JP5695049B2 - イマチニブ免疫アッセイ - Google Patents
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Description
を有するイマチニブ及びその塩、特にメシル酸イマチニブは、急性転化期、加速期又は慢性期のフィラデルフィア染色体陽性慢性骨髄性白血病の治療のための最も広く使用される化学治療薬の1つである(グリベックの添付文書、Novartis Pharmaceuticals Corporation、2004年7月)。
・器官機能
・遺伝的調節
・疾患状態
・年齢
・薬物間相互作用
・薬物摂取の時間
・コンプライアンス
を含む多くの要因に影響される。
[式中、Yは、有機スペーシング基であり、
Xは、前記アミノ基又はチオール基を介して前記担体に結合することが可能な末端官能基であり、
pは、0から1の整数である]の化合物又はその薬理活性塩とのコンジュゲートである免疫原を使用することによって、イマチニブ又はその薬理活性塩に特異的であり、N−デスメチルイマチニブと実質的に反応又は結合しない抗体が生成されることが判明した。加えて、これらの抗体は、その治療活性又は不活性イマチニブ代謝物のいずれとも実質的に交叉反応性を示さない。
本明細書全体を通じて、以下の定義が把握されるべきである。
抗体に基づく免疫アッセイにおいて、イマチニブのコンジュゲートは、抗体上の結合部位をめぐって試料中のイマチニブ及びその薬理活性塩と競合するように構成される。本発明の免疫アッセイにおいて、式IVの試薬は、式Iのイマチニブのアミド架橋上に形成された窒素置換イマチニブ誘導体である。式IVの化合物において、リンカースペーサは、この分子の「Y−X」部分を構成する。このリンカーX及びスペーサ−「Y」は、免疫アッセイのためのコンジュゲート及び抗体を生成するための免疫原を調製する上で従来的である。免疫アッセイのためのコンジュゲート及び抗体を生成するための免疫原を調製するのに利用される従来のスペーサ連結基のいずれかを式IVの化合物に利用することができる。当該従来のリンカー及びスペーサは、米国特許第5,501,987号及び米国特許第5,101,015号に開示されている。
[式中、X’は、前記アミノ基又はチオール基を介して前記担体に結合することが可能な官能性連結基であり、p及びYは以上の通りである]を有するハプテンに連結されている。
[式中、n及びoは0から6の整数であり、mは1から6の整数である]であり、アルキレンが特に好適なスペーシング基である。
[式中、R3は水素であるか、又はその結合酸素原子と一緒になって反応性エステルを形成し、R4は酸素又は硫黄である]である。基
は、イソシアネート又はイソチオシアネートであり得る。OR3によって形成される活性エステルとしては、N−ヒドロシキスクシンアミドなどのイミドエステル、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びp−ニトロフェニルエステルが挙げられる。しかし、アミン基と反応することができる任意の活性エステルを使用することができる。
である場合は、これらの化合物は、好ましくは、ポリマー又は免疫原性担体の遊離アミノ基と反応する。一方、式IVの化合物のXが式
のマレイミド基である場合は、この化合物は、好ましくは、免疫原を含むポリマー又はタンパク質担体上に存在し得るチオール(又はSH)基と反応して、式IV−Aの化合物のX’としてマレイミド官能基を生成する。
[式中、R15は、チオール保護基であり、
R3は、上記の通りであり、
vは、1から4の整数である]の化合物とを反応させることによって実施され得る。
である式IV−Aのコンジュゲート又は免疫原を生成する。
である。
[式中、p、Y及びXは上記の通りである]のハロゲン化物とを反応させて、式IVの化合物を形成することによって形成される。ハロゲン化物と、アミド上の窒素とを反応させる任意の従来の手段を、式Iのイマチニブ上のこのアミド位置に対する式VIIの化合物の縮合に利用することができる。式VIIの化合物におけるハロゲン化物に使用は、式Iの化合物上のアミド基との縮合によってこのような置換アミドを形成するための効率的な手段を提供する。
本発明は、また、上記免疫原を利用することによって生成されるイマチニブ又はその薬理活性塩に対するモノクローナル抗体を含む新規の抗体に関する。本発明によれば、本発明により生成されるこれらの抗体は、イマチニブ又はその薬理活性塩と選択的に反応し、イマチニブ及びその薬理活性塩に対する免疫アッセイを妨げるN−デスメチルイマチニブと反応しないことが判明した。N−デスメチルイマチニブと反応しない本発明の抗体の能力により、これらの抗体が、患者の体液試料におけるイマチニブ及びその薬理活性塩の存在を検出し、且つ/又はその量を定量するための免疫アッセイを提供する。
