JP5717119B2 - L−乳酸の製造方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Description
グラム染色 +
カタラーゼ −
運動性 −
生育温度及び至適温度 10〜45℃ 至適温度30℃
初発pH及び至適pH pH5〜11 至適pH11
糖類発酵性
アルギン酸ナトリウム −
セルロース −
デキストリン +
フルクトース +
ガラクトース +
グルコース +
グリセリン +
ラクトース +
マルトース +
ラムノース +
デンプン −
スクロース +
D−キシロース −
岩手県産のワカメを分離源として、エンテロコッカス フェカリス(Enterococcus faecalis)W11菌株(受託番号FERM P−21943)を分離した。
乳酸菌の培養培地として、表1に示される組成のGYP白亜寒天培地を用いた。組成1を調整後、組成2を加え、オートクレーブ滅菌(121℃、15分)を行った。液体培地として用いる場合、組成2を除いたものをGYP液体培地として用いた。
NaCl濃度を7%に調整したGYP白亜寒天培地で、20〜25℃で1週間培養した場合に形成されるコロニーを観察した。エンテロコッカス フェカリス(Enterococcus faecalis)W11菌株を培養した場合に形成されるコロニーは、直径:1〜2mm、色調:白、形:円系、***状態:半レンズ状、周縁:全縁、表面の形状等:スムーズ、透明度:不透明、粘稠度:バター様、というものであった。
W11菌株のグラム染色、カタラーゼ試験、運動性試験、生育温度試験、初発pH試験、耐塩性・好塩性試験及び糖類発酵性試験を行った。以下の記載において、+は陽性を、−は陰性を意味する。糖類発酵性試験の結果は表2にまとめて示す。
グラム染色 +
カタラーゼ −
運動性 −
生育温度及び至適温度 10〜45℃ 至適温度30℃
初発pH及び至適pH pH5〜11 至適pH11
耐塩性 11%
糖類発酵性
アルギン酸ナトリウム −
セルロース −
デキストリン +
フルクトース +
ガラクトース +
グルコース +
グリセリン +
ラクトース +
マルトース +
ラムノース +
デンプン −
スクロース +
D−キシロース −
W11菌株の16S rRNA遺伝子全長(1444bp)の解析を行い、BLASTプログラムを用いた細菌基準株データベース及び国際塩基配列データベース(GenBank/DDBJ/EMBL)に対する相同性検索を行った。その結果、エンテロコッカス フェカリス(Enterococcus faecalis)と本菌株の相同性は100%であった。さらに、W11菌株の表現形質による分類学的性質も考慮して、本菌株は、エンテロコッカス フェカリス(Enterococcus faecalis)であると判断された。
GYP液体培地を用いて、W11菌株の前培養を行った。前培養は、30℃、一晩の条件下で行った。
参考例1
GYP液体培地のグルコースをグリセリンに変えてグリセリン1%(w/v)としたものをGYP改変液体培地(A)とした。この液体培地(5ml)に、得られた前培養液を1%植菌し、30℃の条件下で3日間、静置培養した。培養液を遠心分離(5000×g、15min、室温)した後、上清を熱失活(80℃、15min)させた。さらに遠心分離(8000×g、15min、室温)を行い、得られた上清をサンプルとし、D−乳酸及びL−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはF−キット(Roche社製)を用いた。結果を表2にまとめて示す。
培養条件を振とう培養(約115rpm)にした以外は参考例1と同様に培養し、D−乳酸及びL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表2にまとめて示す。
参考例3
GYP改変液体培地(A)5mlに、得られた前培養液を1%植菌し、30℃の条件下で3日間、静置培養した。培養液を遠心分離(5000×g、15min、室温)した後、上清を熱失活(80℃、15min)させた。さらに遠心分離(8000×g、15min、室温)を行い、得られた上清をサンプルとし、D−乳酸及びL−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはF−キット(Roche社製)を用いた。結果を表3にまとめて示す。
GYP改変液体培地(A)のNaCl濃度を3%に調整した以外は参考例3と同様に培養し、D−乳酸及びL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表3にまとめて示す。
GYP改変液体培地(A)のNaCl濃度を6%に調整した以外は参考例3と同様に培養し、D−乳酸及びL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表3にまとめて示す。
GYP改変液体培地(A)5mlに、得られた前培養液を1%植菌し、25℃で3日間、静置培養した。培養液を遠心分離(5000×g、15min、室温)した後、上清を熱失活(80℃、15min)させた。さらに遠心分離(8000×g、15min、室温)を行い、得られた上清をサンプルとし、D−乳酸およびL−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはF−キット(Roche社製)を用いた。結果を表4にまとめて示す。
培養温度を30℃にした以外は参考例6と同様に培養し、D−乳酸およびL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表4にまとめて示す。
培養温度を37℃にした以外は参考例6と同様に培養し、D−乳酸およびL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表4にまとめて示す。
培養温度を45℃にした以外は参考例6と同様に培養し、D−乳酸およびL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表4にまとめて示す。
