ES2645390T3 - Inmunoensayo de imatinib - Google Patents

Inmunoensayo de imatinib Download PDF

Info

Publication number
ES2645390T3
ES2645390T3 ES10810301.1T ES10810301T ES2645390T3 ES 2645390 T3 ES2645390 T3 ES 2645390T3 ES 10810301 T ES10810301 T ES 10810301T ES 2645390 T3 ES2645390 T3 ES 2645390T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
imatinib
antibody
pharmacologically active
active salts
formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10810301.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Salvatore J. Salamone
Jodi Blake Courtney
Alexander Volkov
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Saladax Biomedical Inc
Original Assignee
Saladax Biomedical Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Saladax Biomedical Inc filed Critical Saladax Biomedical Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2645390T3 publication Critical patent/ES2645390T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

Un inmunoensayo para detectar imatinib y sus sales farmacológicamente activas en una muestra que comprende proporcionar una mezcla de una muestra, un anticuerpo reactivo de manera selectiva con imatinib y sus sales farmacológicamente activas que tiene una reactividad cruzada con N-desmetil imatinib de menos del 15 % y un conjugado de un vehículo que contiene un polímero que tiene bien un grupo tiol o un grupo amino reactivos con un compuesto de la fórmula:**Fórmula** o sus sales farmacológicamente activas, en donde Y es un grupo espaciador orgánico; X es un grupo funcional terminal capaz de unirse a dicho vehículo mediante dichos grupos amino o tiol y; p es un número entero de 0 a 1; provocando que el imatinib y sus sales farmacológicamente activas en la muestra y dicho conjugado se unan con dicho anticuerpo y posteriormente medir la cantidad de dicho conjugado en dicha mezcla que está unido o desunido a dicho anticuerpo, por lo que se puede determinar la presenta de imatinib o sus sales farmacológicamente activas en la muestra.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
DESCRIPCION
Inmunoensayo de imatinib Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al campo de los inmunoensayos para la determinacion de la presencia y/o la cuantificacion de la cantidad de imatinib o sus sales farmacologicamente aceptables en fluidos corporales humanos con el fin de determinar rapidamente las concentraciones optimas del farmaco durante la quimioterapia.
Antecedentes de la invencion
Cancer es un termino usado para describir un grupo de neoplasias en que todas comparten la caracterlstica comun de desarrollarse cuando las celulas comienzan a crecer fuera de control en una parte del cuerpo. La mayorla de los canceres se forman como tumores, pero tambien se pueden manifestar en la sangre y circular a traves de otros tejidos donde crecen. Las neoplasias malignas son las mas comunmente tratadas con una combinacion de cirugla, quimioterapia y/o radioterapia. El tipo de tratamiento usado para tratar un determinado cancer depende de varios factores que incluyen el tipo de neoplasia maligna y la etapa durante la cual se ha diagnosticado.
Imatinib tiene la siguiente formula:
imagen1
y sus sales, particularmente el mesilato de imatinib, son uno de los agentes quimioterapeuticos mas comunmente usados para el tratamiento de leucemia mieloide cronica con cromosoma Filadelfia positivo en fase blastica, en fase acelerada o en fase cronica (inserto del paquete Gleevec, Novartis Pharmaceuticals Corporation, julio de 2004).
Se ha demostrado que el imatinib tiene una variabilidad interpaciente de hasta 16 veces en las concentraciones mlnimas y que esta variabilidad puede afectar la eficacia. (Picard et.al. Blood 2007: 109; 3496-3499, Larson et al. Blood 2008,111: 4022-4028, Demetri et.al. J Clin Oncol 2009, 27: 3141-3147)
La sal preferida de imatinib es mesilato de imatinib y tiene la formula:
imagen2
Dado que la eficacia de imatinib se mejora a niveles mlnimos mas elevados y dado que el farmaco presenta una amplia variabilidad farmacocinetica del farmaco, el control de las concentraciones de este farmaco en sangre y el ajuste a niveles diana serla de valor en el aumento de la eficacia y la minimization de la toxicidad. El grado de variabilidad farmacocinetica intraindividual e interindividual de imatinib y sus sales se ha comunicado que es de 16 veces y se ve afectado por muchos factores, que incluyen:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
◦ La funcion del organo
◦ La regulacion genica
◦ El cuadro clmico
◦ La edad
◦ La interaccion entre farmacos
◦ El tiempo de consumo del farmaco
◦ El cumplimiento
Como resultado de esta variabilidad, las mismas dosis del mismo farmaco en diferentes individuos puede dar lugar a resultados clmicos marcadamente diferentes. La eficacia de la misma dosificacion de imatinib o sus sales vana de manera significativa basandose en la tasa de excrecion del farmaco del individuo y la concentracion serica final del farmaco en el paciente. La gestion del farmaco terapeutico podna proporcionar al medico una vision sobre la variacion de la administracion del farmaco en el paciente. Con la gestion del farmaco terapeutico, se podnan individualizar las dosificaciones para el paciente, y las posibilidades de tratar el cancer de manera eficaz sin los efectos secundarios indeseados senan mucho mayores.
Ademas, la gestion del farmaco terapeutico de imatinib o sus sales podna servir como una excelente herramienta para asegurar el cumplimiento (Henk, et al. Proc ASCO 2006, abst. 6083, Feng, et al. Proc ASCO 2006, abst. 6038) de la administracion de quimioterapia con la dosificacion prescrita real y el alcance de los niveles de concentracion serica eficaces. La gestion habitual del farmaco terapeutico de imatinib o sus sales requerina la disponibilidad de ensayos automatizados simples adaptables a un equipo general de laboratorio. Se ha descrito el uso de cromatograffa de lfquidos (LC)/espectrometna de masas en tandem para determinar la concentracion de imatinib, las sales de imatinib o sus metabolitos quimioterapeuticos en la sangre y el plasma humanos (Guetens, J Pharm Biomed Anal., 33(5):879-89 2003; Bakhtiar, J Chromatrography B, 768(2):325-340, 2002; Titier, Ther. Drug. Monit., (27)5:634-640, 2005). Tambien se ha desarrollado un metodo de LC para determinar la pureza de imatinib, las sales de imatinib o sus metabolitos terapeuticos (Vivekanand, J Pharm Biomed Anal., 28(6):1183-94, 2002) pero no se uso para determinar los niveles en los fluidos biologicos. Estos metodos son de mano de obra intensiva, usan equipos caros y no son susceptibles de uso habitual en laboratorio clmico. Se ha desarrollado un ensayo enzimatico para medir imatinib expuesto en la patente de Estados Unidos N.° 7.300.768. Sin embargo, no existen inmunoensayos simples para determinar la presencia o cuantificar la cantidad de imatinib en fluidos biologicos humanos de pacientes tratados con este agente quimioterapeutico.
Como se deduce de lo anterior, no existen inmunoensayos para determinar la presencia y/o cuantificar la cantidad de imatinib o sus sales farmacologicamente activas en fluidos biologicos humanos. La gestion habitual del farmaco terapeutico de imatinib y sus sales farmacologicamente activas mediante inmunoensayos proporcionana ensayos automatizados simples adaptados a un equipo convencional de laboratorio. Sin embargo, con el fin de proporcionar tales inmunoensayos, se deben producir anticuerpos espedficos para imatinib y sus sales farmacologicamente activas. Los derivados e inmunogenos usados en este ensayo deben impartir mediante estos correspondientes anticuerpos producidos una reactividad espedfica a imatinib y sus sales farmacologicamente activas sin ninguna reactividad cruzada sustancial con los metabolitos terapeuticamente activos o inactivos o farmacologicamente activos o inactivos de imatinib y sus sales. Con el fin de ser eficaces en el control de los niveles de farmaco, los anticuerpos debenan ser espedficos para imatinib y sus sales farmacologicamente activas y no reaccionar de manera cruzada con el N-desmetil imatinib
El metabolito activo de imatinib que se da en muestras de pacientes tratados con imatinib y sus sales es N-desmetil imatinib, que tiene la formula:
imagen3
Es este metabolito farmacologicamente activo el que impide la determinacion precisa de imatinib y sus sales mediante inmunoensayos de muestras de pacientes tratados con imatinib y sus sales. Por lo tanto, desde hace mucho tiempo se desea proporcionar anticuerpos espedficos para imatinib y sus sales farmacologicamente activas y que no reaccionen de manera cruzada con el N-desmetil imatinib
Sumario de la invencion
De acuerdo con la presente invencion, se ha producido una nueva clase de anticuerpos que son sustancial y selectivamente reactivos con imatinib y sus sales farmacologicamente activas de manera que se unan
5
10
15
20
25
30
35
40
45
selectivamente a imatinib y sus sales farmacologicamente activas sin ninguna reaccion cruzada sustancial con su metabolito de imatinib farmacologicamente activo, N-desmetil imatinib. Por selectivamente reactivos, se entiende que este anticuerpo solamente reacciona con el imatinib y sus sales farmacologicamente activas y tiene una reactividad cruzada con el metabolito farmacologicamente activo de imatinib, N-desmetil imatinib, de menos del 15 %. El metabolito N-desmetil imatinib impide la determinacion precisa mediante un inmunoensayo de la presencia y las cantidades de imatinib y sus sales farmacologicamente activas en fluidos biologicos humanos.
Se ha descubierto que mediante el uso de inmunogenos que son conjugados de un vehlculo que contienen un pollmero inmunogenico que tiene un grupo funcional tiol o un grupo funcional amino reactivos con un compuesto de la formula:
imagen4
o sus sales farmacologicamente activas.
en donde Y es un grupo espaciador organico;
X es un grupo funcional terminal capaz de unirse a dicho vehlculo mediante dicho grupo amino o tiol y;
p es un numero entero de 0 a 1;
se producen anticuerpos que son especlficos para imatinib o sus sales farmacologicamente activas y no reaccionan de manera sustancial con o se unen a N-desmetil imatinib. Ademas, estos anticuerpos no presentan reactividad cruzada de manera sustancial con ninguno de sus metabolitos de imatinib terapeuticamente activos o inactivos
La provision de estos anticuerpos que reaccionan sustancial y selectivamente con imatinib y sus sales farmacologicamente activas y no reaccionan de manera cruzada con N-desmetil imatinib permite producir un inmunoensayo que puede detectar de manera especlfica y cuantificar de manera que controle el imatinib y sus sales farmacologicamente activas en las muestras de fluido de pacientes que se estan tratando con imatinib o sus sales farmacologicamente activas. Tambien incluidos en la presente invencion hay reactivos y kits para dicho inmunoensayo. La presencia del metabolito activo de imatinib, N-desmetil imatinib, es la causa principal de lecturas imprecisas en inmunoensayos para imatinib o sus sales farmacologicamente activas.