本発明によれば、式IVのこれらの化合物の免疫原から生成されるコンジュゲート及び抗体を、患者の試料におけるイマチニブ又はその薬理活性塩の決定のための試薬として利用することができる。この決定は、免疫アッセイを用いて実施される。式IVの化合物から形成された試薬コンジュゲートが、本発明に従って生成される抗体上の結合部位をめぐって試料中のイマチニブ又はその薬理活性塩と競合する任意の免疫アッセイを利用して、患者の試料におけるイマチニブ又はその薬理活性塩の存在を決定することができる。イマチニブ又はその薬理活性塩を含有する疑いのある試料中のイマチニブ又はその薬理活性塩に対して当該アッセイを実施するための方法は、(a)水性媒体試料と、(b)本発明に従って生成されたイマチニブ又はその薬理活性塩に対する抗体と、(c)式IVの化合物又はそれらの混合物から形成されたコンジュゲートとを合わせることを含む。試料と抗体との混合物に添加された既知量のコンジュゲートの特定の抗体に対する結合の阻害率を測定することによって、試料中のイマチニブ又はその薬理活性塩の量を決定することができる。未知の試料による既知量のコンジュゲートの当該結合の阻害率の結果と、イマチニブ又はその薬理活性塩の既知の標準溶液を利用することによって同一のアッセイで得られた結果とを比較する。未知の試料中のイマチニブ又はその薬理活性塩の量を決定するのに際して、試料、式IVの化合物から形成されたコンジュゲート及び抗体を任意の順序で加えることができる。
NaH 水素化ナトリウム
THF テトラヒドロフラン
DMF ジメチルホルムアミド
LiOH 水酸化リチウム
EDC 1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩
スルホ−NHS N−ヒドロキシスルホスクシンイミド
DMSO ジメチルスルホキシド
MeOH メタノール
CH2Cl2 ジクロロメタン
APCI 大気圧化学イオン化質量分析
TLC 薄層クロマトグラフィー
HOAc 酢酸
CHCl3 クロロホルム
HPLC 高圧液体クロマトグラフィー
ANS 8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸
HRP ホースラディッシュペルオキシダーゼ
TMB 3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン
TRIS トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩
BSA ウシ血清アルブミン
KLH キーホールリンペットヘモシアニン
PBS リン酸緩衝食塩水
diH2O 脱イオン水
15.4mMの二塩基性リン酸ナトリウム(Na2HPO4)
4.6mMの一塩基性リン酸ナトリウム(NaH2PO4)
(pH=7.2±0.10)
を含有する水溶液を有する。
メシル酸イマチニブの抽出
それぞれメシル酸塩として400mgのイマチニブを含有する14個のタブレットを、乳鉢及び乳棒を用いて微粉末に粉砕した。タブレットコーティングを最初に除去しなかった。粉砕タブレットの粉末を1500mLの10(体積)%のMeOH/CH2Cl2中で4時間撹拌した。メシル酸イマチニブを含有する粉砕タブレットからの混合物をセライトで濾過し、溶媒を取り除いて、メシル酸イマチニブを含有する7.14gの黄色固体を得た。メシル酸イマチニブを含有する黄色固体をエタノール中75mLの20(体積)%の加温クロロホルムに溶解させて、メシル酸イマチニブの溶液を生成し、次いで50mLの1:1エーテル:エタノール(体積:体積)を添加して、メシル酸イマチニブの溶液を濁らせた。氷で冷却して、メシル酸イマチニブの沈殿を誘導し、エーテルを徐々に加えることによってこの沈殿を継続的に進行させた。沈殿したメシル酸イマチニブをエーテルで層状にし、蓋をして終夜放置した。
イマチニブ遊離塩基の調製
