選択される。好ましい実施形態では、選択された部位はクロストリジウム細胞の染色体ＤＮＡにある。典型的には、選択された部位は特定の遺伝子又は特定の遺伝子の発現に作用するＤＮＡの部分の範囲内にある。変性されたグループIIイントロンのこのような部位への挿入は、典型的には遺伝子の発現を阻害し、表現型の変更を促す。

遺伝子は、メタボリックエンジニアリングを目的とする突然変異体のために選択されうる。例えば、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリチカム等の有機的組織体又は同様の代謝作用を有するクロストリジウム綱の他のメンバーにおいて、乳酸塩及び酢酸塩の形成をそれぞれ阻害するための乳酸脱水素酵素及びホスホトランスアセチラーゼの削除は、エタノールの上昇レベルに用いられる（Ｄｅｓａｉ等（２００４）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６５：６００−５）。クロストリジウム・アセトブチリカム及びクロストリジウム・バイジェリンキー等のソルベントジェニッククロストリジウムでは、特定の削除が、アセトン及びブタノールを最大にする溶媒及び酸生成に関与するエンザイムをコードする遺伝子になされる（Ｊｏｎｅｓ及びＷｏｏｄｓ（１９８６）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．５０：４８４−５２４参照）。したがって、酢酸塩（ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼ）、ブチラート（ホスホトランスブチリラーゼ及び／又はブチラートキナーゼ）、ブタノール（ブタノールデヒドロゲナーゼＡ及び／又はブタノールデヒドロゲナーゼＢ）及び／又はアセトン（アセトアセテートデカルボキシラーゼ及び／又はアセトアセチル‐ＣｏＡ トランスフェラーゼ）の生成に関与するエンザイムの除外により、アセトン及びブタノールのみを生成する株を生成することができる。更に、このような株の発酵能は、染色体への遺伝子の追加により拡張することができ、これにより新たな基質が劣化し（糖類、リグノセルロース、ヘミセルロース等）及び／又は新たな末端生成物が作られる（イソプロパノール，１，３‐プロパンジオール等）。

遺伝子は、それらのコード生成物の毒性における役割、ワクチンの発展の必要条件及び他の対抗手段を決定するために、突然変異体に選択されることができる。クロストリジウム・ディフィシレでは、例えば、毒素Ａ及び毒素Ｂ（ＣｄｔＡ及びＣｄｔＢ）の関連する役割は、以前から同質突然変異体を生成することができていないため、確立されていないままである（Ｂｏｎｇａｅｒｔｓ及びＬｙｅｒｌｙ（１９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ１７：１−１２）。特定の株（Ｐｅｒｅｌｌｅ等（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．６５：１４０２−１４０７）は、アクチン特有のＡＤＰ−リボシルｔランスファーゼＣＤＴ（ＣｄｔＡ及びＣｄｔＢ）をも生成する。他の要素は、特に初期の定着処理において、間違いなく毒性を助長する。多くの遺伝子生成物の関与が提案されており（Ｔａｓｔｅｙｒｅ等（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６９：７９３７−７９４０；Ｃａｌａｂｉ等（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０：５７７０−５７７８；Ｗａｌｉｇｏｒａ等（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６９：２１４４−２１５３）、接着に含まれるもの、Ｓ層タンパク質（ＳｐｌＡ）及び運動性（ＦｌｉＣ及びＦｌｉＤ）を含んでいる。突然変異体の生成を通じてこれらの要素が病気に含まれることの決定的証拠は、現在のところ不可能である。

クロストリジウム綱の多くの細菌のゲノムのＤＮＡ配列が知られている。例えば、クロストリジウム・アセトブチリカムのゲノムのＤＡＮ配列（ＡＴＣＣ８２４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ ＡＥ００１４３７））、クロストリジウム・ディフィシレ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ ＡＭ１８０３５５）、クロストリジウム・テタニＥ８８（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ ＡＥ０１５９２７）及びクロストリジウム・パーフリンジェンス株１３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ ＢＡ００００１６）及びボツリヌス菌が知られている。クロストリジウム・スポロジェンヌの配列は、部分的に知られており、ボツリヌス菌の配列に大変似ている。この情報から、挿入部位は、例えばオープンリーディングフレームの範囲内ですばやく識別される。本発明のＤＮＡ分子は、これらのうち一種の細菌種のゲノム中の遺伝子を標的とする標的化部分を含む変性されたグループIIイントロンであり、当該標的化部分は、変性されたグループIIイントロンのＲＮＡ転写物（又はそのＤＮＡコピー）に、当該標的化された遺伝子に標的とさせることが好ましい。

上述のように、グループIIイントロンは、イントロンを標的ＤＮＡの特定の配列に標的化する領域を本来的に含む。ＤＮＡ基質の認識部位がＲＮＰ複合体の切除されたグループIIイントロンＲＮＡとの塩基対合等を通じて認識されるので、ＤＮＡ基質内における核酸挿入部位を制御することが可能である。これは、ＥＢＳ１配列、ＥＢＳ２配列、δ配列又はこれらの組合せを変性することにより行われる。このような変性されたグループIIイントロンは、ゲノムの新たな認識部位において、ＤＮＡ基質の開裂及び核酸分子の挿入が可能なＲＮＰ複合体を生成する。例えば、図１Ａ及び図１Ｂに図示された乳酸連鎖球菌のＬ１．ＬｔｒＢグループIIイントロンを参照することにより、ＥＢＳ１，ＥＢＳ２及びδは、変性されたグループIIイントロンのＲＮＡ転写体の標的部位への塩基対合を可能とするように変性される。イントロンの特定のＤＮＡ配列への最標的を可能とする、Ｌ１．ＬｔｒＢグループIIイントロンによるＤＮＡ標的部位の認識のルールが、参照によりここに組み込まれるＭｏｈｒ等（２０００）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４，５５９−５７３に記載されている。標的部位のコンピュータによる設計が、参照によりここに組み込まれるＰｅｒｕｔｋａ等（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６，４２１−４２９に記載されている。

参照によりここに組み込まれるＯｈｉｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｃｈ ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎのＷＯ０１／２９０５９は、所望のＤＮＡ標的部位が、プロモーターを持たないｔｅｔ^Ｒ遺伝子の受容体ベクター上流にコピーされる、選択に基づくアプローチを記載している。この部位に挿入するイントロンは、任意抽出の標的部分（ＥＢＳ及びδ）及びＩＢＳエクソン配列を有する組合せドナーライブラリから選択される。変性されたＬ１．ＬｔｒＢイントロンは、異種プロモーターを含み、受容体ベクターの標的部位に挿入される際に、ｔｅｔ^Ｒ遺伝子が転写され、ベクターを含む細菌性細胞が選択されうる。変性されたイントロンの配列は、ＰＣＲにより決定されうる。したがって、クロストリジウム綱内の標的ＤＮＡ部位への挿入を可能とする変性されたグループIIイントロンＤＮＡが単離されうる。

Ｌ１．ＬｔｒＢグループIIイントロンの場合、δ領域の標的ＤＮＡのａδ´領域との相互作用は、グループIIイントロンの効果的なレトロホーミングにとって決定的に重要なわけではない。しかしながら、イントロンＲＮＡ中のＥＢＳ２及びＥＢＳ１、並びに標的ＤＮＡ中のＩＢＳ２及びＩＢＳ１との相互作用がより重要である。

グループIIイントロンがＲＮＡ転写体から切り離されるとき、隣接するエクソンＲＮＡの部分と一時的に塩基対合すると考えられている。特に、ＥＢＳ２及びＥＢＳ１領域は、それぞれ５´エクソンのＩＢＳ２及びＩＢＳ１と塩基対合する。したがって、５´エクソンのＩＢＳ２及びＩＢＳ１は、イントロンＲＡＮの変性されたＥＢＳ２及びＥＢＳ１領域との塩基対合を推進するよう変性されることが望ましい。これはグループIIイントロンのそのＲＮＡ転写体からの効果的な切除を促進する。

ＥＢＳ２及びＥＢＳ１δ部位並びにＩＢＳ２ＩＢＳ１部位の組み換えは、好都合なことに、既知である適当な部位特異的突然変異方法、例えば、オリゴヌクレオチド特異的突然変異又はＰＣＲをベースとする方法を用いて実行される。

典型的には、本発明のＤＮＡ分子は、選択可能なマーカーと異なる抗生物質抵抗性マーカーを発現することができる。例えば、選択可能なマーカー遺伝子が第１の抗生物質抵抗性遺伝子である場合は、ＤＮＡは第２の抗生物質抵抗性遺伝子を含む。これは特に、双方の抗生物質抵抗性遺伝子が、クロストリジウム細胞において抗生物質抵抗性を生じさせるものである場合に好ましい。例えば、ＤＮＡ分子の選択可能なマーカー遺伝子は、エリスロマイシン抵抗性遺伝子であってもよく、ＤＮＡ分子はクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を更に含んでもよい（又はその逆であってもよい）。ＤＮＡ分子がクロストリジウム種に使用される場合、抗生物質抵抗性遺伝子がエリスロマイシン抵抗性遺伝子（すなわちｅｒｍＢ）又はクロラムフェニコール抵抗性遺伝子（すなわちｃａｔＰ）のいずれから選択されてもよいことは特に好ましい。

本発明のＤＮＡ分子にとって、それ自体がＩＥＲＴを発現することができる遺伝子を含むことは都合がよいが、これは別個のＤＮＡ分子に提供されてもよい。したがって、本発明の更なる側面は、本発明の第１の側面のＤＮＡ分子を備えるパーツのキットと、ＩＥＲＴを発現することができる別個のＤＮＡ分子とを備える。典型的には、ＤＮＡ分子はプラスミドであり、好ましくは互換プラスミドである。キットが、ラックリプレッサータンパク質を発現することができるＤＮＡ分子（典型的にはプラスミド）を更に含みうる。これは、本発明のＤＮＡ分子が、グループIIイントロンに動作可能につながっているＩＰＴＧ誘導プロモーターを有するが、本発明のＤＮＡ分子がｌａｃＩ遺伝子を含まない場合に有用である。

本発明の第３の側面は、核酸分子をクロストリジウム綱の細菌性細胞におけるＤＮＡ分子の部位に導入する方法であって、
（ｉ）クロストリジウム綱の細菌性細胞に、本発明のＤＮＡ分子及びグループIIイントロンコード逆転写酵素を発現することができるＤＮＡ分子を提供する工程と、
（ｉｉ）細菌性細胞を、グループＩイントロンの変性されたグループIIイントロンのＲＮＡ転写体からの除去及び選択可能なマーカー遺伝子を含むＲＮＡ転写体（またはそのＤＮＡコピー）の挿入が可能な条件下で培養する工程と、
を含む方法である。

好ましくは、クロストリジウム綱の細菌性細胞は、選択可能なマーカーが発言することができる条件下で培養される。典型的には、細胞（すなわち突然変異細胞）内のＤＮＡ部位において核酸が導入されるクロストリジウム目の細菌性細胞が、選択可能なマーカーにより与えられた変化した表現型に基づいて選択される。

好都合なことに、選択可能なマーカーは抗生物質抵抗性マーカーであり、突然変異したクロストリジウム細胞が、関連のある抗生物質の存在下で成長する能力に基づいて選択される。

好都合なことに、選択された細胞はコピーされ、細胞の単一のクローンが取得される。

本発明の更なる側面は、核酸分子を、クロストリジウム綱の細菌性細胞におけるＤＮＡ分子の選択された部位に標的化させる方法であって、クロストリジウム綱の細菌性細胞に、標的化部分を有する変性されたグループIIイントロンを含む本発明のＤＮＡ分子、及びグループIIイントロンコード逆転写酵素を発現することができるＤＮＡ分子を提供する工程、及び、細菌性細胞を、グループＩイントロンを変性されたグループIIイントロンのＲＮＡ転写体からの除去及び選択可能なマーカー遺伝子を有するＲＮＡ転写体（又はそのＤＮＡコピー）の選択された部位への挿入を可能とする条件下で培養する工程と、を有する。

これにより、クロストリジウム種等のクロストリジウム綱の細菌性細胞のＤＮＡ（ゲノム等）において部位特異的突然変異体を作成できることは好ましい。

本発明の方法により得られたクロストリジウム綱の突然変異細菌性細胞もまた、本発明の一部である。

本発明のすべての側面に関して、クロストリジウム綱の細菌性細胞はクロストリジウム種であることが望ましい。また、クロストリジウム細胞が、クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ディフィシレ、ボツリヌス菌、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・スパロゼネス、クロストリジウム・バイジェリンキー、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・セルリチカム又はクロストリジウム・セプティカムであれば特に好ましい。クロストリジウム細胞は、工業的エタノールの生成に重要な種であるサーモアナエロバクテリア サッカロリチカムに代替されてもよい。用語「クロストリジウム」に、我々はプロバイオティクス細菌であるＲｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｉｓ等のＲｏｓｅｂｕｒｉａを含める。したがって、好ましくは、本発明のＤＮＡ分子における選択可能なマーカー遺伝子は、これらの種の選択に用いることができる遺伝子である（すなわち、エリスロマイシン抵抗性遺伝子又はクロラムフェニコール抵抗性遺伝子又はテトラサイクリン抵抗性遺伝子又はスペクチノマイシン抵抗性遺伝子である）。また、好ましくは、本発明のＤＮＡ分子は複製の起点及びこれらの細菌種の複製を可能とするどんな複製遺伝子をも含む。

本発明の特定の特徴は、変性された選択可能なマーカー遺伝子は選択可能なマーカーの発現を妨害するグループＩイントロンを含むものであることである。選択可能なマーカーは、クロストリジウム綱の細菌性細胞、特にクロストリジウム細胞において発現され、又は選択に使用されうるものである。