Descripcion detallada
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona una nueva clase de anticuerpos que sustancial y selectivamente reacciona con imatinib o sus sales farmacologicamente activas y no reacciona de manera sustancial o de manera cruzada con sus metabolitos tal como se menciona anteriormente en el presente documento. Se ha descubierto que mediante el uso de estos derivados de imatinib de formula IV como inmunogenos, se proporciona esta nueva clase de anticuerpos de la presente invencion. Mediante el uso de estos anticuerpos se ha desarrollado un inmunoensayo que incluye reactivos y kits para tal inmunoensayo para detectar y/o cuantificar imatinib y sus sales farmacologicamente activas en sangre, plasma u otras muestras de fluidos corporales. Mediante el uso del presente inmunoensayo, se puede detectar y/o cuantificar la presencia y cantidad de imatinib o sus sales farmacologicamente activas en muestras de fluido corporal de pacientes que se estan tratando con este agente quimioterapeutico. De esta manera, se puede controlar durante la terapia a un paciente que se esta tratando con imatinib o sus sales farmacologicamente activas y ajustar su tratamiento de acuerdo con dicho control. Mediante la presente invencion se logra la gestion de farmaco terapeutico de imatinib o sus sales farmacologicamente activas en pacientes de cancer que se estan tratando con imatinib o sus sales farmacologicamente activas como un agente quimioterapeutico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El agente quimioterapeutico a detectar es imatinib de formula I o sus sales farmacologicamente activas. Estas sales incluyen las sales de adicion de acido, por ejemplo, sales con acidos inorganicos, tales como acido clorhldrico, acido sulfurico o acido fosforico, o con acidos organicos carboxllico o sulfonico adecuados, por ejemplo, acidos alifaticos mono o dicarboxllico, tales como acido trifluoroacetico, acido acetico, acido propionico, acido glicolico, acido succlnico, acido maleico, acido fumarico, acido hidroximaleico, acido malico, acido tartarico, acido cltrico o acido oxalico, o aminoacidos tales como arginina o lisina, acidos carboxllicos aromaticos, tales como acido benzoico, acido 2-fenoxibenzoico, acido 2-acetoxibenzoico, acido salicllico, acido 4-aminosalicllico, acidos carboxllicos aromaticos- alifaticos, tales como acido mandelico o acido cinamico, acidos carboxllicos heteroaromaticos, tales como acido nicotlnico o acido isonicotlnico, acidos sulfonicos alifaticos, tales como acido metanosulfonico, etanosulfonico o 2- hidroxietanosulfonico, o acidos sulfonicos aromaticos, por ejemplo, acido benceno-2 sulfonico, p-tolueno-2 sulfonico o naftaleno-2 sulfonico. El acido preferido es acido metanosulfonico.
Los reactivos utilizados en el ensayo para la presente invencion son conjugados de un vehlculo que tienen un grupo funcional tiol o un grupo funcional amino reactivos con los compuestos de formula IV. Estos conjugados son companeros de union competitiva con el imatinib y sus sales farmacologicamente activas presentes en la muestra para la union con los anticuerpos de la presente invencion. Por lo tanto, la cantidad de reactivo conjugado que se une al anticuerpo sera inversamente proporcional a la cantidad de imatinib y sus sales farmacologicamente activas en la muestra. De acuerdo con la presente invencion, el ensayo utiliza cualquier medio de medicion convencional para la deteccion y la medicion de la cantidad de dicho conjugado que se une o desune del anticuerpo. Mediante el uso de dichos medios, se puede determinar la cantidad de conjugado unido o desunido. En general, la cantidad de imatinib o sus sales farmacologicamente activas en una muestra se determina mediante la correlacion de la cantidad medida del conjugado unido o desunido producido por el imatinib o sus sales farmacologicamente activas en la muestra con valores del conjugado unido o desunido determinado a partir del patron o curva de calibracion obtenida con muestras que contienen cantidades conocidas de imatinib o sus sales farmacologicamente activas, cuyas cantidades conocidas estan en el intervalo esperado para la muestra a ensayar. Estos estudios para generar curvas de calibracion se determinan usando el mismo procedimiento de inmunoensayo que el usado para la muestra.
Definiciones
A lo largo de la presente descripcion, deben entenderse las siguientes definiciones:
El termino "Ph" tal como se usa a lo largo de la presente solicitud designa un radical fenilo. El termino "alquileno" designa un sustituyente hidrocarbonado divalente saturado de cadena lineal o ramificada que contiene de uno a diez atomos de carbono
Los terminos "inmunogeno" e "inmunogenico" se refieren a sustancias capaces de provocar, producir o generar una respuesta inmunitaria en un organismo.
El termino "conjugado" se refiere a cualquier sustancia formada a partir de la union conjunta de partes separadas. Los conjugados representativos de acuerdo con la presente invencion incluyen aquellos formados por la union conjunta de una pequena molecula, tal como el compuesto de formula IV, y una molecula grande, tal como un vehlculo que tiene uno o mas grupos tiol funcionales o grupos amino funcionales reactivos, cuyo vehlculo puede ser un pollmero de poliamina, particularmente protelna. En el conjugado, la molecula pequena podrla unirse a uno o mas sitios activos en la molecula grande. El termino conjugado incluye el termino inmunogeno.
"Haptenos" son antlgenos parciales o incompletos. Son sustancias sin protelna, principalmente sustancias de bajo peso molecular, que no son capaces de estimular la formation de anticuerpos, pero que reaccionan con anticuerpos. Los ultimos estan formados acoplando un hapteno con un vehlculo inmunogenico de alto peso molecular y despues inyectando este producto acoplado, es decir, inmunogeno, en un sujeto humano o animal. EL hapteno de la presente invencion es imatinib o sus sales farmacologicamente activas.
Tal como se usa en el presente documento, un "grupo espaciador" o un "espaciador" se refiere a una portion de una estructura qulmica que conecta dos o mas subestructuras tales como haptenos, vehlculos, inmunogenos, etiquetas o marcadores mediante un grupo de union funcional. Estos grupos espaciadores se enumeraran en lo sucesivo en el presente documento, en la presente solicitud. Los atomos de un grupo espaciador y los atomos de una cadena en el grupo espaciador estan conectados mediante enlaces qulmicos. Entre los espaciadores preferidos estan las cadenas de carbono lineales o ramificadas, saturadas o insaturadas. Estas cadenas de carbono tambien pueden incluir uno o mas heteroatomos en la cadena o en los extremos de las cadenas. Con "heteroatomos" se refiere a atomos que no sean de carbono que se eligen del grupo que consiste en oxlgeno, nitrogeno y azufre. Los grupos espaciadores tambien pueden incluir grupos clclicos o aromaticos como parte de la cadena o como una sustitucion en uno de los atomos en la cadena.
El numero de atomos en el grupo espaciador se determina mediante recuento de los atomos que no sean de hidrogeno. El numero de atomos en una cadena en un grupo espaciador se determina mediante el recuento del numero de atomos que no sean de hidrogeno a lo largo de la ruta mas corta entre las subestructuras que se estan conectando. Se puede usar un grupo de union funcional para activar, por ejemplo, proporcionar un sitio funcional
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
disponible en, un hapteno o grupo espaciador para sintetizar un conjugado de un hapteno con una etiqueta o vehlculo o pollmero de poliamina.
Un "vehlcuio inmunogenico", tal como se usa la expresion en el presente documento, es una sustancia inmunogenica, comunmente una protelna o protelna modificada para contener un grupo tiol o un grupo amino reactivos, que se puede unir a una o mas posiciones con un hapteno, en el presente caso imatinib, permitiendo de este modo a los derivados de hapteno inducir una respuesta inmunitaria y provocar la produccion de anticuerpos que se pueden unir de manera especlfica con estos haptenos. Los vehlculos inmunogenicos y los grupos de union se enumeraran en lo sucesivo en el presente documento, en la presente solicitud. Entre las sustancias de vehlculo inmunogenico se incluyen protelnas, glucoprotelnas, complejos poliaminopolisacaridos, partlculas y acidos nucleicos que se reconocen como extranas y por lo tanto provocan una respuesta inmunologica del hospedador. Los poliaminopolisacaridos se pueden preparar a partir de polisacaridos usando cualquiera de los medios convencionales conocidos para esta preparacion.
Tambien se pueden emplear diversos tipos de protelnas como un vehlculo inmunogenico de poli(aminoacidos). Estos tipos incluyen albuminas, protelnas sericas, lipoprotelnas, etc. Las protelnas ilustrativas incluyen albumina de suero bovino (BSA, del ingles bovine serum albumin), hemocianina de lapa californiana (KLH, del ingles keyhole limpet hemocyanin), ovoalbumina de huevo, tiroglobulina bovina (BTG, del ingles bovine thyroglobulin). Como alternativa, se pueden utilizar poli(aminoacidos) sinteticos.
Los vehlculos inmunogenicos tambien pueden incluir poliaminopolisacaridos, que son un pollmero de alto peso molecular construido por condensaciones repetidas de monosacaridos. Los ejemplos de polisacaridos son almidones, glucogeno, celulosa, gomas de carbohidratos tales como goma arabiga, agar, etc. El polisacarido tambien contiene restos de poliaminoacidos y/o restos de llpido.
El vehlculo inmunogenico tambien puede ser poli(acido nucleicos) bien solos o conjugados con uno de los poli(aminoacidos) o polisacaridos mencionados anteriormente.
El vehlculo inmunogenico tambien puede incluir partlculas solidas. Las partlculas generalmente son al menos de aproximadamente 0,02 micrometros (pm) y no mas de aproximadamente 100 pm, y normalmente de aproximadamente 0,05 pm a 10 pm de diametro. La partlcula puede ser organica o inorganica, hinchable o no hinchable, porosa o no porosa, de manera optima, de una densidad que se acerca a la del agua, generalmente desde aproximadamente 0,7 a 1,5 g/ml y compuesta de material que puede ser transparente, parcialmente transparente u opaco. Las partlculas pueden ser materiales biologicos tales como celulas y microorganismos, incluyendo ejemplos tales como eritrocitos, leucocitos, linfocitos, hibridomas, Streprococcus, Staphylococcus aureus, E. coli, y virus. Las partlculas tambien pueden estar comprendidas de pollmeros organicos e inorganicos, liposomas, latex, veslculas de fosfollpido o lipoprotelnas.
