JP5685243B2 - 薬剤キャリア、その調製方法及び使用 - Google Patents

Description

本発明は、薬剤キャリア、その調製方法及び使用に関し、特には抗ヘリコバクターピロリのための薬剤キャリア、その調製方法及び使用に関する。

ヘリコバクターピロリは、生物の胃及び十二指腸において主に見られるグラム陰性菌である。ヘリコバクターピロリは、胃粘膜層の表面に付着した際に胃壁の表面において曇った膜を形成し、ＮＨ_３及びＣＯ_２を生成するように胃において尿素を加水分解するためのウレアーゼを生成し、それにより中和して胃内のｐＨ値をｐＨ４．５−ｐＨ７．４に上昇させる。このようなｐＨ値は、生物の胃におけるヘリコバクターピロリの定着に適している。

統計によると、世界の人口の５０％以上が、消化器系においてヘリコバクターピロリに感染している。いくらかのヘリコバクターピロリ感染者は、胃粘膜の慢性炎症、消化性潰瘍、及び胃癌といった症状に苦しんでいる。消化性潰瘍は主に、胃の幽門又は小腸の十二指腸において生じ、消化性潰瘍の患者はたいてい、胃潰瘍の患者として診断される。胃潰瘍の通常の症状は、腹痛、食欲喪失、体重減少等である。

アモキシシリン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン及びメトロニダゾールといった抗菌薬は通常、ヘリコバクターピロリ感染により引き起こされる疾患の治療のために臨床において用いられる。しかしながら、抗菌薬はしばしば胃酸により分解され、又は胃粘膜を経てヘリコバクターピロリの定着部位に到達することができないため、抗菌薬治療では、良好な治療効果を得ることができていなかった。加えて、抗菌薬治療を受けた患者は頻繁に、目まい、腹痛、下痢、アレルギー等の副作用に苦しむ。

上記の観点において、ヘリコバクターピロリ感染に関連する疾患をより効果的に治療し得る薬剤がいまだに必要とされる。本発明は、前述の需要を研究し、ヘリコバクターピロリを標的とし、及び特定のｐＨコンディション下で膨張又は崩壊することのできる薬剤キャリアを提供する。したがって、薬剤キャリアは、抗ヘリコバクターピロリ薬を封入するために用いられ得、それにより、ヘリコバクターピロリの定着部位に到達するのを助けて抗ヘリコバクターピロリ効果を達成させる。

本発明の第一の目的は、
アミノ基（−ＮＨ_２）を有する生体適合性ポリマーである第一の成分と；
グルコース、フコース、ガラクトサミン、マンノース、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるサッカライドと；
生物適合性マテリアルである第二の成分と；
を含有し、
サッカライドは、第一の成分のアミノ基（−ＮＨ_２）により第一の成分に結合し、第一の成分は、イオン結合により第二の成分に結合することを特徴とする薬剤キャリアを提供することである。

本発明の他の目的は、抗ヘリコバクターピロリ薬の製造における前述の薬剤キャリアの使用を提供することである。

本発明のさらなる目的は、
（ａ）グルコース、フコース、ガラクトサミン、マンノース、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるサッカライドが結合した、アミノ基（−ＮＨ_２）を有する生体適合性ポリマーである第一の成分を提供することと；
（ｂ）サッカライドが結合した第一の成分を水に溶解して、第一の溶液を提供することと；
（ｃ）生物適合性マテリアルである第二の成分を水に溶解して、第二の溶液を提供することと；
（ｄ）任意に、活性剤、保護剤、架橋剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される第三の成分を含有する第三の溶液を提供することと；
（ｅ）第一の溶液、第二の溶液、及び任意の第三の溶液を混合させて、薬剤キャリアを形成することを含む、薬剤キャリアの調製方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、有効量の前述の薬剤キャリアを必要に応じて対象に投与することを含む、ヘリコバクターピロリに関連した疾患又はコンディションを治療又は軽減するための方法を提供することである。

詳細な技術及び本発明のために実施された好ましい実施態様は、この技術分野における当業者が特許請求の範囲に記載された発明の特徴をよく理解できるように、添付された図面とともに後述の段落において記載される。

フコース結合キトサンのフーリエ変換赤外分光の図である。 アモキシシリンを封入したフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアのフーリエ変換赤外分光の図である。 （Ａ）〜（Ｅ）は、種々のｐＨコンディションにおける、ゲニピンにより架橋されアモキシシリンを封入したフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアの写真の図である。 マウスのカンピロバクター様菌アッセイの結果を示す写真の図である。 ＦＡ−アモキシシリン溶液のヘリコバクターピロリへのターゲティングを示す蛍光染色イメージの図である。 本発明のナノ薬剤キャリアのヘリコバクターピロリへのターゲティングを示す蛍光染色イメージの図である。 本発明のナノ薬剤キャリアのヘリコバクターピロリへのターゲティングを示す蛍光染色イメージの図である。

本発明のいくつかの実施態様が下記に詳細に開示される。しかしながら、本発明の精神から逸脱することなく、本発明は種々の実施態様において具体化され得、本明細書に記載される実施態様に限定されるべきではない。加えて、本明細書において他に言及のない限り、本明細書において（特に後述の特許請求の範囲において）用いられる“一”、“該”又は同様の用語は、単数形式及び複数形式の両方を包含するように理解されるべきである。

前述の通り、抗菌薬がヘリコバクターピロリ感染患者の治療において臨床的に用いられる場合、抗菌薬はしばしば胃酸により分解されてその治療効果を維持させることができず、又は抗菌薬は胃粘膜を通過するのが困難であるためにヘリコバクターピロリを良好に除去することができず、その結果、抗菌薬では良好な治療結果を達成することができない。本発明は、伝統的治療法の不利な点を克服し、ヘリコバクターピロリをターゲティングし得る薬剤キャリアを提供する。それは、胃粘膜層のバリアを通過し得、胃酸から抗ヘリコバクターピロリ薬を保護し、その結果薬剤の有用性を増加させ、良好な生物適合性を有する。

