JP5683476B2 - 感染因子を含まないエンベロープウイルスベースｖｌｐを単離するための改良法 - Google Patents

感染因子を含まないエンベロープウイルスベースｖｌｐを単離するための改良法 Download PDF

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Description

（発明の分野）
本発明は、感染因子（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｇｅｎｔ）を含まない、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子（ＶＬＰ）を単離する分野に関する。好ましい例において、該分野は、エンベロープウイルスベースのＶＬＰの免疫原性に有害な影響を及ぼさない、感染因子を不活化する方法を包含する。特定の実施形態では、エンベロープウイルスベースのＶＬＰを、昆虫細胞ベースの発現系において作製する。
（発明の背景）
アセンブリーは、宿主細胞内で見出されるアクセサリー因子を必要とすることが多いため、エンベロープウイルスベースのＶＬＰを作製するには、宿主細胞の発現系内におけるＶＬＰの発現およびアセンブリーを必要とすることが典型的である。宿主細胞内における生物学的成分の発現には、感染因子による汚染の危険性が付きまとう。タンパク質および多糖など、比較的小さな生物学的成分については、そのような作用物質を除去するのに、フィルターによる滅菌が一般に用いられるが、ＵＶによる不活化または化学的な不活化など、他の方法もまた用いられている（単独で、またはフィルターベースの方法と組み合わせて用いられる）。例えば、オーエスキー病ウイルスの糖タンパク質Ｄ遺伝子を発現させるのに用いるときのバキュロウイルスを不活化するには、光化学的不活性化が用いられており、該発現するタンパク質に対する抗体の結合の低下は何ら観察されていない（非特許文献１を参照されたい）。しかし、ＶＬＰなど、比較的大きな生物学的成分については、ＶＬＰはサイズが感染因子（例えば、ウイルス）に近接し、濾過によりそのような感染因子から分離することが不可能なことが多いので、フィルターによる滅菌は適用可能でないことが多い。したがって、ＶＬＰを調製するときの感染因子を不活化するには、他の方法を用いる必要がある。ブタパルボウイルス（ＰＰＶ：非エンベロープまたはカプシドウイルス）ＶＬＰを生成させるのに用いるときのバキュロウイルスを不活化するには、そのような他の方法が試みられている。Ｒｕｅｄａらは、バキュロウイルスに対する低温殺菌、化学的不活化、および、洗浄剤による不活化を比較し、ＰＰＶ ＶＬＰの免疫原性に対して影響を及ぼさないことを見出した（例えば、非特許文献２を参照されたい）。
Ｓ．Ａ． Ｗｅｉｇｈｔｍａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９９年）８１巻：１７９〜１８２頁 Ｐ． Ｒｕｅｄａら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１年）１９巻：７２６〜７３４頁
しかし、感染因子を不活化する典型的な方法をエンベロープウイルスベースのＶＬＰに適用すると、該エンベロープウイルスベースのＶＬＰの免疫原性が顕著に低下することが、思いがけず判明した。したがって、エンベロープウイルスベースのＶＬＰに対して用いることができ、該ＶＬＰの免疫原性に有害な影響を及ぼすことなく感染因子を不活化する不活化法が必要とされている。
（概要）
本発明の好ましい実施形態は、エンベロープウイルスベースのＶＬＰの免疫原性に有害な影響を及ぼさない、本明細書で開示される、感染因子を不活化するための各種の方法および組成物と、不活化を受けていないＶＬＰ調製物と実質的に同じ免疫原性を有する、感染因子を含まないエンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物を含む組成物とを提供することにより、この必要を満たす。このような好ましい実施形態は、試験された電磁放射ベースの不活化法（単独の不活化法、または該電磁放射に反応性の化学物質を伴う不活化法）が、他の純粋に化学物質ベースの不活化法と比較して、エンベロープウイルスベースのＶＬＰの免疫原性を結果として低下させないという驚くべき観察に基づく。
本発明の態様は、感染因子を実質的に含まないエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を単離する方法であって、（ａ）該エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を作製するのに用いられる宿主細胞、または該宿主細胞の成分から、該エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を単離するステップと、（ｂ）該エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物における実質的にすべての感染因子を不活化するのに十分な線量の電磁放射を、該調製物へと適用するステップとを含み、ステップ（ｂ）の後の該エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ（ｂ）の前の該エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と実質的に同じ免疫原性を有する方法を包含する。ある実施形態では、分離するステップ（ａ）が、少なくとも１つの遠心分離ステップを含む。前出の実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、分離するステップ（ａ）がまた、少なくとも１つの濾過ステップも包含し、該少なくとも１つの濾過ステップを、ノーマルフロー濾過、限外濾過、またはタンジェンシャルフロー（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ）濾過からさらに選択することができる。前出の実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、分離するステップ（ａ）がまた、クロマトグラフィーステップも包含し、該少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合方式クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびサイズ除外クロマトグラフィーからなる群よりさらに選択することができる。
前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、電磁放射を、可視光、ｘ線放射、紫外線放射、およびガンマ放射からなる群より選択することができ、該紫外線放射を、ＵＶ−Ａ、ＵＶ−Ｂ、およびＵＶ−Ｃからなる群よりさらに選択する場合もあり、該紫外線放射の波長が、３２０ｎｍ〜４００ｎｍの場合もある。
前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、宿主細胞が、昆虫細胞または哺乳動物細胞である。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、宿主細胞が昆虫細胞であり、該昆虫細胞に、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子のうちの少なくとも１つの成分を発現するバキュロウイルス発現ベクターを感染させる。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、宿主細胞を、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ宿主細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ宿主細胞、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ宿主細胞、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ宿主細胞、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ宿主細胞、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞、Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ宿主細胞、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ宿主細胞、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ宿主細胞、Ｍａｌａｃｏｓｔｏｍａ ｄｉｓｓｔｒｉａ宿主細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ宿主細胞、Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ宿主細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ宿主細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａ宿主細胞、およびＨｙａｌｏｐｈｏｒａ ｃｅｃｒｏｐｉａ宿主細胞からなる群より選択する。宿主細胞が哺乳動物細胞である、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、該哺乳動物細胞を、ＭＲＣ−５細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（ＴＭ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、およびＨＥＫ２９３細胞から選択する。昆虫細胞を宿主細胞として包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、電磁放射線量が、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物におけるバキュロウイルスを不活化させるのに十分である。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、宿主細胞が哺乳動物細胞であり、前記哺乳動物細胞に、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の少なくとも１つの成分を発現する、アデノウイルス発現ベクター、アデノ関連ウイルス発現ベクター、アルファウイルス発現ベクター、ヘルペスウイルス発現ベクター、ポックスウイルス発現ベクター、またはレトロウイルス発現ベクターを感染させる。アデノウイルス発現ベクター、アデノ関連ウイルス発現ベクター、アルファウイルス発現ベクター、ヘルペスウイルス発現ベクター、ポックスウイルス発現ベクター、またはレトロウイルス発現ベクターを包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、電磁放射線量が、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物における、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、またはレトロウイルスを適宜不活化させるのに十分である。
前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、適用するステップ（ｂ）の前に、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物にＤＮＡインターカレート化合物を添加することができ、該ＤＮＡインターカレート化合物は、場合によって、光反応性のこともあり、ソラーレン、イソソラーレン、ならびにこれらの誘導体および類似体からなる群より選択することもある。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、電磁放射を、紫外線放射および可視光からなる群より選択することができる。
前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、該方法が、（ｃ）エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物にアジュバントを添加するステップをさらに含み得る。
前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、分離するステップ（ａ）の前に、（ｉ）ｇａｇポリペプチドと、天然では脂質ラフトと会合しない抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとを併せて発現する、１または複数の発現ベクターを供給するステップと；（ｉｉ）前記１または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと；（ｉｉｉ）前記ｇａｇポリペプチドと、前記抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、宿主細胞内においてエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する。
前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、分離するステップ（ａ）の前に、（ｉ）ＲＳウイルスＭポリペプチドと、ＲＳウイルスＦポリペプチドとを発現する、１または複数の発現ベクターを供給するステップと；（ｉｉ）前記１または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと；（ｉｉｉ）前記ＲＳウイルスＭポリペプチドと、前記ＲＳウイルスＦポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、宿主細胞内においてエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する。前出の実施形態は、場合によって、前記１または複数の発現ベクターから、ＲＳウイルスＧポリペプチドをさらに発現させることがある。
前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、分離するステップ（ａ）の前に、（ｉ）レンチウイルスおよびアルファレトロウイルスからなる群より選択されるレトロウイルスのｇａｇポリペプチドと、ＲＳウイルスＦポリペプチドとを発現する、１または複数の発現ベクターを供給するステップと；（ｉｉ）前記１または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと；（ｉｉｉ）前記レトロウイルスのｇａｇポリペプチドと、前記ＲＳウイルスＦポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、宿主細胞内においてエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する。前出の実施形態は、場合によって、前記１または複数の発現ベクターから、ＲＳウイルスＧポリペプチドをさらに発現させることがある。
前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、分離するステップ（ａ）の前に、（ｉ）ｇａｇポリペプチドと、インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドとを併せて発現する、１または複数の発現ベクターを供給するステップと；（ｉｉ）前記１または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと；（ｉｉｉ）前記ｇａｇポリペプチドと、前記インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、宿主細胞内においてエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する。
前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、分離するステップ（ａ）の前に、（ｉ）インフルエンザＭ１ポリペプチドと、赤血球凝集素ポリペプチドとを併せて発現する、１または複数の発現ベクターを供給するステップと；（ｉｉ）前記１または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと；（ｉｉｉ）前記インフルエンザＭ１ポリペプチドと、前記赤血球凝集素ポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、宿主細胞内においてエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する。赤血球凝集素ポリペプチドを包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、該１または複数の発現ベクターが、ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに発現し得る。１または複数の発現ベクターを包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、該１または複数の発現ベクターが、ウイルスベクター（複数可）であり得、該ウイルスベクター（複数可）を、バキュロウイルス、アルファウイルス、アデノ関連ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびレトロウイルスからなる群よりさらに選択することができる。
前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、ウイルスベクターを用いて、宿主細胞内において、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の少なくとも１つの成分を発現させ、また、場合によって、該感染因子が、該ウイルスベクターを含む。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、調製物が、１ミリリットル当たり２０個未満の感染因子；１ミリリットル当たり１５個未満の感染因子；１ミリリットル当たり１０個未満の感染因子；１ミリリットル当たり８個未満の感染因子；１ミリリットル当たり６個未満の感染因子；または１ミリリットル当たり５個未満の感染因子を含む。