"Poli(aminoacido)" o "polipeptido" es una poliamida formada a partir de poliaminoacidos. Los poli(aminoacidos) generalmente oscilaran desde aproximadamente un peso molecular de 2.000, sin tener un llmite superior de peso molecular, siendo normalmente menor de 10.000.000 y normalmente de no mas de aproximadamente 600.000 daltons. Normalmente seran intervalos diferentes, dependiendo de si esta implicado un vehlculo inmunogenico o una enzima,
un "peptido" es cualquier compuesto formado por la union de dos o mas aminoacidos mediante uniones amida (peptldicas), normalmente un pollmero de a-aminoacidos en el que el grupo a-amino de cada resto de aminoacido (excepto el termino NH2) se une al grupo a-carboxilo del siguiente resto en una cadena lineal. Los terminos peptido, polipeptido y poli(aminoacido) se usan como sinonimos en el presente documento para referirse a esta clase de compuestos sin restriction en cuanto al tamano. Los miembros mas grandes de esta clase se citan como protelnas.
Una "etiqueta", "molecula detectora", o "marcador" es cualquier molecula que produce o que se puede inducir para producir, una senal detectable. la etiqueta se puede conjugar con un analito, inmunogeno, anticuerpo o con otra molecula tal como un receptor o una molecula que se puede unir a un receptor tal como un ligando, particularmente un hapteno. Los ejemplos de etiquetas incluyen isotopos radiactivos, enzimas, fragmentos de enzimas, sustratos enzimaticos, inhibidores enzimaticos, coenzimas, catalizadores, fluoroforos, colorantes, quimioluminiscentes, luminiscentes o sensibilizadores; una partlcula magnetica o no magnetica, un soporte solido, un liposoma, un ligando o un receptor.
El termino "anticuerpo" se refiere a un companero de union especlfica de protelna para un antlgeno y es cualquier sustancia o grupo de sustancias, que tiene una afinidad de union especlfica por un antlgeno para la exclusion de otras sustancias. El termino generico anticuerpo abarca anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpo.
El termino "derivado" se refiere a un compuesto o molecula qulmica preparada a partir de un compuesto parental mediante una o mas reacciones qulmicas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
El termino "vehfculo" se refiere a partfculas solidas y/o polfmeros polimericos que tienen un grupo funcional tiol o un grupo funcional amino reactivos tal como polfmeros inmunogenicos tales como aquellos mencionados anteriormente. Cuando el vehfculo es una partfcula solida, la partfcula solida se puede unir, recubrir con o enlazar de algun modo con un polfmero de poliamina para proporcionar uno o mas sitios reactivos para la vinculacion con el grupo X funcional terminal en los compuestos de la formula IV. Por otro lado, los inmunoensayos de la presente invencion se pueden llevar a cabo recubriendo el anticuerpo sobre las partfculas solidas.
El termino "kit de reactivo", o "kit de ensayo", se refiere a un ensamblaje de materiales que se usan en la realizacion de un ensayo. Los reactivos se pueden proporcionar en una combinacion empaquetada en el mismo envase o en envases separados, dependiendo de las reactividades cruzadas y estabilidades, y en forma lfquida o liofilizada. Las cantidades y proporciones de reactivos proporcionados en el kit se pueden seleccionar de manera que proporcionen resultados optimos para una aplicacion particular. Un kit de reactivo que incorpora las caracterfsticas de la presente invencion comprende anticuerpos especfficos para Imatinib o sus sales farmacologicamente activas, El kit puede comprender adicionalmente ligandos del analito y materiales de calibracion y control. Los reactivos pueden permanecer en forma lfquida o se pueden liofilizar.
La frase "materiales de calibracion y de control" se refiere a cualquier patron o material de referencia que contiene una cantidad conocida de farmaco a medir. La concentracion de farmaco se calcula comparando los resultados obtenidos de la muestra desconocida con los resultados obtenidos para el patron. Esto se hace frecuentemente construyendo una curva de calibracion.
La expresion "muestra biologica" incluye cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o un antiguo ser vivo. Tales seres vivos incluyen seres humanos, ratones, monos, ratas, conejos, caballos y otros animales. Tales sustancias incluyen sangre, suero, plasma, orina, celulas, organos, tejidos, oseo, medula osea, linfa, los nodos linfaticos, tejido sinovial, condrocitos, macrofagos sinoviales, celulas endoteliales y piel.
Reactivos e inmunogenos
En un inmunoensayo basado en un anticuerpo, se construye un conjugado de imatinib para competir con el imatinib y sus sales farmacologicamente activas en la muestra por los sitios de union en el anticuerpo. En el inmunoensayo de la presente invencion, los reactivos de la formula IV son derivados de imatinib sustituidos con nitrogeno formados en el puente amida de imatinib de formula I. En los compuestos de formula IV, el espaciador del enlazador constituye la porcion "Y-X" de esta molecula. Este enlazador X y el espaciador. "Y" son convencionales en la preparacion de conjugados para inmunoensayos e inmunogenos para la produccion de anticuerpos. Se puede utilizar cualquiera de los grupos convencionales que se unen al espaciador utilizados para preparar conjugados para inmunoensayos e inmunogenos para producir anticuerpos en los compuestos de formula IV. Tales enlazadores y espaciadores convencionales se desvelan en la Patente de Estados Unidos 5.501.987 y en la Patente de Estados Unidos 5.101.015.
Los conjugados, asf como los inmunogenos, se preparan a partir del compuesto de formula I. En los conjugados o inmunogenos del vehfculo con el hapteno, los vehfculos se enlazan en una o mas posiciones a uno o mas grupos amino o tiol reactivos contenidos en la porcion polimerica del vehfculo al hapteno que tiene la formula:
imagen5
en donde X' es un grupo de union funcional capaz de unirse a dicho vehfculo mediante dicho grupo amino o tiol y p e Y son como anteriormente;
5
10
15
20
25
30
35
Entre los grupos espaciadores preferidos se incluyen los grupos espaciadores mencionados anteriormente en el presente documento. Los grupos espaciadores particularmente preferidos son grupos tales como alquilenos que contienen de 1 a 10 atomos de carbono,
-jj-(CH2)m-C-NH-(CH2)„-Q_(CH2)o.,-C-(CH2)m- 0 -C-NH-(CH2)m- 0 O OO
o
- Q-(CIU<>-
en donde n y o son numeros enteros de 0 a 6, y m es un numero entero de 1 a 6 con alquileno siendo el grupo espaciador especialmente preferido.
En los compuestos de formula IV-A, donde X' es un grupo funcional que se une al espaciador, preferentemente mediante un grupo amino o tiol reactivo en el vehfculo polimerico. El grupo X' es el resultado del grupo X funcional terminal en los compuestos de formula IV que se unen al grupo amino o tiol reactivo en el polfmero del vehfculo o el inmunogeno. Cualquier grupo funcional terminal capaz de reaccionar con un grupo amino o tiol se puede utilizar como el grupo X funcional en los compuestos de formula IV. Estos grupos funcionales terminales preferentemente incluidos en C son:
imagen6
en donde R3 es hidrogeno o tomado junto con su atomo de oxfgeno unido forma un ester reactivo y R4 es oxfgeno o azufre. El radical -N=C=R4, puede ser un isocianato o un isotiocianato. Los esteres activos formados mediante OR3 incluyen imidoester, tales como N-hidroxisuccinamida, 1-hidroxibenzotriazol y p-nitrofenil ester. Sin embargo, se puede usar cualquier ester activo que pueda reaccionar con un grupo amino.
Cuando X en el compuesto de formula IV es
-C-OR3
II
o
imagen7
imagen8
estos compuestos preferentemente reaccionan con los grupos amino libres del vehfculo polimerico o inmunogenico. Por otra parte, cuando X en el compuesto de formula IV es el radical maleimida de la formula
imagen9
este compuesto reacciona preferentemente con grupo tiol (o SH) que puede estar presente en el vehfculo polimerico o de protefna, incluyendo los inmunogenos, para producir el grupo funcional de maleimida como X' en los compuestos de la formula IV-A.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
De acuerdo con una realizacion, de la presente invention en donde X' es una maleimida en los compuestos de formula IV se une a una protelna polimerica que se ha modificado para convertir un grupo amino reactivo a un grupo tiol. Esto se puede hacer haciendo reaccionar un grupo amino libre de un vehlculo de protelna polimerica con un compuesto de la formula
R3-0—C-(CH2)v-SR15 yi
en donde R15 es un grupo protector de tiol;
R3 es como anteriormente; y v es un numero entero de 1 a 4.
De esta manera, el grupo tiol, SH- llega a ser el grupo funcional del vehlculo unido al resto del portador. La reaction para convertir el grupo amino reactivo de la protelna se lleva a cabo en un medio acuoso mezclando la protelna que contiene el vehlculo con el compuesto de formula VI en un medio acuoso. En esta reaccion, la temperatura y la presion no son crlticas y la reaccion se puede llevar a cabo a temperatura ambiente y a presion atmosferica. Las temperaturas desde 10 °C hasta 25 °C son generalmente preferidas. En la siguiente etapa se hace reaccionar el vehlculo con el tiol modificado con el compuesto de formula IV, despues el grupo protector de tiol del vehlculo se retira del producto de reaccion resultante del compuesto de formula V con el vehlculo de protelna.
Cualquier medio convencional para retirar un grupo protector de tiol se puede utilizar para llevar a cabo esta reaccion. Sin embargo, al utilizar un medio para retirar el grupo protector de tiol, se debe tener cuidado de que los reactivos sean solubles en el medio acuoso y de que no destruyan o danen de ningun modo el pollmero de poliamina contenido en el vehlculo. Un medio preferido para retirar este grupo protector es mediante el uso de ditiotreitol como un agente para reducir el producto de condensation resultante. Esta reduction se puede llevar a cabo anadiendo simplemente el agente reductor al medio de reaccion sin utilizar altas presiones o temperaturas. Esta reduccion se puede llevar a cabo a temperatura ambiente y a presion atmosferica. Cualquier agente protector de tiol convencional se puede utilizar en el compuesto de formula VI. Los grupos protectores de tiol son bien conocidos en la materia, siendo el 2-piridilditio el grupo protector preferido.
Aunque que el metodo anterior representa un medio para convertir un grupo amino terminal en el vehlculo que contiene la poliamina polimerica a un grupo tiol, se puede utilizar cualquier medio convencional para llevar a cabo esta conversion. Los metodos para convertir grupos amino terminal en vehlculos que contienen poliamina polimerica a tioles son bien conocidos en la materia y se pueden emplear de acuerdo con la presente invencion.
La reaccion del vehlculo que contiene la poliamina polimerica que tiene un grupo tiol terminal reactivo con el compuesto de formula IV donde X es un grupo funcional capaz de unirse al grupo tiol terminal que lleva el vehlculo se puede llevar a cabo por medios convencionales. En la realizacion preferida, la maleimida que lleva el X en el compuesto de formula IV se hace reaccionar con el grupo tiol que lleva el vehlculo de poliamina polimerica. Cualquier medio bien conocido para la adicion de un tiol a traves de un enlace doble de maleimida se puede utilizar en la production de conjugados de formula VI A que se conjugan mediante un puente de tiol.