したがって、本発明は、アミノ基（−ＮＨ_２）を有する生体適合性ポリマーである第一の成分と；グルコース、フコース、ガラクトサミン、マンノース、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるサッカライドと；生物適合性マテリアルである第二の成分と；を含有する薬剤キャリアを提供する。サッカライドは、第一の成分のアミノ基（−ＮＨ_２）により第一の成分に結合し、第一の成分は、イオン結合により第二の成分に結合する。

本発明の薬剤キャリアにおいて、第一の成分は、アミノ基（−ＮＨ_２）を有するいかなる適切な生体適合性ポリマーであってもよい。例えば、限定されることなく、第一の成分は、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、エチレン グリコール−キトサン、ポリ（エチレン グリコール）−キトサン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。好ましくは、第一の成分は、キトサン、ゼラチン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。

本発明に適するサッカライドは、ヘリコバクターピロリの表面に結合し得るいかなるサッカライドであってもよい。例えば、限定されることなく、本発明の薬剤キャリアは、グルコース、フコース、ガラクトサミン、マンノース、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるサッカライドを含み得る。好ましくは、本発明の薬剤キャリアは、フコースを含む。

特定の理論に縛られることを望むものではないが、本発明の薬剤キャリアにおいて、サッカライドは第一の成分のヒドロキシル基（−ＯＨ）及びアミノ基（−ＮＨ_２）により第一の成分に結合し得ると考えられる。一般に、本発明の薬剤キャリアにおけるサッカライドは、サッカライドと結合する第一の成分の全アミノ基（−ＮＨ_２）が約５％から約３０％となり得る量であり、好ましくは約１０％から約１５％である。加えて、本発明の薬剤キャリアが第一の成分として複数のマテリアルを含む場合（例えば、第一の成分としてゼラチン及びキトサンの２つのマテリアルを用いる場合）、実際の要求及び製造の利便性に依存して、採用されるサッカライドは、ヘリコバクターピロリのターゲティングという目的を達成し得る限り、各々のマテリアルに結合してもよく、又は一つのマテリアルのみに結合してもよい。

本発明の薬剤キャリアはまた、第二の成分を含有し得、それは、イオン結合により第一の成分に結合し得る、いかなる生体適合性マテリアルであってもよい。例えば、限定されることなく、第二の成分は、抗ヘリコバクターピロリといった薬剤活性を有する物質であってもよい。例えば、第二の成分は、主成分として、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、及びエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）（ＥＧＣＧは最も高い割合のカテキンを作る）を含有するカテキンといった、茶ポリフェノールであってもよい。第二の成分はまた、薬剤活性を持たない生物適合性マテリアルであってもよく、例えば、ヘパリン、ポリ（グルタミン酸）、トリポリリン酸、ポリ（アクリル酸）、リン脂質、アルギン酸ナトリウム、及びこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。本発明のいくつかの態様において、薬剤キャリアの第二の成分は、ヘパリン、ポリ（グルタミン酸）、アルギン酸ナトリウム、及びこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。

特定の理論に縛られることを望むものではないが、本発明の薬剤キャリアにおいて、キャリアの調製プロセスの間、第一の成分は調製溶液において正電荷を有する物質として解離され、第二の成分は負電荷を有する物質として解離されていると考えられる。第一の成分及び第二の成分は、陽イオンと陰イオンとの間のイオン性相互作用により互いに引きつけられており、イオン結合により互いに結合し、本発明の薬剤キャリアを提供する。概して、本発明の薬剤キャリアにおいて、第一の成分及び第二の成分は、約１：０．１−１、好ましくは約１：０．２−０．４の重量比で用いられる。

本発明の薬剤キャリアは、薬剤キャリアの適用性を高めるために、任意に第三の成分を含有していてもよい。例えば、限定されることなく、第三の成分は、活性剤、保護剤、架橋剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。活性剤は、例えば、限定されることなく、アモキシシリン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、メトロニダゾール、クルクミン、ベルベリン、及びこれらの組み合わせを含む、抗ヘリコバクターピロリ活性を有する成分であってもよい。好ましくは、活性剤は、アモキシシリン又はクルクミンのうち少なくともいずれか一方である。保護剤は、トレハロース、グルコース、ラクトース、グリセリン、及びこれらの組み合わせといった、後の凍結乾燥プロセスにおいて薬剤キャリアの構造を保護し得る凍結防止剤であってもよい。架橋剤については、それは、薬剤キャリアの構造的安定性を向上させるように、本発明の薬剤キャリアにおいて第一の成分及び／又は第二の成分と架橋し得、酸性コンディション（例えば、胃液におけるｐＨ１．２のコンディション）で薬剤キャリアを安定的に維持し、一方で中性コンディション（例えば、胃粘膜層における、又はヘリコバクターピロリが感染した胃上皮細胞のコンディションにおけるｐＨ７．４のコンディション）で崩壊し始めて活性剤及び活性物質を放出する。例えば、限定されることなく、本発明の薬剤キャリアにおいて有用な架橋剤は、グルタルアルデヒド、ゲニピン、エポキシ樹脂、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、塩化カルシウム、及びこれらの組み合わせからなる群より選択され得る。好ましくは、本発明の薬剤キャリアは、架橋剤としてゲニピン又は塩化カルシウムのうち少なくともいずれか一方を含む。