例1で調製したメシル酸イマチニブ塩(1)(1.01g、1.71mmol)を250mLのジクロロメタンに添加して、メシル酸イマチニブの懸濁液を形成した。50mLの10%飽和NaHCO3水溶液を添加し、ジクロロメタン中メシル酸イマチニブの懸濁液と十分に混合して、有機層(ジクロロメタン)にイマチニブの遊離塩基を生成した。NaHCO3水溶液及びジクロロメタンから形成されたエマルジョンを濾過によって除去して、遊離塩基としてのイマチニブを含有するジクロロメタンの有機層及び水層を生成した。遊離塩基としてのイマチニブを含有するジクロロメタンの有機層を水層から分離した。有機層をNa2SO4/MgSO4で乾燥させた。イマチニブ遊離塩基を単離するために、有機層(ジクロロメタン)を濾過してNa2SO4/MgSO4を除去し、次いで取り除いて、イマチニブの遊離塩基を含有する固体を生成した。イマチニブ遊離塩基を含有する固体にトルエンを添加し、3回フラッシュ蒸発させ、次いで真空下で乾燥させていかなる残留水をも除去した。イマチニブの遊離塩基を白色固体として得て、例3で使用した。イマチニブの遊離塩基は、構造と一致する1H、13C NMR及びAPCIデータを示した。NMR帰属は、DQF−COSY実験に基づいていた。
イマチニブの酪酸エチルエーテルの調製
例2で調製したイマチニブの乾燥遊離塩基を窒素下で35mLの乾燥DMFに溶解させ、氷で冷却した。イマチニブを含有する混合物を効果的に撹拌し、固体の水素化ナトリウム(鉱油中60%の分散体、0.111g、2.78mmol、1.6当量)を1回で添加した。3.5mLのDMF中4−ブロモ酪酸エチル(0.59g、3.0mmol、1.8当量)の溶液を、シリンジを介して、イマチニブを含有する混合物に徐々に添加し、イマチニブ(2)の酪酸エチルエステルを生成するための反応を終夜進行させ、浴槽で周囲温度まで加温した。APCI(+)による反応混合物の現場分析は、それぞれイマチニブ(2)の酪酸エチルエステル、イマチニブ出発材料及びイマチニブの二酪酸エチルエステルに対応するm/z=608.3(100%)、494.2(30%)及び722.4(5%)amuを示した。反応混合物を100mLのジクロロメタンで希釈し、氷で冷却し、10mLの水でクエンチした。イマチニブの酪酸エチルエステルを含有するジクロロメタンと水層とを分離した。収率を高めるために、水層を3×50mLのジクロロメタン及び2×25mLの酢酸エチルで抽出した。イマチニブの酪酸エチルエステル誘導体を含有する合わせた有機フラクションを取り除いて、イマチニブ誘導体の混合物を残した。イマチニブの酪酸エチルエステルを単離するために、5〜50%のメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、100gのシリカゲル上で混合物をクロマトグラフィー処理した。得られたイマチニブ(2)の酪酸エチルエステルは、
を有した。
イマチニブ酪酸エチルエステルの加水分解
4−{[4−(4−メチル−ピペラジン−1−イルメチル)−ベンゾイル]−[4−メチル−3−(4−ピリジン−3−イル−ピリミジン−2−イルアミノ)−フェニル]−アミノ}−酪酸エチルエステル(2)(1.21g、2.0mmol、1当量)を60mLのTHFに溶解し、氷で冷却した。20mLの水中LiOH・H2O(0.28g、6.7mmol、3.4当量)の溶液を撹拌しながら滴加した。この加水分解反応を0℃で3時間インキュベートし、次いで終夜進行させながら室温まで加温して、遊離酸のイマチニブ酪酸を生成した。
1H NMR(dmso−d6、80℃)は、構造と一致する。
イマチニブのスルホ−NHS活性化エステルの調製
イマチニブ酪酸(3)をEDC及びスルホ−NHSとの反応によって誘導体化して、タンパク質に対する究極的なコンジュゲート(例6a、6b、7)のためのイマチニブのスルホ−NHS活性化エステルを生成した。撹拌した5mLの無水DMSOに化合物3(94mg、0.16mmol)を添加した後、EDC(94mg、0.49mmol)及びスルホ−NHS(107mg、0.49mmol)を添加した。反応混合物を室温にて窒素下で18時間撹拌して、イマチニブのスルホ−NHS活性化エステルを生成した。反応混合物を例6a及び6bでそのまま使用した。
イマチニブ免疫原の調製
300mgのKLHを19.6mLのリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)に溶解させ、次いで39.2mLのDMSOを徐々に添加しながらKLHのタンパク質溶液を氷上で撹拌することによって、KLHのタンパク質溶液を調製した。撹拌を室温でさらに30分間継続した後、例5で調製したスルホ−NHS活性化イマチニブ誘導体(4)(2.532mL、0.08mmol)を添加した。KLHと活性化イマチニブ誘導体(4)との反応混合物を琥珀ガラスボトル中で室温にて18時間撹拌させて、イマチニブ−KLHコンジュゲート(5)を生成した。次いで、イマチニブ−KLHコンジュゲートを、室温にてリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)中66%DMSOに対して透析することによって精製した。その後、DMSOの割合を60%、50%、40%、20%、10%及び0%に段階的に減少させた。4℃でリン酸緩衝液に対して最後の透析を実施した。イマチニブ−KLHコンジュゲート(5)を紫外線可視分光法によって特徴づけた。コンジュゲートをリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)で2mg/mLの最終濃度まで希釈した。