El grupo carboxllico y los esteres activos se acoplan al vehlculo o al pollmero inmunogenico por medios convencionales. El grupo amino en el pollmero de poliamina, tal como una protelna, produce un grupo amida que conecta el espaciador al pollmero, inmunogenos o vehlculo y/o conjugados de la presente invencion.
En los inmunogenos conjugados de la presente invencion, los enlaces qulmicos entre el hapteno imatinib que contiene el grupo carboxilo y los grupos amino reactivos en el pollmero de poliamina que esta contenido en el vehlculo o inmunogeno se pueden establecer usando varios metodos conocidos por el experto en la materia. Frecuentemente se prefiere formar enlaces amida. Los enlaces amida se forman en primer lugar activando el resto de acido carboxllico en los compuestos de formula IV-A haciendo reaccionar el grupo carboxilo con un reactivo de grupo de salida (por ejemplo, N-hidroxiuccinimida, 1-hiroxienzotriazol y p-nitrofenol). Se puede usar un agente de activation tal como dicilohexilcarbodiimida y diisopropilcarbodiimida. La forma activada del grupo carboxilo en el hapteno imatinib de formula VI-A se hace reaccionar despues con una solution tamponada que contiene el vehlculo con el grupo amino reactivo.
Por otro lado, cuando X es un isocianato terminal o un radical tioisocianato en el compuesto de formula IV, cuando estos radicales reaccionan con los aminos libres de un pollmero de poliamina producen el conjugado o inmunogeno de formula IV-A donde X' es
imagen10
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
con el grupo amino en el vehlcuio de poliamina o en el polipeptido inmunogenico.
Cuando X, en los compuestos de formula IV contiene un radical aldehldo, estos compuestos se pueden conectar a los grupos amino libres del polipeptido de poliamina en el vehlculo mediante un enlace amino mediante aminacion reductiva. Se puede usar cualquier metodo convencional de condensacion de un aldehldo con una amina tal como la aminacion reductiva para formar este enlace. En este caso, X' en las porciones de ligando de formula IV es -CH2-.
Los compuestos de formula IV se forman haciendo reaccionar el imatinib de formula I con un haluro de formula:
halo-CH2-(Y)p-X VII
en donde p, Y y X son como anteriormente para formar el compuesto de formula IV. Cualquier medio convencional de hacer reaccionar un haluro con el nitrogeno en la amida se puede utilizar en la condensacion del compuesto de formula VII para esta posicion de amida en el imatinib de formula I. El uso de un haluro en el compuesto de formula VII proporciona un medio eficiente para formar tal amida sustituida mediante condensacion con el grupo amida en el compuesto de formula I.
Cuando el compuesto de formula I esta en la forma de su sal es necesario convertir esta sal en su base libre antes de hacerla reaccionar con el compuesto de formula V para formar el compuesto de formula IV. Esto se puede llevar a cabo por medios convencionales tales como la neutralizacion de la sal. Cuando la sal es una sal basica, la neutralization se puede realizar en un medio acuoso mediante adicion de un acido. Cuando la sal es una sal de adicion de acido, la neutralizacion se realiza en un medio acuoso mediante la adicion de una base.
El compuesto de formula IV se puede convertir en los inmunogenos y/o los reactivos del conjugado de la presente invention haciendo reaccionar estos compuestos con un vehlculo que contiene una poliamina o un polipeptido. Se puede utilizar el mismo polipeptido como el vehlculo y como el pollmero inmunogenico en el inmunogeno de la presente invencion siempre que la poliamina o el polipeptido sean inmunologicamente activos. Sin embargo, para formar los conjugados, estos pollmeros no necesitan producir una respuesta inmunitaria tal como necesitan los inmunogenos. De acuerdo con la presente invencion, los diversos grupos funcionales representados por X en los compuestos de formula IV se pueden conjugar con el vehlculo que contiene pollmero con un grupo amino reactivo por medios convencionales de union de un grupo funcional a un grupo amino contenido en el pollmero. De acuerdo con una realization preferida, en el compuesto de formula IV cuando la union es mediante un grupo amino reactivo en el vehlculo, X es un grupo de acido carboxllico o un ester activo del mismo.
ANTICUERPOS
La presente invencion tambien se refiere a nuevos anticuerpos que incluyen anticuerpos monoclonales para imatinib o sus sales farmacologicamente activas producidos mediante la utilization de los inmunogenos mencionados anteriormente. De acuerdo con la presente invencion, se ha descubierto que estos anticuerpos producidos de acuerdo con la presente invencion son reactivos de manera selectiva con imatinib o sus sales farmacologicamente activas y no reaccionan con N-desmetil imatinib que interfiere con los inmunoensayos para imatinib y sus sales farmacologicamente activas. La capacidad de los anticuerpos de la presente invencion para no reaccionar con N- desmetil imatinib hace que estos anticuerpos proporcionen un inmunoensayo para detectar la presencia y/o cuantificar la cantidad de imatinib y sus sales farmacologicamente activas en muestras de fluido de pacientes
La presente invencion se refiere a nuevos anticuerpos y a anticuerpos monoclonales para imatinib o sus sales farmacologicamente activas. El antisuero de la invencion se puede producir de manera conveniente mediante la inmunizacion de animales hospedadores con los inmunogenos de la presente invencion. Los animales hospedadores adecuados incluyen roedores, tal como, por ejemplo, ratones, ratas, conejos y cobayas o mamlferos superiores tales como cabras, ovejas y caballos. Las dosis iniciales, los sangrados y las dosis de refuerzo se pueden dar de acuerdo con los protocolos aceptados para provocar respuestas inmunitarias en animales, por ejemplo, en una realizacion preferida, los ratones recibieron una dosis inicial de 100 ug de inmunogeno/raton, i.p. y dos o mas dosis de refuerzo posteriores de entre 50 y 100 ug de inmunogeno /raton durante un perlodo de seis meses. Mediante el sangrado perlodo de sangrado, se observo que las muestras de sangre de los ratones inmunizados desarrollaban una respuesta inmunitaria frente a la union a imatinib o sus sales farmacologicamente activas utilizando inmunoensayos convencionales. Estos metodos proporcionan una manera conveniente de reconocer hospedadores que estan produciendo antisuero que tiene la actividad deseada. Tambien se reconocieron anticuerpos frente a los metabolitos principales de imatinib o sus sales farmacologicamente activas y no presentaron union sustancial a estos compuestos.
Los anticuerpos monoclonales se producen de manera conveniente mediante la inmunizacion de ratones Balb/c de acuerdo con la pauta anterior seguida por la inyeccion de los ratones con 100 ug de inmunogeno i.p. o i.v. en tres dlas sucesivos comenzando cuatro dlas antes de la fusion celular. Tambien se pueden utilizar otros protocolos en la materia de los anticuerpos. El protocolo de inmunizacion completa detallado en el presente documento proporciono un protocolo optimo para la respuesta de anticuerpos sericos para el anticuerpo contra imatinib o sus sales farmacologicamente activas.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Los linfocitos B obtenidos del bazo, de la sangre periferica, de los ganglios linfaticos u otro tejido del hospedador se puede usar como la celula productora de anticuerpos monoclonales. Lo mas preferido son linfocitos B obtenidos del bazo. Los hibridomas capaces de generar los anticuerpos monoclonales deseados de la invention se obtienen fusionando tales linfocitos B con una llnea celular inmortal, que es una llnea celular que proporciona estabilidad a largo plazo del cultivo tisular en la celula hlbrida. En la realization preferid de la invencion, la celula inmortal puede ser una celula linfoblastoide o una celula de plasmocitoma tal como una celula de mieloma, en si misma una celula productora de anticuerpos pero tambien maligna. Los hibridomas murinos que producen anticuerpos monoclonales para imatinib o sus sales farmacologicamente activas se forman mediante la fusion de celulas de mieloma de raton y celulas de bazo de ratones inmunizados frente a conjugados de protelna con imatinib o sus sales farmacologicamente activas. Los anticuerpos monoclonales quimericos y humanizados se pueden producir mediante la donation de los genes que expresan anticuerpos a partir de las celulas de hibridoma y empleando metodos de ADN recombinante bien conocidos en la actualidad en la tecnica para unir la subsecuencia de la region variable de raton a las regiones constantes humanas o para combinar regiones marco humanas con regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una inmunoglobulina de rata o de raton donador. Un metodo mejorado para llevar a cabo la humanization de anticuerpos monoclonales murinos que proporciona anticuerpos de afinidades mejoradas se expone en la Solicitud de Patente Internacional WO 92/11018.
Se pueden producir fragmentos de polipeptido que comprenden solo una parte de la estructura primaria de los anticuerpos, cuyos fragmentos poseen una o mas actividades de inmunoglobulina. Estos fragmentos de polipepido se pueden producir mediante escision proteolltica de anticuerpos intactos mediante metodos bien conocidos en la materia o mediante la insertion de codones de parada en los lugares deseados en vectores de expresion que contienen los genes de anticuerpo usando mutagenesis de sitio dirigido para producir fragmentos Fab o fragmentos (Fab')2. Los anticuerpos de cadena simple se pueden producir uniendo las regiones CL y VH con un enlazador de ADN (vease Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 85:5879-5883 (1988) y Bird et al., Science, 242:423-426 (1988))
Los anticuerpos de la presente invencion son selectivos para imatinib y sus sales farmacologicamente activas sin tener ninguna reactividad cruzada con N-desmetil imatinib. Ademas, estos anticuerpos no presentan reactividad cruzada de manera sustancial con ninguno de sus metabolitos de imatinib terapeuticamente activos o inactivos. Sin tener reactividad cruzada significa que los anticuerpos de la presente invencion tienen una reactividad cruzada en relation con imatinib y sus sales farmacologicamente activas con estos metabolitos, particularmente N-desmetil imatinib, de menos del 15 %, preferentemente de menos del 10 %.
INMUNOENSAYOS
De acuerdo con la presente invencion, los conjugados y los anticuerpos generados a partir de los inmunogenos de estos compuestos de formula IV se pueden utilizar como reactivos para la determination de imatinib o sus sales farmacologicamente activas en muestras de pacientes. Esta determinacion se realiza por medio de un inmunoensayo. Cualquier inmunoensayo en el que los conjugados de reactivo formados a partir de los compuestos de formula iV compiten con el imatinib o sus sales farmacologicamente activas en la muestra por los sitios de union en los anticuerpos generados de acuerdo con la presente invencion se pueden utilizar para determinar la presencia de imatinib o sus sales farmacologicamente activas en una muestra de pacientes. El modo de llevar a cabo tal ensayo para imatinib o sus sales farmacologicamente activas en una muestra de la que se sospecha que contiene imatinib o sus sales farmacologicamente activas, comprende combinar (a) una muestra de medio acuoso, (b) un anticuerpo para imatinib o sus sales farmacologicamente activas generado de acuerdo con la presente invencion y (c) los conjugados formados a partir de los compuestos de formula IV o las mezclas de los mismos. La cantidad de imatinib o sus sales farmacologicamente activas en la muestra se puede determinar midiendo la inhibition de la union al anticuerpo especlfico de una cantidad conocida del conjugado anadido a la mezcla de la muestra y anticuerpos. El resultado de la inhibicion de tal union de la cantidad conocida de conjugados mediante la muestra desconocida se compara con los resultados obtenidos en el mismo ensayo utilizando soluciones patron conocidas de imatinib o sus sales farmacologicamente activas. En la determinacion de la cantidad de imatinib o sus sales farmacologicamente activas en una muestra desconocida, la muestra, los conjugados formados a partir de los compuestos de la formula IV y el anticuerpo se pueden anadir en cualquier orden.