選択可能なマーカーは、クロストリジウム種の選択に使用することができる抗生物質抵抗性遺伝子であることが特に望ましい。

本発明の更なる側面は、グループＩのイントロンを含む、変性されたエリスロマイシン抵抗性遺伝子を有するＤＮＡ分子を提供する。

本発明の更なる側面は、グループＩのイントロンを含む、変性されたクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を有するＤＮＡ分子を提供する。

本発明の更なる側面は、グループＩのイントロンを含む、変性されたテトラサイクリン抵抗性遺伝子を有するＤＮＡ分子を提供する。

本発明の更なる側面は、グループＩのイントロンを含む、変性されたスペクチノマイシン抵抗性遺伝子を有するＤＮＡ分子を提供する。

また、本発明は、宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ細胞又はクロストリジウム綱の細胞に存在するこれらのＤＮＡ分子を含む。

好ましくは、グループＩイントロンは、抗生物質抵抗性遺伝子と反対の方向に存在する。

グループＩイントロンは、抗生物質抵抗性遺伝子のいずれに存在してもよく、例えば、コード領域に存在して翻訳を妨害してもよく、コード領域の上流に存在して翻訳または転写を妨害してもよい。

グループＩイントロンは、抗生物質抵抗性遺伝子中に、イントロンが転写されるときにＲＮＡ転写体から自らを切除（スプライス）することができる形状で存在する。

より大きなＲＮＡから方向依存方法により自らをスプライスすることができるいかなる自己触媒的なＲＮＡも、本発明のグループＩイントロンを代替しうる。グループＩイントロン及びＩＳ要素の融合と考えられている「ＩＳｔｒｏｎ」が適宜使用されうる（Ｈａｓｅｌｍａｙｅｒ等（２００４）Ａｎａｅｒｏｂｅ １０：８５−９２；Ｂｒａｕｎ等（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１４４７−１４５９）。

誤解を避けるために、本発明のすべての側面の目的のために、より大きなＲＮＡから方向依存方法により自らをスプライスすることができるいかなる自己触媒的なＲＮＡは、補完的要素を必要とするか否かに関わらず、グループＩイントロンと考えられる。好ましくは、グループＩイントロンは補完的要素を必要としない。

グループＩイントロンは、イントロンコード逆転写酵素等のイントロンコードタンパク質をコードしないことが望ましい。この特徴は、切除されたグループＩイントロンＲＮＡが、細菌ゲノム内の他の部位に再挿入されることを防止する。

典型的には、グループＩイントロン（ファージＴ４のｔｄイントロン等）のスプライシングは、挿入ポイントの傍らにあるエクソン配列に依存するということが知られている。したがって、本発明の変性された選択可能なマーカー遺伝子（及び、特に、本発明の本側面のエリスロマイシン抵抗性、クロラムフェニコール抵抗性、テトラサイクリン抵抗性及びスペクチノマイシン抵抗性をコードする変性された抗生物質抵抗性遺伝子）は、そこに挿入されることによりＲＮＡ転写体からのスプライスを可能とする適切なエクソン配列の横に配置されたグループＩイントロンを含み、また、結果として得られるスプライスされた転写体（又はそのＤＮＡコピー）が機能的選択可能マーカー（機能的エリスロマイシン抵抗性又は機能的クロラムフェニコール抵抗性）をコードする。適切なフランキング配列は、グループＩイントロンとして知られている公知である。例えば、ファージＴ４ｔｄグループＩイントロンに対しては、イントロンは典型的にＧ残基に先行され（すなわち、イントロンの５´に存在し）、また、典型的に配列５´‐ＡＣＣＣＡＡＧＡＧＡ‐３´（配列番号３）に続く（すなわち、イントロンの３´に存在する）。若しくは、イントロンは配列５´‐ＡＣＣＣＡＡＧＡＡ‐３´（配列番号４）に続いてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、選択可能なマーカー（エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン又はスペクチノマイシン抵抗性遺伝子）のコード領域は、イントロンの傍らに配置される適当な配列を有する。これは、ｔｄイントロン及び結合された５´及び３´フランキング配列５´‐ＧＡＣＣＣＡＡＧＡＧＡ‐３´（配列番号５）との関係では、（実施例においてより詳細に説明するように、）リーディングフレームに応じて、いくつかのアミノ酸配列のためにコード化することができる。

フレーム１では、それはアミノ酸配列ＤＰＲＤ／Ｅ（配列番号６）をコードし；フレーム２では、それはアミノ酸配列Ｒ／ＧＰＫＲ（配列番号７）をコードし；フレーム３では、それはアミノ酸配列“Ｘ”ＴＱＥ“Ｚ”（配列番号８）をコードし、ＸはＧ，Ｅ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｓ，Ｗ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｍ，Ｔ又はＫのいずれであってもよく、“Ｚ”はＫ，Ｓ，Ｒ，Ｉ，Ｍ，Ｔ又はＮのいずれであってもよい。

したがって、好ましい実施形態では、選択可能なマーカー遺伝子のコード領域は、上記のアミノ酸配列を含むペプチドの部分をコードする。

更に好ましい実施形態では、イントロンのエクソン配列３´は、選択可能なマーカーのコード配列の５´末端において適切なリーディングフレームに存在し、これによりイントロンの不存在下において、コード配列は、選択可能なマーカーポリペプチドのＮ末端においてリンカーペプチドを含む機能的選択可能マーカーをコードする。

リンカーペプチドは、典型的には４〜２０、好ましくは４〜１５、典型的には、４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４又は１５アミノ酸残基によるペプチドであり、その一部がイントロンの傍らに配置されるエクソンコーディング配列によりコード可能である。リンカーペプチドの存在は、抗生物質抵抗活性を実質的に妨害しない。すなわち、グループＩイントロンが切除されるときに生成される核酸分子の発現から生成されるポリペプチドは、抗生物質抵抗活性を有する。

あるいはグループＩイントロンフランキング配列は、グループＩイントロンの挿入が選択可能なマーカー遺伝子の転写を妨害するように配置されうる。例えば、プロモーターの−３５要素及び−１０要素の間に配置されてもよい。

更に、あるいはグループＩイントロンフランキング配列は、グループＩイントロンの挿入が選択可能なマーカー遺伝子の翻訳を妨害するように配置されうる。例えば、リボソーム結合部位及び開始コドンの間に配置されてもよい。

本発明のＤＮＡ分子は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」，２００１年，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されているような標準的な分子生物学的技術を用いて作られてもよいことが好ましい。

Ｌｔ．ＬｔｒＢグループIIイントロンの第２構造モデルである。 Ｌｔ．ＬｔｒＢグループIIイントロンによるＤＮＡ標的部位の認識機構である。 再標的化核酸由来の突然変異体の正の選択である。 クロストリジウム・スポロジェンヌ及びクロストリジウム・アセトブチリカムにおけるｐＭＴＬ５４０１Ｆｃａｔの誘導性発現である。 ｔｄグループＩイントロンの良好なスプライシングのための選択可能なマーカー遺伝子に適した配列である。 リンカーを用いたｅｒｍＢへのＲＡＭ機能性追加である。 は、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１の特徴及び配列。ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１配列である（配列番号１３）。 ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１がＥ．ｃｏｌｉでスプライスされる直接的証拠である。 ｐＢＲＲ３におけるマルチクローニング部位の構造である。 ｔｈｌ及びｔｈｌ２プロモーターの配列である。 ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２の特徴及び配列である。 ｐＭＴＬ００７の特徴及び配列である。 ｐＭＴＬ００７の特徴及び配列である。 ｐＭＴＬ００７の特徴及び配列である。 ｐＭＴＬ００７の特徴及び配列である。 ｐＭＴＬ００７の特徴及び配列である。 ｐＭＴＬ００７の特徴及び配列である。 ｐＭＴＬ５４０１Ｆの構造である。 ｐＭＴＬ５４０１Ｆの構造である。 ｐＭＴＬ５４０２Ｆ及びｐＭＴＬ５４０２Ｆ‐ｌａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１の構造である。 ｐＭＴＬ５４０２Ｆ及びｐＭＴＬ５４０２Ｆ‐ｌａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１の構造である。 ｐＭＴＬ００７の構造である。 ｐＭＴＬ００７の構造である。 突然変異体のスクリーニング及び特性解析の例である。 胞子を形成しないｓｐｏ０Ａ突然変異体である。

本発明は、下記の限定されない実施例及び図面に言及して説明される。

図１Ａ：Ｌｔ．ＬｔｒＢグループIIイントロンの第２構造モデル。予測第２構造モデルは、６つのドメイン（Ｉ−ＶＩ）から成る。イントロンと、スプライスされていない先駆体ＲＮＡにおけるフランキングエクソンとの間のＥＢＳ２／ＩＢＳ２，ＥＢＳ１／ＩＢＳ１及びδ‐δ’相互作用は、破線で示されている。変性されていないＬｔ．ＬｔｒＢイントロンでは、ＬｔｒＡタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが、ドメインＩＶとして示される非構造ループに存在している。Ｂ：Ｌｔ．ＬｔｒＢグループIIイントロンによるＤＮＡ標的部位の認識機構。ＬｔｒＡタンパク質は、Ｌｔ．ＬｔｒＢグループIIイントロンＲＮＡに結合し、リボヌクレオタンパク質複合体を形成する。イントロンはｐｒｅ‐ｍＲＮＡからスプライスされ、リボヌクレオタンパク質を粒子として遊離させる。リボヌクレオタンパク質粒子は、細胞内において、標的ＤＮＡ配列の場所を示す。変性されていないリボヌクレオタンパク質の標的ＤＮＡ配列は、ｌｔｒＢ遺伝子のイントロンを含まないコピーであり、その配列が示される（配列番号９）。イントロンＲＮＡは、トップストランド（ＩＳ）の挿入部位に挿入される。その後、ボトムストランドは、開裂部位（ＣＳ）において開裂され、ＬｔｒＡは切断ＤＮＡから準備してイントロンＲＮＡを逆転写する。宿主修復活性が組み込み処理を完了させる。標的の認識は、ＬｔｒＡ及び標的配列のヌクレオチドの間、並びにイントロンＲＮＡのＥＢＳ２及びＥＢＳ１、並びに標的遺伝子における相補的配列であるＩＢＳ２及びＩＢＳ１との相互作用によって行われる。ＬｔｒＡタンパク質によって認識されるヌクレオチドで最も重要なものは、網掛けにより示されている。

図２．再標的化核酸由来の突然変異体の正の選択。Ａ．生成されたｍＲＮＡはｔｄグループＩイントロンの挿入を保持し、これにより選択可能なマーカー遺伝子の発現が妨害されるため、選択可能なマーカー遺伝子の、プラスミドに位置する再標的化核酸からの転写は、耐性をもたらさない。ｔｄ要素は、誤った方向で転写されているため、ｍＲＮＡからスプライスすることができない。Ｂ．Ｌ１．ＬｔｒＡグループIIイントロンＲＮＡ生成は、ＩＰＴＧの添加により誘発され、クロストリジウムプロモーターｆａｃからの転写を引き起こす。
選択可能なマーカー遺伝子内のｔｄグループＩイントロンは正しい方向で転写され、ｔｄＲＮＡは生成されたＲＮＡからスプライスされる。Ｃ．Ｌ１．ＬｔｒＡ ＲＮＡ及び選択可能なマーカー遺伝子は、染色体の標的部位に挿入される。選択可能なマーカー遺伝子はｔｄグループＩイントロンを含まないため、選択可能なマーカー遺伝子の発現は妨害されない。したがって、細胞は選択可能なマーカーに関連する表現型を表し、これによって選択されることができる。

図３．クロストリジウム・スポロジェンヌ及びクロストリジウム・アセトブチリカムにおけるｐＭＴＬ５４０１Ｆｃａｔの誘導性発現。（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ／クロストリジウムシャトルプラスミドｐＭＴＬ５４０１Ｆｃａｔ（ｂ）ｐＭＴＬ５４０１Ｆｃａｔを含む、クロストリジウム・スポロジェンヌのクローン又は（ｃ）ｐＭＴＬ５４０１Ｆｃａｔを含むクロストリジウム・アセトブチリカムのクローンが初期の指数成長期に培養され、細胞溶解物におけるＣＡＴ活性が、１ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導の後で（■）又は誘導なしで（▲）観測された。

図４．ｔｄグループＩイントロンの良好なスプライシングのための選択可能なマーカー遺伝子に適した配列。３つの翻訳リーディングフレームのいずれかにおいて要求されるアミノ酸配列（配列番号６〜８）は、上記のヌクレオチド配列（配列番号１３２〜１３４）に示されている。位置‘Ｘ’におけるアミノ酸は、Ｇ，Ｅ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｓ，Ｗ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｍ，Ｔ又はＫのいずれであってもよい。位置‘Ｚ’では、それらはＫ，Ｓ，Ｒ，Ｉ，Ｍ，Ｔ又はＮでありうる。