イマチニブ免疫原の調製
イマチニブ−KLHコンジュゲート(5)をリン酸緩衝液及びDMSO(50体積%)で2mg/mLの最終濃度まで希釈したことを除いては例6aと同様にしてイマチニブ免疫原を調製した。
誘導体4を用いたイマチニブ−BSAコンジュゲートの調製
1000mgのBSAを50mg/mLの最終濃度に向けてリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)に溶解させることによってBSAのタンパク質溶液を調製した。40mLのDMSOをBSAのタンパク質溶液に徐々に添加しながら氷上で撹拌した。撹拌を室温でさらに30分間継続した後、例5で調製したスルホ−NHS活性化イマチニブ誘導体(4)(0.437ml、0.014mmol)を添加した。BSAのタンパク質溶液に添加されたスルホ−NHS活性化イマチニブ誘導体(4)の量をイマチニブの誘導体(4)とBSAとの間の1:1のモル比について計算した。BSAと活性化イマチニブ誘導体(4)との混合物を琥珀ガラスボトル中で室温にて18時間撹拌させて、活性化イマチニブエステル(4)とBSAとのコンジュゲートを生成した。次いで、このコンジュゲートを、室温にてリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)中66%DMSOに対して透析することによって精製した。その後、DMSOの割合を60%、50%、40%、20%、10%及び0%に段階的に減少させた。4℃でリン酸緩衝液に対して最後の透析を実施した。精製したイマチニブ−BSAコンジュゲートをUV/VIS分光法によって特徴づけた。
イマチニブに対するポリクローナル抗体の調製
10匹の雌のBALB/cマウスの2グループの一方を例6aで調製した100μg/マウスのイマチニブ−KLH免疫原(10匹のマウス)で、他方を例6bで調製した、完全フロイントアジュバントで乳化された100μg/マウスのイマチニブ−KLH免疫原(10匹のマウス)で腹腔内免疫化した。最初の注射の後で、不完全フロイントアジュバントで乳化された100μg/マウスの同一の免疫原を4週間に1回マウスに追加免疫投与した。追加免疫投与の20日後に、眼窩採血によって、各マウスからのポリクローナル抗体を含有する試験採血を得た。イマチニブ抗体を含有するこれらの試験採血からの抗血清を例9、10a及び11で評価した。
イマチニブに対するモノクローナル抗体の調製
6bで調製したイマチニブ−KLHで免疫化された例8aのマウスを使用して、モノクローナル抗体を生成した。融合の3日前に発生するモノクローナル抗体について、例6bで調製したPBS/DMSO中イマチニブ−KLHの400μg(融合の3日前)、200μg(融合の2日前)及び200μg(融合の1日前)をマウスに腹腔内注射した。脾臓細胞を、選択したマウスから単離し、Coligan、J.E.ら編、「免疫学における現行のプロトコル(Current Protocols in Immunology)」、2.5.1〜2.5.8、(1992)、Wiley & Sons、NYの方法に従って、50%ポリエチレングリコール1500を用いて2×107SP2/0細胞と融合させた。融合細胞を、20%のFetalClone I、2%のL−グルタミン(100mM)及び2%の50X HATが補給されたDMEM/F12中10個の96ウェルプレートに接種した。2から3週間後、ハイブリドーマ上澄みを(例10bのように)ELISAにより抗イマチニブ抗体の存在についてアッセイした。陽性のELISA結果を示したウェルの細胞(例10b)を24個のウェルプレートに拡大した。ELISAにより陽性のクローンを、Coligan、J.E.ら編、「免疫学における現行のプロトコル(Current Protocols in Immunology)」、2.5.8〜2.5.17、(1992)、Wiley & Sons、NYに開示されている方法に従って希釈を制限することによって2回サブクローニングした。選択されたサブクローンのモノクローナル抗体を含有するハイブリドーマ培養上澄みを競合ELISAによってイマチニブ結合について確認した(例11)。これらのモノクローナル抗体を、例11に記載されている間接的競合マイクロタイタプレートアッセイにより、イマチニブ結合、及び主たるイマチニブ代謝物、即ちN−デスメチルイマチニブに対する交叉反応性について試験した。