前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、ステップ（ｂ）の後のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ（ｂ）の前のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも５０パーセントの免疫原性、ステップ（ｂ）の前のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも６０パーセントの免疫原性、ステップ（ｂ）の前のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも７０パーセントの免疫原性、ステップ（ｂ）の前のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも８０パーセントの免疫原性、ステップ（ｂ）の前のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも８５パーセントの免疫原性、ステップ（ｂ）の前のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも９０パーセントの免疫原性、ステップ（ｂ）の前のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも９５パーセントの免疫原性を有する。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、感染因子を含まないようにされた後のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物は、感染因子を含まないようにされる前のエンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物より大きな免疫原性を有するか、または、これと比較して免疫原性が増大する。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、赤血球凝集素ポリペプチドを含み、免疫原性を予測する（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）赤血球凝集アッセイを用いて、該エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の物理的および生化学的な完全性を測定することもでき、または、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子により免疫化した動物の血清におけるＨＡＩ活性を、免疫原性の尺度として決定することもできる。免疫原性を特定する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、動物にエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子（ＲＳウイルス（ＲＳＶ）ポリペプチドを包含し得る）をワクチン接種し、ＥＬＩＳＡアッセイもしくはウイルス中和アッセイにより、またはウェスタンブロットにより抗体力価を測定するか、あるいは増殖アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、またはサイトカイン放出アッセイによりＴ細胞反応を測定することにより、該免疫原性を直接測定することができる。
本発明の別の態様は、感染因子を実質的に含まないエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を含む、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物であって、該エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、感染因子を実質的に含まないわけではないエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子と実質的に同じ免疫原性を有する調製物を包含する。
ある実施形態では、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、昆虫または哺乳動物グリコシル化をさらに含む。前出の実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、昆虫グリコシル化を、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ； Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ； Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ； Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ； Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ； Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ； Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ； Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ； Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ； Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ； Ｍａｌａｃｏｓｔｏｍａ ｄｉｓｓｔｒｉａ； Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ； Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ； Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ； Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａ；およびＨｙａｌｏｐｈｏｒａ ｃｅｃｒｏｐｉａからなる群よりさらに選択することができる。前出の実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、哺乳動物グリコシル化を、ヒトグリコシル化（ＰＥＲ．Ｃ６（ＴＭ）細胞、ＭＲＣ−５細胞、およびＨＥＫ２９３細胞によりもたらされるグリコシル化を含めた）、サルグリコシル化（Ｖｅｒｏ細胞によりもたらされるグリコシル化を含めた）、また、げっ歯動物グリコシル化（チャイニーズハムスター卵巣細胞によりもたらされるグリコシル化を含めた）からなる群よりさらに選択することができる。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、共有結合した光化学作用物質、タンパク質サブユニットの三次構造または四次構造においてＵＶ照射もしくはガンマ照射により誘導される変化、ガンマ照射により誘導される化学結合の開裂、またはＵＶ照射もしくはガンマ照射により誘導される、脂質の酸化、タンパク質の架橋形成、アミノ酸の酸化、およびアミノ酸の修飾からなる群より選択される化学修飾から選択される１または複数の欠損をさらに示す。好ましい実施形態では、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、該欠損のすべてを示す。特定の実施形態では、このような欠損の検出を、免疫原性の低下が見られないことを介して推測することもでき、または、適切な技法（例えば、ウイルス様粒子を含むポリペプチド内における共有結合の変化に関して欠損が見られないことを確認する場合の質量分析、また、ウイルス様粒子を含むポリペプチドの三次構造または四次構造内において、欠損が見られないことを確認する場合の分析的ＨＰＬＣ）の適用を介して推測することもできる。
前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、ｇａｇポリペプチドと、非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチド、または天然では脂質ラフトと会合しない、連結を形成するための抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとを含み、場合によって、該非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドを、ＧＰＩアンカーポリペプチド、ミリストイル化配列ポリペプチド、パルミトイル化配列ポリペプチド、二重アセチル化配列ポリペプチド、シグナル伝達ポリペプチド、および膜輸送ポリペプチドからなる群よりさらに選択することもでき、ＧＰＩアンカーポリペプチド、ミリストイル化配列ポリペプチド、パルミトイル化配列ポリペプチド、二重アセチル化配列ポリペプチド、カベオリン（ｃａｖｅｌｉｎ）ポリペプチド、フロチリンポリペプチド、シンタクシン−１ポリペプチド、シンタクシン−４ポリペプチド、シナプシンＩポリペプチド、アデューシンポリペプチド、ＶＡＭＰ２ポリペプチド、ＶＡＭＰ／シナプトブレビンポリペプチド、シナプトブレビンＩＩポリペプチド、ＳＮＡＲＥポリペプチド、ＳＮＡＰ−２５ポリペプチド、ＳＮＡＰ−２３ポリペプチド、シナプトタグミンＩポリペプチド、およびシナプトタグミンＩＩポリペプチドからなる群よりさらに選択することもできる。ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドは、赤血球凝集素ポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、融合タンパク質ポリペプチド、糖タンパク質ポリペプチド、およびエンベロープタンパク質ポリペプチドからなる群よりさらに選択することができる。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、膜結合エンベロープタンパク質ポリペプチドをさらに含む。
連結を包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、該連結を、共有結合、イオン性相互作用、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、金属−配位子相互作用、および抗体−抗原相互作用からなる群よりさらに選択することができ、該共有結合は、場合によって、ペプチド結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、およびジスルフィド結合からなる群よりさらに選択することもできる。脂質ラフト会合ポリペプチドを包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、該脂質ラフト会合ポリペプチドが、内在性膜タンパク質である。抗原を包含する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、該抗原を、タンパク質、ポリペプチド、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖のペプチド性または非ペプチド性模倣体、低分子、脂質、糖脂質、および炭水化物からなる群よりさらに選択することができる。
前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、赤血球凝集素ポリペプチド、ＲＳウイルスＭポリペプチド、ＲＳウイルスＧポリペプチド、および／またはＲＳウイルスＦポリペプチドをさらに含む。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、ｇａｇポリペプチドおよび赤血球凝集素ポリペプチド；レンチウイルスおよびアルファレトロウイルスからなる群より選択されるレトロウイルスのｇａｇポリペプチド、ならびにＲＳウイルスＦポリペプチド（また、場合によって、Ｇポリペプチド）；またはインフルエンザＭ１ポリペプチドおよび赤血球凝集素ポリペプチドを含む。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに包含する。
前出の実施形態のいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、前記ウイルス様粒子と会合するアジュバントを包含する。アジュバントを包含する特定の実施形態では、処方ステップにおいて、該アジュバントを、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子と混合することができる。アジュバントは、ウイルス様粒子の内側または外側に位置する場合もあり、ウイルス様粒子に組み込まれる場合もある。前出の実施形態のいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、アジュバントを、前記ウイルス様粒子と共有結合させて、共有結合を形成させることができる。
本発明の別の態様は、免疫系の疾患または症状を処置または予防する方法であって、免疫原性量の、前出の実施形態のうちのいずれかによるエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物、または前出の方法およびその実施形態のうちのいずれかを用いて単離したエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を、被験体に投与するステップを含む方法を包含する。一実施形態では、被験体がヒトである。前出の実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、投与するステップにより、被験体において、防御的免疫化反応が誘導される。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、投与するステップを、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）送達、皮内送達、真皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）送達、筋肉内送達、経口による（ｐｅｒｏｒａｌ）送達、経口（ｏｒａｌ）送達、鼻腔内送達、口腔内送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、経肛門送達、および頭蓋内送達からなる群よりさらに選択することができる。
本発明の別の態様は、免疫原性量の、前出の実施形態のうちのいずれかによるエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物、または前出の方法およびその実施形態のうちのいずれかを用いて単離したエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を含む医薬組成物を包含する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
感染因子を実質的に含まないエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を単離する方法であって、
（ａ）前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を作製するのに用いられる宿主細胞、または前記宿主細胞の成分から、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を単離するステップと、
（ｂ）前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物における実質的にすべての感染因子を不活化するのに十分な線量の電磁放射を、前記調製物へと適用するステップと
を含み、ステップ（ｂ）の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物は、ステップ（ｂ）の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と実質的に同じ免疫原性を有する、方法。
（項目２）
前記分離するステップ（ａ）が、少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記少なくとも１つのクロマトグラフィーステップが、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー−クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合方式クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびサイズ除外クロマトグラフィーからなる群より選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記分離するステップ（ａ）が、少なくとも１つの濾過ステップを含む、項目１から３のうちのいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記少なくとも１つの濾過ステップが、ノーマルフロー濾過、限外濾過、またはタンジェンシャルフロー濾過である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記分離するステップ（ａ）が、少なくとも１つの遠心分離ステップを含む、項目１から５のうちのいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記電磁放射が、可視光、ｘ線放射、紫外線放射、およびガンマ放射からなる群より選択される、項目１から６のうちのいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記紫外線放射が、ＵＶ−Ａ、ＵＶ−Ｂ、およびＵＶ−Ｃからなる群より選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記紫外線放射の波長が、３２０ｎｍ〜４００ｎｍである、項目７から８のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記宿主細胞が、昆虫細胞または哺乳動物細胞である、項目１から９のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記宿主細胞が昆虫細胞であり、前記昆虫細胞は、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の少なくとも１つの成分を発現するバキュロウイルス発現ベクターで感染させられる、項目１から１０のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記宿主細胞が、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ宿主細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ宿主細胞、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ宿主細胞、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ宿主細
胞、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ宿主細胞、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞、Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ宿主細胞、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ宿主細胞、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ宿主細胞、Ｍａｌａｃｏｓｔｏｍａ ｄｉｓｓｔｒｉａ宿主細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ宿主細胞、Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ宿主細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ宿主細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａ宿主細胞、およびＨｙａｌｏｐｈｏｒａ