第三の成分が存在する場合で、薬剤キャリアの所望の特性が影響を受けない前提のもとでは、第三の成分の量は、それが所望の薬剤の効果、保護効果、及び／又は架橋効果を提供し得る限りにおいて、特に制限されない。概して、第三の成分、活性剤が存在する場合、本発明の薬剤キャリアにおける第一の成分、第二の成分、及び活性剤は、約１：０．１−１：０．１−１の重量比、好ましくは約１：０．２−０．４：０．２−０．４の重量比で用いられる。第三の成分、保護剤が存在する場合、第一の成分、第二の成分、及び保護剤は、約１：０．１−１：１−１０の重量比、好ましくは約１：０．２−０．４：３−５の重量比で用いられる。第三の成分、架橋剤が存在する場合、第一の成分、第二の成分、及び架橋剤は、約１：０．１−１：０．０２−０．２の重量比、好ましくは約１：０．２−０．４：０．０５−０．１の重量比で用いられる。２つ又は３つの第三の成分が存在する場合、各成分の量は、前述の通りである。例えば、活性剤、保護剤、及び架橋剤が存在する場合、第一の成分、第二の成分、活性剤、保護剤、及び架橋剤は、約１：０．１−１：０．１−１：１−１０：０．０２−０．２の重量比、好ましくは約１：０．２−０．４：０．２−０．４：３−５：０．０５−０．１の重量比で用いられる。

本発明の薬剤キャリアは、ナノの形態、微粒子の形態、ヒドロゲルの形態等であってもよい。例えば、適切な調製プロセス下において、ゼラチンが第一の成分として用いられる場合、アルギン酸ナトリウムは通常、第二の成分として用いられる。塩化カルシウムは、ヒドロゲルの形態における薬剤キャリアを提供するように、架橋剤として用いられ得る。他の例を挙げると、ゼラチンが第一の成分として用いられ、カテキンが第二の成分として用いられる場合、微粒子の形態における薬剤キャリアが提供され得る。さらに、ゼラチン又はキトサンが第一の成分として用いられ、ヘパリン又はポリ（グルタミン酸）が第二の成分として用いられる場合、ナノの形態における薬剤キャリアが通常提供され得る。生物体への経口投与のための薬剤キャリアの粒子サイズは、バイオアベイラビリティを最大化させるように、薬剤キャリアを、胃粘膜層のバリアを経て感染部位に良好に到達させるために、好ましくはナノ−スケールであると考えられる。したがって、胃粘膜層のバリアを良好に通過するように、本発明の薬剤キャリアの粒径は、好ましくは約１００ｎｍから約４μｍ、より好ましくは約１５０ｎｍから約１μｍ、最も好ましくは約２００ｎｍから約５００ｎｍである。

本発明のいくつかの態様によれば、薬剤キャリアは、アモキシシリンを封入したフコース結合キトサン／ヘパリンナノキャリア、クルクミンを封入したフコース結合キトサン／ポリ（グルタミン酸）ナノキャリア、又はフコース結合キトサン／ゼラチン／ＥＧＣＧナノキャリアである。薬剤キャリアは好ましくは、ゲニピンにより架橋され、アモキシシリンを封入し、トレハロースを含有するフコース結合キトサン／ヘパリンナノキャリアである。

本発明の薬剤キャリアは、ヘリコバクターピロリの表面に結合することのできるサッカライドを含むため、それは特異的にヘリコバクターピロリをターゲットとすることができる。本発明の薬剤キャリアが抗ヘリコバクターピロリ活性剤（例えば、アモキシシリン、クラリスロマイシン、及びクルクミン）を封入し、又は第二の成分として抗ヘリコバクターピロリ活性物質（例えばＥＧＣＧ）を含む場合、それは、活性剤又は活性物質がヘリコバクターピロリ感染部位に到達するのを促進する。したがって、本発明の薬剤キャリアは、薬剤を製造するために、具体的には抗ヘリコバクターピロリ薬剤を製造するために用いられ得、該薬剤は、消化性潰瘍、胃炎、又は胃癌の治療又は軽減の効果を達成し得る。

前述の通り、本発明の薬剤キャリアは、ヘリコバクターピロリをターゲットとし得、抗ヘリコバクターピロリ活性剤を封入し得、又は第二の成分として抗ヘリコバクターピロリ活性物質を含有するため、本発明はまた、有効量の前述の薬剤キャリアを必要に応じて対象に投与することを含む、消化性潰瘍、胃炎又は胃癌を治療又は軽減させるといった、ヘリコバクターピロリに関連する疾患又はコンディションを治療又は軽減させる方法を提供する。各々の成分のタイプ及び量は、前述の通りである。

本発明はまた、下記の工程：
（ａ）グルコース、フコース、ガラクトサミン、マンノース、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるサッカライドが結合した、アミノ基（−ＮＨ_２）を有する生体適合性ポリマーである第一の成分を提供することと；
（ｂ）サッカライドが結合した第一の成分を水に溶解して、第一の溶液を提供することと；
（ｃ）生物適合性マテリアルである第二の成分を水に溶解して、第二の溶液を提供することと；
（ｄ）任意に、活性剤、保護剤、架橋剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される第三の成分を含有する第三の溶液を提供することと；
（ｅ）第一の溶液、第二の溶液、及び任意の第三の溶液を混合させて、薬剤キャリアを形成させること（第一の成分、第二の成分、活性剤、保護剤、及び架橋剤は前述の通り規定される）；
を含む、前述の薬剤キャリアの調製方法を提供する。

本発明による方法の工程（ａ）において、サッカライドが結合した第一の成分は、例えば、サッカライド及び第一の成分を別々に同じ又は異なる溶媒に溶解させ、その後、２つの溶液を混合させ、サッカライドを第一の成分と反応させ、サッカライドを第一の成分に結合させることにより提供され得る。この点において、特定の理論に縛られることを望むものではないが、サッカライドの−ＯＨが第一の成分の−ＮＨ_２と反応して結合（ｇｒａｆｔｉｎｇ）が達成され得ると考えられる。サッカライド及び第一の成分を溶解させるのに有用な溶媒は、水、酢酸、又はこれらの混合物といった成分を含む。メタノール、エタノール、又はこれらの混合物といった他の溶媒がさらに、結合（ｇｒａｆｔｉｎｇ）プロセスを促進させるために、それに加えられ得る（通常、第一の成分の溶液に加えられる）。