イマチニブ−BSAコンジュゲートを用いたマイクロタイタプレート感作手順
イマチニブ濃度を測定するためのELISA法を、タンパク質結合に対して最適化され、1プレート当たり96個のウェルを含有するポリスチレンマイクロタイタプレート(Nunc MaxiSorp F8イムノモジュール)にて実施した。0.05Mの炭酸ナトリウム(pH9.6)中10μg/mLの濃度の300μLのイマチニブ−BSAコンジュゲートを添加し、室温で3時間インキュベートすることによって各ウェルを(例7で調製した)イマチニブ−BSAコンジュゲートで被覆した。ウェルを0.05Mの炭酸ナトリウム(pH9.6)で洗浄し、次いで室温にて30分間にわたって375μLの5%スクロース、0.2%カゼイン酸ナトリウム溶液でブロックした。被覆後溶液の除去後、プレートを37℃で終夜乾燥させた。
抗体スクリーニング手順−力価
この手順は、例11のように置換についての試験対象の抗体の希釈率を確認するものである。(例8a及び8bで生成された)イマチニブ抗体をスクリーニングするためのELISA法を、例9で調製されたイマチニブBSAコンジュゲートで感作されたマイクロタイタプレートを用いて実施した。ポリクローナルイマチニブ抗体を含有する(例8aの)試験採血からのマウス血清を、0.1%のBSA及び0.01%のチメロサールを含有するリン酸緩衝食塩水で1:2000、1:6000、1:20000及び1:50000(体積/体積)に希釈することによって、抗体スクリーニングアッセイを実施した。モノクローナル抗体の評価については、例10bの手順により抗体の存在について陽性であることが判明した例8bのハイブリドーマ上澄みを、0.1%のBSA及び0.01%のチメロサールを含有するリン酸緩衝食塩水で1:2、1:4、1:16(体積/体積)等に希釈した。(例9で調製された)イマチニブ−BSA感作ウェルの各ウェルに、0.1%のBSA及び0.01%のチメロサールを含有する50μLのリン酸緩衝食塩水、並びに50μLの希釈抗体を添加し、振盪しながら室温で10分間インキュベートした。このインキュベーションを通じて、抗体は、受動的にウェルに吸収されたイマチニブコンジュゲート(例9)に結合する。プレートのウェルを0.02MのTRIS、0.9%のNaCl、0.5%のTween−80及び0.001%のチメロサール(pH7.8)で3回洗浄して、いかなる未結合の抗体をも除去した。ウェル内のイマチニブ−BSAコンジュゲートに結合したイマチニブ抗体の量を検出するために、0.1%のBSA、0.05%のANS、0.01%のチメロサールを含むPBSで比活性度(約1/3000)まで希釈され、マウス免疫グロブリンと特異的に結合し、基質、本実施例ではTMBとともにインキュベートされると着色生成物を生成することが可能な100μLのヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲート(Jackson Immunoresearch)を各ウェルに添加した。その間ヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲートがウェル内のイマチニブ抗体に結合する振盪による室温での10分間のインキュベーションの後、プレートを再び3回洗浄して、未結合のヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲートを除去した。ウェル内に測定可能な色を発生させるために、洗浄後にHRPに対する基質である100μLのTMB(TMB基質、BioFx)を添加して、室温での振盪による10分間のインキュベーションを通じて発色させた。発色のためのインキュベーションに続いて、50μLの停止液(diH2O中1.5%のフッ化ナトリウム)を各ウェルに添加して、発色を停止し、20秒の振盪後に、650nmで吸光度を決定した(分子デバイスプレートリーダー)。ウェルにおける抗体の量は、測定された吸光度に比例し、1.5の吸光度になる希釈率(力価)で表された。測定される抗体の抗体希釈率(x軸)対650nmの吸光度(y軸)のグラフを作成し、1.5の吸光度に力価を補間することによって力価を決定した。1.5の吸光度をもたらした力価は、例11に記載される間接的競合マイクロタイタプレートアッセイに使用される抗体の濃度(希釈率)を決定づけた。
抗体スクリーニング手順−モノクローナルスクリーニング