Se pueden utilizar diversos medios para medir la cantidad de conjugado formado a partir de los compuestos de formula IV unido al anticuerpo. Un metodo es cuando la union de los conjugados al anticuerpo provoca una disminucion en la tasa de rotation de un conjugado de fluoroforo. La cantidad de descenso en la tasa de rotation de un conjugado de fluoroforo en la mezcla llquida se puede detectar mediante la tecnica de polarization fluorescente tal como la desvelada en la Patente de Estados Unidos 4.269.511 y la Patente de Estados Unidos 4.420.568.
Por otra parte, el anticuerpo se puede recubrir o adsorber sobre nanopartlculas de manera que cuando estas partlculas reaccionen con los conjugados de imatinib o sus sales farmacologicamente activas formados a partir de los compuestos de formula IV, estas nanopartlculas formen un agregado. Sin embargo, cuando las nanopartlculas recubiertas de o con anticuerpo adsorbido reaccionen con el imatinib o sus sales farmacologicamente activas en la muestra, el imatinib o sus sales farmacologicamente activas de la muestra unidas a estas nanopartlculas no genera la agregacion de las nanopartlculas de anticuerpo. La cantidad de agregacion o aglutinacion se puede medir en la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
mezcla de ensayo mediante absorbancia.
Por otra parte, estos ensayos se pueden llevar a cabo teniendo bien el anticuerpo o bien los conjugados de imatinib o sus sales farmacologicamente activas unidas a un soporte solido tal como una placa de microtitulacion o cualquier otro soporte solido convencional, incluyendo partlculas solidas. La union de anticuerpos y protelnas a tales partlculas solidas es bien conocida en la materia. Cualquier metodo convencional se puede utilizar para llevar a cabo tales uniones. En muchos casos, con el fin de ayudar a la medicion, se pueden colocar etiquetas sobre los anticuerpos, los conjugados o las partlculas solidas, tales como etiquetas radiactivas o etiquetas de enzima, como ayuda en la deteccion de la cantidad de los conjugados formados a partir de los compuestos de formula IV que se unen o desunen del anticuerpo, Otras etiquetas adecuadas incluyen cromoforos, fluoroforos, etc.
Por cuestiones de conveniencia, los componentes del ensayo de la presente invencion se pueden proporcionar en un kit, una combinacion empaquetada con cantidades predeterminadas de nuevos reactivos empleados en el ensayo para imatinib o sus sales farmacologicamente activas. Estos reactivos incluyen el anticuerpo de la presente invencion, as! como, los conjugados formados a partir de los compuestos de la formula IV.
Ademas de estos reactivos necesarios, se pueden incluir aditivos tales como reactivos auxiliares, por ejemplo, estabilizantes y tampones. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solucion de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo, Los reactivos se pueden proporcionar en solucion o como polvos secos, normalmente liofilizados, que incluyen excipientes que en disolucion proporcionaran una solucion de reactivo que tiene las concentraciones adecuadas para realizar el ensayo.
Ejemplos
En los ejemplos, las siguientes abreviaturas se usan para designar lo siguiente:
NaH
hidruro sodico
THF
tetrahidrofurano
DMF
dimetilformamida
LiOH
Hidroxido de litio
EDC
clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
Sulfo-NHS
N-hidroxisulfosuccinimida
DMSO
dimetilsulfoxido
MeOH
metanol
CH2Cl2
diclorometano
APCI
espectrometrla de masas de ionizacion qulmica a presion atmosferica
TLC
Cromatografla en capa fina
HOAc
acido acetico
CHCI3
cloroformo
HPLC
Cromatografla llquida de alta presion
ANS
acido 8-anilino-1-naftalenosulfonico
HRP
peroxidasa de rabano picante
TMB
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina
TRIS
clorhidrato de Tris(hidroximetil)aminometano
BSA
albumina de suero bovino
KLH
hemocianina de lapa californiana
PBS
solucion salina tamponada con fosfato
diH2O
agua desionizada
En los ejemplos, el Esquema 1 a continuacion expone los compuestos especlficos preparados y citados mediante numeros en los Ejemplos. La composicion de tampon de fosfato tiene una solucion acuosa que contiene fosfato de sodio dibasico (Na2HPO4) 15,4 mM, fosfato de sodio monobasico (NaH2HPO4) 4,6 mM, pH = 7,2±0,10
El eter usado en los Ejemplos fue dietileter. Las partes o porcentajes dados en estos ejemplos son partes por volumen.
Esquema 1
imagen11
Ejemplos
5
Ejemplo 1
Extraccion de mesilato de imatinib
10 Se trituraron con un mortero y una maja hasta hacer polvo fino catorce comprimidos, conteniendo cada uno 400 mg del imatinib como la sal de mesilato; el recubrimiento del comprimido no se elimino primero. El polvo de los comprimidos triturados se agito en 1500 ml de MeOH al 10 % (por volumen)/CH2Cl2 durante cuatro horas. La mezcla de los comprimidos triturados que contiene mesilato de imatinib se filtro a traves de Celite y se elimino el disolvente para proporcionar 7,14 gramos de un solido amarillo que contiene mesilato de imatinib. El solido amarillo 15 que contiene mesilato de imatinib se disolvio en 75 ml de cloroformo caliente al 20 % (por volumen) en etanol para producir una solucion de mesilato de imatinib, despues se anadieron 50 ml de eter:etanol a 1:1 (volumen:volumen), provocando que la solucion de mesilato de imatinib se volviese turbia. El enfriamiento en hielo indujo la precipitacion de mesilato de imatinib, que continuo progresando con la adicion lenta de eter. El mesilato de imatinib precipitado se deposito en capas con eter, se cubrio y se permitio que se estabilizase toda la noche.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El mesilato de imatinib precipitado se recogio mediante filtracion y se lavo con 50 ml de etanol frlo al 10 % (por volumen) en eter, despues se seco al vaclo para obtener 6,42 g (el 115 %) de mesilato de imatinib como un solido amarillo claro. La recristalizacion de mesilato de imatinib a partir de cloroformo/etanol con la ayuda de eter se llevo a cabo una segunda vez para proporcionar 4,45 g (el 79 %) de mesilato de imatinib como un solido amarillo claro. Este solido amarillo claro de mesilato de imatinib aislado a partir de los comprimidos se uso en el Ejemplo 2. La estructura se confirmo mediante RMN y analisis elemental. La pureza se confirmo mediante HPLC.
Ejemplo 2
Preparacion de la base libre de imatinib
La sal de mesilato de imatinib (1) (1,01 g, 1,71 mmol) preparada en el Ejemplo 1 se anadio a 250 ml de diclorometano para formar una suspension de mesilato de imatinib. Se anadieron 50 ml de NaHCO3 acuoso saturado al 10 % y se mezclo bien con la suspension de mesilato de imatinib en diclorometano para producir la base libre de imatinib en la capa organica (diclorometano). La emulsion formada a partir del NaHCO3 acuoso y el diclorometano se retiro mediante filtracion, produciendo una capa organica de diclorometano que contiene el imatinib como la base libre y una capa acuosa. La capa organica de diclorometano que contiene imatinib como la base libre se separo de la capa acuosa. La capa organica se seco sobre Na2SO4/MgSO4. Para aislar la base libre de imatinib, la capa organica (diclorometano) se filtro para eliminar el Na2SO4/MgSO4 y despues se separo, produciendo un solido que contiene la base libre de imatinib. Se anadio tolueno al solido que contiene la base libre de imatinib y se evaporo rapidamente tres veces y despues se seco al vaclo para eliminar cualquier resto de agua. La base libre de imatinib se obtuvo como un solido blanco y se uso en el ejemplo 3. La base libre de imatinib presento datos de RMN de 1H, 13C y de APCI consistentes con la estructura. Las asignaciones de RMN se basaron en un experimento DQF-COSY.
Ejemplo 3
Preparacion de etilester de acido butlrico de Imatinib
La base libre de imatinib seca preparada en el ejemplo 2 se disolvio en 35 ml de DMF seco en nitrogeno y se enfrio en hielo. La mezcla que contiene imatinib se agito de manera eficaz y el hidruro de sodio solido (dispersion del 60 % en aceite mineral, 0,111 g, 2,78 mmol, 1,6 equiv.) se anadieron a la vez. Una solucion de 4-bromobutirato de etilo (0,59 g, 3,0 mmol, 1,8 equiv.) en 3,5 ml de DMF se anadio lentamente mediante una jeringa a la mezcla que contiene imatinib, y se dejo que la reaccion para producir el etilester de acido butlrico de imatinib (2) tuviera lugar durante la noche, calentandose a temperatura ambiente con el bano. El analisis in situ de la mezcla de la reaccion mediante APCI(+) mostro un m/z = 608,3 (100 %), 494,2 (30 %), y 722,4 (5 %) uma, correspondiente con el etilester de acido butlrico de imatinib (2), material de partida de imatinib, y un etilester de acido dibutlrico de imatinib, respectivamente.
La mezcla de reaccion se diluyo con 100 ml de diclorometano, se enfrio en hielo y se desactivo con 10 ml de agua. Se separaron el diclorometano que contiene los etilesteres de acido butlrico de imatinib y las capas acuosas. Para aumentar el rendimiento, se extrajo la capa acuosa con 3 x 50 ml de diclorometano y 2 x 25 ml de acetato de etilo. Las fracciones organicas combinadas que contienen los derivados de etilester de acido butlrico de imatinib se separaron, dejando una mezcla de derivados de imatinib. Para aislar el etilester de acido butlrico de imatinib, se sometio a la mezcla a cromatografla en 100 g de gel de sllice usando un gradiente de metanol/diclorometano del 550 %. El etilester de acido butlrico de imatinib resultante (2) tenia una masa de 0,61 g (el 59 %) de TLC Rf = 0,36 (MeOH: CHCl3: HOAc a 1:4:0,05). APCI (+) m/z = 608,3 uma.