本発明の一実施態様において、工程（ａ）は、（サッカライドとしての）フコースの水溶液及び（第一の成分としての）キトサンの溶液（酢酸／メタノール＝１／１）を混合させ、約５−８時間、暗所、室温にて、還元剤の存在下で混合物を攪拌することを含む。その後、溶媒及び未反応のマテリアルを凍結乾燥により除去し、フコース結合キトサンを得ることができる。本発明において有用である還元剤は、限定されることなく、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ_３）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）等を含む。結合（ｇｒａｆｔｉｎｇ）プロセスを行う際、所望の結合（ｇｒａｆｔｉｎｇ）レベル及び製造の利便性に依存して、コンディション（例えば、サッカライド溶液及びキトサン溶液の濃度、攪拌速度、並びに反応時間）が調節され得る。

その後、工程（ｂ）において、サッカライドが結合した第一の成分を水に溶解させて、第一の成分を提供する。さらに、工程（ｃ）において、第二の成分を水に溶解させて、第二の溶液を提供する。そして、任意の工程（ｄ）において、活性剤、保護剤、架橋剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される第三の成分を含む第三の溶液が提供される。第三の溶液で用いられる溶媒は、本発明の薬剤キャリアに悪影響を及ぼさず、第三の成分を溶解することができる限り、特に限定されることはない。例えば、第三の溶液で用いられる溶媒は、水、酢酸、メタノール、エタノール、ジメチルスルフォキシド、ポリビニルアルコールといった極性溶媒から選択され得る。

第一の溶液、第二の溶液、及び任意の第三の溶液を提供した後、第一の溶液、第二の溶液、及び任意の第三の溶液を工程（ｅ）において混合させ、本発明の薬剤キャリアを形成する。第三の溶液が存在する場合、第一の溶液、第二の溶液、及び第三の溶液は、いかなる適切な順序においても混合され得る。例えば、第一の溶液及び第二の溶液を最初に混合し、その後、第三の溶液を混合する。あるいは、第一の溶液及び第三の溶液を最初に混合し、その後、第二の溶液を混合する。第一の溶液、第二の溶液、及び第三の溶液を同時に混合する。

本発明の方法において、得られる薬剤キャリアの特性は、用いられる第一の成分及び第二の成分（及び任意の第三の成分）及び混合コンディション（例えば、混合の順番、混合時間、及び攪拌速度）を選択することにより、制御及び調節され得る。概して、第一の成分及び第二の成分は、約１：０．１−１の重量比、好ましくは約１：０．２−０．４の重量比で用いられる。第三の成分、活性剤が存在する場合、本発明の方法における第一の成分、第二の成分、及び活性剤は、約１：０．１−１：０．１−１の重量比、好ましくは約１：０．２−０．４：０．２−０．４の重量比で用いられる。第三の成分、保護剤が存在する場合、第一の成分、第二の成分、及び保護剤は、約１：０．１−１：１−１０の重量比、好ましくは約１：０．２−０．４：３−５の重量比で用いられる。第三の成分、架橋剤が存在する場合、第一の成分、第二の成分、及び架橋剤は、約１：０．１−１：０．０２−０．２の重量比、好ましくは約１：０．２−０．４：０．０５−０．１の重量比で用いられる。２つ又は３つの第三の成分が存在する場合、各成分の量は、前述の通りである。例えば、活性剤、保護剤、及び架橋剤が同時に存在する場合、第一の成分、第二の成分、活性剤、保護剤、及び架橋剤は、約１：０．１−１：０．１−１：１−１０：０．０２−０．２の重量比、好ましくは約１：０．２−０．４：０．２−０．４：３−５：０．０５−０．１の重量比で用いられる。

本発明の方法の一実施態様において、ナノの形態におけるフコース結合キトサン／ヘパリン薬剤キャリアは、下記の工程により調製され得る：
（１）６時間、室温にて、ＮａＣＮＢＨ_３の存在下でフコースとキトサンとの間の結合（ｇｒａｆｔｉｎｇ）反応を行い、その後、サンプルを凍結乾燥させ、フコース結合キトサンを収集する；
（２）得られたフコース結合キトサンを水に溶解させる；
（３）ヘパリンを水に溶解させる；及び
（４）キトサン溶液及びヘパリン溶液を均一に混合させ、得られたナノ薬剤キャリアを収集する。

第三の成分を含有するフコース結合キトサン／ヘパリン薬剤キャリアの調製のために、（活性剤としての）アモキシシリン、（凍結防止剤としての）トレハロース、及び／又は（架橋剤としての）ゲニピンといった第三の成分を水に溶解させ、溶液を前述の調製プロセスより得られたナノキャリアと混合させ、１２０分間、室温にて攪拌する。その後、サンプルを凍結乾燥させ、形成されたナノ薬剤キャリアを収集する。このプロセスにおいて、アモキシシリン、トレハロース、及びゲニピンを第三の成分に同時に加える場合、ゲニピンにより架橋され、アモキシシリンを封入し、トレハロースを含有する、フコース結合キトサン／ヘパリンナノキャリアが得られ得る。