図５．リンカーを用いてｅｒｍＢに追加されるＲＡＭ機能。
（ａ）ｔｄイントロン及びそのエクソスを含むリンカーは、ｅｒｍＢＯＲＦ及びそのプロモーター（配列番号１０）の間に挿入されて、エリスロマイシン耐性を妨害する。ｔｄイントロンの逆ストランドからのスプライシングは、Ｎ末端（配列番号１２）において１２の追加的なアミノ酸と共に機能的タンパク質をコードする、変質されたｅｒｍＢ遺伝子（配列番号１１）を産出する。ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１のｅｒｍＢプロモーターは、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２のｔｈｌプロモーターに置き換えられる。
（ｂ）種々のテンプレート及びプライマーＥｒｒｍＢ‐Ｐｒｏ‐Ｆ３及びＥｒｍＢ‐Ｒ１であって、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１のｔｄイントロンの傍らに位置するプライマーを用いたＰＣＲ。
レーン１：ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ ＤＮＡ；レーン２：ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１のＰＣＲ；レーン３：ＩＰＴＧ誘導の後にｐＭＴＬ２０１ａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１を含む細胞から単離されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ；レーン４：ｃＤＮＡ合成前の、同じＲＮＡ調製物。
（ｃ）種々のテンプレート及びプライマーＴｈｉｏ‐Ｆ１及びＥｒｍＢ−Ｒ１であって、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２のｔｄイントロンの傍らに位置するプライマーを用いたＰＣＲ。レーン１：クロストリジウム・スポロジェンヌｓｐｏ０Ａ突然変異体ゲノムのＤＮＡ；レーン２：ｐＭＴＬ００７：：Ｃｓｐ‐ｓｐｏ０Ａ‐２４９ｓプラスミドＤＮＡ；レーン３：クロストリジウム・スポロジェンヌ野生型ゲノムのＤＮＡ；レーン４：水。

図６．ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１の特徴及び配列。ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１配列（配列番号１３）。

図７．ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１がＥ．ｃｏｌｉでスプライスされる直接的証拠。ｔｄグループＩイントロンが、グループIIイントロンＲＮＡ発現の誘導に続いて、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１からスプライスされることを試験するために、ｐＭＴＬ２０１ａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１を発現する細胞からＲＮＡが調製された。ｔｄの挿入部位の傍らに位置するプライマーを用いて、ＲＴ‐ＰＣＲが実行された。コントロールとしての反応において、同様のプライマーが、ＰＣＲによりＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１及びスプライスされた等価物ＳＥ ＤＮＡを増幅するのに用いられた。レーン１：ＤＮＡマーカー；レーン２，ＥｒｍＢｔｄ ＲＡＭ１ｎｏＰＣＲ；レーン３，ＥｒｍＢｔｄ ＲＡＭ１ＳＥのＰＣＲ；レーン４，ｐＭＴＬ２０１ａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１を含む細胞からのすべてのＲＮＡにおけるＲＴ−ＰＣＲ，及び；レーン５ＲＴ‐ＰＣＲのネガティブコントロール。

図８．ｐＢＲＲ３におけるマルチクローニング部位の構造。ｐＢＲＲ３‐ＬｔｒＢのクローニング部位の配列（配列番号１４）及びｐＣＲ２．１‐ＴＯＰＯプラスミドのクローニングの部位の配列（配列番号１５）。描かれたマルチクローニング部位フラグメント（配列番号１６）は、開裂されたｐＢＲＲ３‐ＬｔｒＢに挿入されて、ｐＣＲ２．１‐ＴＯＰＯにみられる制限部位を含む、描かれたｐＢＲＲ３‐ＭＣＳ１（配列番号１７）が作られた。

図９．ｔｈｌ及びｔｈｌ２プロモーターの配列。ｔｈｌ（配列番号１８）及びｔｈｌ２（配列番号１９）の配列が、コンセンサスプロモーター（配列番号２０）との比較において示される。「ｘ」は、コンセンサス配列と比較したヌクレオチド置換を示している。−１０要素及び−３５要素の間隔が各配列について示されている。

図１０．ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２の特徴及び配列。ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２配列（配列番号２１）。

図１１．ｐＭＴＬ００７の特徴及び配列。最終的なクロストリジウム再標的化システムのプラスミドマップ（図示例はｌａｃＺを再標的とするように改良された派生物）及び配列（配列番号２２）。

図１２．ｐＭＴＬ５４０１Ｆの構造。各工程で用いられる制限部位が示される。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡの平滑末端化が実行された。

図１３．ｐＭＴＬ５４０２Ｆ及びｐＭＴＬ５４０２Ｆ‐ｌａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１の構造。各工程で用いられる制限部位が示される。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡの端鈍化が実行された。

図１４．ｐＭＴＬ００７の構造。各工程で用いられる制限部位が示される。

図１５．突然変異体のスクリーニング及び特性解析の例。（ａ）プラスミドｐＭＴＬ００７．（ｂ，ｃ）ＰＣＲが、イントロン固有プライマーＥＢＳユニバーサル及び遺伝子固有プライマーＣｄ‐ｓｐｏ０Ａ‐Ｒ２を用いて、クロストリジウム・ディフィシレｓｐｏ０Ａ遺伝子におけるイントロン挿入の初期のスクリーンに用いられた（小矢印）。レーン１：水；レーン２：クロストリジウム・ディフィシレ母株ゲノムのＤＮＡ；レーン３：ｐＭＴＬ００７：：Ｃｄｉ‐ｓｐｏ０Ａ‐１７８ａプラスミドＤＮＡ；レーン４〜６：ｐＭＴＬ００７：：Ｃｄｉ‐ｓｐｏ０Ａ‐１７８ａを用いて生成された３つの任意抽出のＥｍ^Ｒクロストリジウム・ディフィシレクローンからのＤＮＡ。（ｄ）ｅｒｍＢへのプローブを用いたクロストリジウム・ディフィシレのｓｐｏ０Ａ及びｐｙｒＦ突然変異体のサザンブロット。このプローブの先在（機能的でない）染色体ｅｒｍＢ ＯＲＦへのハイブリダイゼーションは、第２バンドを引き起こし、母体レーンで見ることができる。ｓｐｏ０Ａ突然変異体のＥｃｏＲＶ消化物において、双方のバンドは同じサイズである。（ｅ）クロストリジウム・アセトブチリカムの等価サザンブロット及び（ｆ）クロストリジウム・スポロジェンヌ。

図１６．ｓｐｏ０Ａ突然変異体は胞子を形成しない。固体培地においてそれぞれ１４日、４日又は３日培養した、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・アセトブチリカム及びクロストリジウム・スポロジェンヌのｓｐｏ０Ａ突然変異体及び母株の位相差顕微鏡写真。異なる３つの実験の平均胞子形成頻度がパーセンテージで示されている。

実施例１：ＩＰＴＧ‐誘導‘ｆａｃ’プロモーターの開発
人工プロモーター‘ｆａｃ’を担持するＥ．ｃｏｌｉ／クロストリジウムシャトルベクター（ｐＭＴＬ５４０Ｆ）の使用は既に説明されている。それは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺオペロンのオペレータを、クロストリジウム・パスツリアヌム・フェレドキシン遺伝子（Ｆｏｘ等（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１７３〜１７８）のプロモーターのすぐ下流に挿入することにより生成された。このプロモーター要素はクロストリジウムの異種遺伝子の高レベル発現に直接用いられたが、安定化した転写は実証されていない。そこで、新たなＥ．ｃｏｌｉ／クロストリジウムシャトルベクターｐＭＴＬ５４０１Ｆが、ｆａｃプロモーター、クロストリジウム・アセトブチリカム・ホスホトランスブチリラーゼ（ｐｔｂ）遺伝子のプロモーターの転写制御下にあるｌａｃＩリプレッサー遺伝子、及びクロストリジウム・スポロジェンヌ、ボツリヌス菌及びクロストリジウム・ディフィシレへの接合伝達を促進するプラスミドＲＫ２のｏｒｉＴ領域を用いて構築された。ｐＭＴＬ５４０１Ｆをテストするため、我々はプロモーターを有しないｐＣ１９４ ｃａｔ 遺伝子を挿入して、その転写が得られたプラスミド、ｐＭＴＬ５４０１Ｆｃａｔのｆａｃプロモーターの制御下となるようにした（図３）。我々はその後、外来栄養のＩＰＴＧの存在下又は不存在下で培養された、ｐＭＴＬ５４０１Ｆｃａｔを担持するクロストリジウム・スポロジェンヌ又はクロストリジウム・アセトブチリカム細胞の溶解物におけるｃａｔ遺伝子生成物のエンザイム活性を測定した。誘導は双方の有機的組織体において観察されたが、ＩＰＴＧの不存在下では、クロストリジウム・スポロジェンヌにおいて転写の強い抑制が明らかだった一方で（図３）、クロストリジウム・アセトブチリカムにおいて発現の顕著な基礎レベルが観察された（図３）。ｐＭＴＬ５４０１Ｆはクロストリジウム・ディフィシレに導入されることができるが、ｐＣＢ１０２レプリコンはこのクロストリジウム宿主において比較的有効でなく機能し（Ｐｕｒｄｙ ｅｔ ａｌ (２００２) Ｍｏｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ４６： ４３９−４５２）、抗生物質添加液体培養においてその接合体の成長を支持することができない。したがって、同等の誘導実験を行うことはできなかった。

実施例２：クロストリジウムに対する選択可能なマーカーとしてのＥｒｍＢｔｄの開発
ｔｄグループＩイントロンのスプライシングは、挿入ポイントの傍らに配置されるエクソン配列に依存する。ファージＴ４ｔｄグループＩイントロンに認識される標的部位は５’‐ＧＡＣＣＣＡＡＧＡＡ‐３’（配列番号２３）であり、イントロンは初めの‘Ｇ’の後に挿入する。しかしながら、ｔｄグループＩイントロンは５’‐ＧＡＣＣＣＡＡＧＡＧＡ‐３’（配列番号５）部位にも挿入する（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＴａｒｇｅＴｒｏｎ^ＴＭ Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｙｓｔｅｍ）。クロストリジウムにおいて現在使用される抗生物質遺伝子の配列は、これらの配列の存在について評価されたが、これらの配列のいずれも組み込んだ遺伝子は識別されていない。スプライス部位５’‐ＧＡＣＣＣＡＡＧＡＧＡ‐３’（配列番号５）がタンパク質コード領域に存在する場合は、それがコードするアミノ酸配列はそのリーディングフレームに依存する。スプライス部位にコードされうるアミノ酸配列（３つの可能なフレームに対応する）が図４に示されている。クロストリジウムに耐性を与えると知られているすべてのタンパク質のタンパク質配列のスクリーニングは、所望のアミノ酸配列のいずれかを含む候補タンパク質を識別することができなかった。

したがって、選択可能なマーカーをコードする遺伝子は、ｔｄグループＩイントロンの挿入部位を含むように設計された。これはクロストリジウムＲＡＭの基礎を形成することである。エリスロマイシンに耐性を与える大便連鎖球菌プラスミドｐＡＭβ１の天然ｅｒｍＢ遺伝子は、この遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ／クロストリジウムシャトルベクターの生成に広く用いられていることから、選択可能なマーカー遺伝子として選択された（Ｄｕｒｒｅ，Ｐ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ．２００５．Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）。

要求されたスプライス部位を含むようにリンカー配列が設計され、そのリンカー配列がｅｒｍＢ遺伝子のコード領域の５’末端に融合され、実質的にタンパク質のＮ末端を１２アミノ酸延長した（図５）。この配列の設計において、選択されたリーディングフレームは、できる限り不活性で、可溶性であり、ＥｒｍＢタンパク質の機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸をコードするものだった。フレーム１（ＤＰＲＤ；配列番号６）は、可溶性を支持するべき３つの帯電した残基（Ａｓｐ −ｖｅ，Ａｒｇ +ｖｅ）を含むことから、ベストな選択肢だった。電荷の混合物がタンパク質の残りの部分との強い相互作用の妨害を助長することが望まれていた。リンカーの残りの部分は、単一のＳｅｒと共に小さく不活性な残基Ｇｌｙ及びＡｌａから成り、タンパク質の溶解性を低減しうる疎水性残基が長く延びることを避ける。更に、選択されたヌクレオチド配列は、クロストリジウムコドンの使用を含み、いかなる潜在的発現問題も最小化している。

２つの構成物は、後述のようにＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲを用いて、下記の表１に示すオリゴヌクレオチドプライマーを用いて組み立てられた。ＥｒｍＢｔｄ ＲＡＭ１（図６の示された部位に挿入されたｔｄイントロンを含む変性されたｅｒｍＢ遺伝子（配列番号１３））及びｔｄイントロンが存在しないスプライスされた等価物（ＳＥ）。ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１及びＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ ＳＥは、それぞれｆａｃプロモーターと反対方向でハイコピープラスミドｐＭＴＬ５４０２Ｆに複製された（与えられた耐性はＲＡＭ又はＳＥ自体のプロモーターによるものとなる）。

ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ ＳＥは、以下のように作られる。ｅｒｍＢプロモーターは、プライマーＥｒｍＢ‐Ｐｒｏ‐Ｆ３及びＥｒｍＢ‐Ｐｒｏ‐ＲＡを用いて、ｐＭＴＬ５４０２ＦからＰＣＲ増幅された。ｅｒｍＢ ＯＲＦは、プライマーｌｉｎｋｅｒ１‐ＥｒｍＢ‐Ｆ１及びＥｒｍＢ‐Ｒ１を用いて、ｐＭＴＬ５４０２ＦからＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ生成物はゲル精製され、アウタープライマーＥｒｍＢ‐Ｐｒｏ‐Ｆ３及びＥｒｍＢ‐Ｒ１を用いてＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲにおいてテンプレートとして使用された。ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ ＳＥをコードするＰＣＲ生成物は、ｐＣＲ２．１‐ＴＯＰＯに複製される。ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ ＳＥは、ｐＣＲ２．１：：ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ＳＥからＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントとして切除され、同じエンザイムでリニアライズされたｐＭＴＬ５４０２Ｆに結紮された。これはＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ ＳＥを、得られたプラスミドｐＭＴＬ５４０２Ｆ：：ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ＳＥにおいて、ｆａｃｐロモーターと反対方向に配置する。

ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１構成物は以下のように作られる。ｅｒｍＢプロモーターは、プライマーＥｒｍＢ‐Ｐｒｏ‐Ｆ３及びＥｒｍＢ‐Ｐｒｏ‐ＲＢを用いて、ｐＭＴＬ５４０２ＦからＰＣＲ増幅された。ｅｒｍＢ ＯＲＦは、プライマーｌｉｎｋｅｒ１‐ＥｒｍＢＦ１及びＥｒｍＢ‐Ｒ１を用いて、ｐＭＴＬ５４０２ＦからＰＣＲ増幅された。転写減衰されたｔｄグループＩイントロン及びそのエクソンは、プライマーｔｄＧｐＩ‐Ｆ１及びｔｄＧｐＩ−Ｒ１を用いて、ｐＡＣＤ４Ｋ‐ＣからＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ生成物はゲル精製され、アウタープライマーＥｒｍＢ‐Ｐｒｏ‐Ｆ３及びＥｒｍＢ‐Ｒ１を用いて、３ウェイＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲにおいてテンプレートとして使用された。ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１をコードするＰＣＲ生成物は、ｐＣＲ２．１‐ＴＯＰＯに複製された。ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１は、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントとしてのｐＣＲ２．１：：ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１から切除され、同じエンザイムでリニアライズされたｐＭＴＬ５４０２Ｆに結紮された。

ｐＭＴＬ５４０２Ｆ：：ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１を担持するＥ．ｃｏｌｉは、５００及び１２５μｇ／ｍｌでエリスロマイシンに敏感だった（３７℃において一晩中成長しなかった）。ｐＭＴＬ５４０２Ｆ：：ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ＳＥを担持するＥ．ｃｏｌｉは、５００及び１２５μｇ／ｍｌでエリスロマイシンに耐性があった（３７℃において一晩中成長した）。これら実験は、変性されたｅｒｍＢ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉのエリスロマイシンに耐性を与えたこと、また、同じくらい重要なこととして、ｔｄの挿入が遺伝子を不活性化することを立証した。

実施例３：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＥｒｍＢｔｄ選択可能マーカーの検証
ｐＡＣＤ４Ｋ‐Ｃの再標的化核酸構成要素は、ＮａｅＩ（ｂｌｕｎｔ）フラグメントとして、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩ部位の間でｐＭＴＬ２０にサブクローニングされ（Ｃｈａｍｂｅｒｓ等（１９８８）Ｇｅｎｅ ６８：１３９〜１４９）、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）においてｌａｃＺ遺伝子をノックアウトできるように、ｌａｃＺ再標的化領域が再び示された。次に、ｐＭＴＬ２０１ａｃＺＴＴのｋａｎＲＡＭが、ＭｌｕＩフラグメントであるＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１に置き換えられた。ｔｄグループＩイントロンが、グループIIイントロンＲＮＡ発現の誘導に続いて、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１からスプライスされていることをテストするため、ｐＭＴＬ２０１ａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１を担持するＥ．ｃｏｌｉ細胞が採取され、ＲＮＡが作成された。その後、ｔｄ挿入部位の傍らにあるプライマーを用いてＲＴ‐ＰＣＲ反応が開始された。コントロールとして、ＥｒｍＢｔｄ ＲＡＭ１及びＥｒｍＢｔｄ ＲＡＭ１ ＳＥ（ＥｒｍＢｔｄ ＲＡＭ１のスプライスされた等価物）に標準的ＰＣＲが実行された。図７にみられるように、ＩＰＴＧ誘導ＲＮＡサンプルから得られた主な生成物は、ＳＥ遺伝子に対応するより小さいものだった。これは、ｔｄが、ＥｒｍＢｔｄ ＲＡＭ１における変性されたｅｒｍＢ遺伝子のＲＮＡからスプライスされたことを明確に立証している。

ＥｒｍＢｔｄ ＲＡＭ１のスプライシングが起きることが明らかに実証されたにも関わらず、エリスロマイシン耐性コロニーは、５００，２５０又は１２５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンが添加された寒天培地にＩＰＴＧ誘導細胞を植菌しても取得されなかった。Ｅ．ｃｏｌｉは本来的により低いレベルの抗生物質に耐性を有することから、抗生物質の濃度をこれ以上低減することは不可能である。

エリスロマイシン耐性コロニーを取得できないことは、遺伝子数による効果であると考えられている。したがって、ゲノムに挿入された単一のコピーは、抗生物質への耐性を、野生型Ｅ．ｃｏｌｉに固有の低レベルの耐性より上げるのに不十分であった可能性がある。この可能性をテストするために、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ ＳＥを担持するＤＮＡフラグメントは、開裂したｐＡＣＹＣ１８４に結紮され、結紮混合物はＥ．ｃｏｌｉに導入され、５００，２５０及び１２５μｇ／ｍｌの３つの異なる濃度でテトラサイクリン又はエリスロマイシンのいずれかを含む２ＹＴの上に蒔かれた。同等数のコロニーがＥｒｍ１２５及びＴｅｔの上で成長したが、Ｅｒｍ２５０の上では数倍少なく成長し、Ｅｒｍ５００の上ではごく少量が成長した。この対照実験では、ｐＡＣＹＣ１８４上に存在するときのＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ ＳＥの遺伝的形質の実用限界を１２５μｇ／ｍｌに設定した。

Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ ＳＥのスクリーンに必要なエリスロマイシンのレベルを確立して、標的領域にわたるｌａｃＺの領域は、プライマーｌａｃＺ ｔａｒｇｅｔ‐Ｆ（ＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＴＡＡＴＧＣＧＡＡＣＡＧＣ‐ＧＣＡＣＧＧ；配列番号３３）及びｌａｃＺ ｔａｒｇｅｔ‐Ｒ（ＴＧＣＧＡＴＣＧＣＡＣＣＧＣＣＧＡ‐ＣＧＧＣＡＣＧＣＴＧＡＴＴＧ；配列番号３４）によりＰＣＲ増幅され、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯに複製されて、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に数コピー存在するｐＡＣＹＣ１８４にサブクローニングされた。その後、再標的化実験は、ｐＭＴＬ２０１ａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１を、ｐＡＣＹＣ１８４：：ｌａｃＺを担持するＥ．ｃｏｌｉ細胞に導入することにより繰り返された。ＩＰＴＧの誘導に続いて、細胞はエリスロマイシンを含む媒体に蒔かれた。以前の実験とは対照的に、適切な数の耐性コロニーが得られた。診断ＰＣＲにおける適切なプライマーの使用が、グループIIイントロンの、ｌａｃＺ遺伝子への再標的化がｐＡＣＹＣ１８４の上で起こったことを確実にした。したがって、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ ＳＥが単一のコピーとして存在するとき、ＥｒｍＢの発現はエリスロマイシンに耐性を与えるのに不十分であるが、複数のコピーに存在するときは、ＥｒｍＢは耐性表現型を与えるのに十分な量で発現される。

実施例４：ＥｒｍＢｔｄ選択可能マーカーを用いたクロストリジウム再標的化システムの構築
ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１がＳｉｇｍａ‐ＡｌｄｒｉｃｈグループIIイントロンにおいてＫａｎＲＡＭの代わりになりうることを確立して、全体の要素は、ｌａｃＺの再標的化領域と共に、（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩ及びＳａｃＩ／Ｎｈｅｌフラグメントとしての）ｐＭＴＬ２０１ａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１から（ＨｉｎｄＩＩＩ‐ＮｈｅＩで切断された）クロストリジウム発現ベクターｐＭＴＬ５４０２Ｆにサブクローニングされて、ｐＭＴＬ５４０２ＦｌａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１を与えた。その結果、グループIIイントロンの発現はｆａｃプロモーターの制御下にあった。グループIIイントロンの発現はＩＰＴＧによって調節される。

このベクターが、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐＡＣＹＣ１８４：：ｌａｃＺ上のｌａｃＺ遺伝子を再標的化する能力をテストした。ＩＰＴＧ誘導及びエリスロマイシンに蒔くことに続いて、良好な再標的化が実証された。

実施例５：グループIIイントロン再標的化におけるＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１の効率の決定
ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１が、ＫａｎＲＡＭと比較して、グループIIイントロンが標的化できる頻度に影響するか否かを評価するために、我々は、Ｋａｒｂｅｒｇ等（２００１，上記と同様）が開発した２プラスミドシステムを用いて、いくつかのモビリティアッセイに着手した。ＩＰＴＧ誘導に続くｐＡＣＤ２からのグループIIイントロンの（本来的な標的であるＬｔｒＢを担持する）ｐＢＲＲ３‐ＬｔｒＢへの再標的化は、後者のプラスミド上のＴｅｔ遺伝子の活性化をもたらした。このように個々の再標的化事象はテトラサイクリンへの耐性の取得に基づいて検知することができる。

したがって、プラスミドｐＡＣＤ２は、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１又はＫａｎＲＡＭのいずれかのこのベクター固有ＭｌｕＩ部位への挿入により、変性された。これら２つのプラスミドは、ｐＢＲＲ３‐ＬｔｄＢすなわち野生型標的配列を含む受容体プラスミドを含むＨＭＳ１７４（ＤＥ３）細胞に導入された。ドナープラスミドについての選択の後、細胞は５００μＭ ＩＰＴＧで１時間誘導され、ＬＢ中で再懸濁され、１時間回復させられて、その後、種々の希釈物が種々の選択的なプレート上に蒔かれた。それらのＲＡＭを含む構造体のために、Ｔｅｔ^ＲコロニーがまずＴｅｔプレートに再植菌され、その後再び適切な抗生物質を含むプレートに植菌されてＲＡＭスプライシングをテストする。結果を表２に示す。

この実験は、ＫａｎＲＡＭ及びＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１は恐らく主にイントロンの増大したサイズに起因して、イントロン効率に同様の影響をもたらすことを実証した。重要なことには、データは双方のＲＡＭが同じ効率ですプライスしたことを示している。

いずれのＲＡＭのスプライシングも当初は抗生物質耐性により検出できないが、Ｔｅｔ^Ｒコロニーから再植菌される場合のみ検出できる。

実施例６：効果的なクロストリジウム再標的化配列の識別
ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１の再標的化を評価するために、３つの異なるクロストリジウム種から８つの異なるテスト遺伝子が選択された。これらは、クロストリジウム・スポロジェンヌｐｙｒＦ，ｓｐｏ０Ａ，ｃｏｄＹ及びＳＯＮＯ，クロストリジウム・ディフィシレｐｙｒＦ（ゲノム注釈番号ＣＤ３５９２）及びｓｐｏ０Ａ（ゲノム注釈番号ＣＤ１２１４）、クロストリジウム・アセトブチリカムｐｙｒＦ（ゲノム注釈番号ＣＡＣ２６５２）及びｓｐｏ０Ａだった。

各遺伝子はhttp://www.sigma-genosys.com/targetron/で解析され、再標的化を可能とするのに適切な変更が特定された。適切なプライマーを用いて、適切な変性グループIIイントロンの生成は、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ ＴａｒｇｅＴｒｏｎ^ＴＭ Ｇｅｎｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅで示される、ＰＣＲによって行われた。各ＰＣＲは、グループIIイントロン又はその５’エクソンの標的部分を変性するように設計された固有のＩＢＳ，ＥＢＳ２及びＥＢＳ１ｄプライマーと、ＥＢＳユニバーサルプライマーとを要求する。各遺伝子の標的挿入部位及びプライマーの配列を表３及び表４に示す。

変性されたグループIIイントロンが選択されたクロストリジウム遺伝子を再標的化することができることを保証するために、実験はまず効果的に機能することが知られているプラスミドシステムを用いたＥ．ｃｏｌｉにおいて行われた。利用されたシステムは、実施例５に記載したように、Ｋａｒｂｅｒｇ等（２００１）が開発した２プラスミドシステムである。このシステムを用いて、処理されたグループIIイントロンは１つのプラスミド（ｐＡＣＤ２）上に載置され、その標的（この場合複製されたクロストリジウム遺伝子）は２つ目のプラスミド（ｐＢＲＲ３）上に載置された。ｐＡＣＤ２からのグループIIイントロンのｐＢＲＲ３への再標的化は、後者のプラスミド上のＴｅｔ遺伝子の活性化をもたらす。このように、個々の再標的化事象はテトラサイクリンの耐性の取得により検出することができる。細菌の一部は選択的でない寒天プレート上に蒔かれて、すべての成長できる細菌を示唆し、一部はテトラサイクリンを含む寒天プレート（Ｔｅｔプレート）上に蒔かれる。再標的化の効率は、テトラサイクリンに耐性があるすべての成長可能な細菌の割合に基づいて評価される。

標的遺伝子のｐＣＲ２．１／ｐＣＲＩＩＴＯＰＯプラスミドからｐＢＲＲ３へのサブクローニングを促進するために、複数クローニング部位がｐＢＲＲ３‐ＬｔｒＢに導入されｐＢＲＲ３‐ＭＣＳ１を作る。これは、ｐＣＲ２．１‐ＴＯＰＯプラスミドにみられる制限部位を含む、ＡａｔＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位の間のマルチクローニング部位フラグメントの挿入によって行われる。クローニング部位の配列は、図８に示される。図８に示されるマルチクローニング部位フラグメントは、ＭＣＳ１ａオリゴヌクレオチドＣＴＣＧＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＴＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＡ‐ＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧ（配列番号６８）及びＭＣＳ１ｂオリゴヌクレオチドＡＡＴＴＣ‐ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＡＧＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＣＣＴＡＴＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＴＣＧＡＧＡＣＧＴ（配列番号６９）から作られる。