Ejemplo 4
Hidrolisis de etilester de acido butlrico de imatinib
Se disolvio etilester de acido 4-{[4-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-benzoil]-[4-metil-3-(4-piridin-3-il-pirimidin-2-ilamino)- fenil]-amino}-butirico (2) (1.21 g, 2,0 mmol, 1 equiv.) en 60 ml de THF y se enfrio en hielo. Se anadio una solucion de UOHH2O (0,28 g, 6,7 mmol, 3,4 equiv.) en 20 ml de agua por goteo mientras se agitaba. La reaccion de hidrolisis se incubo durante 3 h a 0 °C y despues se dejo que procediese durante la noche, mientras se calentaba a temperatura ambiente para producir el acido libre, acido butlrico de imatinib.
Tras el enfriamiento, a la mezcla de reaccion que contiene el acido butlrico de imatinib en hielo, se le anadio HCl 0,5 M (aq) por goteo para obtener un pH de 5-6. Se separaron los disolventes volatiles para proporcionar un producto de reaccion en bruto que contiene el acido butlrico de imatinib como un solido blanco. Para eliminar impurezas, el producto de la reaccion en bruto se trituro en agua, se recogio por filtracion y se seco al vacio y despues se trituro en eter para proporcionar el derivado de acido butlrico de imatinib, compuesto 3, como un solido amarillo, de masa 0,99 g (el 86 %) como la sal parcial de HCl. Punto de fusion: 203-207 °C (dec). TLC Rf = 0,26 (7:1:0,1) CH2O2: MeOH:NH4OH APCI (+) m/z = 580,2 uma. La RMN de 1H (dmso-d6, 80 °C) es consistente con la estructura. El analisis para C33H37N7Oa-1,65H2O0,1HCl requiere C: 64,48; H: 6,25; N: 15,83; Cl: 0,63. C encontrado: 64,65; H: 6,64; N: 15,99; Cl: 0,58. la pureza de la HPLC fue del 100 %.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Ejemplo 5
Preparacion de ester de imatinib activado por Sulfo-NHS
El acido butlrico de imatinib se derivatizo (3) mediante la reaccion con EDC y sulfo-NHS para producir el ester de imatinib activado por sulfo-NHS para la conjugacion eventual con las protelnas (ejemplos 6a, b, 7). A los 5 ml de DMSO anhidro agitado se le anadio compuesto 3 (94 mg, 0,16 mmol), seguido de EDC (94 mg, 0,49 mmol) y sulfo- NHS (107 mg, 0,49 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 18 horas en nitrogeno para producir el ester de imatinib activado por sulfo-NSH. La mezcla de reaccion se uso de manera directa en los Ejemplos 6a y 6b.
Ejemplo 6a
Preparacion de inmunogeno de Imatinib
Se preparo una solucion de protelna de KLH disolviendo 300 mg de KLH en 19,6 ml de tampon fosfato (50 mM, pH 7,5) y despues se anadieron lentamente 39,2 ml de DMSO mientras se agitaba la solucion de protelna de KLH en hielo. La agitacion continuo durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente, seguido de la adicion del derivado de imatinib activado por sulfo-NHS (4) preparado en el Ejemplo 5 (2,532 ml, 0,08 mmol). La mezcla de reaccion de KLH y el derivado de imatinib activado (4) se dejaron en agitacion durante 18 horas a temperatura ambiente en una botella de cristal ambar, produciendo un conjugado de imatinib-KLH (5). El conjugado de imatinib- KLH se purifico despues mediante dialisis frente a DMSO al 66 % en tampon fosfato (50 mM, pH 7,5) a temperatura ambiente. A continuacion, la proporcion de DMSO se redujo de manera gradual: al 60 %, al 50 %, al 40 %, al 20 %, al 10 % y al 0 %. La ultima dialisis se realizo frente a tampon fosfato a 4 °C. El conjugado de imatinib-KLH (5) se caracterizo mediante espectroscopla de ultravioleta-visible. El conjugado se diluyo a una concentracion final de 2 mg/ml en tampon fosfato (50 mM, pH 7,5).
Ejemplo 6b
Preparacion de inmunogeno de Imatinib
Se preparo un inmunogeno de Imatinib como en el Ejemplo 6a excepto en que el conjugado de imatinib-KLH (5) se diluyo a una concentracion final de 2 mg/ml en tampon fosfato y DMSO (50 % en volumen).
Ejemplo 7
Preparacion de conjugado de Imatinib-BSA con derivado 4
Se preparo una solucion de protelna de BSA disolviendo 1.000 mg de BSA en tampon fosfato (50 mM, pH 7,5) a una concentracion final de 50 mg/ml. Se anadieron lentamente 40 ml de DMSO a la solucion de protelna de BSA mientras se agitaba en hielo. La agitacion continuo durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente, seguido de la adicion del derivado de imatinib activado por sulfo-NHS (4) preparado en el Ejemplo 5 (0,437 ml, 0,014 mmol). La cantidad de derivado de imatinib activado por sulfo-NHS (4) anadida a la solucion de protelna de BSA se calculo para una proporcion molar de 1:1 entre el derivado de imatinib (4) y BSA. La mezcla de BSA y derivado de imatinib activado (4) se dejo en agitacion durante 18 horas a temperatura ambiente en una botella de cristal ambar para producir el conjugado del ester de imatinib activado (4) y BSA. Este conjugado se purifico despues mediante dialisis frente a DMSO al 66 % en tampon fosfato (50 mM, pH 7,5) a temperatura ambiente. A continuacion, la proporcion de DMSO se redujo de manera gradual: al 60 %, al 50 %, al 40 %, al 20 %, al 10 % y al 0 %. La ultima dialisis se realizo frente a tampon fosfato a 4 °C. El conjugado de imatinib-BSA se caracterizo mediante espectroscopla UV/VIS.
Ejemplo 8a
Preparacion de anticuerpos policlonales para Imatinib
Se inmunizaron de manera i.p. dos grupos de diez ratones BALB/c hembras, un grupo con 100 pg/raton de inmunogeno de imatinib-KLH tal como se prepara en el Ejemplo 6a (10 ratones) y el otro grupo con 100 pg/raton de inmunogeno de imatinib-KLH (10 ratones) emulsionado en adyuvante completo de Freund tal como se prepara en el Ejemplo 6b. A los ratones se les reforzo una vez cuatro semanas despues de la inyeccion inicial con 100 pg /raton de los mismos inmunogenos emulsionados en adyuvante incompleto de Freund. Veinte dlas despues, se obtuvieron de cada raton sangrados del ensayo de refuerzo que contienen anticuerpos policlonales mediante sangrado orbital. El antisuero de estos sangrados de ensayo contenla anticuerpos de imatinib se evaluaron en los Ejemplos 9, 10a y 11.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Ejemplo 8b
Preparacion de anticuerpos monoclonales para Imatinib
Los ratones del ejemplo 8a que se inmunizaron con imatinib-KLH preparado en 6b se usaron para producir anticuerpos monoclonales. Para los anticuerpos monoclonales, comenzando tres dlas antes de la fusion, se inyecto i.p. a los ratones con 400 pg (3 dlas antes de la fusion), 200 pg (2 dlas antes de la fusion) y 200 pg (1 dla antes de la fusion) de imatinib-KLH en PBS/DMSO preparado en el ejemplo 6b. Las celulas del bazo se aislaron a partir de los ratones seleccionados y se fusionaron con 2 x 107 celulas SP2/0 con polietilenglicol 1500 al 50 %, de acuerdo con el metodo de Coligan, J.E. et al., eds., Current Protocols in Immunology, 2.5.1 - 2.5.8, (1992), Wiley & Sons, NY. Las celulas fusionadas se colocaron en diez placas de 96 pocillos en DMEM/F12 suplementado con FetalClone I al 20 %, L-glutamina al 2 % (100 mM) y 50X HAT al 2 %. Dos o tres semanas despues, el sobrenadante de hibridoma se ensayo para la presencia de anticuerpos anti-imatinib mediante ELISA (como en el ejemplo 10b). Las celulas de los pocillos que dieron resultados positivos en el ELISA (ejemplo 10b) se expandieron a placas de 24 pocillo. Los clones positivos mediante ELISA se subclonaron dos veces mediante dilucion limitante de acuerdo con el metodo desvelado en Coligan, J.E. et al., eds., Current Protocols in Immunology, 2.5.8 - 2.5.17, (1992), Wiley & Sons, NY. Los sobrenadantes de cultivo de hibridoma que contienen anticuerpos monoclonales de subclones seleccionados se confirmaron para la union a imatinib mediante un ELISA competitivo (ejemplo 11). Estos anticuerpos monoclonales se ensayaron para la union de imatinib y la reactividad cruzada a un metabolito principal de imatinib, N-desmetil imatinib, mediante ensayo de placa de microtitulacion competitivo indirecto tal como se describe en el ejemplo 11.
Ejemplo 9
Procedimiento de sensibilizacion de placas de microtitulacion con conjugado de imatinib-BSA
El metodo ELISA para medir concentraciones de imatinib se realizo en placas de microtitulacion (Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules) optimizadas para la union a protelna y que contienen 96 pocillos por placa. Cada pocillo se recubrio con el conjugado de imatinib-BSA (preparado como en el Ejemplo 7) anadiendo 300 pl de conjugado de imatinib-BSA a 10 pg/ml en carbonato de sodio 0,05 M, a pH 9,6, e incubando durante tres horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con carbonato de sodio 0,05 M, a pH 9,6 y despues de bloquearon con 375 pl de sacarosa al 5 %, solucion de caseinato de sodio al 0,2 % durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la retirada dela solucion post-recubrimiento, las placas se secaron a 37 °C durante toda la noche.
