JP5704684B2 - IgG4関連疾患診断用マーカー及びその利用 - Google Patents
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Description
本発明において、用いられる検体は特に限定されないが、たとえば末梢血を用いることができる。
1)表1及び表2に記載の遺伝子群から選ばれる遺伝子に特異的にハイブリダイズし、当該遺伝子を増幅するためのプライマー
2)表1及び表2に記載の遺伝子群から選ばれる遺伝子に特異的にハイブリダイズし、当該遺伝子を検出するためのプローブ
3)表1及び表2に記載の遺伝子群から選ばれる遺伝子に特異的にハイブリダイズし、当該遺伝子を検出するためのプローブを固定した固相化試料
4)蛋白質シンボルCLUS、ALTA、PEDF、DCD、及びSAA4からなる群から選ばれる蛋白質に特異的に結合する抗体、リガンド、又は受容体分子。
1)被験者から単離された検体における、表1と表2記載の遺伝子群、及び/又は蛋白質シンボルCLUS、ALTA、PEDF、DCD、及びSAA4からなる蛋白質群の発現量を入力する手段と、
2)予め入力されたIgG4関連疾患患者および健常人の前記遺伝子群、及び/又は蛋白質群の発現量に関するデータを記憶する手段と、
3)前記被験者における前記遺伝子群、及び/又は蛋白質群の発現量と前記健常人における前記遺伝子群、及び/又は蛋白質群の発現量を比較解析する手段と、
4)前記解析結果に基づき、当該被験者がIgG4関連疾患の罹患あるいは病態を評価する手段と、
5)前記評価結果を出力する手段。
IgG4関連疾患は、シェーグレン症候群、キャッスルマン病、悪性リンパ腫、自己免疫性膵炎、硬化性胆管炎、後腹膜線維症、炎症性偽腫瘍、キュツナー腫瘍、間質性腎炎、各臓器癌などと診断されてきた症例に存在する共通の“疾患群”である。
当初、いわゆるミクリッツ病及びミクリッツ病の徴候は呈していなくても、血清IgG4高値(>135mg/dl)かつ特徴的な組織像を呈する58例をIgG4関連疾患と診断した。IgG4関連疾患を典型的シェーグレン症候群症例と比較解析した結果、以下に示すIgG4関連疾患の特徴が明らかになった。
IgG4関連ミクリッツ病もシェーグレン症候群も著明なリンパ球浸潤を認めるが、IgG4関連ミクリッツ病では、リンパ瀘胞を形成するほどリンパ球浸潤が華々しい反面、唾液腺導管へのリンパ球浸潤が少なく導管の構造が保たれている。すなわち、シェーグレン症候群のようにリンパ上皮性病変を形成しないことが、涙腺や唾液腺の腫脹が著明な割に、乾燥症状が少ない理由である可能性がある。最も重要な相違は、IgG4関連疾患ではIgG4陽性形質細胞の著明な浸潤(IgG4陽性細胞/IgG陽性細胞が50%以上)が認められるが、シェーグレン症候群では殆ど認められないことである。多くの症例は多クローン性のB細胞増殖であり、免疫ブロブリンのκ鎖、λ鎖が同等に染色される。
片側性の硬化性顎下腺炎であるキュツナー腫瘍もIgG4関連疾患であることが判明している。ミクリッツ病とキュツナー腫瘍の両者はIgG4関連疾患としての唾液腺炎であるという点で共通している。キュツナー腫瘍の組織は非常に強い線維性硬化性病変が存在し、その中にIgG4陽性形質細胞が認められる。一方、ミクリッツ病ではそれほど線維化は強くないことが多い。しかし、一般的に***小唾液腺生検で診断されるミクリッツ病では線維化が軽く評価されている傾向にあり、両者に厳密な境界を設けることは難しい。
1961年のSarlesらによる自己免疫機序による慢性膵炎の報告、1978年のNakanoらによるシェーグレン症候群に合併し、ステロイドにより改善した腫瘤形成性膵炎の報告、1991年のKawaguchiらによる自己免疫性膵炎の特徴的な病理所見としてLymphoplasmacytic sclerosing pancreatitis (LPSP)の報告に続き、1995年にYoshidaらによって、高γグロブリン血症、各種自己抗体の存在、膵組織へのリンパ球浸潤、他の自己免疫性疾患の合併、良好なステロイド反応性等の特徴を持つ自己免疫性膵炎の疾患概念が提唱された。その後、2001年HamanoらによるIgG4上昇の発見があり(前掲)、厚生労働省難治性膵疾患調査研究班の精力的な研究により、自己免疫性膵炎はIgG4関連疾患と考えられるようになった。
IgG4関連疾患の腎病変には、後腹膜線維症に伴う水腎症や腎盂・尿管腫瘍などの腎実質病変以外の場合も存在するが、腎実質病変の代表は間質性腎炎である(IgG4関連間質性腎炎)。IgG4関連間質性腎炎は、他の間質性腎炎に比べ、膵炎、唾液腺炎、リンパ節炎などの腎外性病変の合併が多く、IgG4関連疾患の中では低補体血症頻度が高い。画像上は、腎に腫瘤や多発結節など不均一な陰影を認めることが多く、他の間質性腎炎ではみられない所見である。病理学的には腎尿細管間質に多数のリンパ球、形質細胞の浸潤と線維化を認め、IgG4免疫染色で多数のIgG4陽性形質細胞が確認される。糸球体には著変がないとの報告が多いが、膜性腎症をはじめ糸球体病変の合併も報告されている。ほとんどの症例でステロイド(predonisolone 0.6-1.0mg/kg/日)が著効し、腎機能の改善が認められる。