ｃｅｃｒｏｐｉａ宿主細胞からなる群より選択される、項目１から１１のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記電磁放射線量が、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物におけるバキュロウイルスを不活化させるのに十分である、項目１１から１２のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記宿主細胞が哺乳動物細胞であり、前記哺乳動物細胞は、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の少なくとも１つの成分を発現する、アデノウイルス発現ベクター、アデノ関連ウイルス発現ベクター、アルファウイルス発現ベクター、ヘルペスウイルス発現ベクター、ポックスウイルス発現ベクター、またはレトロウイルス発現ベクターで感染させられる、項目１から１０のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記適用するステップ（ｂ）の前に、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物にＤＮＡインターカレート化合物を添加するステップをさらに含む、項目１から１４のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記ＤＮＡインターカレート化合物が、光反応性である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ＤＮＡインターカレート化合物が、ソラーレン、イソソラーレン、ならびにこれらの誘導体および類似体からなる群より選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記電磁放射が、紫外線放射および可視光からなる群より選択される、項目１から１７のうちのいずれかに記載の方法。
（項目１９）
（ｃ）前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物にアジュバントを添加するステップをさらに含む、項目１から１７１８のうちのいずれかに記載の方法。
（項目２０）
前記分離するステップ（ａ）の前に、（ｉ）ｇａｇポリペプチドと、天然では脂質ラフトと会合しない抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとを併せて発現する、１または複数の発現ベクターを供給するステップと；（ｉｉ）前記１または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと；（ｉｉｉ）前記ｇａｇポリペプチドと、前記抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、前記宿主細胞内において前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する、項目１から１９のうちのいずれかに記載の方法。
（項目２１）
前記分離するステップ（ａ）の前に、（ｉ）ＲＳウイルスＭポリペプチドと、ＲＳウイルスＦポリペプチドとを発現する、１または複数の発現ベクターを供給するステップと；（ｉｉ）前記１または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと；（ｉｉｉ）前記ＲＳウイルスＭポリペプチドと、前記ＲＳウイルスＦポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、前記宿主細胞内において前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する、項目１から１９のうちのいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記１または複数の発現ベクターが、ＲＳウイルスＧポリペプチドをさらに発現する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記分離するステップ（ａ）の前に、（ｉ）ｇａｇポリペプチドと、インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドとを併せて発現する、１または複数の発現ベクターを供給するステップと；（ｉｉ）前記１または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと；（ｉｉｉ）前記ｇａｇポリペプチドと、前記インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、前記宿主細胞内において前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する、項目１から１９のうちのいずれかに記載の方法。
（項目２４）
前記分離するステップ（ａ）の前に、（ｉ）インフルエンザＭ１ポリペプチドと、赤血球凝集素ポリペプチドとを併せて発現する、１または複数の発現ベクターを供給するステップと；（ｉｉ）前記１または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと；（ｉｉｉ）前記インフルエンザＭ１ポリペプチドと、前記赤血球凝集素ポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、前記宿主細胞内において前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する、項目１から１９のうちのいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記１または複数の発現ベクターが、ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに発現する、項目２３から２４のうちのいずれかに記載の方法。
（項目２６）
前記１または複数の発現ベクターが、ウイルスベクターである、項目２０から２５のうちのいずれかに記載の方法。
（項目２７）
前記ウイルスベクターが、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびレトロウイルスからなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
ウイルスベクターを用いて、前記宿主細胞内において、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の少なくとも１つの成分を発現させる、項目１から２７のうちのいずれかに記載の方法。
（項目２９）
前記感染因子が、前記ウイルスベクターを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記調製物が、１ミリリットル当たり２０個未満の感染因子を含む、項目１から２９のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３１）
前記調製物が、１ミリリットル当たり１５個未満の感染因子を含む、項目１から２９のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３２）
前記調製物が、１ミリリットル当たり１０個未満の感染因子を含む、項目１から２９のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３３）
前記調製物が、１ミリリットル当たり８個未満の感染因子を含む、項目１から２９のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３４）
前記調製物が、１ミリリットル当たり６個未満の感染因子を含む、項目１から２９のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３５）
前記調製物が、１ミリリットル当たり５個未満の感染因子を含む、項目１から２９のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３６）
ステップ（ｂ）の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ（ｂ）の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも５０パーセントの免疫原性を有する、項目１から３５のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３７）
ステップ（ｂ）の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ（ｂ）の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも６０パーセントの免疫原性を有する、項目１から３５のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３８）
ステップ（ｂ）の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ（ｂ）の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも７０パーセントの免疫原性を有する、項目１から３５のうちのいずれかに記載の方法。
（項目３９）
ステップ（ｂ）の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ（ｂ）の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも８０パーセントの免疫原性を有する、項目１から３５のうちのいずれかに記載の方法。
（項目４０）
ステップ（ｂ）の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ（ｂ）の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも８５パーセントの免疫原性を有する、項目１から３５のうちのいずれかに記載の方法。
（項目４１）
ステップ（ｂ）の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ（ｂ）の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも９０パーセントの免疫原性を有する、項目１から３５のうちのいずれかに記載の方法。
（項目４２）
ステップ（ｂ）の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ（ｂ）の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも９５パーセントの免疫原性を有する、項目１から３５のうちのいずれかに記載の方法。
（項目４３）
前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、赤血球凝集素ポリペプチドを含み、前記免疫原性が、赤血球凝集抑制アッセイを用いて測定される、項目１から４２のうちのいずれかに記載の方法。
（項目４４）
感染因子を実質的に含まないエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を含む、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物であって、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、感染因子を実質的に含まないわけではないエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子と実質的に同じ免疫原性を有する、調製物。
（項目４５）
前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、昆虫または哺乳動物グリコシル化をさらに含む、項目４４に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目４６）
前記昆虫グリコシル化が、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ；Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ；Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ；Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ；Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ；Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ；Ｍａｌａｃｏｓｔｏｍａ ｄｉｓｓｔｒｉａ；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ；Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ；Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ；Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａ；およびＨｙａｌｏｐｈｏｒａ ｃｅｃｒｏｐｉａからなる群より選択される、項目４４または４５に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目４７）
前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、共有結合した光化学作用物質、タンパク質サブユニットの三次構造もしくは四次構造においてＵＶ照射もしくはガンマ照射により誘導される変化、ガンマ照射により誘導される化学結合の開裂、またはＵＶ照射もしくはガンマ照射により誘導される、脂質の酸化、タンパク質の架橋形成、アミノ酸の酸化、およびアミノ酸の修飾からなる群より選択される化学修飾から選択される１または複数の欠損をさらに示す、項目４４から４６のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目４８）
前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、以下の欠損：共有結合した光化学作用物質、タンパク質サブユニットの三次構造もしくは四次構造においてＵＶ照射もしくはガンマ照射により誘導される変化、ガンマ照射により誘導される化学結合の開裂、またはＵＶ照射もしくはガンマ照射により誘導される、脂質の酸化、タンパク質の架橋形成、アミノ酸の酸化、およびアミノ酸の修飾からなる群より選択される化学修飾のいずれもを含まない、項目４７に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目４９）
前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、
（ａ）ｇａｇポリペプチドと、
（ｂ）非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチド、または連結を形成するための抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドであって、前記抗原は天然では脂質ラフトと会合しない、ポリペプチドと
を含む、項目４４から４８のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目５０）
前記非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドが、ＧＰＩアンカーポリペプチド、ミリストイル化配列ポリペプチド、パルミトイル化配列ポリペプチド、二重アセチル化配列ポリペプチド、シグナル伝達ポリペプチド、および膜輸送ポリペプチドからなる群より選択される、項目４９に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目５１）
前記非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドが、ＧＰＩアンカーポリペプチド、ミリストイル化配列ポリペプチド、パルミトイル化配列ポリペプチド、二重アセチル化配列ポリペプチド、カベオリンポリペプチド、フロチリンポリペプチド、シンタクシン−１ポリペプチド、シンタクシン−４ポリペプチド、シナプシンＩポリペプチド、アデューシンポリペプチド、ＶＡＭＰ２ポリペプチド、ＶＡＭＰ／シナプトブレビンポリペプチド、シナプトブレビンＩＩポリペプチド、ＳＮＡＲＥポリペプチド、ＳＮＡＰ−２５ポリペプチド、ＳＮＡＰ−２３ポリペプチド、シナプトタグミンＩポリペプチド、およびシナプトタグミンＩＩポリペプチドからなる群より選択される、項目４９に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目５２）
前記ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドが、赤血球凝集素ポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、融合タンパク質ポリペプチド、糖タンパク質ポリペプチド、およびエンベロープタンパク質ポリペプチドからなる群より選択される、項目４９に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目５３）
前記連結が、共有結合、イオン性相互作用、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、金属−配位子相互作用、および抗体−抗原相互作用からなる群より選択される、項目４９から５２のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目５４）
前記連結が、共有結合である、項目４９から５２のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目５５）
前記共有結合が、ペプチド結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、およびジスルフィド結合からなる群より選択される、項目５４に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目５６）
前記脂質ラフト会合ポリペプチドが、内在性膜タンパク質である、項目４９から５５のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目５７）
前記抗原が、タンパク質、ポリペプチド、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖のペプチド性または非ペプチド性模倣体、低分子、脂質、糖脂質、および炭水化物からなる群より選択される、項目４９から５６のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目５８）
赤血球凝集素ポリペプチドをさらに含む、項目４４から５７のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目５９）
ＲＳウイルスＭポリペプチドをさらに含む、項目４４から５８のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目６０）
ＲＳウイルスＧポリペプチドをさらに含む、項目４４から５９のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目６１）