本発明による方法の他の態様において、ヒドロゲルの形態におけるフコース結合ゼラチン／アルギン酸ナトリウム薬剤キャリアが、下記の工程：
（１）６時間、室温にて、ＮａＣＮＢＨ_３の存在下、フコースとゼラチンとの間の結合（ｇｒａｆｔｉｎｇ）反応を行い、その後、サンプルを凍結乾燥させ、フコース結合ゼラチンを収集する；
（２）得られたフコース結合ゼラチンを水に溶解させる；
（３）アルギン酸ナトリウムを水に溶解させる；
（４）ゼラチン溶液及びアルギン酸ナトリウム溶液を均一に混合させる；及び
（５）（４）の混合溶液をシリンジに充填させ、塩化カルシウム溶液にゆっくりと滴下し、ヒドロゲルの形態における薬剤キャリアを形成させる；
により調製され得る。ヒドロゲルの形態における形成された薬剤キャリアは、安定的な構造を有し、酸性コンディション（例えば、胃液におけるｐＨ１．２のコンディション）で安定的である一方、中性コンディション（例えば、胃粘膜層における、又はヘリコバクターピロリが感染した胃上皮細胞のコンディションにおけるｐＨ７．４のコンディション）で崩壊し始め活性剤及び／又は活性物質を放出し得る。したがって、ヒドロゲルの形態における薬剤キャリアは、活性剤を封入するように用いられ得、又は本発明のナノ薬剤キャリアは、所望の薬剤を調製するように用いられ得る。

本発明の方法において、架橋剤を用いることに加えて、得られる薬剤キャリアの安定性は、工程（ｅ）において油−水エマルジョンを形成させることで向上し得、封入率は活性剤が封入されるコンディション下で増加し得る。例えば、第一の溶液及び第三の溶液を工程（ｅ）で最初に混合させ、その後、第二の溶液と混合させ得、界面活性剤を含有する油性溶液を、第二の溶液と混合させる前にそれに加える。具体的には、工程（ｅ）は下記の工程を含む：（ｅ１）第一の溶液及び第三の溶液を混合させて、第一の混合溶液を形成させる；（ｅ２）第一の混合溶液及び界面活性剤を含有する油性溶液を混合させて、第二の混合溶液を形成させる；及び（ｅ３）第二の混合溶液及び第二の溶液を混合させて、薬剤キャリアを形成させる。界面活性剤は、例えば、限定されることなく、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ２０、Ｓｐａｎ４０、Ｓｐａｎ６０、Ｓｐａｎ８０等であってもよい。油性溶液における油は、例えば、限定されることなく、パラフィン油、大豆油であってもよい。概して、界面活性剤及び油は、約０．００５−０．０２：１の容積比で用いられる。

本発明による方法の一実施態様において、油／水エマルション法の形成による薬剤キャリアの調製は、最初にフコース結合キトサン溶液及びアモキシシリン溶液を均一に攪拌して混合させ；Ｔｗｅｅｎ２０を含むパラフィン油溶液を加え、ホモジナイザーを用いて（例えば１５０００−２５０００ｒｐｍ）低温で混合物を攪拌して、均一な混合溶液を形成させ；その後ヘパリン溶液を前述の均一な混合溶液と均一に混合させ；最後に遠心分離によりアモキシシリンを封入したサッカライド結合薬剤キャリアを得ることを含む。この方法により得られる薬剤キャリアは通常、ナノの形態である。

本発明はさらに、下記の通り特定の実施例により詳細に記述される。しかしながら、下記の実施例は本発明を記述するために単に提供されたものにすぎず、本発明の範囲はそれにより限定されない。加えて、本明細書において他に言及のない限り、後に用いられる“％”の単位は、“重量／容積％”を意味する。

（実施例１）活性剤を封入したナノ薬剤キャリアの調製
（１）フコース結合キトサン（以下、“フコース−キトサン”という）の調製
キトサンを５０ｍＬの溶媒（１％酢酸：メタノール＝１：１）に溶解して１％キトサン溶液を提供し、０．５ｇのグルコースを１０ｍＬの脱イオン水に溶解した。フコース溶液及びキトサン溶液を混合し、それに０．１ｇのＮａＣＮＢＨ_３を加え、混合液を６時間、暗所、室温にて、マグネチックスターラーで攪拌した。反応溶液を３日間透析し、未反応のＮａＣＮＢＨ_３を除去した。その後、サンプルを凍結乾燥し、フコース−キトサンを得た。

得られたフコース−キトサンをフーリエ変換赤外分光法により分析した。結果を図１に示す。キトサンは、１５７２ｃｍ^−１でＮＨ_３ ^＋官能基のシグナルを示し；フコースは、２９００ｃｍ^−１及び３４５０ｃｍ^−１でＣＨ及びＯＨ官能基のシグナルを示し；フコース−キトサンは、ＮＨ_３ ^＋官能基のシグナル（１５６８ｃｍ^−１）及びＣＨ及びＯＨ官能基のシグナル（２９２３ｃｍ^−１−３４５７ｃｍ^−１）の両方を示す。フコースは良好にキトサンに結合したことが示される。

（２）フコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアの調製
（１）より得られたフコース−キトサンを水に溶解して０．１２％のフコース−キトサン溶液（１０ｍＬ）を調製し、それに０．１％ヘパリン水溶液（２ｍＬ）を加え、１０分間室温にて攪拌した。その後、サンプルを遠心分離し、沈殿したフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアを収集した。得られたフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアを、下記の実験のために、０．５ｍＬの脱イオン水に溶解させた。

得られたフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアをフーリエ変換赤外分光法により分析した。結果を図２に示す。フコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアは、３４６２ｃｍ^−１−２９０６ｃｍ^−１でフコースのＣＨ官能基のシグナル及びＯＨ官能基のシグナルを示し；１５７０ｃｍ^−１でキトサンのＮＨ_３ ^＋官能基のシグナルを示し；１２４０ｃｍ^−１でヘパリンのＳＯ_４ ⁻官能基のシグナルを示す。

（３）架橋剤で架橋されたフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアのの調製
１２．０％のトレハロース（凍結防止剤）溶液（０．５ｍＬ）及び０．０７５％のゲニピン（架橋剤）（０．５ｍＬ）を均一に混合し、それに（２）で得られた０．５ｍＬのフコース−キトサン／ヘパリンナノキャリア溶液を加えた。サンプルを２時間、室温で攪拌し、ゲニピンにより架橋されたフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアを形成させた。架橋されたナノ薬剤キャリアを、一晩、−２０℃で保存し、凍結乾燥により収集した。