肺のIgG4関連疾患と考えられる症例は、これまで炎症性偽腫瘍、間質性肺炎、器質化肺炎、lymphomatoid granulomatosisなどの診断名で報告されていたものが多い。それらを集計すると、男性優位(80.5%)で年齢の中央値は65歳であり、IgG4関連疾患の特徴と似かよっている。乾性咳や呼吸困難など初発時の呼吸器症状を認めたものは少数で、75%の症例は無症状で偶然に胸部異常陰影として発見されている。画像上は、炎症性偽腫瘍型と間質性肺炎型に大別される。炎症性偽腫瘍型は、結節性あるいは腫瘤性病変、浸潤影などと表現され、腫瘤周辺に放射状に伸びる網状陰影が特徴である。間質性肺炎型は、両下肺野に網状影、すりガラス状陰影、間質性線維化を認める例が多い。
リンパ節病変を主体とするIgG4関連疾患の場合には、キャッスルマン病や特発性形質細胞性リンパ節症(IPL: idiopathic plasmacytic lymphadenopathy)との鑑別が問題となることがある。IgG4関連リンパ節症は好酸球の浸潤と血清IgEの上昇を伴い、IgG4陽性形質細胞の浸潤形態により、interfollicular plasmacytosis typeとintra-germinal center typeの2型に分類される。多中心性キャッスルマン病(multicentric Casteleman’s disease)の大きな違いは、IgG4関連リンパ節症に比べ、発症年齢が若いこと(43.3 vs 68.8 歳)、CRP高値であること(8.71 vs 0.29 mg/dl)、IL-6が高値であること(34.82 vs 8.45 pg/ml)である。
発明者らは、IgG4関連疾患患者末梢血リンパ球におけるmRNA量を、DNAマイクロアレイを用いて網羅的に解析することにより、病態関連遺伝子群の検索を行なった。具体的には、IgG4関連疾患患者(治療前後)と健常人から末梢血を採取し、その単核球から抽出したRNAを用いてDNAマイクロアレイ解析を行なった。そして、患者の治療前後において有意に発現が変動する遺伝子、及び患者と健常人間において有意に発現が異なる遺伝子群を抽出した。さらに抽出された各遺伝子について、リアルタイムPCRによるバリデーションを行った。
とくに、治療前後で発現が相違する表2に記載の遺伝子群は、病態評価のマーカーとして好ましい。
(1)Charcot-Leyden crystal protein (CLC)
CLCはβ-galactoside-binding lectin familyに属しており、ガレクチン-10とも呼ばれる。CLCは、長く好酸球、好塩基球におけるlysophospholipaseとして機能していると考えられていたが、最近はそれを否定する論文が報告されている。一方でCLCはガレクチンファミリーに属しており、ガレクチンはヒトでは15種類知られているが、その遺伝子をノックアウトした場合にみられる影響は、免疫、感染、炎症等に深く関係していることから、免疫系における機能が推定されている。
Defensinは哺乳類の代表的な抗菌ペプチドであり、その抗菌活性により自然免疫のエフェクター因子として機能している。ヒトではα-defensinとβ-defensinが存在するが、DEFA3がコードしているhuman neutrophil peptide-3(HNP-3)、DEFA4がコードしているHNP-4はα-defensinとして好中球のアズール顆粒中に大量に存在する。また単球において、HNP-1〜3はIL-8産生を誘導することが知られている。
CXCR-1及びCXCR-2が同定されている。ともに7回膜貫通三量体Gタンパク共役型受容体で、アミノ酸レベルで76%の相同性を示す。これらの受容体は好中球、好酸球、肥満細胞、CD8陽性T細胞、CD56陽性NK細胞及び単球の一部に発現している。
Interleukin-8は、IL-1やTNFといった炎症性サイトカインの刺激により、主に単球やマクロファージから産生されるケモカインである。CXCR-1、CXCR-2の両方にほぼ同様に作用し、主に好中球の遊走と活性化を促し、炎症反応を促進する。
この遺伝子はmembrane-spanning 4A(MS4A) gene familyに属する。MS4A3は造血系細胞において、好塩基球で最も優位に発現を認めるが、その他の顆粒球やB細胞、T細胞にも低いレベルで発現している。染色体の局在が、同じMS4A familyであるFcεRI抗原レセプターβ鎖(MS4A2)に近接しており、この染色体領域は有意にヒトアトピー表現型と関連していることが報告されている。MS4A3はアトピー喘息と強い関連を示し、アトピー遺伝子の候補であると考えられている。
発明者らは、IgG4関連疾患の治療前後及び健常人における血清中蛋白質を、プロテオミクス的手法により解析し、「IgG4関連疾患診断用マーカー蛋白質」として抽出した。
(1)クラステリン(CLUS:Clustering precursor)