ＲＳウイルスＦポリペプチドをさらに含む、項目４４から６０のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目６２）
前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、
（ａ）ｇａｇポリペプチドと、
（ｂ）赤血球凝集素ポリペプチドと
を含む、項目４４から４７のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目６３）
前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、
（ａ）インフルエンザＭ１ポリペプチドと、
（ｂ）赤血球凝集素ポリペプチドと
を含む、項目４４から４７のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目６４）
ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに含む、項目４４から６３に記載のエンベロー
プウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目６５）
前記ウイルス様粒子と会合するアジュバントをさらに含む、項目４４から６４に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目６６）
前記アジュバントが、前記ウイルス様粒子の内側に位置する、項目６５に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目６７）
前記アジュバントが、前記ウイルス様粒子の外側に位置する、項目６５に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目６８）
前記アジュバントを、前記ｇａｇポリペプチドと共有結合させて、共有結合を形成させる、項目６５から６７のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目６９）
前記アジュバントを、前記脂質ラフト会合ポリペプチドと共有結合させて、共有結合を形成させる、項目６５から６７のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目７０）
前記アジュバントが、フラジェリンのアジュバント活性断片を含む、項目６５から６９のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
（項目７１）
免疫系の疾患または症状を処置または予防する方法であって、免疫原性量の、項目４４から７０のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物、または項目１から４３のうちのいずれかに記載の方法を用いて単離したエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を投与するステップを含む、方法。
（項目７２）
前記投与するステップにより、被験体において、防御的免疫化反応が誘導される、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記投与するステップが、皮下送達、皮内送達、真皮下送達、筋肉内送達、経口による送達、経口送達、鼻腔内送達、口腔内送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、経肛門送達、および頭蓋内送達からなる群より選択される、項目７１から７２のうちのいずれかに記載の方法。
（項目７４）
免疫原性量の、項目４４から７０のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物、または項目１から４３のうちのいずれかに記載の方法を用いて単離したエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と、薬学的に許容されるキャリアとを含む、医薬組成物。
前出の態様およびそれらの実施形態は、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれかとさらに組み合わせることができる。前出の実施形態、および／または本明細書で開示されるさらなる実施形態のうちのいずれかと共に包含され得る、本発明のさらなる態様は、本明細書の全体において見出すことができる。
図１は、ＨＡおよびＮＡを含有するキメラＶＬＰの分析を示す図である。組換えバキュロウイルス発現細胞の上清は、細胞性細片を除去され、ＰＲ／８ Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰは、ショ糖クッションによって１００，０００×ｇで遠心分離され、再懸濁され、不連続ショ糖密度勾配で再度遠心分離された。（Ａ）勾配全体でのＰＲ／８ Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰ赤血球凝集活性。（Ｂ）ＰＲ／８ Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ＧａｇおよびＨＡの共移動を示している。（Ｃ）Ａ／Ｒｕｓｓｉａ／７７（Ｈ１Ｎ１）に特異的な抗体を使用する勾配画分４〜１６のＨ１Ｎ１特異的ウェスタンブロット。（Ｄ）ピーク勾配画分由来のネガティブ染色試料の電子顕微鏡写真。（Ｅ）分子量を増加させてＨＡ産物の電気泳動移動度を減少させるために、無関係な配列でＨＡ遺伝子がそのアミノ末端で伸長された精製ＰＲ／８ Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｆ）Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）を示す精製ＶＬＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｇａｇ対ＨＡの比を示す。 図２は、不連続ショ糖勾配で遠心分離したＨ５Ｎ１ ＶＬＰでの赤血球凝集活性およびノイラミニダーゼ活性の検査を示すグラフである。Ｈ５Ｎ１ ＶＬＰは、図１でＨ１Ｎ１ ＶＬＰについて示した通り調製されたが、ショ糖勾配画分は、赤血球凝集活性およびノイラミニダーゼ活性の両方についてアッセイされた。ＮＡ活性は蛍光基質２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸を使用して測定された。（Ａ）は、Ｖｉｅｔｎａｍ Ｈ５Ｎ１ ＶＬＰについての活性を示す。（Ｂ）はＩｎｄｏｎｅｓｉａ Ｈ５Ｎ１ ＶＬＰについての活性を示す。 図３は、ＶＬＰ免疫原性およびチャレンジ防御を示すグラフである。１６匹のマウス３群は、キメラＨ１Ｎ１ ＶＬＰ（Ａ／ＰＲ／８／３４を示す）で筋肉内または腹腔内免疫化を介して初回および追加免疫化を受けた。すべてのＶＬＰ処方物は、１用量あたりＨＡおよそ０．７μｇを含有した。追加の４週間後に動物は１０ＬＤ５０のＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）でチャレンジされた。（Ａ）追加後２週間でのＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）に特異的なＨＡＩ活性。（Ｂ）追加後２週間でのＡ／ＰＲ／８／３４に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２Ａ応答の定量。（Ｃ）Ｈ１Ｎ１チャレンジに続く重量減少によって示されるチャレンジ防御。 図４は、ＶＬＰおよび生きているウイルスがＨＡＩアッセイにおいて同様に挙動することを示すグラフである。ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）ＶＬＰで免疫化したマウス由来の血清を生きているＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）ウイルスの４ＨＡユニットまたは対応するＶＬＰの４ＨＡユニットのいずれかを使用してＨＡＩ活性について検査した。ＨＫ／６８（Ｈ３Ｎ２）ＶＬＰで免疫化したマウス由来の血清を同様にＨＫ／６８ウイルスおよびＶＬＰに対して検査した。データは、ＨＡＩアッセイにおいてウイルスとＶＬＰとの間での同様の挙動を示した。 図５は、ＶＬＰ免疫化フェレットにおける追加後免疫応答を示すグラフである。フェレットは初回および追加免疫化をそれぞれ０日目および２８日目にＨ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１および裸のＶＬＰで受けた。Ｈ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１ ＶＬＰ用量は、１用量あたりＨＡおよそ５μｇを含有した。２８日目および４２日目の血清試料を（Ａ）Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）特異的ＨＡＩ活性および（Ｂ）Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）特異的マイクロ中和活性について分析した。 図６は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１および裸のＶＬＰで免疫化したフェレットでのチャレンジ後の体重減少および生存を示すグラフである。追加免疫化を受けた２週間後にＶＬＰワクチン接種フェレットは、１×１０６ＴＣＩＤ５０のＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）でチャレンジされた。（Ａ）すべての群についての平均体重減少データ（生存データをグラフ説明に示す）。（Ｂ）Ｂ群中のＨ１Ｎ１ワクチン接種動物についての個々の体重減少データ。 図７は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１および裸のＶＬＰで免疫化されたフェレットでのチャレンジ後の鼻洗浄液ウイルス力価を示すグラフである。追加免疫化を受けた２週間後にＶＬＰワクチン接種フェレットは、１×１０６ＴＣＩＤ５０のＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）でチャレンジされた。（Ａ）チャレンジ後３日目（４５日目）の鼻洗浄液ウイルス力価。（Ｂ）チャレンジ後５日目（４７日目）の鼻洗浄液ウイルス力価。
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の好ましい実施形態には、感染因子を不活化する方法に供されたエンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物であって、そのような不活化法に供されていないＶＬＰと実質的に同じ免疫原性をＶＬＰが保持することを可能とする調製物と；エンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物における感染因子を不活化するこのような方法と；このような調製物をワクチン組成物へとさらに加工する方法と、このようなワクチン組成物を用いる方法とが含まれるが、これらに限定されない。
理論に制約されることを望まないが、本発明の特定の好ましい実施形態は、以下の実施例に示すように、ＰＰＶ ＶＬＰなど、他の非エンベロープウイルスベースのＶＬＰとは異なり、エンベロープウイルスベースのＶＬＰが、感染因子を不活化するのに用いられる標準的な不活化法に対して感受性であるという驚くべき発見に基づいている。しかし、同じく驚くべきことに、ＵＶ−Ａ照射＋光化学作用物質、ＵＶ−Ｃ照射、およびガンマ照射など、電磁ベースの不活化システムは、汚染性のエンベロープウイルスを不活化するのに効果的である一方で、該エンベロープウイルスベースのＶＬＰの免疫原性を維持し、このために、このような不活化法は、ワクチンにおいて用いられるエンベロープウイルスベースのＶＬＰを調製するのに理想的となっている。
エンベロープウイルスベースのＶＬＰを作製する好ましい方法は、好ましくはポリペプチド抗原の共発現（ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を含めた、昆虫細胞内における発現を介する。バキュロウイルス発現系内における各種のレトロウイルスから得ることができるｇａｇ ＶＬＰの収量が大きい（２３、２４、４６、４９、５２〜５８）ため、ｇａｇポリペプチドを用いてＶＬＰを作製することがさらにより好ましい。天然のレトロウイルスアセンブリー過程において、ｇａｇポリペプチドはＣ末端伸長を本質的に包含する。すなわち、天然において、機能的なｇａｇタンパク質は、リボソームのフレームシフトに起因して、レトロウイルスプロテアーゼ活性、逆転写酵素活性、およびインテグラーゼ活性を含有する長いＣ末端伸長を有する。ラウス肉腫ウイルスのｇａｇ（５９）およびＭＬＶのｇａｇ（６０）の両方について、人工的な伸長を伴う機能的なｇａｇタンパク質の作製が達成されている。ｇａｇのＣ末端操作がこのように柔軟であることから、他の抗原および免疫刺激性タンパク質の配列など、他のポリペプチドを組み込むのに重要な部位が得られる。エンベロープウイルスベースのＶＬＰを作製する別の好ましい方法は、インフルエンザＨＡタンパク質およびインフルエンザＭ１タンパク質（また、場合によって、インフルエンザＮＡタンパク質）の共発現を介する。昆虫細胞内におけるこれら２つのタンパク質の共発現は、エンベロープウイルスベースのＶＬＰを作製する有効な方法であることが示されている（１１１〜１１２）。
エンベロープウイルスベースのＶＬＰの好ましい例には、（ｉ）ｇａｇポリペプチドと、抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとを含むＶＬＰ；（ｉｉ）ＲＳウイルスＭポリペプチドと、ＲＳウイルスＦポリペプチドと（また、場合によって、ＲＳウイルスＧポリペプチドと）を含むＶＬＰ；（ｉｉｉ）レンチウイルスおよびアルファレトロウイルスからなる群より選択されるレトロウイルスのｇａｇポリペプチドと、ＲＳウイルスＦポリペプチドとを含むＶＬＰ；（ｉｖ）ｇａｇポリペプチドと、インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドと（また、場合によって、ノイラミニダーゼポリペプチドと）を含むＶＬＰ；ならびに（ｖ）インフルエンザＭ１ポリペプチドと、赤血球凝集素ポリペプチドと（また、場合によって、ノイラミニダーゼポリペプチドと）を含むＶＬＰが含まれる。
１つのウイルスに由来するコア粒子と、別のウイルスに由来する表面抗原とを含有するキメラＶＬＰの作製は、シュードタイピング（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）と呼ばれる。おそらく、インフルエンザＨＡタンパク質およびインフルエンザＮＡタンパク質が、脂質ラフトドメイン内に濃縮される（６１、６２）一方、出芽過程では、ミリストイル化した（ｍｙｒｉｓｔｏｌａｔｅｄ）ｇａｇタンパク質もまた、脂質ラフトドメインの内部表面において濃縮される（６３）ため、ｇａｇポリペプチドが効率的にシュードタイピングされるのは、これらのタンパク質を伴うときである。
本明細書で記載される本発明の実施形態は、キメラＶＬＰを形成するための基盤として、天然では脂質ラフトと会合しない抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドを包含するＶＬＰプラットフォームに適合する。
開示される方法およびプロトコールを実施するには、別段に示さない限り、当業者の能力の範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を用いる。このような技法は、文献において説明されている。例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＴ． Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら（１９９５年、および定期的な補遺；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、９、１３、および１６章、ニューヨーク州、ニューヨーク、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社）； Ｂ． Ｒｏｅ、Ｊ． Ｃｒａｂｔｒｅｅ、およびＡ． Ｋａｈｎ、１９９６年、「ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ： Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社； Ｊ． Ｍ． ＰｏｌａｋおよびＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ． ＭｃＧｅｅ、１９９０年、「Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ社； Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ（編）、１９８４年、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ社；ならびにＤ． Ｍ． Ｊ． ＬｉｌｌｅｙおよびＪ． Ｅ． Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２年、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社を参照されたい。
（定義）
本明細書で用いられる「エンベロープウイルスベースのＶＬＰ」とは、エンベロープウイルスに由来する１または複数の成分を用いて形成されるウイルス様粒子を指す。好ましい例には、ｇａｇポリペプチドを用いて作製したＶＬＰと、インフルエンザＭ１ポリペプチドおよび／または赤血球凝集素ポリペプチド（また、場合によって、ノイラミニダーゼポリペプチド）を用いて作製したＶＬＰと、レンチウイルスのｇａｇポリペプチドおよびアルファレトロウイルスのｇａｇポリペプチドからなる群ならびにＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆポリペプチド（および、場合によって、ＲＳウイルスＧポリペプチド）を用いて作製したＶＬＰと、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｍおよび／またはＦポリペプチド（および、場合によって、ＲＳウイルスＧポリペプチド）を用いて作製したＶＬＰとが含まれるが、これらに限定されない。
さらなる例には、エンベロープウイルスベースのＶＬＰを形成するのに用い得る、エボラウイルスおよびマールブルクウイルスなどのフィロウイルス（例えば、細胞内においてフィロウイルスに由来するウイルス性ＧＰおよびウイルス性ＶＰ４０を共発現させると、脂質ラフト内におけるこれら２つのウイルス性タンパク質の会合により、ＶＬＰが生成される（米国特許公開第２００６００９９２２５号を参照されたい））；ＳＡＲＳウイルスなどのコロナウイルス（例えば、コロナウイルスのＶＬＰ形成には、Ｅタンパク質およびＭタンパク質で十分である（Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（１９９８年）、７２巻：７８８５〜７８９４頁；およびＶｅｎｎｅｍａら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９６年）、１５巻：２０２０〜２０２８頁を参照されたい））；ＲＳウイルス（ＲＳＶ）など、パラミクソウイルス科のウイルス（例えば、ＲＳＶのＭタンパク質を発現させると、ＶＬＰが生成される（例えば、米国特許公開第２００８０２３３１５０号を参照されたい））；ならびに西ナイルウイルスなどのフラビウイルス科（例えば、バキュロウイルス発現系内で西ナイルウイルスのｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子を含む構築物を発現させると、ＶＬＰが生成される（例えば、米国特許公開第２００８０２３３１５０号を参照されたい））が含まれる。