参考例10
GYP液体培地から無機塩類を除き、さらにグルコースをグリセリンに変えてグリセリン1%(w/v)としたものをGYP改変液体培地(B)とした。このGYP改変液体培地(B)に塩酸を用いて、pH6に調整し、フィルターろ過によって滅菌した。それぞれの液体培地(5ml)に前培養液を1%植菌し、30℃の条件下で3日間静置培養した。培養液を遠心分離(5000×g、15min、室温)した後、上清を熱失活(80℃、15min)させた。さらに遠心分離(8000×g、15min、室温)を行い、得られた上清をサンプルとし、D−乳酸およびL−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはF−キット(Roche社製)を用いた。結果を表5にまとめて示す。
GYP改変液体培地(B)にNaOHを用いて、pH7に調整した以外は参考例10と同様に培養し、D−乳酸およびL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表5にまとめて示す。
GYP改変液体培地(B)にNaOHを用いて、pH8に調整した以外は参考例10と同様に培養し、D−乳酸およびL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表5にまとめて示す。
GYP改変液体培地(B)にNaOHを用いて、pH9に調整した以外は参考例10と同様に培養し、D−乳酸およびL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表5にまとめて示す。
GYP改変液体培地(B)にNaOHを用いて、pH10に調整した以外は参考例10と同様に培養し、D−乳酸およびL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表5にまとめて示す。
GYP改変液体培地(B)にNaOHを用いて、pH11に調整した以外は参考例10と同様に培養し、D−乳酸およびL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表5にまとめて示す。
培養条件を振とう培養(約115rpm)にした以外は参考例15と同様に培養し、D−乳酸およびL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表5にまとめて示す。
参考例17
GYP改変液体培地(A)にNaOHを加えて、pH11に調整した。この液体培地(50ml)に、前培養液を1%植菌した。坂口フラスコを用いて、30℃の条件下で3日間、振とう培養(約115rpm)を行った。培養液を遠心分離(5000×g、15min、室温)した後、上清を熱失活(80℃、15min)させた。さらに遠心分離(8000×g、15min、室温)を行い、得られた上清をサンプルとし、D−乳酸及びL−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはF−キット(Roche社製)を用いた。結果を表6にまとめて示す。
培養条件を、500mlのバッフル付き三角フラスコを用い、無通気の条件下で、液体培地(100ml)が撹拌される程度の緩やかな振とう培養(約70rpm)を行った以外は参考例17と同様に培養し、D−乳酸及びL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表6にまとめて示す。
培養条件を、200mlのバッフル付き三角フラスコ及び撹拌子を用い、無通気の条件下で、液体培地(100ml)を撹拌培養(約120rpm)した以外は参考例17と同様に培養し、D−乳酸及びL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表6にまとめて示す。
実施例1
GYP液体培地から無機塩類及び炭素源(グルコース)を除き、炭素源としてバイオディーゼル廃液(株式会社 総社技術コンサルタント提供)を1%(w/v)加え、オートクレーブ滅菌した。用いたバイオディーゼル廃液の組成は、グリセリンが約39質量%、メタノールが約30質量%であった。培地のpHは7.8であった。このGYP改変液体培地に(100ml)に、前培養液を1%植菌した。30℃の条件下で3日間、スターラーを用いた撹拌培養を行った。培養液を遠心分離(5000×g、15min、室温)した後、上清を熱失活(80℃、15min)させた。さらに遠心分離(8000×g、15min、室温)を行い、得られた上清をサンプルとし、D−乳酸及びL−乳酸の生成量の測定を行った。測定にはF−キット(Roche社製)を用いた。結果を表7にまとめて示す。
バイオディーゼル廃液を2%(w/v)加え、培地のpHが8.3であった以外は実施例1と同様に培養し、D−乳酸及びL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表7にまとめて示す。
バイオディーゼル廃液を3%(w/v)加え、培地のpHが8.6であった以外は実施例1と同様に培養し、D−乳酸及びL−乳酸の生成量の測定を行った。結果を表7にまとめて示す。
Claims (3)
- 炭素源としてグリセリンを含有する原料を用いてエンテロコッカス フェカリス(Enterococcus faecalis)にL−乳酸を生産させるに際し、前記エンテロコッカス フェカリスがエンテロコッカス フェカリス W11(受託番号FERM P−21943)であり、生産させる乳酸がL−乳酸のみであり、前記炭素源のうち50質量%以上がバイオディーゼル廃液由来のグリセリンであることを特徴とする、L−乳酸の製造方法。
- 原料のNaCl濃度が0.1質量%〜飽和濃度である請求項1記載のL−乳酸の製造方法。
- 原料のpHが7.5以上である請求項1又は2記載のL−乳酸の製造方法。
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