４つの再標的化核酸（各々がクロストリジウム・スポロジェンヌ遺伝子ｐｙｒＦ，ｓｐｏ０Ａ，ｃｏｄＹ及びＳＯＮＯのいずれか１つにおける挿入を対象としている）は、２プラスミドイントロンモビリティアッセイを用いて評価される。４つすべてが予想より遥かに効果的な再標的化を可能とした。したがって、Ｔｅｔプレートに蒔かれるよう選択された希釈物は理想的でなく、単にちょうどコロニー数の範囲内であり、したがって前で示された効率は、より少ない細菌が蒔かれた場合より精度が低い可能性がある。次の４つの再標的化核酸（各々がクロストリジウム・ディフィシレｐｙｒＦ及びｓｐｏ０Ａ遺伝子又はクロストリジウム・アトブチリカムｐｙｒＦ及びｓｐｏ０Ａ遺伝子のいずれか１つにおける挿入を対象としている）が、再標的化の評価を受けた。再標的化事象は、Ｔｅｔプレートに蒔かれた細菌により評価された。この初期実験では、ＳＯＮＯはＥｍ^Ｒコロニーをもたらさなかった。結果を表５に示す。

実施例７：クロストリジウムにおける核酸の再標的化の評価
初めの４つの新たな再標的化核酸（各々がクロストリジウム・スポロジェンヌ遺伝子ｐｙｒＦ，ｓｐｏ０Ａ，ｃｏｄＹ及びＳＯＮＯのいずれか１つにおける挿入を対象としている）がプロトタイプベクターｐＭＴＬ５４０２ＦＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１にサブクローニングされ、その後当該プロトタイプベクターがＥ．ｃｏｌｉドナーＣＡ４３４に導入され続いて、そのＥ．ｃｏｌｉは受容体としてのクロストリジウム・スポロジェンヌ又はクロストリジウム・ディフィシレのいずれかとの接合に用いられた。後者の場合、接合体は得られなかった。クロストリジウム・スポロジェンヌの場合は、双方のプラスミドにより接合体が得られた。単一の接合体が、２５０μｇ／ｍｌのサイクロセリン及び７．５μｇ／ｍｌのチアンフェニコール（後者はプラスミドメンテナンスを保証する）が補充された１．５ｍｌの適当な成長媒体に植菌され、培養地は３７℃で、一晩、嫌気的培養で静止期まで成長させられた。この培養地の１５０μｌが、同じタイプで、同じ抗生物質を含む１．５ｍｌの未使用の培養液の植菌に使用され、その後３７℃で嫌気的に培養された。培養地の中において増殖が視認可能となってすぐに、典型的には１時間後に、培養地は１ｍＭのＩＰＴＧで誘導され、１時間培養された。

２ｍｌの誘導細胞が、７０００ｒｐｍで１分間の遠心分離により採取され、ＰＢＳにおいて再懸濁により洗浄され、元の通り採取される。沈殿物は、サプルメントを含まない同量（２ｍｌ）の適当な成長媒体中で再懸濁だれ、３７℃で１時間嫌気的に培養された。それから、培養地の連続希釈は、１時間、２４時間及び４８時間後、１〜１０μｇ／ｍｌのエリソマイシンが補充された適当な固体成長媒体に食菌され、３７℃で嫌気的に培養された。

２回の別々の試みにおいて、エリソマイシンコロニーは得られなかった。

実施例８：天然ｅｒｍＢプロモーターが選択可能なマーカーとして機能するのに十分なＥｒｍＢの発現を促進するには弱すぎることの証拠
実施例７に記載したように、再標的化核酸が再標的化を検出できないことの１つの説明は、ｅｒｍＢプロモーターが、細胞の染色体における遺伝子の１つのコピーがエリソマイシン耐性を与えることを可能とするのに弱すぎることである。大腸連鎖球菌プラスミドｐＡＭβ１のｅｒｍＢプロモーター配列の解析は、プロモーターの−３５及び−１０領域の間隔は２１ｂｐであることを示した。グラム陽性プロモーターの最適条件は１７±１ｂｐである。

ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ ＳＥは、ｐＭＴ５４０２Ｆにおいてｆａｃと異なる２方向に複製された。遺伝子がｆａｃの制御下にあるときのみ、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ ＳＥを担持するプラスミドは、クロストリジウム・スポロジェンヌ宿主にエリスロマイシン耐性を与えることができる。反対の方向において、ｅｒｍＢコード領域の転写がそれ自身のプロモーターに依存しており、ｅｒｍＢがマルチコピープラスミドに存在するにも関わらず、発現は耐性に不十分である。

実施例９：強いプロモーターを有するクロストリジウムＥｒｍＢｔｄＲＡＭの開発
クロストリジウム・アセトブチリカムのｔｈｌ遺伝子のプロモーターは、強く構成的なプロモーターとして認識されている。プライマーは、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１プロモーターをｔｈｌプロモーターに置き換えるように設計された。これらは、転写開始部位及びリボソーム結合部位の間における不要な配列を削除し、開始コドンにＮｄｅＩ部位を挿入して、プロモーターが必要に応じて再度変更されることを容易にしている。ｔｈｌプロモーターが強くなりすぎるのを防ぐために、−３５及び−１０〜１６ｎｔの間隔を変更し、−３５及び−１０要素にマイナーチェンジを行うことにより、突然変異体ｔｈｌプロモーター‘ｔｈｌ２’も設計された。−３５及び−１０要素にわたるｔｈｌ及びｔｈｌ２プロモーターが、コンセンサスグラム陽性増殖期プロモーターとの比較において、図９に示されている。完全なｔｈｌプロモーターの配列は、図１０のＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２配列における１５〜８４ポジションに示されている。完全なｔｈｌ２プロモーターの配列は、図９に示される部分のみ、ｔｈｌプロモーターと異なっている。

ｔｈｌ及びｔｈｌ２プロモーターは、ＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲ及びクローニング処理を用いて、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１及びＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１ ＳＥ開始コドンに接合され、それぞれがｔｈｌプロモーターを含むＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２及びＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２ ＳＥ、及びそれぞれがｔｈ２プロモーターを含むＥｒｍＢｔｄＲＡＭ３及びＥｒｍＢｔｄＲＡＭ３ ＳＥを生成した。ＲＡＭ２及びＲＡＭ３双方の正しい配列が得られ、評価のためにｐＡＣＤ２及びｐＭＴＬ２０１ａｃＺＴＴにサブクローニングされた。ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２特徴及び配列は、図１０に示されている。

ＲＡＭ２及びＲＡＭ３部分の、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０細胞のエリスロマイシンへの耐性を与える能力は、下記の表６に示すように、これらの部分を含むプラスミドに対して決定された。

ＳＥ ＴＯＰＯプラスミド以外のすべてにおいて、ｅｒｍＢ遺伝子はグループＩイントロンにより妨害されるため、耐性は期待されなかった。ＳＥ ＴＯＰＯプラスミドにおいては、ｅｒｍＢ遺伝子は妨害されないため、ｅｒｍＢのプロモーターが十分に強ければ、耐性表現型が得られるはずである。予期外に、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＲＡＭ２ ＴＯＰＯクローンがエリスマイシン耐性を与えた。非常に強いｔｈｌプロモーター及び非常に高いコピー数が、恐らく天然ＡＴＧの珍しい翻訳開始により、この状況でグループＩイントロンに打ち克つようである。この効果は、遺伝子がＴＯＰＯに存在するときにのみ見られる。ｐＡＣＤ２及びｐＭＴＬ２０１ａｃＺＴＴＲＡＭ等の再標的化に関連するプラスミドに挿入されたとき、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞はエリスマイシンに耐性を持たない。ＲＡＭ３耐性プロファイルは予想通りだった。したがって、いずれのプロモーターもクロストリジウム再標的化核酸における選択可能なマーカーの発現を促進するのに有用なようであった。

実施例１０：ｐＡＣＤ２／ｐＢＲＲ３システムにおけるＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２及び３の評価
ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２及び３の再標的化効率は、実施例５に記載した再標的化アッセイを用いて評価した。結果を下記の表７に示す。

ＲＡＭ２及びＲＡＭ３のスプライシングは効率的であり（９０％）、オリジナルＲＡＭ（ＲＡＭ１）と同様であった。

実施例１１：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐＭＴＬ２０１ａｃＺＴＴシステムにおけるＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２及び３の評価
上述のように、いずれのＲＡＭも、Ｅｒｙ５００又はＥｒｙ１２５のいずれかを用いて、グループIIイントロンのＥ．ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）染色体のｌａｃＺへの再標的化を検出するのに用いることはできない。ＲＡＭ３ではなくＲＡＭ２の場合、非常に多くのＥｒｙＲコロニーが出来るが、ＰＣＲの結果、ＬａｃＺ遺伝子に再標的化されたグループIIイントロンの存在を確認することが出来なかった。恐らくこれらのコロニーは、プラスミドが与える弱い耐性により生じる。

実施例１２：
図１１は、ｐＭＴＬ５４０２ＦｌａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２とも呼ばれるベクターｐＭＴＬ００７の主要な構成要素を図示している。このグループIIイントロンは、ｌａｃＺ遺伝子を再標的とするように変性される。それはクロストリジウム綱の細菌性細胞の遺伝子を再標的とするように変性されてもよい。

プラスミドの主要な要素は以下のとおりである。

図示例で誘導ｆａｃプロモーターである、再標的化核酸要素の発現を引き起こすクロストリジウムプロモーター。他のプロモーター、すなわちｌａｃオペレーターの存在により誘導性とされるもの、例えばｆａｃ２も、同様に用いられる。誘導を仲介するために、プラスミドは、クロストリジウムプロモーター、この例ではクロストリジウム・アセトブチリカムのｐｔｂ遺伝子（ホスホトランスブチリラーゼをコードする）のプロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩ 遺伝子をも担持する。構成的プロモーターは、誘導プロモーターの代わりに用いられうる。プラスミドは、プラスミドｐＭＴＬ２０ＥのＣｏ１Ｅ１レプリコンをも担持し、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドのメンテナンスを可能とし、更にクロストリジウム・ブチリカム・プラスミドｐＣＢ１０２のレプリケーション領域をも担持することでクロストリジウム種におけるメンテナンスを可能とする。プラスミドのメンテナンスは、Ｅ．ｃｏｌｉ（クロラムフェニコールを含む媒体の補給を通じて）及びクロストリジウム（チアンフェニコールを含む媒体の補給を通じて）におけるプラスミドの選択を可能とするｃａｔＰ遺伝子の含有によっても提供される。導入に加えてプラスミドのクロストリジウム受容体への接合を容易にするために、ベクターはプラスミドＲＰ４のｏｒｉＴ領域をも担持する。

これらの要素のすべては他のソースからの等価の要素との互換性がある。したがって、Ｃｏ１Ｅ１はＥ．ｃｏｌｉにおいてレプリケーションを可能とする、ｐ１５ａ、ｐＶＷ０１等の他のレプリコン又はＭ１３等のファージオリジンに置き換えられてもよい。ｃａｔＰ遺伝子は、ｔｅｔＭ又はａａｄ等の他の適当な抗生物質抵抗性遺伝子に置換されてもよい。同様に、ｐＩＭ１３，ｐＩＰ４０４，ｐＡＭβ１，ｐＣＤ６，ｐＣ１９４，ｐＥ１９４，ｐＴ１８１，ｐＣＢ１０１，ｐＢＰ１等の、標的のクロストリジウム又はグラム陽性細菌宿主において複製可能ないかなるレプリコンが用いられてもよい。レプリケーションに条件を有する、例えばレプリケーションのための温度に敏感である又は外性的な要素に依存するレプリコンを含む、レプリケーションに欠陥があるレプリコンも用いることができる。グラム陽性プラスミドにおいてレプリケーションに対する条件を欠くプラスミド、すなわちＣｏ１Ｅ１レプリコンのみを担持する自殺ベクターを用いてもよい。

オペレーター及びリプレッサー遺伝子の他の組合せが用いられてもよい。テトラサイクリン（Ｔｅｔ）により調整されるコンジュゲイティブトランスポゾンＴｎ５３９７で同定されるプロモーターは、他の対象を示す（Ｒｏｂｅｒｔｓ，博士論文，ＵＣＬ）。あるいは、近年、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓから生成されたキシロース誘導プロモーターがクロストリジウム・アセトブチリカムで機能することが示されている（Ｇｉｒｂａｌ等（２００３）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：４９８５‐８）。他の対象候補は、枯草菌において作成されたｔｅｔ調節プロモーターである（Ｇｅｉｓｓｅｎｄｏｒｆｅｒ ａｎｄ Ｈｉｌｌｅｎ（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：６５７−６３）。それは、ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔ Ｏ）配列を強いｘｙｌプロモーターの−３５及び−１０の間に加えることによって作られた（Ｇｅｉｓｓｅｎｄｏｒｆｅｒ ａｎｄ Ｈｉｌｌｅｎ，１９９０、上記と同様）。ｔｅｔ Ｒ遺伝子（リプレッサーをコードしている）の存在下において、誘導体化プロモーターは、亜致死量濃度のＴｅｔにより１００倍誘導可能だった。得られた発現の基礎レベルは、第２のｔｅｔオペレーターの追加により、この追加により発現レベルの全体の低減を引き起こすものの、完全になくすことができた。続いて、このプロモーターは、１つのオペレータのみが必要と証明された黄色ブドウ球菌に応用されてきた（Ｂａｔｅｍａｎ等（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，６９：７８５１‐７：Ｊｉ等（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：２２６６‐２２６９）。

ｔｅｔ調整プロモーターは、我々が開発したｆａｃ／ｌａｃＩシステムの理想的な代替品になる。このように、我々はｌａｃＩの発現に用いられる同じプロモーターを用いてｔｅｔ^Ｒを発現することができる（クロストリジウム・アセトブチリカムｐｔｂプロモーター）。枯草菌において、誘導の度合いはテスト範囲にわたって用量依存的だった。しかしながら、枯草菌は抗生物質に敏感であることから、高濃度のＴｅｒは加えられなかった。同様の制約は、抗生物質に耐性があるクロストリジウム・ディフィシレ等のクロストリジウムには適用されない。システムの実現可能性をテストするために、ｆａｃを再合成して、−３５及び−１０の間の領域をｔｅｔＯで置き換える。Ｔｅｔの非存在下で高基礎レベルが観察されれば、第２のオペレーターを加えることができる。更なる合成ｌａｃＯ配列の追加は、ＬａｃＩによるプロモーターの抑圧を強めるのにも用いることができる（Ｍｕｌｌｅｒ等（１９９６）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２５７：２１‐９）。