Ejemplo 10a
Procedimiento de seleccion de anticuerpos - Tltulo
Este procedimiento es para descubrir la dilucion de anticuerpos a usar para el desplazamiento tal como en el Ejemplo 11. El metodo de ELISA para seleccionar anticuerpos de imatinib (producidos en el Ejemplo 8a y 8b) se realizo con las placas de microtitulacion que se sensibilizaron con el conjugado de imatinib-BSA preparado en el Ejemplo 9. El ensayo de seleccion de anticuerpos se realizo diluyendo el suero murino de los sangrados de ensayo (como en el Ejemplo 8a) que contiene anticuerpos policlonales de imatinib a 1:2.000, 1:6.000, 1:20.000 y 1:50.000 (volumen/volumen) en solucion salina tamponada con fosfato que contiene BSA al 0,1 % y timerosal al 0,01 %. Para la evaluacion de anticuerpos monoclonales, los sobrenadantes de hibridoma del Ejemplo 8b, que se descubrieron que eran positivos para la presencia de anticuerpo mediante el procedimiento del Ejemplo 10b se diluyeron a 1:2, 1:4, 1:16, etc. (volumen/volumen) en solucion salina tamponada con fosfato que contiene BSA al 0,1 % y timerosal al 0,01 %. A cada pocillo de los pocillos sensibilizados con imatinib-BSA (preparados en el ejemplo 9) se le anadieron 50 pl de solucion salina tamponada con fosfato que contiene BSA al 0,1 % y timerosal al 0,01 % y 50 pl de anticuerpo diluido y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitacion. Durante esta incubacion, el anticuerpo se une al conjugado de imatinib absorbido de manera pasiva en los pocillos (Ejemplo 9). Los pocillos de las placas se lavaron tres veces con TRIS 0,02 M, NaCl al 0,9 %, Tween-80 al 0,5 % y timerosal al 0,001 %, a pH 7,8 para eliminar cualquier anticuerpo desunido. Para detectar la cantidad de anticuerpo de imatinib unido al conjugado de imatinib-BSA en los pocillos, se anadieron a cada pocillo 100 pl de un conjugado de anticuerpo de cabra anti-raton con enzima HRP (Jackson Immunoresearch) diluido a una actividad especlfica (aproximadamente 1/3000) en PBS con BSA al 0,1 %, ANS al 0,05 %, timerosal al 0,01 % capaz de unirse de manera especlfica con inmunoglobulinas de murino y producir un producto de color cuando se incuba con un sustrato, en este ejemplo, TMB. Despues de incubacion de 10 minutos a temperatura ambiente con agitacion, durante la que el conjugado de anticuerpo de cabra anti-raton con enzima HRP se une a los anticuerpos de imatinib en los pocillos, las placas se lavaron de nuevo tres veces para eliminar el conjugado de anticuerpo de cabra anti- raton con enzima HRP no unido. Para desarrollar un color medible en los pocillos, el lavado fue seguido por la adicion de 100 pl de TMB (sustrato TMB, BioFx), el sustrato para HRP, para desarrollar color durante una incubacion de 10 minutos con agitacion a temperatura ambiente. Tras la incubacion para el desarrollo del color, se anadieron 50 pl de solucion de parada (fluoruro sodico al 1,5 % en di H2O) a cada pocillo para detener el desarrollo del color y tras 20 segundos de agitacion se determino la absorbancia a 650 nm (lector de placa de Molecular Devices). La cantidad de anticuerpo en un pocillo fue proporcional a la absorbancia medida y se expreso como la dilucion (tltulo) que da como resultado una absorbancia de 1,5. Los tltulos se determinaron representando graficamente la dilucion de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
anticuerpo del anticuerpo medido (eje x) frente a la absorbancia a 650 nm (eje y) e interpolando el tltulo a una absorbancia de 1,5. El tltulo que produjo la absorbancia de 1,5 determino la concentracion (dilucion) de anticuerpo usado en el ensayo de placa de microtitulacion competitivo indirecto descrito en el Ejemplo 11.
Ejemplo 10b
Procedimiento de seleccion de anticuerpos - Seleccion monoclonal
El metodo de ELISA para seleccionar anticuerpos monoclonales de imatinib (producidos en el Ejemplo 8b) se realizo con las placas de microtitulacion que se sensibilizaron con imatinib-BSA tal como se describe en el ejemplo 9. A cada pocillo de los pocillos sensibilizados con imatinib-BSA (preparados en el ejemplo 9) se le anadieron 50 pl de solucion salina tamponada con fosfato que contiene BSA al 0,1 % y timerosal al 0,01 % y despues 50 pl de sobrenadante de cultivo monoclonal y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitacion. Durante esta incubacion, el anticuerpo se une al conjugado de imatinib en el pocillo. Los pocillos de las placas se lavaron tres veces con TRIS 0,02 M, 0,9 % de NaCl, Tween-80 al 0,5 % y timerosal al 0,001 %, a pH 7,8 para eliminar cualquier anticuerpo desunido. Para detectar la cantidad de anticuerpo de imatinib unido al conjugado de imatinib-BSA en los pocillos, se anadieron a cada pocillo 100 pl de un conjugado de anticuerpo de cabra anti-raton con enzima HRP (Jackson Immunoresearch) diluido a 1/3000 en PBS con BsA al 0,1 %, ANS al 0,05 %, timerosal al 0,01 % capaz de unirse de manera especlfica con inmunoglobulinas de murino y producir un producto de color cuando se incuba con un sustrato, en este ejemplo, TMB. Despues de incubacion de 10 minutos a temperatura ambiente con agitacion, durante la que el conjugado de anticuerpo de cabra anti-raton con enzima HRP se une a los anticuerpos de imatinib en los pocillos, las placas se lavaron de nuevo tres veces para eliminar el conjugado de anticuerpo de cabra anti-raton con enzima hRp no unido. Para desarrollar un color medible en los pocillos, el lavado fue seguido por la adicion de 100 pl de TMB (sustrato TMB, BioFx), el sustrato para HRP, para desarrollar color durante una incubacion de 10 minutos con agitacion a temperatura ambiente. Tras la incubacion para el desarrollo del color, se anadieron 50 pl de solucion de parada (fluoruro sodico al 1,5 % en di H2O) a cada pocillo para detener el desarrollo del color y tras 10 segundos de agitacion se determino la absorbancia a 650 nm (lector de placa de Molecular Devices). La cantidad de anticuerpo en un pocillo fue proporcional a la absorbancia medida. Las muestras con una absorbancia de mas de tres o mas veces de fondo se designaron como positivas. Cincuenta muestras con la absorbancia mas alta se expandieron a placas de 24 pocillos, tal como se describe en el Ejemplo 8b.
Ejemplo 11
Procedimiento de inmunoensayo competitivo indirecto en placa de microtitulacion que determina la CI50 y la reactividad cruzada para anticuerpos de Imatinib
El metodo de ELISA para determinar los valores de la CI50 y la reactividad cruzada se realizo con las placas de microtitulacion que se sensibilizaron con imatinib-BSA descritas en los Ejemplos 9. Analitos - imatinib y N-desmetil imatinib se diluyeron en diH2O sobre un intervalo de concentracion de 10 a 1.000.000 ng/ml. Cada uno de los ensayos se realizo incubando 50 pl de la solucion de imatinib con 50 pl de uno de los anticuerpos seleccionados a partir de los anticuerpos policlonales producidos en el Ejemplo 8a con el inmunogeno del Ejemplo 6a y los producidos en el Ejemplo 8a con el inmunogeno del ejemplo 6b y el anticuerpo monoclonal producido en el Ejemplo 8b. Todos estos ensayos se realizaron diluyendo la concentracion de anticuerpos en cada uno de los pocillos al tltulo determinado en el Ejemplo 10a. Durante la incubacion de 10 minutos (T.A., con agitacion) se da una competicion de la union de anticuerpos para el conjugado de imatinib-BSA en el pocillo (producida en el ejemplo 9) y el analito en solucion. Tras esta incubacion, los pocillos de la placa se lavaron tres veces con TRIS 0,02 M, 0,9 % de NaCl, Tween-80 al 0,5 % y timerosal al 0,001 %, a pH 7,8 para retirar cualquier material que no estaba unido. Para detectar la cantidad de anticuerpo de imatinib unido al conjugado de imatinib-BSA en los pocillos (producida en el ejemplo 9), se anadieron a cada pocillo 100 pl de un conjugado de anticuerpo de cabra anti-raton con enzima HRP (Jackson Immunoresearch) diluido a una actividad especlfica predeterminada (aproximadamente 1/3000) en PBS con BSA al 0,1 %, ANS al 0,05 %, timerosal al 0,01 % capaz de unirse de manera especlfica con inmunoglobulinas de murino y producir un producto de color cuando se incuba con un sustrato, en este ejemplo, TMB. Despues de incubacion de 10 minutos a temperatura ambiente con agitacion, durante la que el conjugado de anticuerpo de cabra anti-raton con enzima HRP se une a los anticuerpos de imatinib en los pocillos, las placas se lavaron de nuevo tres veces para retirare el conjugado secundario no unido. Para desarrollar un color medible en los pocillos, el lavado fue seguido por la adicion de 100 pl de TMB (sustrato TMB, BioFx), el sustrato para HRP, para desarrollar color en una incubacion de 10 minutos con agitacion a temperatura ambiente. Tras la incubacion para el desarrollo del color, se anadieron 50 pl de solucion de parada (fluoruro sodico al 1,5 % en di H2O) a cada pocillo para detener el desarrollo del color y tras 20 segundos de agitacion se determino la absorbancia a 650 nm (lector de placa de Molecular Devices). La cantidad de anticuerpo en un pocillo fue proporcional a la absorbancia medida e inversamente proporcional a la cantidad de imatinib en la muestra. Las CI50 de imatinib y N-desmetil imatinib se determinaron construyendo curvas de respuesta a la dosis con la absorbancia en los pocillos representada frente a la concentracion de analito en los pocillos. La absorbancia del color en los pocillos que contienen el analito se comparo con la de sin analito y se genero una curva patron. El valor de CI50 se definio como la concentracion de analito que se requiere para tener el 50 % de la absorbancia de los pocillos que no contienen analito. La reactividad cruzada se calculo como la proporcion de la CI50 de mesilato de imatinib frente a la CI50 de N-desmetil imatinib y se expreso
como un porcentaje. Cuando se midio con este grupo de anticuerpos, el porcentaje de reactividades cruzadas referido al imatinib para N-desmetil imatinib fue menor o igual al 7 %. Los resultados para los anticuerpos policlonales para imatinib estan en la tabla I a continuacion. Cuando se midio con los anticuerpos monoclonales seleccionados, el porcentaje de reactividades cruzadas referido a imatinib para N-desmetil imatinib fue menor del 4 5 %. Los resultados para los anticuerpos monoclonales para imatinib estan en la tabla II a continuacion.
TABLAI
Reactividad cruzada de inmunoensayo competitivo que usa anticuerpos policlonales para imatinib (Ejemplo ________________________________________8a)___________________________________
N.° de sangrado 1 2 3 4 5
Producido a partir de uno o dos grupos de diez ratones con inmunogeno preparado en el ejemplo: 6b 6b 6b 6a 6a
Analito
Imatinib 100 % 100 % 100 % 100 % 100 %
N-desmetil imatinib
1 % 5 % 2 % 7 % 1 %
TABLA II
Reactividad cruzada de inmunoensayo competitivo que usa anticuerpos monoclonales para imatinib (Ejemplo 8b).
Analito
Numero de anticuerpo monoclonal
9F2-4-29
9F2-4-31
Imatinib
100 % 100 %
N-desmetil imatinib
2,7 % 3,2 %
10
Tal como se ve a partir de las Tablas I y II, los anticuerpos producidos de acuerdo con la presente invencion que fueron sustancialmente reactivos con el mesilato de imatinib y sustancialmente no reactivos con el metabolito, N- desmetil imatinib.