ヒトクラステリンは、ジスルフィド結合で強く結合した、75〜80kDaヘテロ二量体性糖蛋白質である。クラステリンは、上皮細胞や神経細胞等、多くの細胞や母乳、血漿、尿等、体液性物質から分泌される主要蛋白質である。このように、クラステリンは体内に広範囲で存在するため、膜組織の再生や、リン脂質の輸送等、多くの生理的機能を起因する物質と考えられています。さらに、細胞死をプログラムする機能を持つ細胞外シャペロンとしての役割も示唆されています。また、腎臓変性疾患、前立腺癌、卵巣癌、アルツハイマー病等の神経性疾患等、重度の疾患の発症に関与しているとの報告もある。
代表的な急性相反応物質の一つ。欠損すると若年性肺気腫を引き起こすことが知られている蛋白質である。
網膜色素上皮より単離された分泌性蛋白。血管新生抑制、抗酸化作用、神経新生作用を有する。平滑筋細胞の増殖・遊走を抑制し、単球・T cell 活性化を抑制する。
抗菌ペプチドのひとつ。侵入した病原体に対し、直接的な抗菌作用をもつ。特にE.coli、E.faecalis、S.aureus、C.albicansに対しより強い抗菌作用を持つ。汗に含まれる。 アトピー性皮膚炎患者では、表皮の分化異常のため、抗菌ペプチドの発現が低下し、炎症があっても抗菌ペプチドがうまく誘導されない。
SAAは血中では高比重リポ蛋白(HDL)の構成アポ蛋白として存在する。最も増大率の高い炎症蛋白質。SAAには4種類のアイソタイプ(SAA1,SAA2,SAA3,SAA4:ヒトではSAA3は非発現)があり、このうちSAA1,SAA2がIL-1,IL-6,TNFなどの炎症性サイトカインに応答する急性相反応物質で、アミロイド原性蛋白である。SAA4はHDLの構成蛋白で、炎症時には変動しない。SAAは主に肝臓で産生されるが、その他末梢血単球や血管内皮細胞から産生されているという報告もある。
本発明のマーカー遺伝子及び本発明のマーカー蛋白質の発現量は、IgG4関連疾患の罹患、病態や予後を反映する。従って、検体中の前記遺伝子又は蛋白質の発現量を測定することにより、IgG4関連疾患の罹患の有無や病態を評価し、IgG4関連疾患の診断に利用することができる。
本発明のマーカー遺伝子を利用した診断方法は、例えば、以下の工程1)〜3)の工程により実施できる。
1)被験者から単離された検体(例えば、末梢血)より、全RNAを抽出する;
2)上記検体由来全RNAにおける、マーカー遺伝子の発現量を測定する;
3)上記各マーカー遺伝子の発現量に基づき、当該被験者のIgG4関連疾患の罹患あるいは病態を評価する。
工程1)における全RNAの抽出は、特に限定されず、例えば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法(Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159)等を採用することができる。抽出された全RNAはさらに精製してmRNAとして使用することが好ましい。
工程2)におけるマーカー遺伝子発現量は、工程1で得られた全RNA(あるいはmRNA)中におけるマーカー遺伝子(mRNA)の発現量を、マイクロアレイ(遺伝子チップ、cDNAアレイ)等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、次世代シーケンス解析法(パイロシーケンス、Sequencing by Ligationなどを利用した高速シーケンス)ならびにクロスハイブリダイゼーション法など公知の方法を用いて測定することができる。
工程3)における評価は、特定のマーカー遺伝子について個別に評価して行うことも可能であるが、複数のマーカー遺伝子について、その発現量の相違を総合的に評価(発現プロファイル解析)して行うことが好ましい。例えば、健常人血清に対する検体中のマーカー遺伝子群の発現プロファイルが、IgG4関連疾患患者血清における発現プロファイルと類似している場合、当該患者はIgG4関連疾患に罹患している可能性が高いと予測される。また、個々の患者について、該マーカー遺伝子の発現変動を経時的に観察すれば、該患者の病態、予後を評価(予測)することができる。
本発明のマーカー蛋白質を利用した診断方法は、例えば、以下の工程1)〜3)の工程により実施できる。
1)単離された検体(例えば、末梢血)中のポリペプチドを固相化する;
2)上記固相化ポリペプチドにおける、本発明の各マーカー蛋白質の発現量を該マーカー蛋白質に特異的に結合する抗体を用いて検出する;
3)上記各マーカー蛋白質の発現量に基づき、当該被験者のIgG4関連疾患の罹患あるいは病態を評価する。
工程1)において、単離された検体(例えば、末梢血や血清)は、必要に応じて高速遠心を行うことにより不溶性の物質を除去した後、以下のようにELISA/RIA用試料やウエスタンブロット用試料として調製する。
工程2)において、マーカー蛋白質発現量は、抗原抗体反応を利用した免疫学的方法を用いて測定することができる。