ｐＭＴＬ００７の構造

前記構造で用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは下記の表８に示される。

１．６２７ ｋｂ ＬｓｐＩ‐ＨｉｎｄＩＩＩ フラグメントは、クロストリジウム・ブチリカム・プラスミド ｐＣＢ１０２から単離され（Ｍｉｎｔｏｎ及びＭｏｒｒｉｓ（１９８１）Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １２７：３２５‐３３）、かつ、クレノウポリメラーゼにより平滑末端化された。レプリコンクローニングベクターｐＭＴＬ２１Ｅ（Ｓｗｉｎｆｉｅｌｄ等（１９９０）Ｇｅｎｅ ８７：７９−８９）はＮｈｅｌにより開裂され、クレノウポリメラーゼにより平滑末端化されて単離されたｐＣＢ１０２レプリコンフラグメントと結紮された。結果として得られたプラスミドは、図１２に示すように、ｐＭＴＬ５４０Ｅと名付けられた（Ｔ Ｄａｖｉｓ，ＰｈＤ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｅ Ｏｐｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９８９）。

誘導プロモーター要素は、クロストリジウム・パスツリアヌムのフェレドキシン遺伝子プロモーターから生成された。現在ｆａｃと呼ばれており、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ オペレーターをフェレドキシン遺伝子プロモーターの＋１のすぐ後に加えることにより生成され、フェレドキシン構造遺伝子のＡＴＧ開始コドンのすぐ前の配列をＣＡＴに変更し、これによりＮｄｅＩ制限部位（ＣＡＴＡＴＧ）を生成した（Ｍｉｎｔｏｎ等（１９９０）Ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｉｎ：Ａｎａｅｒｏｂｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（ｅｄｓ Ｐ Ｂｏｒｉｅｌｌｏ ＆ Ｊ Ｈａｒｄｉｅ）， Ｗｒｉｇｈｔｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｐｅｔｅｒｓｆｉｅｌｄ，ＵＫ ｐｐ．１８７‐２０６）。この特定の例では、ｌａｃプロモーターに比べ、ｌａｃオペレーターは転写と反対方向に挿入された。しかしながら、これは機能的に影響せず、ＬａｃＩプロテインはまだ結合して、プロモーターを抑制する。

その後、ｆａｃプロモーターは、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ制限フラグメントとしてプラスミドｐＭＴＬ１００３の同等の部位の間にサブクローンされ（Ｂｒｅｈｍ等（１９９１）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，３５８‐３６３）、プラスミドｐＭＴＬ１００６を生成する。このサブクローニング処理は、ｐＭＴＬ１００３のｔｒｐプロモーターを除去し、ｌａｃＺ’の発現を変性されたｆｄプロモーターの制御下に置いた。その後、プラスミドｐＭＴＬ１００６は、ＢｇｌＩで切断され、２つのフラグメントのうち大きいほうが単離された。プラスミドｐＭＴＬ５００Ｅ（Ｏｕｌｔｒａｒｎ ｅｔ ａｌ （１９９８） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｔｔｔｓ ５６： ８３−８８）が、同様にＢｇｌＩで開裂され、２つのフラグメントのうち大きいほうが単離され、それがｐＭＴＬ１００６から単離されたより大きいフラグメントと結紮された。得られたプラスミドはｐＭＴＬ５００Ｆと名付けられた（Ｆｏｘ等、１９９６、上記と同様）。

ｐＭＴＬ５００Ｆはクロストリジウムにおいて複製の盛んなｐＭＴＬ５００Ｆであるが、我々は、ｐＡＭβ１をベースとしたシャトルベクターの転送頻度は、比較的効率が悪いことを発見した。それゆえ我々は、レプリコンをｐＣＢ１０２のそれに変えることを決めた。したがって、ｐＭＴＬ５４０Ｅ及びｐＭＴＬ５００Ｆは、ＢｇｌＩによって切断され、ｐＭＴＬ５４０Ｅのより大きいフラグメントは、ｐＭＴＬ５００Ｆのより小さいフラグメントに結紮した。得られたプラスミドは、指定のｐＭＴＬ５４０Ｆだった（Ｆｏｘ等，１９９６、上記と同様）。簡潔化のために、ｐＭＴＬ５００Ｅ及びｐＭＴＬ１００６フラグメントの結紮と、ｐＭＴＬ５４０Ｅ及びｐＭＴＬ５００Ｆフラグメントの結紮とは、ｐＭＴＬ５４０Ｅ及びｐＭＴＬ１００６の１つの結紮として図１２に示されている。

形質転換がまた実証されていないプラスミドの接合伝達を可能とするために、我々はプラスミドにプラスミドＲＰ４のｏｒｉＴ（転写の複製起点）を与えることを選択した。そのようなものとして、ＲＰ４ ｏｒｉＴ領域は、ｐＥｏｒｉＴ（Ｐｕｒｄｙ等，２００２）からＥｃｏＲＶ及びＳｍａＩを用いて切除され、ｐＭＴＬ５４０ＦのＥｃｏＲＶ制限部位にサブクローンされて、ｐＭＴＬ５４００Ｆを生成した（図１２参照）。

ＬａｃＩリプレッサータンパク質の生成を引き起こすために、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＩ遺伝子のプロモーターを含まないコピーは、ＰＣＲプライマーｌａｃＰ１及びｌａｃＩＰ２を用いて、ｐＮＭ５２（Ｇｉｌｂｅｒｔ等（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：１５１−１６０）から約１．０ｋｂのＮｄｅｌ‐ＥｃｏＲＩフラグメントに増幅された。同時に、クロストリジウム・アセトブチリカムｐｔｂ（ホスホトランスブチリラーゼ）のプロモーター領域は、プライマーｐｔｂ‐Ｐ１及びｐｔｂ‐Ｐ２を用いてＰＣＲ増幅された。これは、遺伝子が５７８ｂｐ ＥｃｏＲＩ‐Ｎｄｅｌフラグメントに配置する。２つのフラグメントは単離され、ＥｃｏＲＩ‐切断ｐＭＴＬ２０Ｅにより結紮して、ｌａｃＩ遺伝子をｐｔｂプロモーターの転写制御下におき、運搬可能なＥｃｏＲＩフラグメントに変性された遺伝子を配置した。このフラグメントは、生成されたプラスミドから切除され、クレノウポリメラーゼにより平滑末端化され、ＥｃｏＲＶ‐切除ｐＭＴＬ５４００Ｆに結紮した。得られたプラスミドは、図１２に示すように、ｐＭＴＬ５４０１Ｆと名付けられた。

プラスミドｐＭＴＬ５４０１Ｆは、ｅｒｍ遺伝子を選択可能なマーカーとして担持する。したがって、それはＥｒｍＲＡＭと混合することはできない。したがって、ｅｒｍ遺伝子はｐＪＩＲ４１８のｃａｔＰ遺伝子と置き換えられた（Ｓｌｏａｎ等（１９９２）Ｐｌａｓｍｉｄ ２７：２０７‐２１９）。これは、ＡｈｄＩ／ＴｔｈＩＩＩ１によりｐＭＴＬ５４０１Ｆを切除し、ＤＮＡをクレノウポリメラーゼにより平滑末端化し、その後、ＡｈｄＩ及びＴｔｈＩＩＩ１による切断によって生成された２つのｐＭＴＬ５４０１Ｆフラグメントの大きい方にｐＪＩＲ４１８ｃａｔＰ遺伝子を運ぶ１．１ｋｂのＰｖｕＩＩフラグメントに結紮することにより達成された。この操作は、ｅｒｍＢの削除及びｂｌａ遺伝子の大部分の除去を完了させた。得られたプラスミドは、図１３に示すように、ｐＭＴＬ５４０２Ｆと名付けられた。

この置換に先立って、ｃａｔＰフラグメントのＢｓｒＧ１部位は、ｃａｔＰコード配列を変化させることなく、ＢｓｒＧ１パリンドロームを破壊するように配列を突然変異させることにより除去された。これはプライマーＣａｔＰＳＯＥＦ及びＣａｔＰＳＯＥＲを用いた、Ｓｅｗｉｎｇ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ） ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ等，１９９０）を用いた仕事だった。更に、使用された傍らのプライマーＣａｔＰＦｗｄ及びＣａｔＰＲｅｖは、ＰｖｕＩＩ部位及び内部ＡｇｅＩ部位の双方を包含するように作られた。前者は、後に続くプラスミドのｐＭＴＬ５４０１Ｆへの挿入のために組み込まれ、後者は、最終プラスミドｐＭＴＬ００７のｃａｔＰの将来的な代用マーカーとの後々の置換を促進するために導入された。

ｐＭＬ Ｔ００７は以下のように構成された。

Ｔａｒｇｅｔｒｏｎ^ＴＭ プラスミド ｐＡＣＤ４Ｋ‐Ｃは、Ｓｉｇｍａから購入され、ＰＣＲ生成物がまず複製されてその配列がＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｒＧＩフラグメントのｐＡＣＤ４Ｋ‐Ｃへのサブクローニングの前に検証される以外は、与えられたプロトコルに従って、キットに提供された制御プライマーを用いてＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子に再標的化された。

ｌａｃＺ‐再標的化核酸領域は、図１３に示すように、５０９９ｂｐ ＮａｅＩフラグメントとして切除され、ＨｉｎｄＩＩＩ端のＴ４ポリメラーゼ平滑末端化と共に、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩによる分解によって予め生成されたｐＭＴＬ２０の２４１２ｂｐフラグメントに結紮された。構成は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ部位が再標的化核酸領域の傍らに位置する方向から選択された。

ＫａｎＲＡＭはＭｌｕＩを用いて切除され、図１３に示すように、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２を含むＭｌｕＩフラグメントに置き換えられた。

ＥｒｍＲＡＭを含む全体のｌａｃＺ‐再標的化核酸領域は、その後、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩに分解されたｐＭＴＬ５４０２Ｆに共に結紮する〜３．３ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩフラグメント及び〜１．８ｋｂｐのＳａｃＩ／ＮｈｅＩフラグメントとして切除された。結果として得られたプラスミドは、指定のｐＭＴＬ５４０２ＦｌａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１だった。

クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ ８２４のｔｈｌプロモーターは、ｐＳＯＳ９５（Ｔｕｍｍａｌａ等（２００３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：１９２３〜１９３４）から、プライマーＴｈｉｏ‐Ｆ１及びＴｈｉｏ‐Ｒ‐ＲＡＭを用いてＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ生成物は、ゲル精製され、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ１構造物からのｔｄグループＩイントロンＰＣＲ生成物と共に、アウタープライマーＴｈｉｏ‐Ｆ１及びｔｄＧｐＩ‐Ｒ１を用いたＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲにおけるテンプレートとして用いられた。ｔｈｌプロモーター及びｔｄイントロンの一部分は、このＰＣＲプロダクトから１４３ｂｐＳｐｅＩ／ＮｓｐＩフラグメントとして切除された。ｔｄイントロンの残りの部分及びｐＣＲ２．１：：ＥｒｍｔｄＲＡＭ１からのｅｒｍＢ ＯＲＦは、共にＮｓｐI／ＮｏｔＩフラグメントとして切除された。これらのフラグメントは、ＳｐｅＩ及びＮｏｔＩにより線形化されたｐＣＲ２．１：：ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２ ＳＥに３ウェイライゲーションで結紮され、プラスミドｐＣＲ２．１：：ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２を生成した。

図１４に示すように、ＲＡＭを含むｐＣＲ２．１：：ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２のＭｌｕｌ／Ｍｌｕｌフラグメントは、ｐＭＴＬ２０１ａｃＺＴＴのより大きいＭｌｕｌ／Ｍｌｕｌフラグメントと結紮して、ｐＭＴＬ２０１ａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２を形成した。

図１４に示すように、ＲＡＭを含むｐＭＴＬ２０１ａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２のＢｓｒＧＩ／ＢｓｔＢＩフラグメントは、ＢｓｒＧＩ／ＢｓｔＢＩ切断ｐＭＴＬ５４０２ＦｌａｃＺＴＴＥｒｍＲＡＭ１にサブクローンされ、ｐＭＴＬ００７を生成する。

ｐＭＴＬ００７は初めに指定したｐＭＴＬ５４０２ＦｌａｃＺＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２であり、ｐＭＴＬ５４０２ＦｌａｃＺＴＴＥｒｍＲＡＭ２又はｐＭＴＬ５４０２ＦｌａｃＺＴＴＲＡＭ２又はｐＭＴＬ５４０２ＦｌａｃＺＴＴＲ２と呼ばれることもある。

再標的化されれば、プラスミドは、「標的領域」（ＴＲ）の識別字が末尾に付いたｐＭＴＬ００７（又はｐＭＴＬ５４０２ＦＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２又はｐＭＴＬ５４０２ＦＴＴＥｒｍＢＲＡＭ２又はｐＭＴＬ５４０２ＦＴＴＲＡＭ２又はｐＭＴＬ５４０２ＦＴＴＲ２）と名付けられる。ＴＲは、再標的化ＰＣＲにより生成された配列のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｒＧＩ部位の間の全体の領域である。例えば、プラスミドが、適当なＴＲフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｓｒＧＩとして複製することにより、ｓｐｏ０Ａ ＯＲＦのポジション１７８において、クロストリジウム・ディフィシレ６３０遺伝子ｓｐｏ０Ａに再標的化されれば、プラスミドはｐＭＴＬ５４０２ＦＴＴＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２：：Ｃｄ‐ｓｐｏ０Ａ‐１７８ａＴＲと名付けられる。