15

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un inmunoensayo para detectar imatinib y sus sales farmacologicamente activas en una muestra que comprende proporcionar una mezcla de una muestra, un anticuerpo reactivo de manera selectiva con imatinib y sus sales 5 farmacologicamente activas que tiene una reactividad cruzada con N-desmetil imatinib de menos del 15 % y un conjugado de un vehfculo que contiene un polfmero que tiene bien un grupo tiol o un grupo amino reactivos con un compuesto de la formula:
    imagen1
    10
    o sus sales farmacologicamente activas,
    en donde Y es un grupo espaciador organico;
    X es un grupo funcional terminal capaz de unirse a dicho vehfculo mediante dichos grupos amino o tiol y;
    15 p es un numero entero de 0 a 1;
    provocando que el imatinib y sus sales farmacologicamente activas en la muestra y dicho conjugado se unan con dicho anticuerpo y posteriormente medir la cantidad de dicho conjugado en dicha mezcla que esta unido o desunido a dicho anticuerpo, por lo que se puede determinar la presenta de imatinib o sus sales farmacologicamente activas 20 en la muestra.
  2. 2. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde p es 1.
  3. 3. Un inmunoensayo de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde Y es alquileno que contiene de 1 a 10 atomos de 25 carbono,
    imagen2
    o
    30
    imagen3
    en donde n y o son numeros enteros de 0 a 6 y m es un numero entero de 1 a 6.
    35 4. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde X es
    imagen4
    -N=C — R4j o
    imagen5
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    en donde R3 es hidrogeno o tomado junto con su atomo de oxlgeno unido forma un ester reactivo y R4 es oxlgeno o azufre.
  4. 5. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra es una muestra humana.
  5. 6. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo se genera a partir de un inmunogeno que comprende un vehlculo inmunogenico que contiene un pollmero que tiene bien un grupo tiol o un grupo amino reactivos unidos a un compuesto de la formula:
    imagen6
    o sus sales farmacologicamente activas,
    en donde Y, X y p son tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  6. 7. Un inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo o el conjugado se unen a un soporte solido, preferentemente placas de microtitulacion o nanopartlculas.
  7. 8. Un anticuerpo que se une de manera selectiva a imatinib y sus sales farmacologicamente activas y tiene una reactividad cruzada con N-desmetil imatinib de menos del 15 %.
  8. 9. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 8, en donde dicho anticuerpo proviene de ratones, conejos o ratas.
  9. 10. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
  10. 11. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
  11. 12. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde dicho anticuerpo proviene de un inmunogeno de un vehlculo inmunogenico que contiene un pollmero que tiene bien un grupo tiol o un grupo amino reactivo conjugados con un compuesto de la formula:
    imagen7
    o sus sales farmacologicamente activas,
    en donde Y, X y p son tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 5
  12. 13. Un compuesto de la formula:
    imagen8
    10 o sus sales farmacologicamente activas,
    en donde Y, X y p son tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
    15
  13. 14. Un conjugado que comprende un vehlculo que contiene un pollmero que tiene bien un grupo tiol o un grupo amino reactivos conjugados con un compuesto de la formula:
    imagen9
    o sus sales farmacologicamente activas,
    en donde Y, X y p son tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  14. 15. Un inmunogeno que comprende un vehfculo inmunogenico que contiene un polfmero que tiene bien un grupo tiol 5 o un grupo amino reactivos conjugados con un compuesto de la formula:
    imagen10
    o sus sales farmacologicamente activas,
    10 en donde Y, X y p son tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  15. 16. Un inmunogeno de acuerdo con la reivindicacion 15, en donde el polfmero inmunogenico contiene uno o mas grupos amino unidos mediante
    15
    en donde P4 es oxfgeno o azufre.
    -C-o -NH-C-
    II II
    O R4
  16. 17. Un kit para determinar la presencia de imatinib o sus sales farmacologicamente activas en una muestra de 20 paciente que comprende reactivos en envases separados, siendo uno de los reactivos un conjugado de un vehfculo que contiene un polfmero que tiene bien un grupo tiol o un grupo amino reactivos con un compuesto de la formula:
    imagen11
    o sus sales farmacologicamente activas,
    en donde Y, X y p son tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4;
    y un segundo reactivo en un recipiente separado que es un anticuerpo que se une de manera selectiva a imatinib y sus sales farmacologicamente activas y que tiene una reactividad cruzada con N-desmetil imatinib de menos del 15
    %.
  17. 18. Un kit segun la reivindicacion 17, en donde dicho conjugado esta presente en una cantidad predeterminada en dicho primer envase.
  18. 19. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 17 o la reivindicacion 18, en donde dicho kit se usa para determinar 5 la cantidad de imatinib y sus sales farmacologicamente activas en dicha muestra,
    10
  19. 20. Un kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en donde dicho anticuerpo se genera a partir de un vehfculo inmunogenico que contiene un polfmero que tiene bien un grupo tiol o un grupo amino reactivos unido a un compuesto de la formula:
    imagen12
    o sus sales farmacologicamente activas,
    en donde Y, X y p son tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
ES10810301.1T 2009-08-19 2010-04-01 Inmunoensayo de imatinib Active ES2645390T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US543699 1983-10-20
US12/543,699 US8076097B2 (en) 2009-08-19 2009-08-19 Imatinib immunoassay
PCT/US2010/029566 WO2011022089A1 (en) 2009-08-19 2010-04-01 Imatinib immunoassay

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2645390T3 true ES2645390T3 (es) 2017-12-05

Family

ID=43605685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10810301.1T Active ES2645390T3 (es) 2009-08-19 2010-04-01 Inmunoensayo de imatinib

Country Status (9)

Country Link
US (3) US8076097B2 (es)
EP (1) EP2467139B1 (es)
JP (1) JP5695049B2 (es)
CN (1) CN102625702B (es)
AU (1) AU2010284614B2 (es)
BR (1) BR112012003602A2 (es)
CA (1) CA2769998C (es)
ES (1) ES2645390T3 (es)
WO (1) WO2011022089A1 (es)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201211634D0 (en) * 2012-06-28 2012-08-15 Randox Lab Assay for benzylpiperazine and metabolites
CN104755093B (zh) 2012-08-21 2018-11-16 詹森药业有限公司 奥氮平半抗原的抗体及其用途
AU2013305879B2 (en) 2012-08-21 2017-10-12 Saladax Biomedical Inc. Antibodies to aripiprazole and use thereof
WO2014031584A1 (en) * 2012-08-21 2014-02-27 Janssen Pharmaceutica Nv Haptens of aripiprazole and their use in immunoassays
CN104736566A (zh) 2012-08-21 2015-06-24 奥索临床诊断有限公司 帕潘立酮半抗原的抗体及其用途
AU2013305970B2 (en) 2012-08-21 2017-08-17 Saladax Biomedical Inc. Antibodies to aripiprazole haptens and use thereof
ES2926662T3 (es) 2012-08-21 2022-10-27 Janssen Pharmaceutica Nv Anticuerpos contra haptenos de risperidona y uso de los mismos
WO2014141306A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Rajiv Gandhi Centre For Biotechnology Methods and materials for identifying therapeutic response in chronic myeloid leukemia
EP3173785B1 (en) * 2014-07-23 2020-11-25 Konica Minolta, Inc. Labeling reagent containing a molecularly targeted drug
CN104804079B (zh) * 2015-05-11 2018-07-13 苏州博源医疗科技有限公司 伊马替尼免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法
CA3075773A1 (en) 2017-09-21 2019-03-28 Becton, Dickinson And Company Hazardous contaminant collection kit and rapid testing
AU2020215639A1 (en) 2019-01-28 2021-08-05 Becton, Dickinson And Company Hazardous contaminant collection device with integrated swab and test device
US20200393451A1 (en) 2019-06-13 2020-12-17 Becton, Dickinson And Company Multiplexed turbidimetric immunoassays to monitor environmental contamination
CN112924668B (zh) * 2021-01-26 2022-08-12 北京丹大生物技术有限公司 一种伊马替尼和/或n-去甲基伊马替尼的免疫学检测方法
CN112946282B (zh) * 2021-01-26 2022-08-09 北京丹大生物技术有限公司 一种用于检测伊马替尼和/或n-去甲基伊马替尼的检测试剂和检测试剂盒
CN112920163B (zh) * 2021-01-26 2023-09-26 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种伊马替尼和n-去甲基伊马替尼的半抗原、抗原和抗体以及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2325739T3 (es) * 2004-11-18 2009-09-15 Saladax Biomedical Inc. Medicion enzimatica de mesilato de imatinib.
CA2602849C (en) 2005-03-30 2013-06-04 Saladax Biomedical Inc. Doxorubicin immunoassay
JP2010500283A (ja) 2006-05-31 2010-01-07 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー チロシンキナーゼ阻害剤を用いて炎症性疾患を治療する方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2769998C (en) 2017-09-12
EP2467139A1 (en) 2012-06-27
JP2013502580A (ja) 2013-01-24
US8076097B2 (en) 2011-12-13
EP2467139B1 (en) 2017-09-20
AU2010284614A1 (en) 2012-02-23
JP5695049B2 (ja) 2015-04-01
WO2011022089A1 (en) 2011-02-24
CN102625702B (zh) 2016-03-30
BR112012003602A2 (pt) 2016-04-12
CN102625702A (zh) 2012-08-01
US8263749B2 (en) 2012-09-11
US20110045608A1 (en) 2011-02-24
EP2467139A4 (en) 2013-06-19
US8273860B2 (en) 2012-09-25
US20120045782A1 (en) 2012-02-23
US20120045470A1 (en) 2012-02-23
AU2010284614B2 (en) 2013-05-23
CA2769998A1 (en) 2011-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2645390T3 (es) Inmunoensayo de imatinib
ES2400773T3 (es) Inmunoensayo de 5-fluoro-uracilo
CA2790408C (en) Risperidone immunoassay
ES2357249T3 (es) Inmunoensayo de docetaxel.
ES2347336T3 (es) Inmunoanalisis del taxol.
WO2011112358A1 (en) Lenalidomide and thalidomide immunoassays
US7175993B2 (en) Taxol immunoassay
ES2675107T3 (es) Inmunoensayo de clozapina
US20120302740A1 (en) Vincristine immunoassay
US20140273023A1 (en) Gemcitabine immunoassay
EP2715340A1 (en) Gemcitabine immunoassay
US20110136253A1 (en) Irinotecan Immunoassay
US20110165699A1 (en) Irinotecan immunoassay
WO2012067670A1 (en) Irinotecan immunoassay
AU2012259309A1 (en) Gemcitabine immunoassay