工程3)における評価は、特定のマーカー蛋白質について個別に評価して行うことも可能であるが、複数のマーカー蛋白質について、その発現量の相違を総合的に評価して行うことが好ましい。例えば、健常人血清に対する検体中のマーカー蛋白質群の発現プロファイルが、IgG4関連疾患患者血清における発現プロファイルと類似している場合、当該患者はIgG4関連疾患に罹患している可能性が高いと予測される。また、個々の患者について、マーカー蛋白質の発現変動を経時的に観察すれば、当該患者の病態、予後を評価(予測)することができる。
本発明はまた、IgG4関連疾患の診断用試薬又はキットを提供する。本発明のキットは、例えば、以下の1)〜4)の1又は2以上を含む:
1)表1及び表2に記載の遺伝子群から選ばれる遺伝子に特異的にハイブリダイズし、当該遺伝子を増幅するためのプライマー
2)表1及び表2に記載の遺伝子群から選ばれる遺伝子に特異的にハイブリダイズし、当該遺伝子を検出するためのプローブ
3)表1及び表2に記載の遺伝子群から選ばれる遺伝子に特異的にハイブリダイズし、当該遺伝子を検出するためのプローブを固定した固相化試料
4)蛋白質シンボルCLUS、ALTA、PEDF、DCD、及びSAA4からなる群から選ばれる蛋白質に特異的に結合する抗体、リガンド、又は受容体。
プライマーは、本発明のマーカー遺伝子を特異的に増幅するため、当該遺伝子の少なくとも一部に相補的な配列を有する5〜30塩基長の連続したオリゴヌクレオチドである。本発明のマーカー遺伝子の配列情報は、公共のデータベースであるGenBankやUnigeneに公表されている。プライマーは各マーカー遺伝子の塩基配列に基づき、市販のプライマー設計ソフトを用いるなど、常法にしたがい容易に設計し、増幅させて調製することができる。このようなプライマーの例としては、後述する実施例記載のオリゴヌクレオチドプライマーを挙げることができる。
プローブは、マーカー遺伝子に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、20〜1500塩基長程度のものが好ましい。具体的には、ノーザンハイブリダイゼーション法であれば、20塩基長程度の1本鎖オリゴヌクレオチドか2本鎖DNAが好適に用いられる。また、マイクロアレイであれば、100〜1500塩基長程度の2本鎖DNA、又は20〜100塩基長程度の1本鎖オリゴヌクレオチドが好適に用いられる。Affimetrix社のGene Chipシステムの場合は、25塩基長程度の1本鎖オリゴがよい。これらは、特に遺伝子の3’非翻訳領域に存在する配列特異性が高い部分に特異的にハイブリダイズするプローブとして設計することが好ましい。
固相化試料は、前記2)記載のプローブをガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ等の固相に固定することにより作製される。このような固相化試料としては、例えば、遺伝子チップ、cDNAアレイ、オリゴアレイ、メンブレンフィルター等を挙げることができる。
マーカー蛋白質に結合する抗体は、本発明のマーカー蛋白質のアミノ酸配列又はその部分配列(エピトープペプチド)にもとづき、常法にしたがって作製できる。
本発明は、本発明のIgG4関連疾患の検査方法を実施するためのプログラムや当該プログラムを用いた診断システムも提供する。
1)被験者から単離された検体における、表1と表2記載の遺伝子群、及び/又は蛋白質シンボルCLUS、ALTA、PEDF、DCD、及びSAA4からなる蛋白質群の発現量を入力する手段と、
2)予め入力されたIgG4関連疾患患者および健常人の前記遺伝子群、及び/又は蛋白質群の発現量に関するデータを記憶する手段と、
3)前記被験者における前記遺伝子群、及び/又は蛋白質群の発現量と前記健常人における前記遺伝子群、及び/又は蛋白質群の発現量を比較解析する手段と、
4)前記解析結果に基づき、当該被験者がIgG4関連疾患の罹患あるいは病態を評価する手段と、
5)前記評価結果を出力する手段、を有する。
IgG4関連疾患患者において健常人よりも発現が低下している本発明のマーカー遺伝子やマーカー蛋白質は、IgG4関連疾患の治療に利用できる可能性がある。
IgG4関連疾患患者において健常人よりも発現が低下しているマーカー遺伝子の全オープンリーディングフレーム配列を組換えベクター(gene transfer vector)に挿入し、心筋細胞で発現させることにより、IgG4関連疾患患者における当該遺伝子の発現低下を正常状態に回復できる可能性がある。
IgG4関連疾患患者において健常人よりも発現が低下しているマーカー遺伝子がコードする蛋白質を患者に投与することにより、IgG4関連疾患の治療できる可能性がある。
IgG4関連疾患患者において健常人よりも発現が増加しているマーカー遺伝子の翻訳を、アンチセンス核酸、リボザイム又はsiRNAを用いて阻止し、IgG4関連疾患患者における該遺伝子の発現上昇を正常状態に回復させることができる。
本発明のマーカー遺伝子を利用することにより、多数の被検物質から、IgG4関連疾患の治療又は予防剤としての可能性を有する物質を機能的に同定することができる。前記方法において、被験物質は(1)本発明のマーカー遺伝子の発現を亢進又は抑制させたときに現れる表現型の変化、あるいは、(2)ヒトIgG4関連疾患病態を反映した培養細胞又はモデル動物におけるマーカー遺伝子やマーカー蛋白質の発現量を指標として評価される。マーカー遺伝子やマーカー蛋白質は、元々細胞中に存在する内在性のものを利用してもよいし、人為的に導入した外来性のものを利用してもよい。以下、これらの試験方法について、具体的に説明する。