実施例１３：クロストリジウム・スポロジェンヌにおけるｐＭＴＬ５４０２ＦｌａｃＺＴＴ体系におけるＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２及び３のｃｏｄＹに対する評価
クロストリジウムにエリスロマイシン耐性を与えることができる新たなＲＡＭを生成して、イントロンがクロストリジウム・スポロジェンヌのｃｏｄＹを再標的化するように構成された標的化部分を有する変性されたグループＩＩイントロンを有するクロストリジウム再標的化核酸が作られた。ＲＡＭ２又はＲＡＭ３のいずれかを含む２つのプラスミドが作られ、それぞれｐＭＴＬ５４０２ＦＣｓ‐ｃｏｄＹ‐４１７ｓＴＴ：：ＲＡＭ２及びＲＡＭ３と命名された。ＲＡＭ２バージョンは、グループＩＩイントロンの再標的化部分及びＩＢＳ配列がＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺではなくクロストリジウム・スポロジェンヌのｃｏｄＹに対する再標的化を可能とするように作られている以外は、図１０に示されたものと同様である。いずれもプラスミドも、クロストリジウム・スポロジェンヌに接合された。接合体はＰＣＲにより実証され、Ｅｒｙ１．２５に対して完全に敏感であることが示された。各ＲＡＭの選択された接合体は、その後ＩＰＴＧにより誘導され、遠心分離及び洗浄により誘導物質を除去した後、ある範囲の濃度のエリスロマイシンを含む寒天プレート上に塗抹される前に、３時間の回復を与えられた。

得られたコロニーの数を下記の表９に示す。

これらのデータは、十分な誘導期間の必要性及びＲＡＭ３に比べてＲＡＭ２を用いると優れた効果が得られることを実証した。

実施例１４：更なる突然変異体の生成
我々は、その不活性化が容易に検出できる表現型に導く２つの遺伝子を標的とすることにした。これらはｐｙｒＦ及びｓｐｏ０Ａである。後者の***が胞子非形成を引き起こすのに対し、前者の不活性化はウラシル要求性を引き起こすと考えられる。

ｐＭＴＬ００７は、クロストリジウム・スポロジェンヌｓｐｏ０Ａ遺伝子を再標的とされ、クロストリジウム・スポロジェンヌの数百のＥｍ^ＲコロニーがＩＰＴＧ誘導の後にただちに得られた。ＤＮＡは４つの任意のコロニーから抽出され、ＰＣＲにおいてテンプレートとして用いられた。すべての場合において、ＲＡＭに固有のプライマーはｔｄイントロンの損失に一致するサイズのＤＮＡフラグメントを生成した（図１５）。

ｐＭＴＬ００７：：Ｃｓｐ‐ｓｐｏ０Ａ‐２４９ｓによるＲＡＭの明らかの機能性を実証して、我々は、３つすべてのクロストリジウム種において、メソッドセクションで概説されたプロトコルを用いて、２つの遺伝子（ｐｙｒＦ及びｓｐｏ０Ａ）の突然変異体を生成し始めた。Ｅｍ^Ｒクローン（図１５ｂ，ｃ）のＰＣＲスクリーニングは、対象とする染色体の部位への挿入の非常に高い頻度を明らかにし（表１０）、この方法を用いていかに容易に組込み体が得られるかを実証した。単離の後、組込み体のシングルコロニーがチアンフェニコール感受性表現型によるプラスミド損失の検査を受け、プラスミドがキュアリングされたコロニーは、更なる継代なしで、これらのすべての有機的組織体の中で優位であることがわかった。挿入部位は、イントロン‐エクソン接合を超えたシークエンシングにより検証され（表１０）、ＲＡＭに対する、プローブによるサザンブロッティングは、挿入要素の単一のコピーの存在を裏付けた（図１５ｄ，ｅ及びｆ）。

クロストリジウム・スポロジェンヌにおけるｐＭＴＬ００７：：Ｃｓｐ‐ｓｐｏ０Ａ‐２４９ｓからのイントロン発現のＩＰＴＧ誘導は、ｐＭＴＬ５４０１Ｆｃａｔからのレポーターデータと一致するように、１００倍以上挿入頻度を増加させた（表１０）。

イントロンの調整性発現が構成的発現に対して優位であることを確立するために、我々は、フレームシフト突然変異のｐＭＴＬ００７：：Ｃｓｐ‐ｓｐｏ０Ａ‐２４９ｓのｌａｃ遺伝子への導入により、ｆａｃプロモーターを非抑制化した。１０倍以上の更なる挿入頻度の増加が観察され（表１０）、イントロンの調整性発現は構成的発現に対して優位ではないことを示した。我々は、同等の実験をｐＭＴＬ００７：：Ｃａｃ‐ｓｐｏ０Ａ‐２４２ａを含むクロストリジウム・アセトブチリカムにおいて行い、ＩＰＴＧの追加によって組込み頻度に変化がないことを観察した（データ図示せず）。ｐＭＴＬ５４０１Ｆｃａｔレポーターデータに従って、この有機的組織体におけるｆａｃプロモーターからの基礎イントロン発現が明らかに容易に検出可能な組込み頻度を達成するのに十分であった。ｐＭＴＬ５４０１Ｆのように、ｐＭＴＬ００７は、抗生物質補充液体培地においてその接合完了体の成長を支持するには、クロストリジウム・ディフィシレにおいて不安定すぎた（Ｐｕｒｄｙ等（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：４３９‐４５２）。したがって、クロストリジウム・スポロジェンヌで行われたＩＰＴＧ誘導実験とのいかなる比較ＩＰＴＧ誘導実験も行われなかった。しかしながら、クロストリジウム・ディフィシレ及びクロストリジウム・アセトブチリカムの双方において、Ｅｍ^Ｒ組込み体は、接合完了体コロニーを、ＩＰＴＧの追加なしで、エリスロマイシンを含む成長媒体に単に再ストリーキングすることにより、容易に得ることができた。

予想したように、すべてのｓｐｏＡ突然変異体は内生胞子を形成することができなかった（図１６）。すべてのｐｙｒＦ突然変異体は５０μｇ／Ｌのウラシルを補充しない限り最少培地では成長することができなかった。我々は、３つすべてのクロストリジウム突然変異体をエリスロマイシン選択のない栄養豊富な溶液媒体で成長させ、その後、それらを最少寒天培地にウラシルと共に、又はウラシルなしで蒔くことにより、ウラシル原栄養性に復帰突然変異株を選択しようと試みた。少なくともこの３種の実験では、ウラシルを欠いた培地では復帰突然変異株は一切得られなかった。ウラシルで補完される媒体における細胞数の比較によって、細胞ごとの復帰頻度がクロストリジウム・ディフィシレにおいて９．３６×１０^−９未満、クロストリジウム・アセトブチリカムにおいて９．６０×１０^−７未満、クロストリジウム・ズポロジェンヌにおいて５．５０×１０^−９未満と評価された。これらの発見は、イントロン組込み体は非常に安定‐非常に望ましい突然変異体特性であることを示す文献（Ｆｒｚｉｅｒ等（２００３）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ。Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：１１２１‐１１２８）のデータと一致した。

実施例１５：他のターゲットに対するＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２体系の評価
標準プロトコルは、クロストリジウムにおいて再標的化のために以下のように作成された。
１． 対象の遺伝子に対するイントロン再標的化配列は、基本的にＴａｒｇｅｔｒｏｎ ^ＴＭ キットでＳｉｇｍａにより提供された方法に従って生成される：
Ｓｉｇｍａのウェブサイト［http://www.sigma-genosys.com/targetron］で提供されたコンピュータアルゴリズムが、対象の遺伝子の配列内で可能なイントロンターゲットを識別し、ＰＣＲプライマーを設計するのに用いられる。これらのプライマーは、その後、Ｓｉｇｍａ Ｔａｒｇｅｔｒｏｎ^ＴＭ プロトコルに従って使用され、Ｓｉｇｍａ Ｔａｒｇｅｔｒｏｎ^ＴＭキットで提供されるＰＣＲ試薬を使用して、イントロンの部分に対応し変性されたＩＢＳ，ＥＢＳ１ｄ及びＥＢＳ２配列を含む３５３ｂｐ ＰＣＲ生成物を生成し、これによりイントロンは対象の遺伝子を再標的化することができる。このＰＣＲ生成物はｐＣＲ２．１等の適当なクローニングベクターに複製され、その配列が検証される。あるいは、それはｐＭＴＬ００７に直接サブクローンされてもよい。

２． 原型クロストリジウム再標的化プラスミドｐＭＴＬ５４０２ＦｌａｃＺＴＴＲ２は、基本的にＴａｒｇｅｔｒｏｎ ^ＴＭ キットでＳｉｇｍａにより提供された方法に従って再標的化される。
工程１のＰＣＲ生成物がクローニングベクターに複製されたとすると、所望の再標的化配列が、制限エンザイムＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｒＧＩの消化により、そのプラスミドから切除され、同じエンザイムにより消化されるｐＭＴＬ５４０２ＦｌａｃＺＴＴＲ２に複製される。いずれの場合でも、結果として得られる構成体は限定解析及び／又はシーケニングにより検証される。

３． 良好に再標的化されたクロストリジウム再標的化プラスミドは、ターゲット有機的組織体に導入される。
組み換え型プラスミドは、電気形質転換又は接合のいずれかに基づく標準ＤＮＡ導入方法により、クロストリジウム宿主に導入されうる。いずれの方法も、Ｄａｖｉｓ Ｉ，Ｃａｒｔｅｒ Ｇ，Ｙｏｕｎｇ Ｍ及びＭｉｎｔｏｎ ＮＰ（２００５）の「Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ」、Ｉｎ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ（Ｄｕｒｒｅ Ｐ，ｅｄ）ｐｐ．３７‐５２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＵＳＡで提供される。我々の実験では、プラスミドはＥ．ｃｏｌｉドナーからの接合によりクロストリジウム・ディフィシレ及びクロストリジウム・スポロジェンヌに導入された。対照的に、プラスミドは形質転換によりクロストリジウム・アセトブチリカムに導入された。

４． 再標的化核酸発現及びそれに続く組込みは、ＩＰＴＧによる形質転換体の誘導によって達成される：
個々の形質転換細胞コロニーは、２５０μｇ／ｍｌのサイクロセリン及び７．５μｇ／ｍｌのチアンフェニコール（後者はプラスミドメンテナンスを補強する）が補充された１．５ｍｌの適当な成長媒体を植菌するのに用いられ、培地は嫌気的培養により３７℃で一晩、静止期まで成長させられる。この培地の１５０μｌが、同じタイプで同じ抗生物質を含む１．５ｍｌの未使用の培養液の植菌に用いられ、その後、３７℃で嫌気的に培養される。培地の中で増殖が視認されるとすぐに、典型的には１時間後に、培地は１ｍＭのＩＰＴＧに誘導され、３時間培養される。

５． 再標的化核酸組込み体は、回復工程に続く細胞の選択溶液培地への植菌及び培養によって検出され、単離される。
１分間７０００ｒｐｍの遠心分離により２ｍｌの誘導細胞が採取され、ＰＢＳにおける再懸濁により洗浄され、もとの通り採取される。沈殿物は同量（２ｍｌ）のサプルメントなしの適当な成長媒体に再懸濁され、３７℃で３時間嫌気的に培養される。その後、培地の連続希釈物が、１〜１０μｍ／ｍｌのエリスロマイシンが補充された適当な固体成長メディア（生育培地）に蒔かれ、３７℃で嫌気的に培養される。再標的化核酸組込み体クローンに対応するエリスロマイシン耐性コロニーは、使用された有機的組織体及びエリスロマイシン濃度に応じて、１８〜４８時間後にこれらのプレートから集められる。

任意に、組込み事象の頻度を決定するために、培地の連続希釈物が、追加的に薬物が加えられていない固体成長媒体又はエリスロマイシンの代わりに１５μｇ／ｍｌのチアンフェニコールが補充された固体成長媒体に蒔かれてもよい。

表１１に示すように、クロストリジウム突然変異体を作るのに標準プロトコルが使用された。

再標的化が不十分な場合もあった。したがって、いかなる所定の遺伝子も破壊するために複数の標的化部分を試すことが勧められる。更に、コロニーは、混合バッチのＰＣＲスクリーニングの前にプールされうる。もし、約１０又は１００コロニーの一部分が混合されて、再標的化された突然変異体のために予想されるサイズのＰＣＲ生成物が生成されると、その後、コロニーは個々にスクリーニングされることができる。

実施例１６：更なる突然変異体の生成
前記方法の利便性を更に確立するために、我々は前述の３つの種それぞれからいくつかの他の遺伝子を選択して、突然変異生成手順を繰り返した。標的化された遺伝子は表１２に挙げられており、ｐＭＴＬ００７のグループＩＩイントロンの組み換えのための標準プロトコルに従ってＰＣＲ生成物を生成するのに使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、表４又は表１４に示されている。すべての場合において、所望の組込み体が得られた。各挿入はＰＣＲスクリーニングにより確認され、挿入ポイントはヌクレオチドシーケニングにより検証された。

実施例１７：ｃａｔＰベースのＲＡＭの構造
クロラムフェニコール又はチアンフェニコールに耐性を与える代替的な変性選択可能マーカー遺伝子、すなわちｃａｔＰを含むＲＡＭが構成される。