本明細書で用いられる「感染因子を含まない」とは、感染可能な活性作用物質の不在を指す。このような試料は、不活性であり、感染不能な作用物質を含有し得る。例を目的として述べると、バキュロウイルスがもはや感染不能であるように処理された、バキュロウイルスを含有する試料は、不活化されたバキュロウイルスをなおも含有するが、感染因子を含まない。さらに、試料は、感染可能な活性作用物質を絶対的に含まないことが必要なわけではなく、これをヒト用または動物用のワクチンとして意図される目的に適宜用い得る（すなわち、ヒト用または動物用のワクチン内における感染因子の許容レベルを統轄する任意の米国連邦規則を適宜満たす）程度に十分に活性作用物質を含まないことだけが必要である。特定の実施形態では、感染因子を含まないようにされた後のエンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物の用量当たりの感染単位またはｍｌ当たりの感染単位は、感染因子を含まないようにされる前のエンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物の少なくとも１０分の１、少なくとも１００分の１、少なくとも１０００分の１、または少なくとも１０，０００分の１に低下する。例示を目的として述べると、感染因子には、１または複数の宿主細胞内において、ＶＬＰを含むポリペプチド（複数可）を発現させるのに用いるベクター（複数可）、および外部の細菌性汚染物質、真菌性汚染物質、またはウイルス性汚染物質、さらにまた、内因性の病原体（例えば、宿主ゲノム内ではサイレントである（ｓｉｌｅｎｔ）ことが典型的である、レトロウイルス性エレメントまたはレトロトランスポゾン性エレメントの再活性化など、供給源物質または宿主細胞に由来する）が含まれ得る。
本明細書で用いられる「実質的に同じ免疫原性」とは、感染因子を含まないようにされる前の調製物と比較した、感染因子を含まないようにされた後のエンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物の免疫原性を指す。特定の実施形態では、感染因子を含まないようにされた後のエンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物は、感染因子を含まないようにされる前のエンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物の少なくとも５０パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセント、または少なくとも９５パーセントの免疫原性を有する。特定の実施形態では、感染因子を含まないようにされた後のエンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物は、感染因子を含まないようにされる前のエンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物より大きな免疫原性を有するか、または、これと比較して免疫原性が増大する。免疫原性の好ましい尺度は、接種後に得られる、ＶＬＰ組成物に対する抗体力価である。インフルエンザワクチンの場合、免疫原性の好ましい尺度は、以下の実施例によるＨＡＩ活性である。前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、赤血球凝集素ポリペプチドを含み、免疫原性を予測する赤血球凝集アッセイを用いて、該エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の物理的および生化学的な完全性を測定することもでき、または、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子により免疫化した動物の血清におけるＨＡＩ活性を、免疫原性の尺度として決定することもできる。免疫原性を特定する、前出の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得るさらに別の実施形態では、動物にエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子（ＲＳウイルス（ＲＳＶ）ポリペプチドを包含し得る）をワクチン接種し、ＥＬＩＳＡアッセイもしくはウイルス中和化アッセイにより、またはウェスタンブロットにより抗体力価を測定するか、あるいは増殖アッセイ、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、またはサイトカイン放出アッセイによりＴ細胞反応を測定することにより、該免疫原性を直接測定することができる。
「昆虫グリコシル化」とは、昆虫により、また、昆虫細胞ベースの発現系によりもたらされるグリコシル化パターンを指す。このようなグリコシル化パターンには、天然においてもたらされるグリコシル化、および哺乳動物のグリコシル化酵素を包含するように改変された昆虫細胞が、天然において、哺乳動物または哺乳動物細胞ベースの発現系によりもたらされるグリコシル化パターンではなく、「哺乳動物様の」グリコシル化をもたらすだけである限りにおいて、このような改変昆虫細胞によりもたらされるグリコシル化パターンも含まれ得る。昆虫グリコシル化パターンの好ましい例には、
など、バキュロウイルス発現系および関連のウイルス発現系に適合する昆虫細胞が含まれる。
「哺乳動物グリコシル化」とは、哺乳動物により、また、哺乳動物細胞ベースの発現系によりもたらされるグリコシル化パターンを指す。このようなグリコシル化パターンには、天然においてもたらされるグリコシル化、およびこのような細胞では見出されないか、または発現することが典型的ではないグリコシル化酵素を包含するように改変された哺乳動物細胞が、天然において、哺乳動物以外または哺乳動物以外の細胞ベースの発現系によりもたらされるグリコシル化パターンではなく、哺乳動物グリコシル化または非天然グリコシル化をもたらすだけである限りにおいて、このような改変哺乳動物細胞によりもたらされるグリコシル化パターンも含まれ得る。昆虫グリコシル化パターンの好ましい例には、ヒト細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＴＭ）細胞、ＭＲＣ−５細胞、およびＨＥＫ２９３細胞によりもたらされるグリコシル化を含めた）、サル細胞（Ｖｅｒｏ細胞によりもたらされるグリコシル化を含めた）、また、げっ歯動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞によりもたらされるグリコシル化を含めた）など、公知のウイルス発現系に適合する哺乳動物細胞が含まれる。
本明細書で用いられる「Ｇａｇポリペプチド」とは、本明細書で記載するウイルス様粒子の形成の一因となる、レトロウイルス由来の構造ポリペプチドである。ｇａｇポリペプチドは、エンベロープウイルスベースのＶＬＰを形成するのに好ましい手段である。一部の実施形態では、ＲＮＡをパッケージングする傾向、または粒子形成および出芽の効率など、特定の特徴に影響を及ぼす目的で、ｇａｇポリペプチドを意図的に変異させることができる。レトロウイルスのゲノムは、３つの主要な遺伝子産物をコードする：構造タンパク質をコードするｇａｇ遺伝子の産物；逆転写酵素および関連のタンパク質分解性ポリペプチド、ヌクレアーゼおよびインテグラーゼに関連する機能をコードするｐｏｌ遺伝子の産物；ｅｎｖの産物（それによりコードされる糖タンパク質の膜タンパク質が、感染細胞の表面上において、また、放出された成熟ウイルス粒子の表面上においても検出される）。すべてのレトロウイルスのｇａｇ遺伝子は、全体的な構造類似性を有し、レトロウイルスの各群内においても、アミノ酸レベルで保存されている。ｇａｇ遺伝子は、逆転写酵素を除くコアタンパク質をもたらす。
ＭＬＶの場合、Ｇａｇの前駆体であるポリタンパク質は、Ｐｒ６５Ｇａｇであり、該前駆体上におけるその順序がＮＨ２−ｐ１５−ｐｐ１２−ｐ３０−ｐ１０−ＣＯＯＨである４つのタンパク質へと切断される。これらの切断は、ウイルス性プロテアーゼを介し、また、ウイルスに応じて、ウイルス放出の前または後において生じ得る。ＭＬＶ Ｇａｇタンパク質は、グリコシル化形態および非グリコシル化形態で存在する。グリコシル化形態はｇＰｒ８０Ｇａｇから切り出され、ｇＰｒ８０Ｇａｇは、非グリコシル化Ｐｒ６５Ｇａｇに対応するＡＵＧコドンの上流に位置する、インフレームの、異なる開始コドンから合成される。グリコシル化Ｇａｇを合成しない、ＭＬＶの欠失変異体がなおも感染性であり、また、非グリコシル化Ｇａｇがなおもウイルス様粒子を形成し得ることから、グリコシル化イベントの重要性について、疑問が投げかけられる。ウイルスがコードするプロテアーゼにより、ＨＩＶ−１ Ｇａｇの前駆体であるｐｒ５５Ｇａｇが翻訳後に切断されることから、Ｎ−ミリストイル化されて内部でリン酸化されたｐ１７マトリックスタンパク質（ｐ１７ＭＡ）、リン酸化されたｐ２４カプシドタンパク質（ｐ２４ＣＡ）、ならびにヌクレオカプシドタンパク質であるｐ１５（ｐ１５ＮＣ）がもたらされ、ｐ１５は、さらにｐ９およびｐ６へと切断される。
構造面において、原型的なＧａｇポリタンパク質は、レトロウイルスのｇａｇ遺伝子において常に同じ順序で生じる３つの主要なタンパク質：マトリックスタンパク質（ＭＡ）（マトリックスという名称を共有するが、ＭＡとは異なるタンパク質である、インフルエンザマトリックスタンパク質Ｍ１と混同しないようにされたい）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、およびヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）に分けられる。成熟タンパク質へのＧａｇポリタンパク質のプロセシングは、レトロウイルスがコードするプロテアーゼにより触媒され、新たに出芽するウイルス粒子が成熟するときに生じる。機能面において、Ｇａｇポリタンパク質は、３つのドメイン：細胞膜をＧａｇポリタンパク質の標的とする膜結合ドメインと；Ｇａｇの重合化を促進する相互作用ドメインと；宿主細胞からの新生ビリオンの放出を促進する後期ドメインとに分けられる。アセンブリーを媒介するＧａｇタンパク質の形態は、ポリタンパク質である。したがって、アセンブリードメインは、後期に形成される任意の切断産物内にもれなく収まる必要はない。こうして、本明細書で包含されるＧａｇポリタンパク質は、ＶＬＰの形成および放出に重要な機能的エレメントを包含する。これらの重要な機能的エレメントに関する最新技術の進歩は大きい。例えば、
を参照されたい。
本発明の特定のＶＬＰにおいて用いられるｇａｇポリペプチドは、ＶＬＰを形成するための機能的エレメントを最小限において包含するだろう。ｇａｇポリペプチドは、場合によって、そのコード配列をｇａｇポリペプチドのコード配列にスプライシングすることによって作製し得る、１または複数のさらなるポリペプチドを包含し得る。ｇａｇポリペプチド内へのさらなるポリペプチドの挿入に好ましい部位は、Ｃ末端である。
Ｇａｇポリペプチドに好ましいレトロウイルスの供給源には、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アルファレトロウイルス（トリ白血病ウイルス、またはラウス肉腫ウイルスなど）、ベータレトロウイルス（マウス乳癌ウイルス、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス、およびメーソン−ファイザーサルウイルスなど）、ガンマレトロウイルス（マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびテナガザル白血病ウイルスなど）、デルタレトロウイルス（ヒトＴリンパ向性ウイルス、およびウシ白血病ウイルスなど）、イプシロンレトロウイルス（ウォールアイ皮膚肉腫ウイルスなど）、またはレンチウイルス（１型ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス）が含まれる。
本明細書で用いられる「脂質ラフト」とは、ウイルス粒子のアセンブリー過程においてｇａｇポリペプチドが濃縮される、細胞膜のマイクロドメインを指す。
本明細書で用いられる「脂質ラフト会合ポリペプチド」とは、脂質ラフトと直接的または間接的に会合する任意のポリペプチドを指す。本発明で用いられる具体的な脂質ラフト会合ポリペプチドは、キメラウイルス様粒子の所望の使用に依存する。
脂質ラフト会合ポリペプチドは、内在性膜タンパク質、膜との会合を引き起こすタンパク質修飾により脂質ラフトと直接的に会合するタンパク質、または脂質ラフト会合ポリペプチドにより脂質ラフトと間接的に会合するポリペプチドであり得る。
脂質アンカーを有する多くのタンパク質が、脂質ラフトと会合する。ポリペプチドを脂質ラフトへと連結する脂質アンカーには、ＧＰＩアンカー、ミリストイル化、パルミトイル化、および二重アセチル化が含まれる。
多くの異なる種類のポリペプチドが、脂質ラフトと会合する。脂質ラフトは、シグナル伝達、膜輸送、ウイルスの侵入、ウイルスのアセンブリー、また、アセンブルした粒子の出芽を含めた、多くの生物学的活性のためのプラットフォームとして機能し、したがって、これらの過程に関与する各種のポリペプチドと会合する。
シグナル伝達カスケードに関与する各種のポリペプチドは、シグナル伝達プラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。シグナル伝達プラットフォームとして機能する脂質ラフトの１つの種類は、カベオラと呼ばれている。それは、カベオリンファミリーに由来するポリペプチド（例えば、カベオリンおよび／またはフロチリン（ｆｌｏｔｔｉｌｌｉｎ））を含有する、細胞膜のフラスコ型の陥入部である。
膜輸送ポリペプチドは、膜輸送プラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。例には、シンタクシン−１タンパク質、シンタクシン−４タンパク質、シナプシンＩタンパク質、アデューシンタンパク質、ＶＡＭＰ２タンパク質、ＶＡＭＰ／シナプトブレビンタンパク質、シナプトブレビンＩＩタンパク質、ＳＮＡＲＥタンパク質、ＳＮＡＰ−２５タンパク質、ＳＮＡＰ−２３タンパク質、シナプトタグミンＩタンパク質、およびシナプトタグミンＩＩタンパク質など、エンドサイトーシスおよびエクソサイトーシスに関与するタンパク質が含まれる。
ウイルス受容体、ウイルス受容体−共受容体複合体、ウイルス侵入過程の調節を補助する他の任意の成分は、ウイルス侵入に特化した膜輸送プラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。脂質ラフトと会合するウイルス受容体の例には、崩壊促進因子（ＤＡＦまたはＣＤ５５）、多くのエンテロウイルスの受容体であるＧＰＩアンカー膜糖タンパク質；ガングリオシド、Ｈｓｃ７０タンパク質、アルファ２−ベータ１インテグリンおよびアルファ５−ベータ２インテグリンを含めた複数の成分を含有する複合体である、Ａ群ロタウイルスの受容体；ＨＩＶウイルス、ＭＬＶウイルス、麻疹ウイルス、およびＥｂｏｌａウイルスなど、複数のエンベロープウイルスの糖タンパク質；ならびにＣＤ５ポリペプチド、ＣＣＲ５ポリペプチド、およびｎｅｆポリペプチドなど、ＨＩＶの侵入に関与するポリペプチドが含まれる。ＣｈａｚａｌおよびＧｅｒｌｉｅｒ、２００３年、「Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ， Ａｓｓｅｍｂｌｙ， Ｂｕｄｄｉｎｇ， ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｒａｆｔｓ」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ａｎｄ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． Ｒｅｖ．、６７巻（２号）：２２６〜２３７頁を参照されたい。
ウイルス粒子のアセンブリーに関与するポリペプチドは、ウイルスアセンブリープラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。このようなポリペプチドの例には、ＨＡインフルエンザエンベロープ糖タンパク質およびＮＡインフルエンザエンベロープ糖タンパク質、麻疹ウイルスに由来するＨタンパク質および成熟Ｆ１−Ｆ２融合タンパク質、ならびにＨＩＶウイルスに由来するｇｐ１６０、ｇｐ４１、およびＰｒ５５ｇａｇが含まれる。ＣｈａｚａｌおよびＧｅｒｌｉｅｒ、２００３年、「Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ， Ａｓｓｅｍｂｌｙ， Ｂｕｄｄｉｎｇ， ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｒａｆｔｓ」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ＆ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． Ｒｅｖ．、６７巻（２号）：２２６〜２３７頁を参照されたい。
アセンブルしたウイルスの出芽に関与するポリペプチドは、ウイルス出芽プラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。宿主細胞からのＨＩＶ−１の出芽は、膜ラフト内で生じることを示唆するデータが存在する。ＣｈａｚａｌおよびＧｅｒｌｉｅｒ、２００３年、「Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ， Ａｓｓｅｍｂｌｙ， Ｂｕｄｄｉｎｇ， ａｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｒａｆｔｓ」、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ａｎｄ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． Ｒｅｖ．、６７巻（２号）：２２６〜２３７頁を参照されたい。ウイルスの出芽に関与するポリペプチドについての一般的な情報は、「Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」（第４版）、２００１年において見出すことができる。
好ましい脂質ラフト会合ポリペプチドには、赤血球凝集素ポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、融合タンパク質ポリペプチド、糖タンパク質ポリペプチド、およびエンベロープタンパク質ポリペプチドなどのウイルスポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドの各々は、任意の種類のウイルスに由来し得るが、特定の実施形態は、ＨＩＶ−１ウイルスに由来するエンベロープタンパク質、ＲＳウイルスまたは麻疹ウイルスに由来する融合タンパク質、ＲＳウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはエボラウイルスに由来する糖タンパク質、また、麻疹ウイルスに由来する赤血球凝集素タンパク質を包含する。