IgG4関連疾患関連遺伝子(IgG4関連疾患の病態依存的に発現が促進される遺伝子)のプロモーター支配下に、プロモーター活性の検出を可能にする遺伝子(以下「レポーター遺伝子」という)を組み込んだ発現プラスミドを作製する。次いで、
(i)上記レポーター遺伝子発現プラスミドと、本発明のマーカー遺伝子を哺乳類細胞で発現可能にした組換えベクターを同時トランスフェクションした群、
(ii)上記レポーター遺伝子発現プラスミドと、本発明のマーカー遺伝子を含まない上記組換えベクターを同時トランスフェクションした群、
の2つの細胞群を作製する。IgG4関連疾患の治療又は予防剤としての可能性は、各群の細胞培養時に被検試料を添加し、上記各群のレポーター遺伝子の発現量に差異が現れるか否かによって評価することができる。例えば、本発明のマーカー遺伝子によってコードされるマーカー蛋白質の産生が促進されるような条件下で、レポーター遺伝子の発現を強く抑制する被験試料は、IgG4関連疾患の治療又は予防剤として有用な可能性が高い。
a)クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ:
b)ホタルルシフェラーゼ:
c)β−ガラクトシダーゼ:
d)分泌型アルカリホスファターゼ:
e)緑色蛍光蛋白質(green-fluorescent protein):
適当な細胞に、本発明のマーカー遺伝子を強制発現させるか、本発明のマーカー蛋白質を外部から作用させる。これによって現れる、IgG4関連疾患につながると考えられる表現型の変化を確認し、その変化を指標として、IgG4関連疾患の治療又は予防剤として有用な物質として評価することができる。なお、表現型の変化としては、例えば、IgG4関連疾患病態関連遺伝子の発現変動、細胞の形態変化、総蛋白質の変化等を挙げることができる。
本発明のマーカー遺伝子を導入したトランスジェニック動物(例えば、マウス等)を作製し、高発現させることにより、ヒトIgG4関連疾患に類似した変化が現れれば、該動物を利用してIgG4関連疾患の治療や予防に有用な物質を探索することができる。あるいは、本発明のマーカー遺伝子に対するリボザイムやsiRNAを動物に導入して、ヒトIgG4関連疾患に類似した変化が惹起できれば、この動物を利用して、IgG4関連疾患の治療や予防に有用な物質を探索することができる。なお、本発明のマーカー遺伝子はヒト由来の遺伝子であるため、前記トランスジェニック動物の作製にあたっては、例えばマウスであれば、該遺伝子のマウスオーソログを取得してこれを導入することになる。
IgG4関連疾患患者末梢血リンパ球におけるmRNA量を網羅的に解析し、病態関連遺伝子群の検索、及び疾患特異的なマーカーの検索を行なった。
(1)試料の調製(RNAの抽出)
IgG4関連疾患患者2人の治療前後と健常人4人の末梢血を採取し、末梢血単核球をLymphoprepを用いて分離した。分離した末梢血単核球をRneasy Plus Miniを用いてRNAを抽出した。
抽出したRNAからAmbion WT Expression Kitを用いてcDNAを作製し、GeneChip WT Terminal Labeling and control kitを用いて断片化し、ラベルした。チップはAffymetrix社GeneChip Human Gene 1.0 ST Arrayを用い、データ取得はAffymetrix社GeneChip Operating Softwareにより行なった。
DNAマイクロアレイデータの解析はAgilent社GeneSpring version 11.0を利用した。
2.1 患者と健常人間で変動のあった遺伝子の抽出
患者2名における治療前後のデータ合計4セットと健常人4名分のデータを比較した。
まず、治療に関係なく患者と健常人間で発現の差が有意(t-検定p>0.05)で、かつ、1.5倍以上のFold Changeを満たす遺伝子群を候補遺伝子として抽出した(図1)。参考として、Fold Changeを2倍及び3倍まで拡大したグラフを図2及び3に示す。抽出された遺伝子群を表1にまとめて示す((A)FC 1.5以上2.0未満、(B)FC 2.0以上3.0未満、(C)FC 3.0以上)。
患者2名における治療前後のデータ合計4セットと健常人4名分のデータを比較した。
治療の前後において、3.0倍以上のFold Changeが2名の患者で共通して観察された遺伝子群と、K-means clusteringで治療前の患者でのみ変動が観察された遺伝子群を合わせて候補遺伝子として抽出した(図4)。抽出された遺伝子群を表2にまとめて示す。