ｃａｔＰ ＯＲＦは、プライマー伸長法を用いてｃａｔＰ ＯＲＦの５’にｔｄイントロン及びリンカーの小部分を加える、プライマー ｌｉｎｋｅｒ‐ｃａｔＰ‐Ｆ ５’‐ＡＴＡＣＴＣＡＧＧＣＣＴＣＡＡＴＴＡＡＣ‐ＣＣＡＡＧＡＧＡ‐ＴＧＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＴＧＧＴＡＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＴＴＧＧＡＡＣＡＧ‐３’（配列番号１３０）及びｃａｔＰ‐ＭｌｕＩ‐Ｒ１ ５’‐ＡＴＡＣＧＣ‐ＧＴＴＴＡＡＣＴＡＴＴＴＡＴＣＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＡＴＴＣＧＴＴＴＡＣＡＡＡＡＣＧＧＣ‐３’（配列番号１３１）を用いて、ｐＭＴＬ５４０２ＦプラスミドＤＮＡテンプレートからＰＣＲ増幅された。

ＰＣＲ生成物は、ＳｔｕＩ及びＭｌｕＩにより消化された。ｔｈｌプロモーター、リンカー及びｔｄグループＩイントロンの大部分を含むＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２の部分は、ｐＣＲ２．１：：ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２からＳｐｅＩ／ＳｔｕＩフラグメントとして切除された。これら２つの制限フラグメントは、共に、ＳｐｅＩ及びＭｌｕＩに線形化されたｐＣＲ２．１：：ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２に結紮され、新たなＲＡＭ要素ＲＡＭ‐Ｃ１を含むプラスミドｐＣＲ２．１：：ＲＡＭ‐Ｃ１を産出した。

ＲＡＭ‐Ｃ１におけるｃａｔＰ ＯＲＦのすぐ前の配列は、ＥｒｍＢｔｄＲＡＭ２におけるｅｒｍＢ ＯＲＦのすぐ前の配列と同一であり、ｔｈｌプロモーター、リンカー及びｔｄグループＩイントロンを含む。全体のＲＡＭ‐Ｃ１要素は、ＭｌｕＩ部位と隣り合っており、ＲＡＭとしての使用のために、Ｌ１．ＬｔｒＢイントロンのＭｌｕＩ部位へのサブクローニングを促進する。

ＲＡＭ‐Ｃ１又はその派生物は、ｐＭＴＬ００７に類似するプラスミドにおいてＲＡＭ要素として使用されることができ、チアンフェニコール又はクロラムフェニコール耐性の取得に基づいて、クロストリジウムにおける再標的化事象を選択する。宿主中でプラスミドを維持することを要求される選択可能マーカーは、ＲＡＭにより与えられる耐性と異なる薬剤に対する耐性を与えなければならないと認められる。したがって、ｐＭＴＬ００７は、そのｃａｔＰ選択可能マーカーのクロストリジウムに有効なｅｒｍＢ等の異なる選択可能マーカーとの置き換えにより変性される。このようにして変性されたプラスミドは、クロストリジウムの再標的化に用いることができる。

ここに記載したように、選択可能マーカーをコードする領域に動作可能に結ばれるプロモーターは、選択可能マーカー遺伝子の単一のコピーに、選択可能マーカーがクロストリジウム細胞の表現型を選択可能マーカー遺伝子が欠如したクロストリジウム細胞から識別できるように変更するのに十分な量でコードされる選択可能マーカーの発現を起こすことができなければならない。ＲＡＭ‐Ｃ１要素におけるｔｈｌプロモーターがこの基準を満たさない場合は、ここに開示される方法を用いて置き換え又は変性されてもよい。同様に、ｔｄグループＩイントロンの位置が、選択可能マーカーがＲＡＭに存在するときにその発現を妨害するのに又は選択可能マーカーがＲＡＭからスプライスされたときにその発現を許可するのに不適である場合、その位置は変更されてもよい。ＲＡＭの要素の機能は、Ｋａｒｂｅｒｇ等（２００１）により開発された２プラスミドシステム（実施例５参照）を用いてテストされてもよい。最後に、ＲＡＭ‐Ｃ１又はその派生物は、クロストリジウムにおける再標的化突然変異体を生成するのに用いることができるであろう。

Claims (40)

1. ＤＮＡ分子であって、
   イントロンコード逆転写酵素を発現しないが、変性されたグループIIイントロンと逆方向の変性された選択可能マーカー遺伝子を含む前記変性されたグループIIイントロンであって、前記選択可能マーカー遺伝子は選択可能マーカーをコードする領域及び前記領域に動作可能に結合されたプロモーターを有し、前記プロモーターは、前記選択可能マーカー遺伝子の単一のコピーに、前記選択可能マーカーがクロストリジウム綱の細菌性細胞の表現型を、前記選択可能マーカー遺伝子が欠如したクロストリジウム綱の細菌性細胞から識別することができるように変更するのに十分な量でコードされる選択可能マーカーの発現を起こすことができる、前記変性されたグループIIイントロンと、
   前記変性されたグループIIイントロンの転写のためのプロモーターであって、前記変性されたグループIIイントロンに動作可能に結合された前記プロモーターと、
   を有し、
   前記変性された選択可能マーカー遺伝子は、前記選択可能マーカー遺伝子の発現を妨害することができるように、前記変性されたグループIIイントロンに対して順方向に位置するグループＩイントロンを含み、
   前記ＤＮＡ分子は、前記グループIイントロンが前記変性されたグループIIイントロンのＲＮＡ転写体から除去されて前記選択可能マーカーをコードする領域を残すことを可能とし、前記ＲＮＡ転写体又はそのＤＮＡコピーをクロストリジウム綱の細菌性細胞におけるＤＮＡ分子の部位に挿入することを可能にする、ＤＮＡ分子。
2. 前記変性されたグループIIイントロンの傍らにはエクソンが位置し、前記エクソンは前記グループIIイントロンの前記ＲＮＡ転写体のスプライシングを可能とする、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
3. 前記変性されたグループIIイントロンは標的化部分を有する、請求項１又は２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
4. 前記標的化部分は、前記変性されたグループIIイントロンの前記ＲＮＡ転写体の、前記クロストリジウム綱の細菌性細胞におけるＤＮＡ分子の範囲内の部位への挿入を可能とする、請求項３に記載のＤＮＡ分子。
5. 前記部位は選択された部位である、請求項４に記載のＤＮＡ分子。
6. 前記ＤＮＡ分子はプラスミドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
7. 前記プラスミドは大腸菌クロストリジウムシャトルベクターである、請求項６に記載のＤＮＡ分子。
8. 前記大腸菌から前記クロストリジウム鋼の細菌性細胞への接合伝達を可能とするタンパク質をコードする遺伝子を更に有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
9. 前記選択可能マーカーをコードする前記領域に動作可能に接合された前記プロモーターは、クロストリジウム・アセトブチリカムのｔｈｌ，ｐｔｂ若しくはａｄｃ遺伝子又はクロストリジウム・パーフリンジェンスのｆｄｘ若しくはｃｐｅ遺伝子のプロモーターである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
10. 前記選択可能マーカーは、前記選択可能マーカー遺伝子が欠如した前記クロストリジウム綱の細菌性細胞と比較して、前記選択可能マーカーが発現する前記クロストリジウム綱の細菌性細胞に増殖優位性を与える、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
11. 前記選択可能マーカーは、前記クロストリジウム綱の細菌性細胞にエリスロマイシン耐性又はクロラムフェニコール耐性を与える、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
12. 前記グループIイントロンは、前記選択可能マーカーをコードする前記領域の範囲内又はその上流に位置する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
13. 前記変性されたグループIIイントロンに動作可能に結合する前記プロモーターは誘導プロモーターである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
14. 前記誘導プロモーターは、ＩＰＴＧ又はキシロース誘導性である、請求項１３に記載のＤＮＡ分子。
15. プロモーターに動作可能に接続されているが前記変性されたグループIIイントロンに含まれないグループIIイントロンコード逆転写酵素をコードする、オープンリーディングフレームを更に有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
16. 請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子と、
    グループIIイントロンコード逆転写酵素を発現することができるＤＮＡ分子と、
    を有するパーツキット。
17. 核酸分子をクロストリジウム綱の細菌性細胞におけるＤＮＡ分子の部位に導入することができる方法であって、
    （ｉ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子と、グループIIイントロンコード逆転写酵素を発現することができるＤＮＡ分子と、をクロストリジウム綱の細菌性細胞に提供する工程と、
    （ｉｉ）前記細菌性細胞を、前記変性されたグループIIイントロンの前記ＲＮＡ転写体からの前記グループＩイントロンの除去と、前記選択可能マーカー遺伝子又はそのＤＮＡコピーを含む前記ＲＮＡ転写体の前記部位への挿入を可能とする条件下で培養する工程と、
    を有する、方法。
18. 前記選択可能マーカーを発現することができる条件下で前記クロストリジウム綱の細菌性細胞を培養する工程を更に有する、請求項１７に記載の方法。
19. 前記選択可能なマーカーにより与えられた変化した表現型に基づいて前記クロストリジウム綱の細菌性細胞を選択する工程を更に有する、請求項１８に記載の方法。
20. 請求項１７で得られた細胞より生じた細胞の単一のクローンを単離する工程を更に有する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記グループIIイントロンコード逆転写酵素を発現することができる前記ＤＮＡ分子は、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の前記ＤＮＡ分子と同一である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記クロストリジウム綱の細菌性細胞はクロストリジウム属のものである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
23. 前記クロストリジウム属である前記細胞はクロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ディフィシレ、ボツリヌス菌、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ベイジェリンキー、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・セルリチカム又はクロストリジウム・セプティカムである、請求項２２に記載のＤＮＡ分子。
24. 前記クロストリジウム綱の細菌性細胞における前記ＤＮＡ分子の前記部位は、遺伝子の範囲内又は遺伝子の発現に影響を及ぼすＤＮＡの部分に位置する、請求項１〜１５，２２又は２３のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
25. 前記部位は、細菌ゲノムの範囲内に位置する、請求項１〜１５若しくは２２〜２４のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
26. 前記クロストリジウム綱の細菌性細胞はクロストリジウム属のものである、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記クロストリジウム属である前記細胞はクロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ディフィシレ、ボツリヌス菌、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ベイジェリンキー、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・セルリチカム又はクロストリジウム・セプティカムである、請求項２６に記載の方法。
28. 前記クロストリジウム綱の細菌性細胞における前記ＤＮＡ分子の前記部位は、遺伝子の範囲内又は遺伝子の発現に影響を及ぼすＤＮＡの部分に位置する、請求項１７〜２１、２６、又は２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記部位は、細菌ゲノムの範囲内に位置する、請求項１７〜２１又は２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 請求項１〜１５のいずれか一項に記載の前記ＤＮＡ分子を有する前記クロストリジウム綱の細菌性細胞を提供する工程は、前記ＤＮＡ分子を前記クロストリジウム綱の細菌性細胞に形質導入若しくは転移する工程、又は前記ＤＮＡ分子をドナー細菌性細胞から前記細菌性細胞にトランス接合させる工程を有する、請求項１７〜２１又は２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
31. 核酸分子をクロストリジウム綱の細菌性細胞におけるＤＮＡ分子の選択部位に標的化させる方法であって、
    （ｉ）請求項３に記載のＤＮＡ分子と、グループIIイントロンコード逆転写酵素を発現することができるＤＮＡ分子と、をクロストリジウム綱の細菌性細胞に提供する工程と、
    （ｉｉ）前記細菌性細胞を、前記変性されたグループIIイントロンの前記ＲＮＡ転写体からの前記グループＩイントロンの除去と、前記選択可能マーカー遺伝子又はそのＤＮＡコピーを含む前記ＲＮＡ転写体の前記選択部位への挿入を可能とする条件下で培養する工程と、
    を有する、方法。
32. 前記ＤＮＡ分子の前記選択部位は、遺伝子又は遺伝子の発現に影響を及ぼすＤＮＡの部分である、請求項３１に記載の方法。
33. 請求項１７〜２１又は２６〜３１のいずれか一項に記載の方法によって得られる、クロストリジウム綱の突然変異細菌性細胞。
34. エリスロマイシン耐性の発現を妨害するグループＩイントロンを含む変性されたエリスロマイシン耐性遺伝子を有するＤＮＡ分子であって、前記グループＩイントロンはエリスロマイシン耐性遺伝子に対して逆方向に位置し、前記グループＩイントロンが転写されるときは、ＲＮＡ転写物から自身を切除することができるＤＮＡ分子。
35. クロラムフェニコール耐性の発現を妨害するグループＩイントロンを含む変性されたクロラムフェニコール耐性遺伝子を有するＤＮＡ分子であって、前記グループＩイントロンはクロラムフェニコール耐性遺伝子に対して逆方向に位置し、前記グループＩイントロンが転写されるときは、ＲＮＡ転写物から自身を切除することができるＤＮＡ分子。
36. テトラサイクリン耐性の発現を妨害するグループＩイントロンを含む変性されたテトラサイクリン耐性遺伝子を有するＤＮＡ分子であって、前記グループＩイントロンはテトラサイクリン耐性遺伝子に対して逆方向に位置し、前記グループＩイントロンが転写されるときは、ＲＮＡ転写物から自身を切除することができるＤＮＡ分子。
37. スペクチノマイシン耐性の発現を妨害するグループＩイントロンを含む変性されたスペクチノマイシン耐性遺伝子を有するＤＮＡ分子であって、前記グループＩイントロンはスペクチノマイシン耐性遺伝子に対して逆方向に位置し、前記グループＩイントロンが転写されるときは、ＲＮＡ転写物から自身を切除することができるＤＮＡ分子。
38. プラスミドである、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
39. 請求項３４〜３８のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を有する宿主細胞。
40. クロストリジウム綱の突然変異体細菌性細胞の作成における、請求項１〜１５又は３４〜３８のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子の使用。

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