得られたナノ薬剤キャリアを、透過電子顕微鏡法により観察した。粒径は、約２５０ｎｍである。

（４）活性剤を封入した架橋剤で架橋されたフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアの調製
１．６％アモキシシリン溶液（０．１２５ｍＬ）及び２４．０％トレハロース（凍結防止剤）溶液（０．１２５ｍＬ）を均一に混合し、０．２５ｍＬの０．０７５％ゲニピン（架橋剤）を加え、アモキシシリン／トレハロース／ゲニピンの混合物を形成させた。それに（１）で得られたフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリア溶液（０．５ｍＬ）を加え、サンプルを２時間、室温で攪拌し、ゲニピンにより架橋され、アモキシシリンを封入したフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアを形成させた。

ゲニピンにより架橋され、アモキシシリンを封入したフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアを、フーリエ変換赤外分光法により分析した。結果を図２に示す。架橋剤、ゲニピンは、１６２８ｃｍ^−１でＣ＝Ｃ官能基のシグナルを示し；得られた、ゲニピンにより架橋され、アモキシシリンを封入したフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアもまた、Ｃ＝Ｃ官能基のシグナルを示す（１６３６ｃｍ^−１）。この結果により、ゲニピンは良好にフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアを架橋したことが示される。

得られたナノ薬剤キャリアを、透過電子顕微鏡法により観察した。結果を図３（Ａ）に示す。ナノ薬剤キャリアの粒径は、約２００ｎｍ−約３００ｎｍであることが示された。

（５）得られたナノ薬剤キャリアの薬剤封入率
得られたナノ薬剤キャリアの抗菌薬を封入する能力（すなわち、封入率）を、高速液体クロマトグラフィーにより求めた。最初に、（４）で得られたナノ薬剤キャリアを１５０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を収集し、段階希釈した。希釈サンプル（５０μＬ）を、３０／７０％（容積／容積）のアセトニトリル及び０．１Ｍリン酸二水素ナトリウムを含む移動相で、分析システムに注入し、ナノ薬剤キャリアに封入されていないアモキシシリンの濃度を分析した。ナノ薬剤キャリアの抗菌薬封入率は、下記の式を用いて算出される。
封入率＝（アモキシシリンの全量（重量／容積）−非封入アモキシシリンの量（重量／容積））／アモキシシリンの全量（重量／容積）×１００％

その結果により、得られたナノ薬剤キャリアの薬剤封入率は、４４．８±２．３％に到達し得ることが示される。

（実施例２）Ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬剤放出試験
実施例１（４）で得られたナノ薬剤キャリアを、ｐＨ１．２のコンディション（胃液コンディションのシミュレーション）又はｐＨ４．５、ｐＨ６．０、若しくはｐＨ７．４のコンディション（すべては、胃粘膜層における、又はヘリコバクターピロリが感染した胃上皮細胞のコンディションのシミュレーション）に置いた。これらのナノ薬剤キャリアの外観及び粒径を透過電子顕微鏡法により観察した。結果を図３に示す。

図３（Ｂ）−３（Ｄ）に示されるように、ナノ薬剤キャリアがｐＨ１．２、ｐＨ４．５、及びｐＨ６．０の酸性コンディションに置かれた場合、ナノ薬剤キャリアの構造は安定的であり、崩壊していなかった。これは、ナノ薬剤キャリアにより、封入された活性剤が酸性コンディションにおいて崩壊しないように保護され得ることを示す。ナノ薬剤キャリアがｐＨ７．４の酸性コンディションに置かれた場合（図３（Ｅ））、ナノ薬剤キャリアは崩壊し始め、活性剤（すなわちアモキシシリン）を放出した。これらの結果は、本発明のナノ薬剤キャリアが胃内で酸性コンディションに入ったときに胃液による破壊を回避し得、一方、ナノ薬剤キャリアが胃壁に付着したときに、それは中性のコンディション（例えば、胃粘膜層におけるコンディション、又はヘリコバクターピロリが感染した胃上皮細胞のコンディション）において活性剤を放出し得、その結果、薬剤放出を制御する目的を達成することを示す。

（実施例３）薬理的効果の試験
（１）コロニー数の実験
小型の黒色マウスに、２週間、６回にわたって継続的に１．０×１０^９ＣＦＵ／ｍＬのヘリコバクターピロリを含有するブロスを与え、ヘリコバクターピロリ感染動物モデルを確立した。マウスにヘリコバクターピロリを与える前に一晩絶食させ、胃内の粘膜を減少させ、感染率を高めた。その後、ヘリコバクターピロリ感染マウス（各群６匹のマウス）に、（ａ）実施例１（２）で得られたナノ薬剤キャリア（コントロール群）；（ｂ）３０ｍｇ／ｋｇのアモキシシリン；及び（ｃ）実施例１（４）で得られたナノ薬剤キャリア（アモキシシリン濃度、３０ｍｇ／ｋｇ）を１０日間、１日１回投与した。その後、マウスを屠殺し、胃内の組織を取り出し、コロニー数実験を行った。結果を表１に示す。

表１に示されるように、アモキシシリンにより治療されていないコントロール群のマウスに比して、３０ｍｇ／ｋｇのアモキシシリンを投与したマウスの胃内組織のヘリコバクターピロリのコロニー数は、５０２．３±８３．７から３１６．９±３０．５に減少し、一方、アモキシシリンを封入したナノキャリアを投与したマウスの胃内組織のヘリコバクターピロリのコロニー数は、さらに６３．２±１５．５に減少した。これらの結果より、本発明のナノ薬剤キャリアは、封入された活性剤の治療効果を効果的に向上させ得ることが示される。