前項で抽出された遺伝子のうち、Charcot-Leyden crystal protein (CLC) 、Defensin, alpha 3 (DEFA3) 、Defensin, alpha 4 (DEFA4) 、Interleukin 8 receptor, alpha (IL8RA, CXCR1) 、Interleukin 8 receptor, beta (IL8RB, CXCR2)、Membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 3 (MS4A3) についてリアルタイムPCRにより発現変動をみた。
TaqMan(R) Gene Expression Assays, Inventoried
Assay ID: Hs00960994_m1
Category: Defense/immunity protein
Gene Name: membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 3 (hematopoietic cell-specific)
Gene Group: Immunoglobulin receptor family member
Qty/Pkg: 250 uL Part Number: 4331182
Assay ID: Hs00414018_m1
Category: Defense/immunity protein
Gene Name: defensin, alpha 3, neutrophil-specific;defensin, alpha 1;defensin, alpha 1
Gene Group: Other defense and immunity protein
Qty/Pkg: 250 uL Part Number: 4331182
Assay ID: Hs00157252_m1
Category: Defense/immunity protein
Gene Name: defensin, alpha 4, corticostatin
Gene Group: Other defense and immunity protein
Qty/Pkg: 250 uL Part Number: 4331182
Assay ID: Hs00174146_m1
Category: Receptor
Gene Name: interleukin 8 receptor, alpha
Gene Group: G-protein coupled receptor
Qty/Pkg: 250 uL Part Number: 4331182
Assay ID: Hs00174304_m1
Category: Receptor
Gene Name: interleukin 8 receptor, beta
Gene Group: G-protein coupled receptor
Qty/Pkg: 250 uL Part Number: 4331182
Assay ID: Hs00171342_m1
Category: Molecular function unclassified
Gene Name: Charcot-Leyden crystal protein
Gene Group: Molecular function unclassified
Qty/Pkg: 250 uL Part Number: 4331182
IgG4関連疾患の診断治療のための疾患関連マーカー蛋白質を特定するため、「治療前」及び「治療後」の患者血清中蛋白質をプロテオミクス的手法により解析した。
IgG4関連疾患の「治療前」及び「治療後」の血清中蛋白質を二次元電気泳動により展開した。2次元電気泳動した蛋白質は、銀染色により呈色させ、「治療前」及び「治療後」に変動したスポットをピックし、in gel消化法により処理した。in gel消化法により得られたペプチドを、質量分析装置で解析し、蛋白質を同定した。
1) 等電点電気泳動
患者血清 5.0 mlに10倍量の冷アセトンを加えて、1 hr、−20℃で静置した。12000 rpm、r=10 cmで4 minで遠心し、蛋白質を沈殿させた。アセトンの量は、対象物の液量の10倍程度を用いた。
ゲルは、Ph3-10 Immobiline Drystrip gel (24cm) (Gelife Science)を用い、前記した450μlの蛋白質溶液を加え、GE healthcareのプロトコールにしたがい等電点電気泳動を行った。
等電点電気泳動の終了後、ゲルを水洗し、10mg/mlのDTT添加平衡化Bufferに浸漬して、室温で30分静置し、ジスルフィド結合を開裂させた。ついで、25mg/mlのヨードアセトアミド添加平衡化バッファーに浸漬して、室温の暗所で30分静置し、ジスルフィド結合の開裂部分をカルバミド修飾した。ゲルをSDS-PAGE用のゲル(アクリルアミド濃度12.5 %)に装着し、分子量マーカーを封入したゲルとともにアガロースゲルで固め、GE healthcareのプロトコールにしたがい、電気泳動を行った (展開距離20 cm) 。電気泳動終了後、銀染色で呈色させた。
電気泳動の終了後、Bio RadのDodeca kitを用いて銀染色を行った。銀染色の方法は、すべてBio Radのプロトコールに拠った。
「治療前」と「治療後」のゲル画像を比較し、変動した蛋白質を選定した。変動したスポットの質量分析により解析した。