好ましい非ウイルス性病原体の脂質ラフト会合ポリペプチドは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘなどのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属； Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ； Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ； Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ； Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ； Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ； Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍなどが含まれるがこれらに限定されない病原性の原虫、蠕虫、また、他の真核微生物の病原体から得ることができる。このような非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドは、それ自体が抗原として作用するので、天然では脂質ラフトと会合しない抗原に連結することなく用いることができる。
本明細書で用いられる「インフルエンザＭ１ポリペプチド」は、ウイルスエンベロープ内におけるウイルス被覆の形成を媒介する、インフルエンザウイルスタンパク質に由来する。該Ｍ１タンパク質は、ウイルスの出芽を駆動し、また、ウイルス粒子の主要なタンパク質成分でもあり、ウイルス粒子内では、ウイルスエンベロープおよび内在性膜タンパク質と、ゲノムリボ核タンパク質との間の中間層を形成する。Ｍ１ポリペプチドはまた、正に帯電したアミノ酸に富む、Ｍ１ポリペプチド内における結合モチーフ（ＲＫＬＫＲ）に依存する非特異的な様式で、ウイルスＲＮＡに結合するとも考えられている。
ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドの好ましい例は、赤血球凝集素ポリペプチドである。本明細書で用いられる「赤血球凝集素ポリペプチド」は、感染される細胞に対するウイルスの結合を媒介するインフルエンザウイルスタンパク質に由来する。赤血球凝集素ポリペプチドはまた、同等の麻疹ウイルスタンパク質にも由来し得る。このタンパク質は、単一の膜貫通ドメインにより、インフルエンザウイルスの表面へとアンカリングすることが見出される抗原性の糖タンパク質である。インフルエンザ赤血球凝集素のうち、Ｈ１〜Ｈ１６と名付けられた、少なくとも１６のサブタイプが同定されている。Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３は、ヒトインフルエンザウイルスにおいて見出される。Ｈ５またはＨ７の赤血球凝集素を有する、高病原性鳥類インフルエンザウイルスがヒトに感染する割合は低いことが判明している。鳥類ウイルス株のＨ５型赤血球凝集素内における単一のアミノ酸変化がヒト患者において見出されており、これが受容体の特異性を変化させることを可能にし、Ｈ５赤血球凝集素が鳥類Ｈ５Ｎ１ウイルスの受容体特異性を顕著に変化させることによって、これらのウイルスに、ヒト受容体に結合する能力がもたらされると報告されている（１０９および１１０）。この知見は、通常ヒトに感染しないＨ５Ｎ１ウイルスが変異し、ヒト細胞に効率的に感染できるようになることを説明する。
赤血球凝集素は、ホモ三量体の内在性膜ポリペプチドである。天然では、その膜貫通ドメインが、脂質ラフトドメインと会合し、これにより、ｇａｇポリペプチドと会合することが可能となり、ＶＬＰ内へと組み込まれる。それは、円筒様の形状をしており、約１３５Åの長さである。ＨＡを構成する３つの同一の単量体は、中央のコイルドコイルと、ＶＬＰの表面上に露出されるシアル酸結合部位を含有する球形の頭状部分とを形成する。ＨＡの単量体は、グリコシル化され、２つのより小型のポリペプチド：ＨＡ１サブユニットおよびＨＡ２サブユニットへと切断される、単一のポリペプチド前駆体として合成される。ＨＡ２サブユニットは、膜へとアンカリングされる、三量体のコイルドコイルを形成し、ＨＡ１サブユニットは、球形の頭状部分を形成する。
本発明の特定のＶＬＰにおいて脂質ラフト会合ポリペプチドとして用いられる赤血球凝集素ポリペプチドは、最小限において、膜アンカードメインを包含するものとする。赤血球凝集素ポリペプチドは、任意のインフルエンザウイルス型、インフルエンザウイルス亜型、インフルエンザウイルス株、またはインフルエンザウイルス亜株に由来することが可能であり、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９赤血球凝集素に由来することが好ましい。加えて、赤血球凝集素ポリペプチドは、異なるインフルエンザ赤血球凝集素のキメラでもあり得る。赤血球凝集素ポリペプチドは、１または複数のさらなるポリペプチドのコード配列を、赤血球凝集素ポリペプチドのコード配列にスプライシングすることにより作製し得る、天然では脂質ラフトと会合しない、１または複数のさらなる抗原を包含することが好ましい。赤血球凝集素ポリペプチド内へのさらなるポリペプチドの挿入に好ましい部位は、Ｎ末端である。
本発明の特定のＶＬＰにおいて抗原として用いられる赤血球凝集素ポリペプチドは、最小限において、膜アンカードメイン、また、赤血球凝集素に由来する少なくとも１つのエピトープを包含するものとする。赤血球凝集素ポリペプチドは、任意のインフルエンザウイルス型、インフルエンザウイルス亜型、インフルエンザウイルス株、またはインフルエンザウイルス亜株に由来することが可能であり、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、およびＨ９赤血球凝集素に由来することが好ましい。加えて、赤血球凝集素ポリペプチドは、異なるインフルエンザ赤血球凝集素のキメラでもあり得る。赤血球凝集素ポリペプチドは、場合によって、そのコード配列を赤血球凝集素ポリペプチドのコード配列にスプライシングすることにより作製し得る、１または複数のさらなるポリペプチドを包含し得る。赤血球凝集素ポリペプチド内へのさらなるポリペプチドの挿入に好ましい部位は、Ｎ末端である。
ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドの好ましい別の例は、ノイラミニダーゼポリペプチドである。本明細書で用いられる「ノイラミニダーゼポリペプチド」は、糖タンパク質から末端のシアル酸残基を切断することにより、細胞からのインフルエンザウイルスの放出を媒介する、インフルエンザウイルスタンパク質に由来する。ノイラミニダーゼ糖タンパク質は、ウイルス表面上において発現する。ノイラミニダーゼタンパク質は四量体であり、ベータ−ピンホイール構造を有する球形の頭状部分、細いストーク状領域、また、単一の膜貫通ドメインによりウイルス膜内に該タンパク質をアンカリングする小さな疎水性領域からなる共通構造を共有する。シアル酸残基を切断するための活性部位は、すべてのインフルエンザＡウイルス内に保存されている、１５の荷電アミノ酸により形成される、各サブユニット表面上のポケットを包含する。インフルエンザノイラミニダーゼのうち、Ｎ１〜Ｎ９と名付けられた、少なくとも９つのサブタイプが同定されている。
本発明の特定のＶＬＰにおいて用いられるノイラミニダーゼポリペプチドは、最小限において、膜アンカードメインを包含するものとする。機能的領域に関する最新技術は極めて高度である。例えば、Ｖａｒｇｈｅｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３０３巻、３５〜４０頁、１９８３年； Ｃｏｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０３巻、４１〜４４頁、１９８３年； Ｌｅｎｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６巻、５３２１〜５３８５頁、１９８７年； Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｖｉｒｏｌ．、１３５巻、３０〜４２頁、１９８４年を参照されたい。ノイラミニダーゼポリペプチドは、任意のインフルエンザウイルス型、インフルエンザウイルス亜型、インフルエンザウイルス株、またはインフルエンザウイルス亜株に由来することが可能であり、Ｎ１ノイラミニダーゼおよびＮ２ノイラミニダーゼに由来することが好ましい。加えて、ノイラミニダーゼポリペプチドは、異なるインフルエンザノイラミニダーゼのキメラでもあり得る。ノイラミニダーゼポリペプチドは、１または複数のさらなるポリペプチドのコード配列を赤血球凝集素ポリペプチドにスプライシングすることにより作製し得る、天然では脂質ラフトと会合しない１または複数のさらなる抗原を包含することが好ましい。ノイラミニダーゼポリペプチドコード配列内へのさらなるポリペプチドの挿入に好ましい部位は、Ｃ末端である。
本発明の特定のＶＬＰにおいて抗原として用いられるノイラミニダーゼポリペプチドは、最小限において、膜アンカードメイン、また、少なくとも１つのシアル酸残基切断活性を包含するものとする。機能的領域に関する最新技術は極めて高度である。例えば、Ｖａｒｇｈｅｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３０３巻、３５〜４０頁、１９８３年； Ｃｏｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０３巻、４１〜４４頁、１９８３年； Ｌｅｎｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６巻、５３２１〜５３８５頁、１９８７年； Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｖｉｒｏｌ．、１３５巻、３０〜４２頁、１９８４年を参照されたい。ノイラミニダーゼポリペプチドは、任意のインフルエンザウイルス型、インフルエンザウイルス亜型、インフルエンザウイルス株、またはインフルエンザウイルス亜株に由来することが可能であり、Ｎ１ノイラミニダーゼおよびＮ２ノイラミニダーゼに由来することが好ましい。加えて、ノイラミニダーゼポリペプチドは、異なるインフルエンザノイラミニダーゼのキメラでもあり得る。ノイラミニダーゼポリペプチドは、場合によって、そのコード配列をノイラミニダーゼポリペプチドのコード配列にスプライシングすることにより作製し得る、１または複数のさらなるポリペプチドを包含し得る。ノイラミニダーゼポリペプチド内へのさらなるポリペプチドの挿入に好ましい部位は、Ｃ末端である。
脂質ラフト会合ポリペプチドの好ましい別の例は、ファシクリンＩ（ＦａｓＩ）と称する、昆虫由来の接着タンパク質である。本明細書で用いられる「ファシクリンＩポリペプチド」は、胚の発生に関与する昆虫タンパク質に由来する。この非ウイルス性タンパク質は、昆虫細胞内のバキュロウイルス発現系において発現させることができ、これにより、ＦａｓＩの脂質ラフト会合がもたらされる（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７７巻、６２６５〜６２７３頁、２００３年）。したがって、ファシクリンＩポリペプチドに異種抗原を結合させて、ｇａｇと共に共発現させると、ＶＬＰ内にキメラ分子が組み込まれる。本発明のＶＬＰにおいて用いられるファシクリンＩポリペプチドは、最小限において、膜アンカードメインを包含するものとする。
脂質ラフト会合ポリペプチドの好ましい別の例は、Ｇ糖タンパク質と称する、ＲＳＶに由来するウイルス性付着タンパク質である。本明細書で用いられる「Ｇグリコポリペプチド」は、ＲＳＶ Ｇ糖タンパク質に由来する。近年のデータは、脂質ラフトドメインが、インフルエンザウイルスにとって重要であるのと同様に、ＲＳＶ粒子の出芽にも重要であることを示している（Ｖｉｒｏｌ、３２７巻、１７５〜１８５頁、２００４年； Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．、１４９巻、１９９〜２１０頁、２００４年； Ｖｉｒｏｌ．、３００巻、２４４〜２５４頁、２００２年）。ＲＳＶに由来するＧ糖タンパク質は、ウイルス性付着タンパク質であり、およびＲＳＶ感染に対する防御抗原として機能する、３２．５ｋｄの内在性膜タンパク質である。インフルエンザウイルスに由来する赤血球凝集素と同様、その抗原性は、それに付着した、任意の非脂質ラフト抗原の抗原性を増強し得る。天然において、ＲＳＶは、ノイラミニダーゼ活性を有するタンパク質を発現しないので、ｇａｇおよびＲＳＶ ＧからなるＶＬＰは、効率的な作製および放出に、ＮＡの存在を必要としない可能性が高い。したがって、ｇａｇ（アルファレトロウイルスのｇａｇなど）およびＧグリコポリペプチドをコードする発現ベクターを開発すれば、結果として、膜内に組み込まれたＧグリコポリペプチドを含有するＶＬＰが作製される。非脂質ラフト外来抗原を付着させる形での、Ｇグリコポリペプチドに対する任意の改変は、結果として、該外来抗原に対して顕著な免疫反応を誘導することが可能なキメラＶＬＰをもたらす。
ＶＬＰが、その文脈により、エンベロープベースのウイルスに基づかないか、または本明細書で開示される特定のエンベロープベースのウイルスの特定の成分に基づくウイルス様粒子を指す場合を除き、用語「エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子」と「ＶＬＰ」とは、本明細書の全体において互換的に用いられる。
（抗原）
本発明の特定の態様は、エンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物と会合するさらなる抗原を包含する。このようなさらなる抗原は、同じ組成物中に組み込むことができ、さらにまた、ＶＬＰと共有結合させることもでき、非共有結合させることもできる。好ましい実施形態では、ｇａｇポリペプチド、インフルエンザＭ１ポリペプチド、赤血球凝集素ポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、および／または他の脂質ラフト会合ポリペプチドが、天然では脂質ラフトと会合しないであろう抗原を含有する、エンベロープウイルスベースのＶＬＰを形成するのに容易に適合可能なプラットフォームである。本節では、開示されるＶＬＰと共に用いるのに好ましい抗原について記載する。
（抗原と脂質ラフト会合ポリペプチドとの連結）
天然では脂質ラフトと会合しない抗原、または天然では細胞膜と会合しない抗原を含有するＶＬＰを形成する手段として、ｇａｇポリペプチド、インフルエンザＭ１ポリペプチド、赤血球凝集素ポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、および／または別の脂質ラフト会合ポリペプチドと、該抗原との連結を形成することができる。単一の抗原または複数の抗原に脂質ラフト会合ポリペプチドを連結することにより、ＶＬＰの免疫原性を増大させるか、各種の病原体に免疫原性を付与するか、または、特定の病原体の各種の株に免疫原性を付与することができる。
抗原と脂質ラフト会合ポリペプチドとの間の連結は、該抗原を結果としてＶＬＰ内へと組み込むのに十分な任意の種類の連結であり得る。結合は、共有結合、イオン性相互作用、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、金属−配位子相互作用、または抗体−抗原相互作用であり得る。好ましい実施形態では、結合は、ペプチド結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、炭素−炭素結合、またはジスルフィド結合などの共有結合である。
抗原は、脂質ラフト会合ポリペプチドに対する既存の結合を伴なって組換えにより作製することもでき、単離物質として作製し、次いで、後に、脂質ラフト会合ポリペプチドに連結することもできる。
（抗原の種類）
本明細書で用いられる抗原は、免疫反応を誘発することが可能であり、また、天然では脂質ラフトと会合しない任意の物質であり得る。抗原には、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質、また、タンパク質内における個々のポリペプチドエピトープを含めた）、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖のペプチド性および非ペプチド性模倣体、ならびに他の分子、低分子、脂質、糖脂質、ならびに炭水化物が含まれるが、これらに限定されない。天然において、抗原が脂質ラフトと直接的または間接的に会合しない場合、脂質ラフト会合ポリペプチドに連結しない限り、それをＶＬＰ内へと組み込むことは期待されない。抗原は、疾患または障害に関与する任意の抗原、例えば、微生物抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫抗原、蠕虫抗原、酵母抗原など）、腫瘍抗原、アレルゲンなどであり得る。
（抗原の供給源）
本明細書で記載される抗原は、化学的または酵素的に合成することもでき、組換えにより作製することもでき、天然の供給源から単離することもでき、前出の組合せでもあり得る。抗原は、精製することもでき、部分精製することもでき、粗抽出物でもあり得る。
ポリペプチド抗原は、液体クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィーなど）、サイズ除外クロマトグラフィー、ゲル電気泳動（一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動を含めた）、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製法が含まれるがこれらに限定されない、当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製法を用いて、天然の供給源から単離することができる。多くの実施形態では、抗原が、例えば、約５０％〜約７５％純粋、約７５％〜約８５％純粋、約８５％〜約９０％純粋、約９０％〜約９５％純粋、約９５％〜約９８％純粋、約９８％〜約９９％純粋、または９９％超純粋の精製抗原である。
固相ペプチド合成法を用いることができるが、このような技法は、当業者に公知である。Ｊｏｎｅｓ、「Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」（オックスフォード、Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ社）（１９９４年）を参照されたい。一般に、このような方法では、活性化させた単量体のユニットを、伸長するペプチド鎖を結合させた固相へと連鎖的に付加することにより、ペプチドを作製する。
ポリペプチドを作製するには、十分に確立された組換えＤＮＡ法を、脂質ラフト会合ポリペプチドと同じベクター内において用いることもでき、この場合、例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物は、適切な宿主細胞（例えば、インビトロの細胞培養物における単細胞実体として増殖させる真核宿主細胞、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞など）または、原核細胞（例えば、インビトロの細胞培養物中）中に導入され、これにより遺伝的に改変された宿主細胞を作製し、適切な培養条件下において、該遺伝的に改変された宿主細胞によりタンパク質を作製する。
（ウイルス抗原）