（２）カンピロバクター様菌アッセイ
カンピロバクター様菌アッセイ（ＣＬＯ）を行い、ヘリコバクターピロリ感染マウスの治療におけるナノ薬剤キャリアの効果を評価した。ヘリコバクターピロリ感染マウスの胃組織の内側をＣＬＯゲルに接触させ、圧着させて、組織を１２時間、３７℃でインキュベートし、ＣＬＯゲルの色の変化を観察した。結果を図４に示す。ヘリコバクターピロリを含まない（脱イオン水を接触させた）ＣＬＯゲルは、黄の色である。ヘリコバクターピロリを少し含むＣＬＯゲルは、黄−オレンジの色である。ヘリコバクターピロリをたくさん含むＣＬＯゲルは、赤の色である。色が暗くなると、より多くの量のヘリコバクターピロリが存在することを表す。

図４に示されるように、活性剤を封入していないナノ薬剤キャリアを投与したマウスの胃組織（コントロール群；暗赤色を示す）及びアモキシシリンを投与したマウスの胃組織（赤色を示す）に比して、アモキシシリンを封入したナノ薬剤キャリアを投与したマウスの胃組織（黄色を示す）におけるヘリコバクターピロリ量は、顕著に減少した。これらの結果により、本発明のナノ薬剤キャリアは、封入された活性剤の治療効果を効果的に向上させ得ることが示される。

（実施例４）ヘリコバクターピロリへのターゲティングにおけるナノ薬剤キャリアの効果の試験
（１）工程Ａ：蛍光標識された抗菌薬を封入した蛍光標識ナノ薬剤キャリアの調製
フルオレセインアミン（ＦＡ；０．０５８３ｇ）を１．０ｍＬのアセトニトリルに溶解させ、ＦＡ溶液を作った。アモキシシリン（０．１ｇ）を３０ｍＬの脱イオン水に溶解させ、前述のＦＡ溶液と混合した。それに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（０．０４０８ｇ）を加え、ＦＡをアモキシシリンのカルボキシル基に結合させるように、１２時間、暗所、室温にて、マグネチックスターラーで攪拌し、蛍光標識されたＦＡ−アモキシシリンを作った。そして、最後に、サンプルを凍結乾燥し、蛍光標識されたＦＡ−アモキシシリンを収集した。

その後、ゲニピンにより架橋され、ＦＡ−アモキシシリンを封入したフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアを、実施例１（４）に記載された方法に従い調製したが、アモキシシリンをＦＡ−アモキシシリンに置き換えた。加えて、架橋されていない、ＦＡ−アモキシシリンを封入したフコース−キトサン／ヘパリンナノ薬剤キャリアを実施例１（４）に記載の方法に従い調整したが、ゲニピンを加えず、アモキシシリンをＦＡ−アモキシシリンに置き換えた。加えて、フコース−キトサンをＣｙ３蛍光色素により標識し、蛍光標識されたＣｙ３−フコース−キトサンを作った。

（２）工程Ｂ：蛍光標識されたヘリコバクターピロリの調製
ヘリコバクターピロリが感染した細胞を観察するために、ＤｉｌＣ１８（５）−ＤＳ分子プローブ（励起波長、６４９ｎｍ）をヘリコバクターピロリの細胞膜に導入して、蛍光標識されたＤｉｌ−ヘリコバクターピロリを作った。最初に、１×１０^６のヘリコバクターピロリを５０μＬのＤｉｌＣ１８（５）−ＤＳ分子プローブ及び９５０μＬのＰＢＳ緩衝溶液と混合させた。５分間、３０℃の水浴中で、その後１５分間、４℃の水浴中で、反応させた。サンプルを遠心分離し、沈殿物を収集して、蛍光標識されたＤｉｌ−ヘリコバクターピロリを得た。

（３）工程Ｃ：蛍光標識されたＤｉｌ−ヘリコバクターピロリに感染したヒト胃腺癌細胞の調製
ヒト胃腺癌（ＡＧＳ）細胞株を、１０％ＦＢＳを含有する培地でインキュベートし、トランスウェル細胞培養チャンバー（１２ｗｅｌl／プレート；８μｍ；生育領域、４．７ｃｍ^２；ＭＩＬＬＰＯＲＥ）に植菌した。細胞を２４−３０日間、インキュベートし、その後、取り出した。次に、蛍光標識されたＤｉｌ−ヘリコバクターピロリを２時間、ＡＧＳ細胞と共培養し、Ｄｉｌ−ヘリコバクターピロリに感染したＡＧＳ細胞株を得た。

（４）工程Ｄ：ターゲティングアッセイ
上述の工程Ａで調製したＦＡ−アモキシシリン溶液（１００μＬ）と、架橋されていないＦＡ−アモキシシリンを封入したターゲティングの蛍光標識ナノ薬剤キャリアと、ゲニピンにより架橋されＦＡ−アモキシシリンを封入したターゲティングの蛍光標識ナノ薬剤キャリアと、を別々に加え、Ｄｉｌ−ヘリコバクターピロリに感染したＡＧＳ細胞株と共培養した。１２０分後、蛍光標識された抗菌薬を封入したターゲティングの蛍光標識ナノ薬剤キャリアを、蛍光イメージをスキャンするために共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察し、ヘリコバクターピロリが感染した細胞におけるターゲティング作用を観察した。ＦＡ−アモキシシリンをコントロール群として用いた。実験結果を図５Ａ−５Ｃに示す。