IgG4関連疾患治療前の血清では、IgG1、IgG4、Ig lambda、Ig kappaの増加、Alpha-1-antitrypsin precursor、Apolipoprotein-L1、Complement 4、C1q、Serum amyloid A protein precursorなどの炎症性因子の増加がみられた。また、健常人と比べても異なるパターンがみられた。
特に発現が有意に変動した蛋白質は、Alpha-1-antitrypsin precursor(ALTA)、Clusterin precursor(CLUS)、Dermcidin precursor(DCD)、Serum amyloid A-4 protein prcursor(SAA4)、Pigment epithelium-derived factor precursor(PEDF)であった。
ウエスタンブロットにより、上記で特定された蛋白質のうち、Clusteringとα1 antitrypsinのバリデーションを行った。
1) SDS-PAGE:電気泳動により分子量の差で蛋白質を分離。
常法にしたがい均一ゲルを調製し、IgG4関連疾患患者血清試料タンパク量 4μgをPBSで溶解したものを載せた。2×SDS buffer 10μL を加え、95℃で5分間加熱後、氷冷した。その後、コールドルームで電気泳動を行った(ゲル1枚あたり30mA、250V、2時間)。
メタノールで前処理したPVDF膜( Hyoid-P )・ろ紙をトランスファーバッファー( Tris-Glycin Buffer+メタノール+DW )で10分間、平衡化させた。セミドライ式ブロッティング装置を組み立て、メンブレン1枚あたり30mA、250V、2時間トランスファーさせた。
ブロッティング済みメンブレンをブロッキングバッファー(5%スキムミルク+PBS-0.1%Tween)に浸し、室温で1時間振盪した。
ハイブリバッグにメンブレンを移し、1000倍希釈した1次抗体を加え、overnightで振盪した後、PBS-0.1%Tweenで5分間、3回洗浄した。
25000倍希釈したHorse-Radish Peroxidase標識2次抗体(anti Mouse IgG , HRP linked Whole Ab from sheep )を加え、1時間振盪した後、PBS-0.1%Tweenで5分間、5回洗浄した。
洗浄済みのメンブレンの余分なバッファーを除去し、ECL plus ウエスタンブロッティングシステム試薬をかけ、5分間放置した。検出試薬を除去し、X線フイルムに感光させ、検出を行った。結果を図11〜14に示す。
Clustering(precursor)とα1 antitrypsin(precursor)は、いずれも患者(治療前)において健常人よりも有意に高い発現が確認された。
Claims (13)
- 被験者のIgG4関連疾患の罹患の有無を判定する方法であって:
1)被験者から単離された末梢血中における、遺伝子シンボル CLC、DEFA3、DEFA4、IL8RA、IL8RB、及びMS4A3で示される遺伝子の発現量、及び/又は蛋白質シンボルCLUS及びALTAで示される蛋白質の発現量を測定し、
2)前記遺伝子の発現量、及び/又は蛋白質の発現量を、健常人における当該遺伝子、及び/又は当該蛋白質の発現量の平均値と比較解析し、
3)前記被験者における前記遺伝子の発現量が健常人における当該遺伝子の発現量の平均値に比較して低い場合、及び/又は、前記被験者における前記蛋白質の発現量が健常人における当該蛋白質の発現量の平均値に比較して高い場合、前記被験者はIgG4関連疾患に罹患している可能性が高いと判定することを特徴とする、前記方法。 - 前記被験者におけるCLC、IL8RA、及びIL8RBの発現量が健常人における当該遺伝子の発現量に比較してFold changeが2.0以上である場合に、前記被験者はIgG4関連疾患に罹患している可能性が高いと判定することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記被験者におけるCLC、IL8RA、及びIL8RBの発現量が健常人における当該遺伝子の発現量に比較してFold changeが3.0以上である場合に、前記被験者はIgG4関連疾患に罹患している可能性が高いと判定することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記蛋白質に加えて、さらに蛋白質シンボルPEDF、DCD、及びSAA4で示される蛋白質の発現量も比較解析し、前記被験者におけるこれら蛋白質の発現量が健常人における当該蛋白質の発現量に比較して高い場合、前記被験者はIgG4関連疾患に罹患している可能性が高いと判定することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 被験者のIgG4関連疾患の病態を判定する方法であって:
1)治療前及び治療後において、被験者から単離された末梢血中の遺伝子シンボル DEFA3、DEFA4、及びMS4A3で示される遺伝子の発現量、及び/又は蛋白質シンボルCLUS及びALTAで示される蛋白質の発現量を測定し、