適切なウイルス抗原には、以下の群：Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ＨＩＶ−１などのヒト免疫不全ウイルス（また、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、もしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも称する））；また、ＨＩＶ−ＬＰなど、他の単離物； Ｐｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）； Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ノーウォークウイルスおよび関連ウイルスを含めた、胃腸炎を引き起こすウイルス株）； Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）； Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）； Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、コロナウイルス）； Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）； Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、コロナウイルス）； Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）； Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、エボラウイルス）； Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス）； Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、インフルエンザウイルス）； Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）； Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ科（出血熱ウイルス）； Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）； Ｂｉｍａｖｉｒｉｄａｅ科； Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科（Ｂ型肝炎ウイルス）； Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ科（パルボウイルス）； Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）； Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科（大半のアデノウイルス）； Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科（１型および２型の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）； Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、アフリカブタコレラウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病因因子、デルタ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトウイルスと思われる）、非Ａ型肝炎、非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内部感染による；クラス２＝非経口感染による（すなわち、Ｃ型肝炎））；およびアストロウイルス）のうちの１または複数のウイルスと関連する（例えば、これらにより合成される）抗原が含まれる。
（ノロウイルス（Ｎｏｒｖｉｒｕｓ）抗原）
本明細書で開示されるＶＬＰには、ノロウイルス科に由来する各種の抗原が含まれ得ることが好ましい。「ノーウォーク様ウイルス」とも呼ばれるノロウイルスは、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅウイルス科内の４つの属のうちの１つを占める。ノロウイルス属内には、遺伝子群Ｉおよび遺伝子群ＩＩと名付けられた、２つの主要な遺伝子群が存在する。遺伝子群Ｉのノロウイルス株には、ノーウォークウイルス、サウサンプトンウイルス、デザートシールドウイルス、およびチバウイルスが含まれる。遺伝子群ＩＩのノロウイルス株には、ヒューストンウイルス、ハワイウイルス、ローズデールウイルス、グリムズビーウイルス、メキシコウイルス、およびスノーマウンテンエージェントが含まれる（Ｐａｒｋｅｒ， Ｔ．Ｄ．ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．（２００５年）、７９巻（１２号）：７４０２〜９頁； Ｈａｌｅ， Ａ．Ｄ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏ．（２０００年）、３８巻（４号）：１６５６〜１６６０頁）。ノーウォークウイルス（ＮＶ）は、世界中における、大半の急性ウイルス性胃腸炎の流行的発生の一因となる、ヒトカリチウイルス群の原型株である。ノーウォークウイルスのカプシドタンパク質は、２つのドメイン：殻ドメイン（Ｓ）および突出部ドメイン（Ｐ）を有する。Ｐドメイン（アミノ酸２２６〜５３０；ノーウォーク株の番号付け）は、２つのサブドメインであるＰ１およびＰ２に分けられる。Ｐ２ドメインは、Ｐ１ドメイン内における１２７アミノ酸の挿入（アミノ酸２７９〜４０５）であり、フォールディングされた単量体の最遠位面に位置する。Ｐ２ドメインは、ノロウイルス株のうちで最も保存の程度が低いＶＰ１領域であり、Ｐ２内の超可変領域は、受容体の結合および免疫反応性において重要な役割を果たすと考えられている。Ｐドメインが外部に位置することを踏まえるなら、それは、本明細書で開示されるＶＬＰワクチンのための抗原として用いるのに好ましい抗原、またはポリペプチドエピトープの供給源である。Ｐ２ドメインは、遺伝子群Ｉまたは遺伝子群ＩＩのノロウイルス株に好ましい抗原である。広範にわたるノロウイルス株を通じて保存されるＰ２ドメインのうちのある領域内に存在するエピトープとして近年になって同定されたｍＡｂ ６１．２１エピトープ、ならびにｍＡｂ ５４．６エピトープ（Ｌｏｃｈｒｉｄｇｅ， Ｖ．Ｐ．ら、Ｊ Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．（２００５年）、８６巻：２７９９〜２８０６頁）がさらにより好ましい。
（インフルエンザ抗原）
本明細書で開示されるＶＬＰは、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ以外に、またはこれらに加えて、インフルエンザに由来する各種の抗原を包含し得る。さらなる好ましいインフルエンザ抗原は、Ｍ２ポリペプチドである。インフルエンザウイルスのＭ２ポリペプチドは、スプライシングイベント後において、ＲＮＡセグメント７（マトリックスセグメント）によりコードされる、９７アミノ酸の小型のクラスＩＩＩ内在性膜タンパク質である（８０、８１）。ウイルス粒子上に存在するＭ２は極めてわずかであり、感染細胞上においてより豊富に見出すことができる。Ｍ２は、ウイルスの侵入に必要な、プロトン選択性イオンチャネルとして用いられる（８２、８３）。感染中または従来のワクチン接種中の免疫原性は最小限であることから、その保存が説明されるが、代替的なフォーマットで存在する場合は、より免疫原性であり防御性である（８４〜８６）。これは、インビボにおけるＭ２モノクローナル抗体の受動伝達により、ウイルスクリアランスが加速化され、結果として防御がもたらされるという観察（８７）と符合する。Ｍ２の外部ドメインエピトープを、融合タンパク質として、ＨＢＶのコア粒子に連結すると、非経口接種および鼻腔内接種のいずれによっても、マウスにおいて防御性であり、３回の繰り返しコピーを該コアタンパク質のＮ末端へと融合させると、最も免疫原性となる（８８〜９０）。これは、エピトープ密度が増大すると免疫原性が増大することを示す他のキャリア−ハプテンデータ（９１）と符合する。
Ｍ２ワクチンを鼻腔内送達する場合、良好な防御を達成するにはアジュバントが必要とされ、ＬＴＲ１９２Ｇ（８８、９０）およびＣＴＡ１−ＤＤ（８９）により良好な結果が達成されている。ペプチドはまた、ＫＬＨ、またはＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓの外膜タンパク質複合体、またはヒトパピローマウイルスのＶＬＰなどのキャリアに化学的に結合体化することもでき、マウスおよび他の動物におけるワクチンとして防御的である（９２、９３）。
Ｍ２タンパク質は、高度に保存的ではあるが、配列の相違を全く示さないわけではない。一般的な株であるＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ａｉｃｈｉ／６８（Ｈ３Ｎ２）のＭ２外部ドメインエピトープは、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）を除き、今日配列決定されている他のすべてのヒト株と、免疫学的に交差反応性であることが示された（９２）。インフルエンザデータベースの配列の検討からも、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４など、他のより近年の病原性Ｈ５Ｎ１ヒト単離物のＭ２配列内において、同様の相違が示されている。この知見は、Ｍ２エピトープを組み込む、有効なＨ５特異的汎流行ワクチンが、ヒトＨ１単離物およびＨ３単離物中において現在広まっているＭ２配列ではなく、病原性の鳥類株に固有のＭ２配列を反映する必要があることを裏付ける。
インフルエンザウイルスに由来するさらなるタンパク質（ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２以外のタンパク質）も、共発現により、またはさらなる抗原の全部もしくは一部を、ｇａｇポリペプチドもしくはＨＡポリペプチドに連結することにより、ＶＬＰワクチン内へと組み込むことができる。これらのさらなる抗原には、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、核タンパク質、マトリックス（Ｍ１）、ＮＳ１、およびＮＳ２が含まれる。これら後者の抗原は、一般に、中和抗体反応の標的ではなく、Ｔ細胞により認識される重要なエピトープを含有し得る。このようなエピトープに対してＶＬＰワクチンにより誘導されるＴ細胞反応が、防御的免疫性を促進するのに有益であることが判明し得る。
（他の病原性抗原）
適切な細菌性抗原には、例えば、病原性Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ属種、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種などの病原性グラム陽性菌；また、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、およびＢａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ属のグラム陰性菌などのグラム陰性菌を含めた、各種の病原性細菌のうちのいずれかと関連する（例えば、これらにより合成され、また、これらに内因性である）抗原が含まれる。例えば、Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ， Ｍ、Ｈ． Ｍｅｄｏｆｆ、Ｄ． Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ」、ボルチモア、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ社（１９８９年）を参照されたい。
感染性の病原性真菌と関連する（例えば、これらにより合成され、また、これらに内因性である）適切な抗原には、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、およびＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、およびＳｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉが含まれるがこれらに限定されない感染性真菌と関連する抗原が含まれる。
病原性原虫、蠕虫、および他の真核微生物病原体と関連する（例えば、これらにより合成され、また、これらに内因性である）適切な抗原には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘなどのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属； Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ； Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ； Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ； Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ； Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ； Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ等が含まれるがこれらに限定されない原虫、蠕虫、および他の真核微生物病原体と関連する抗原が含まれる。
適切な抗原には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ属種（例えば、Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ． ａｖｉｕｍ、Ｍ． ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ． ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ． ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のＡ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属のＢ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（ｖｉｒｉｄａｎｓ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（嫌気性の種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属種、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉなどの病原性微生物と関連する（例えば、これらにより合成され、また、これらに内因性である）抗原が含まれる。病原性Ｅ． ｃｏｌｉ株の非限定的な例は、ＡＴＣＣ第３１６１８号、同第２３５０５号、同第４３８８６号、同第４３８９２号、同第３５４０１号、同第４３８９６号、同第３３９８５号、同第３１６１９号、および同第３１６１７号である。
細胞内病原体と関連する各種のポリペプチドまたは他の抗原のうちのいずれかを、ＶＬＰ内に組み込むことができる。細胞内病原体と関連するポリペプチドエピトープおよびペプチドエピトープとは、その断片が、ＭＨＣクラスＩ分子と併せて、ＣＤ８＋リンパ球の表面上におけるＴ細胞抗原受容体により認識される、例えば、これにより結合されるように、感染細胞の表面上に提示される、細胞内病原体と関連する（例えば、これによりコードされる）任意のポリペプチドである。細胞内病原体と関連するポリペプチドエピトープおよびペプチドエピトープは当技術分野において公知であり、これらには、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ ｇｐ１２０またはその抗原性断片と関連する抗原；サイトメガロウイルス抗原； Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属抗原（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなど）；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｃ ｃａｒｉｎｉｉ（ＰＣＰ）抗原；４１−３、ＡＭＡ−１、ＣＳＰ、ＰＦＥＭＰ−１、ＧＢＰ−１３０、ＭＳＰ−１、ＰＦＳ−１６、ＳＥＲＰなど、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍまたは他の任意のマラリア種と関連する抗原が含まれるがこれらに限定されない、マラリア抗原；真菌抗原；酵母抗原（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ属種抗原）； Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ、または他のＴｏｘｏｐｌａｓｍａ属種と関連する抗原が含まれるがこれらに限定されないトキソプラズマ抗原；エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）による抗原； Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属抗原（例えば、ｇｐ１９０／ＭＳＰ１など）などが含まれるが、これらに限定されない。
好ましいＶＬＰワクチンは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓに対するものであり得る。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓは、好気性または通性嫌気性でグラム陽性の非運動性桿菌であり、幅１．０μｍ、長さ３．０〜５．０μｍである。Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓは、悪条件下でも耐性の高い内性胞子を形成し、これは、感染した動物がかつて死亡した場所の土壌で見出すことができる。本明細書で開示されるＶＬＰワクチン内で用いるのに好ましい抗原は、哺乳動物細胞上の受容体に結合し、Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓが疾患を引き起こす能力にとって極めて重要な８３ｋＤａのタンパク質である防御抗原（ＰＡ）である。より好ましい抗原は、被験体においてＢａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓに対する防御的免疫性を誘導するのに用い得る、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ＰＡのＣ末端における１４０アミノ酸の断片である。炭疽菌に対するＶＬＰワクチン内において用いられる他の例示的な抗原は、炭疽菌胞子に由来する抗原（例えば、ＢｃｌＡ）、該細菌の栄養期に由来する抗原（例えば、細胞壁抗原、被膜抗原（例えば、ポリ−ガンマ−Ｄ−グルタミン酸、またはＰＧＡ）、分泌抗原（例えば、防御抗原、致死性因子、または浮腫因子などの外毒素））である。ＶＬＰワクチンで用いるのに好ましい別の抗原は、Ｂ． ａｎｔｈｒａｃｉｓに固有のアントロースを含有する四糖である（Ｄａｕｂｅｎｓｐｅｃｋ Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（２００４年）、２７９巻：３０９４５頁）。四糖は、脂質ラフト会合ポリペプチドに連結することができ、これにより、ＶＬＰワクチンとの抗原の会合が可能となる。