図５Ａ−５Ｃに示されるように、ＦＡ−アモキシシリン溶液をヘリコバクターピロリが感染したＡＧＳ細胞と共培養した場合、ＦＡ−アモキシシリンは明らかに、ＡＧＳ細胞に入って行かなかった（図５Ａ）。架橋されておらずＦＡ−アモキシシリンを封入したターゲティングの蛍光標識ナノ薬剤キャリアと、ゲニピンにより架橋されＦＡ−アモキシシリンを封入したターゲティングの蛍光標識ナノ薬剤キャリアと、を、ヘリコバクターピロリが感染したＡＧＳ細胞と共培養した場合、明らかに、細胞におけるＦＡ−アモキシシリン及びＣｙ３−フコース−キトサンの蛍光発色が観察された（図５Ｂ及び５Ｃにおける白色スポット）。これらの実験結果により、本発明の薬剤キャリアがたしかに、ヘリコバクターピロリの表面に結合できることが示される。すなわち、本発明の薬剤キャリアは、ヘリコバクターピロリをターゲットとすることができ、その結果、封入された薬剤の抗ヘリコバクターピロリ活性を向上させることができる。

上述の実施例は、本発明の原理及び有効性を示すために単に例示されたにすぎず、本発明を限定することを意図していない。本技術分野における当業者であれば、本発明の技術的範囲において種々の変更及び修正を行い得ることが明白である。それゆえ、これらの変更及び修正は添付された特許請求の範囲及び同等物の範囲内に含まれることが明らかである。

（関連する出願）
本出願は、台湾特許出願１０１１３６９１０（出願日２０１２年１０月５日）に基づく優先権を主張しており、その内容は本明細書に参照として取り込まれる。

Claims (16)

1. アミノ基（−ＮＨ_２）を有する生体適合性ポリマーである第一の成分と；
   グルコース、フコース、ガラクトサミン、マンノース、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるサッカライドと；
   生物適合性マテリアルである第二の成分と；
   を含有し、
   サッカライドは、第一の成分のアミノ基（−ＮＨ_２）により第一の成分に結合し、第一の成分は、イオン結合により第二の成分に結合し、
   第一の成分は、キトサン、ゼラチン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択され；第二の成分は、ヘパリン、ポリ（グルタミン酸）、アルギン酸ナトリウム、カテキン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択され、
   サッカライドは、第一の成分の全アミノ基（−ＮＨ _２ ）の約５％から約３０％に結合している、
   ことを特徴とするヘリコバクターピロリをターゲティングするための薬剤キャリア。
2. サッカライドは、フコースである、
   ことを特徴とする請求項１に記載の薬剤キャリア。
3. カテキンは、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を含む、
   ことを特徴とする請求項１に記載の薬剤キャリア。
4. 活性剤、保護剤、架橋剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される第三の成分をさらに含有する、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の薬剤キャリア。
5. 活性剤は、アモキシシリン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、メトロニダゾール、クルクミン、ベルベリン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択され；保護剤は、トレハロース、グルコース、ラクトース、グリセロール、及びこれらの組み合わせからなる群より選択され；架橋剤は、グルタルアルデヒド、ゲニピン、エポキシ樹脂、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、塩化カルシウム、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、
   ことを特徴とする請求項４に記載の薬剤キャリア。
6. 活性剤は、アモキシシリン、クルクミン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択され；保護剤は、トレハロースであり；架橋剤は、ゲニピン、塩化カルシウム、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、
   ことを特徴とする請求項５に記載の薬剤キャリア。
7. アモキシシリンを封入するフコース結合キトサン／ヘパリンナノキャリア、クルクミンを封入するフコース結合キトサン／ポリ（グルタミン酸）ナノキャリア、又はフコース結合キトサン／ゼラチン／ＥＧＣＧナノキャリアである、請求項６に記載の薬剤キャリア。
8. ゲニピンにより架橋され、アモキシシリンを封入し、トレハロースを含有するフコース結合キトサン／ヘパリンナノキャリアである、請求項７に記載の薬剤キャリア。
9. 約１００ｎｍ−約４μｍの粒径を有する、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の薬剤キャリア。
10. 約１５０ｎｍ−約１μｍの粒径を有する、請求項９に記載の薬剤キャリア。
11. 約２００ｎｍ−約５００ｎｍの粒径を有する、請求項１０に記載の薬剤キャリア。
12. （ａ）グルコース、フコース、ガラクトサミン、マンノース、及びこれらの組み合わせからなる群より選択されるサッカライドが結合した、キトサン、ゼラチン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される第一の成分を提供する工程と；
    （ｂ）サッカライドが結合した第一の成分を水に溶解して、第一の溶液を提供する工程と；
    （ｃ）ヘパリン、ポリ（グルタミン酸）、アルギン酸ナトリウム、カテキン、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される第二の成分を水に溶解して、第二の溶液を提供する工程と；
    （ｄ）任意に、活性剤、保護剤、架橋剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される第三の成分を含有する第三の溶液を提供する工程と；
    （ｅ）第一の溶液、第二の溶液、及び任意の第三の溶液を混合させて、薬剤キャリアを形成する工程と；
    を含む、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の薬剤キャリアを調製するための方法。
13. （ｅ）の工程は、最初に第一の溶液及び第二の溶液を混合し、第三の溶液が存在するならば次に第三の溶液を混合する、
    ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. （ｄ）の工程が存在し、第一の溶液、第二の溶液、及び第三の溶液を混合する工程である（ｅ）の工程は、
    （ｅ１）第一の溶液及び第三の溶液を混合させて、第一の混合溶液を形成させる工程と；
    （ｅ２）第一の混合溶液及び界面活性剤を含有する油性溶液を混合させて、第二の混合溶液を形成させる工程と；
    （ｅ３）第二の混合溶液及び第二の溶液を混合させて、薬剤キャリアを形成させる工程と；
    を含む、
    ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
15. 第一の成分及び第二の成分は、約１：０．１−１の重量比で用いられる、
    ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
16. 工程（ｄ）が存在し、第三の成分は、活性剤、保護剤、及び架橋剤を含有し、第一の成分、第二の成分、活性剤、保護剤、及び架橋剤は、約１：０．１−１：０．１−１：１−１０：０．０２−０．２の重量比で用いられる、
    ことを特徴とする請求項１２乃至１５のいずれか１項に記載の方法。