(例8bで生成された)イマチニブモノクローナル抗体をスクリーニングするためのELISA法を、例9に記載されているようにイマチニブ−BSAで感作されたマイクロタイタプレートを用いて実施した。(例9で調製された)イマチニブ−BSA感作ウェルの各ウェルに、0.1%のBSA及び0.01%のチメロサールを含有する50μLリン酸緩衝食塩水を添加し、次いで50μLのモノクローナル培養上澄みを添加し、振盪しながら室温で10分間インキュベートした。このインキュベーションを通じて、抗体は、ウェル内のイマチニブコンジュゲートに結合する。プレートのウェルを0.02MのTRIS、0.9%のNaCl、0.5%のTween−80及び0.001%のチメロサール(pH7.8)で3回洗浄して、いかなる未結合の抗体をも除去した。ウェル内のイマチニブ−BSAコンジュゲートに結合したイマチニブ抗体の量を検出するために、0.1%のBSA、0.05%のANS、0.01%のチメロサールを含むPBSで1/3000に希釈され、マウス免疫グロブリンと特異的に結合し、基質、本実施例ではTMBとともにインキュベートされると着色生成物を生成することが可能な100μLのヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲート(Jackson Immunoresearch)を各ウェルに添加した。その間ヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲートがウェル内のイマチニブ抗体に結合する振盪による室温での10分間のインキュベーションの後、プレートを再び3回洗浄して、未結合のヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲートを除去した。ウェル内に測定可能な色を発生させるために、洗浄後にHRPに対する基質である100μLのTMB(TMB基質、BioFx)を添加して、室温での振盪による10分間のインキュベーションを通じて発色させた。発色のためのインキュベーションに続いて、50μLの停止液(diH2O中1.5%のフッ化ナトリウム)を各ウェルに添加して、発色を停止し、10秒の振盪後に、650nmで吸光度を決定した(分子デバイスプレートリーダー)。ウェルにおける抗体の量は、測定された吸光度に比例した。バックグラウンドの3倍以上の吸光度を有する試料を陽性とした。最も高い吸光度を有する50個の試料を、例8bに記載されているように24個のウェルプレートに拡大した。
間接的競合マイクロタイタプレート免疫アッセイ手順
イマチニブに対する抗体についてのIC50及び交叉反応性の決定
IC50値及び交叉反応性を決定するためのELISA法を、例9に記載されている、イマチニブ−BSAで感作されたマイクロタイタプレートを用いて実施した。検体−イマチニブ及びN−デスメチルイマチニブを、10から1000000ng/mLの濃度範囲にわたってdiH2Oで希釈した。50μLのイマチニブ溶液を、例6aの免疫原を用いて例8aで生成されたポリクローナル抗体、例6bの免疫原を用いて例8aで生成されたポリクローナル抗体、及び例8bで生成されたモノクローナル抗体から選択される抗体の1つ50μLとともにインキュベートすることによって、アッセイの各々を実施した。アッセイを、いずれも、ウェルの各々における抗体の濃度を例10aで決定された力価まで希釈することによって実施した。(振盪による室温での)10分間のインキュベーションを通じて、(例9で生成された)ウェル内のイマチニブ−BSAコンジュゲート及び溶液中の検体に対する抗体結合の競合が生じる。このインキュベーションに続いて、プレートのウェルを0.02MのTRIS、0.9%のNaCl、0.5%のTween−80及び0.001%のチメロサール(pH7.8)で3回洗浄して、いかなる未結合の物質をも除去した。(例9で生成された)ウェル内のイマチニブ−BSAコンジュゲートに結合したイマチニブ抗体の量を検出するために、0.1%のBSA、0.05%のANS、0.01%のチメロサールを含むPBSで所定の比活性度(約1/3000)まで希釈され、マウス免疫グロブリンと特異的に結合し、基質、本実施例ではTMBとともにインキュベートされると着色生成物を生成することが可能な100μLのヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲート(Jackson Immunoresearch)を各ウェルに添加した。その間ヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲートがウェル内のイマチニブ抗体に結合する振盪による室温での10分間のインキュベーションの後、プレートを再び3回洗浄して、未結合の二次コンジュゲートを除去した。