2)治療前及び治療後における、前記遺伝子の発現量、及び/又は蛋白質の発現量を比較解析し、
3)治療後における前記遺伝子の発現量が、治療前における当該遺伝子の発現量に比較して高い場合、及び/又は、治療後における前記蛋白質の発現量が、治療前における当該蛋白質の発現量に比較して低い場合、前記被験者の病態は治療により改善されたと判定することを特徴とする、前記方法。 - 治療後における前記遺伝子の発現量が、治療前における当該遺伝子の発現量に比較してFold changeが2.0以上である場合に、前記被験者はIgG4関連疾患に罹患している可能性が高いと判定することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 治療後における前記遺伝子の発現量が、治療前における当該遺伝子の発現量に比較してFold changeが3.0以上である場合に、前記被験者はIgG4関連疾患に罹患している可能性が高いと判定することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 前記蛋白質に加えて、さらに蛋白質シンボルPEDF、DCD、及びSAA4で示される蛋白質の発現量も比較解析し、前記被験者における前記蛋白質の発現量が健常人における当該蛋白質の発現量に比較して高い場合、前記被験者はIgG4関連疾患に罹患している可能性が高いと判定することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 遺伝子の発現量が、マイクロアレイ、及びメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、次世代シーケンス解析法ならびにクロスハイブリダイゼーション法から選ばれるいずれかの方法によって測定されることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 蛋白質の発現量が、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ELISA法、質量分析法、プロテインチップ法、ビアコア(登録商標)を含む分子間相互作用解析法及びRIA法から選ばれるいずれかの方法によって測定されることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の1)〜4)のいずれか1又は2以上を含むIgG4関連疾患の診断用試薬又はキット:
1)遺伝子シンボルCLC、DEFA3、DEFA4、IL8RA、IL8RA、及びMS4A3で示される遺伝子にそれぞれ特異的にハイブリダイズし、当該遺伝子を増幅するためのプライマー
2)遺伝子シンボルCLC、DEFA3、DEFA4、IL8RA、IL8RA、及びMS4A3で示される遺伝子にそれぞれ特異的にハイブリダイズし、当該遺伝子を検出するためのプローブ
3)遺伝子シンボルCLC、DEFA3、DEFA4、IL8RA、IL8RA、及びMS4A3で示される遺伝子にそれぞれ特異的にハイブリダイズし、当該遺伝子を検出するためのプローブを固定した固相化試料
4)蛋白質シンボルCLUS及びALTAで示される蛋白質にそれぞれ特異的に結合する抗体。 - 以下の1)〜5)の手段を有するIgG4関連疾患の診断システム
1)被験者から単離された末梢血中の遺伝子シンボルCLC、DEFA3、DEFA4、IL8RA、IL8RA、及びMS4A3で示される遺伝子群、及び/又は蛋白質シンボルCLUS及びALTAで示される蛋白質群の発現量を入力する手段と、
2)予め入力されたIgG4関連疾患患者および健常人の末梢血中の前記遺伝子群、及び/又は蛋白質群の発現量に関するデータを記憶する手段と、
3)前記被験者における前記遺伝子群、及び/又は蛋白質群の発現量と前記健常人における前記遺伝子群、及び/又は蛋白質群の発現量を比較解析する手段と、
4)前記被験者における前記遺伝子の発現量が健常人における当該遺伝子の発現量に比較して低い場合、及び/又は、前記被験者における前記蛋白質の発現量が健常人における当該蛋白質の発現量に比較して高い場合、当該被験者がIgG4関連疾患の罹患している可能性が高いと判定する手段と、
5)前記評価結果を出力する手段。 - 以下の1)〜4)の手段を有するIgG4関連疾患の診断システム
1)治療前及び治療後において、被験者から単離された末梢血中の遺伝子シンボルDEFA3、DEFA4、及びMS4A3で示される遺伝子群、及び/又は蛋白質シンボルCLUS及びALTAで示される蛋白質群の発現量を入力する手段と、
2)治療前と治療後における前記遺伝子群、及び/又は蛋白質群の発現量を比較解析する手段と、
3)治療後における前記遺伝子の発現量が、治療前における当該遺伝子の発現量に比較して高い場合、及び/又は、治療後における前記蛋白質の発現量が、治療前における当該蛋白質の発現量に比較して低い場合、当該被験者の病態は治療により改善されたと判定する手段と、
4)前記評価結果を出力する手段。
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