ウェル内に測定可能な色を発生させるために、洗浄後にHRPに対する基質である100μLのTMB(TMB基質、BioFx)を添加して、室温での振盪による10分間のインキュベーションで発色させた。発色のためのインキュベーションに続いて、50μLの停止液(diH2O中1.5%のフッ化ナトリウム)を各ウェルに添加して、発色を停止し、20秒の振盪後に、650nmで吸光度を決定した(分子デバイスプレートリーダー)。ウェルにおける抗体の量は、測定された吸光度に比例し、試料中のイマチニブの量に逆比例した。イマチニブ及びN−デスメチルイマチニブのIC50を、ウェルにおける吸光度をウェルにおける検体濃度に対してプロットした用量応答曲線を作成することによって決定した。検体を含有するウェルにおける色の吸光度を、検体を含まないウェルの吸光度と比較し、標準曲線を作成した。所与の検体のIC50値を、検体を含有しないウェルの吸光度の50%を有することが必要とされる検体の濃度と定義した。交叉反応率を、N−デスメチルイマチニブのIC50に対するメシル酸イマチニブのIC50の比として計算し、パーセントで表した。この抗体群を用いて測定した場合は、N−デスメチルイマチニブについてのイマチニブに対するパーセント交叉反応率は7%以下であった。イマチニブに対するポリクローナル抗体についての結果を以下の表Iに示す。選択されたモノクローナル抗体を用いて測定した場合は、N−デスメチルイマチニブについてのイマチニブに対するパーセント交叉反応率は4%未満であった。イマチニブに対するモノクローナル抗体についての結果を以下の表IIに示す。
Claims (31)
- 試料中のイマチニブ及びその薬理活性塩を検出するための免疫アッセイであって、試料と、イマチニブ及びその薬理活性塩と選択的に反応する抗体と、反応性チオール基又はアミノ基を有するポリマーを含有する担体と、式:
[式中、Yは、有機スペーシング基であり、
Xは、前記アミノ基又はチオール基を介して前記担体に結合することが可能な末端官能基であり、
pは、0から1の整数である]の化合物又はその薬理活性塩とのコンジュゲートとの混合物を準備するステップと、
試料中のイマチニブ及びその薬理活性塩、並びに前記コンジュゲートを前記抗体と結合させるステップと、その後、前記抗体に結合するか、又は未結合である前記混合物中の前記コンジュゲートの量を測定することによって、試料中のイマチニブ又はその薬理活性塩の存在を決定することが可能であるステップとを含む上記免疫アッセイ。 - 試料が、ヒトの試料である、請求項1に記載の免疫アッセイ。
- 抗体又はコンジュゲートを固体支持体に付着させる、請求項2に記載の免疫アッセイ。
- 固体支持体が、マイクロタイタプレートである、請求項4に記載の免疫アッセイ。
- 固体支持体が、ナノ粒子である、請求項4に記載の免疫アッセイ。
- 前記抗体のN−デスメチルイマチニブとの交叉反応性が、イマチニブ及びその薬理活性塩と比較して15%未満である、請求項1に記載の免疫アッセイ。
- N−デスメチルイマチニブとの交叉反応性が、イマチニブ及びその薬理活性塩と比較して15%未満である、イマチニブ及びその薬理活性塩に選択的に結合する抗体。
- マウス、ウサギ又はラットに由来する、請求項8に記載の抗体。
- ポリクローナル抗体である、請求項8に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項8に記載の抗体。
- pが1である、請求項14に記載の化合物。
- pが1である、請求項19に記載の組成物。
- pが1である、請求項23に記載の免疫原。
- 個別の容器に試薬を含み、第1の容器内の試薬の1つは、反応性チオール基又はアミノ基を有するポリマーを含有する担体と、式:
[式中、Yは、有機スペーシング基であり、
Xは、前記アミノ基又はチオール基を介して前記担体に結合することが可能な末端官能基であり、
pは、0から1の整数である]の化合物又はその薬理活性塩とのコンジュゲートであり、個別の容器における第2の試薬は、イマチニブ及びその薬理活性塩に選択的に結合する抗体であり、イマチニブの薬理不活性代謝物との交叉反応性が、イマチニブ及びその薬理活性塩と比較して15%未満である、患者の試料におけるイマチニブ又はその薬理活性塩の存在を決定するためのキット。 - 前記コンジュゲートが、前記第1の容器内に所定の量で存在する、請求項28に記載のキット。
- 前記試料中のイマチニブ及びその薬理活性塩の量を決定するために使用される、請求項29に記載のキット。
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