（腫瘍関連抗原）
公知の各種腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のうちのいずれかを、ＶＬＰに組み込むことができる。全ＴＡＡを用い得るが、その必要はない。代わりに、ＴＡＡの一部、例えば、エピトープを用いることができる。ＶＬＰ内で用い得る腫瘍関連抗原（またはそれらのエピトープを含有する断片）には、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＨＥＲ−２、高分子量黒色腫関連抗原であるＭＡＡ、ＧＤ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ−７２、卵巣関連抗原であるＯＶ−ＴＬ３およびＭＯＶ１８、ＴＵＡＮ、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＯＦＰ、ＣＡ−１２５、ＣＡ−５０、ＣＡ−１９−９、腎腫瘍関連抗原であるＧ２５０、ＥＧＰ−４０（ＥｐＣＡＭとしても知られる）、Ｓ１００（悪性黒色腫関連抗原）、ｐ５３、およびｐ２１ｒａｓが含まれるがこれらに限定されない。前出のうちのいずれかを含めた、任意のＴＡＡ（またはそれらのエピトープ）の合成類似体を用いることができる。さらに、１または複数のＴＡＡ（またはそれらのエピトープ）の組合せを、組成物中に組み込むことができる。
（アレルゲン）
一態様では、ＶＬＰワクチンの一部である抗原が、各種のアレルゲンのうちのいずれかであり得る。アレルゲンベースのワクチンを用い、被験体におけるアレルゲンに対する忍容性を誘導することができる。チロシンとの共沈殿（ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を伴うアレルゲンワクチンの例は、米国特許第３，７９２，１５９号、同第４，０７０，４５５号、および同第６，４４０，４２６号において見出すことができる。
各種のアレルゲンのうちのいずれかをＶＬＰ内に組み込むことができる。アレルゲンには、環境空中アレルゲン；ブタクサ／花粉症などの植物の花粉；雑草花粉アレルゲン；芝草花粉アレルゲン；ジョンソングラス；樹木花粉アレルゲン；ライグラス；イエダニアレルゲン（例えば、Ｄｅｒ ｐ Ｉ、Ｄｅｒ ｆ Ｉなど）などのクモ形類動物アレルゲン；コナダニ（ｓｔｏｒａｇｅ ｍｉｔｅ）アレルゲン；スギ花粉／花粉症；カビ胞子アレルゲン；動物アレルゲン（例えば、イヌ、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ラット、マウスなどによるアレルゲン）；食物アレルゲン（例えば、甲殻類；ラッカセイなどの堅果；柑橘類によるアレルゲン）；昆虫アレルゲン；毒（膜翅目、スズメバチ（ｙｅｌｌｏｗ ｊａｃｋｅｔ）、ミツバチ、カリバチ、スズメバチ（ｈｏｒｎｅｔ）、ヒアリ）；ゴキブリ、ノミ、蚊などによる他の環境昆虫アレルゲン；連鎖球菌抗原などの細菌アレルゲン； Ａｓｃａｒｉｓ属抗原などの寄生虫アレルゲン；ウイルス抗原；真菌胞子；薬物アレルゲン；抗生剤；ペニシリンおよび関連化合物；他の抗生剤；ホルモン（インスリン）、酵素（ストレプトキナーゼ）などの全タンパク質；不完全抗原またはハプテンとして作用することが可能なすべての薬物およびそれらの代謝物；ハプテンとして作用し、アレルゲンとして機能することが可能な、産業用化学物質および代謝物（例えば、酸無水物（トリメリト酸無水物など）およびイソシアン酸塩（ジイソシアン酸トルエンなど））；小麦粉などの職業アレルゲン（例えば、パン屋喘息（Ｂａｋｅｒ’ｓ ａｓｔｈｍａ）を引き起こすアレルゲン）、トウゴマ、コーヒー豆、また、上記で記載した産業用化学物質；ノミアレルゲン；ヒト以外の動物におけるヒトタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
アレルゲンには、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖のペプチド性および非ペプチド性模倣体、ならびに他の分子、低分子、脂質、糖脂質、ならびに炭水化物が含まれるが、これらに限定されない。
特定の天然の動物アレルゲンおよび植物アレルゲンの例には、以下の属：Ｃａｎｉｎｅ属（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）； Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属（例えば、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅ）； Ｆｅｌｉｓ属（Ｆｅｌｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）； Ａｍｂｒｏｓｉａ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ）； Ｌｏｌｉｕｍ属（例えば、Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）； Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）； Ａｌｔｅｍａｒｉａ属（Ａｌｔｅｍａｒｉａ ａｌｔｅｍａｔａ）； Ａｌｄｅｒ属； Ａｌｎｕｓ属（Ａｌｎｕｓ ｇｕｌｔｉｎｏａｓ）； Ｂｅｔｕｌａ属（Ｂｅｔｕｌａ ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）； Ｑｕｅｒｃｕｓ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ ａｌｂａ）； Ｏｌｅａ属（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａ）； Ａｒｔｅｍｉｓｉａ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）； Ｐｌａｎｔａｇｏ属（例えば、Ｐｌａｎｔａｇｏ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）； Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ属（例えば、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓまたはＰａｒｉｅｔａｒｉａ ｊｕｄａｉｃａ）； Ｂｌａｔｔｅｌｌａ属（例えば、Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ）； Ａｐｉｓ属（例えば、Ａｐｉｓ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）； Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ属（例えば、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ ａｒｉｚｏｎｉｃａ、およびＣｕｐｒｅｓｓｕｓ ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）； Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ属（例えば、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ、およびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ ａｓｈｅｉ）； Ｔｈｕｙａ属（例えば、Ｔｈｕｙａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）； Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ属（例えば、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｏｂｔｕｓａ）； Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ属（例えば、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）； Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ属（例えば、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ ｒｅｐｅｎｓ）； Ｓｅｃａｌｅ属（例えば、Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）； Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属（例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）； Ｄａｃｔｙｌｉｓ属（例えば、Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒａｔａ）； Ｆｅｓｔｕｃａ属（例えば、Ｆｅｓｔｕｃａ ｅｌａｔｉｏｒ）； Ｐｏａ属（例えば、ＰｏａｐｒａｔｅｎｓｉｓまたはＰｏａ ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）； Ａｖｅｎａ属（例えば、Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）； Ｈｏｌｃｕｓ属（例えば、Ｈｏｌｃｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）； Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ属（例えば、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ ｏｄｏｒａｔｕｍ）； Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ属（例えば、Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｎ ｅｌａｔｉｕｓ）； Ａｇｒｏｓｔｉｓ属（例えば、Ａｇｒｏｓｔｉｓ ａｌｂａ）； Ｐｈｌｅｕｍ属（例えば、Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ）； Ｐｈａｌａｒｉｓ属（例えば、Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）； Ｐａｓｐａｌｕｍ属（例えば、Ｐａｓｐａｌｕｍ ｎｏｔａｔｕｍ）； Ｓｏｒｇｈｕｍ属（例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ）； ならびにＢｒｏｍｕｓ属（例えば、Ｂｒｏｍｕｓ ｉｎｅｒｍｉｓ）に特異的なタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
（エンベロープウイルスベースのＶＬＰを作製するのに好ましい方法）
エンベロープウイルスベースのＶＬＰは、当業者に適用可能な任意の方法により作製することができる。エンベロープウイルスベースのＶＬＰは、ＶＬＰを形成する一因となる１または複数のポリペプチドを包含することが典型的である。加えて、エンベロープウイルスベースのＶＬＰは、膜（脂質ラフトを含めた）会合ポリペプチドなど、１または複数のさらなるポリペプチドを包含することにより、（ＶＬＰを形成する一因となる１または複数のポリペプチドの一部として、天然において、または人工的に存在する抗原以外のさらなる）抗原をもたらすことができる。好ましい実施形態では、ポリペプチドを、任意の適用可能なタンパク質発現系、好ましくは、哺乳動物細胞による発現系および昆虫細胞による発現系など、細胞膜内に脂質ラフトドメインを包含する細胞ベースの系において共発現させることができる。
組換えによるＶＬＰ用ポリペプチドの発現は、該ポリペプチドのうちの１または複数をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを伴う。ポリペプチドのうちの１または複数をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野で周知の技法を用いる組換えＤＮＡ法により、該ポリペプチドを作製するためのベクターを作製することができる。このようにして、本明細書では、ＶＬＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のうちのいずれかを含有するポリヌクレオチドを発現することによりタンパク質を調製する方法が記載される。当業者に周知の方法を用いて、ＶＬＰポリペプチドをコードする配列と、適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルとを含有する発現ベクターを構築することができる。例えば、これらの方法には、インビトロにおける組換えＤＮＡ法、合成法、また、インビボにおける遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明は、すべてが１または複数のプロモーターに作動可能に連結した、ｇａｇポリペプチドと、抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
従来の技法により、発現ベクターを宿主細胞へと導入することができ、次いで、従来の技法により、トランスフェクトされた細胞を培養して、ＶＬＰポリペプチド（複数可）を作製することができる。したがって、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結したＶＬＰポリペプチドのうちの１または複数をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を包含する。ＶＬＰを作製するのに好ましい実施形態では、以下で詳述する通り、ｇａｇポリペプチドと、抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとの両方をコードするベクターを、宿主細胞内で共発現させて、ＶＬＰを作製することができる。
各種の宿主発現ベクター系を用いて、ＶＬＰポリペプチドを発現させることができる。このような宿主発現系は、好ましくは共発現によりＶＬＰを生成させる目的で、ＶＬＰポリペプチドを作製し得るビヒクルを表す。広範囲にわたる宿主を、適切な発現ベクター構築物において用いることができ、脂質ラフトベースのアセンブリーに依拠する場合、好ましい宿主発現系は、ＶＬＰのアセンブリーに適する脂質ラフトを有する宿主である。これらには、ＶＬＰポリペプチドコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクター、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換した細菌（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；ＶＬＰポリペプチドコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換した酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属）；ＶＬＰポリペプチドのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ＶＬＰポリペプチドのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞系、もしくはＶＬＰポリペプチドのコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換した植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する、哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）などの微生物が含まれるがこれらに限定されない。それらのいずれもがＶＬＰのアセンブリーに適する脂質ラフトを有するため、ＶＬＰポリペプチドを発現させるには、哺乳動物細胞を用いることが好ましく、また、昆虫細胞を用いることがより好ましい。例えば、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要前初期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組合わされる、ＭＲＣ−５細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（ＴＭ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、およびＨＥＫ２９３細胞などの哺乳動物細胞は、ＶＬＰポリペプチドの有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ、４５巻：１０１頁（１９８６年）； Ｃｏｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８巻：２頁（１９９０年））。
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いることができる。該ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で増殖する。ＶＬＰポリペプチドのコード配列（複数可）は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子領域）内へと個別にクローニングすることができ、また、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
哺乳動物の宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系を用いることができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合は、対象のＶＬＰポリペプチド配列（複数可）を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三連リーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ）配列にライゲーションすることができる。次いで、インビトロまたはインビボにおける組換えにより、このキメラ遺伝子を、アデノウイルスゲノム内に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１領域またはＥ３領域）内に挿入する結果、感染宿主内において生存可能であり、また、ＶＬＰポリペプチド（複数可）を発現することが可能な組換えウイルスがもたらされる（例えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻：３５５〜３５９頁（１９８４年）を参照されたい）。挿入されたＶＬＰポリペプチドのコード配列（複数可）を効率的に翻訳するには、特定の開始シグナルもまた必要とされ得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン、および隣接配列が含まれる。さらに、全挿入配列の翻訳を確保するには、該開始コドンが、所望されるコード配列のリーディングフレームと同フレームでなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、由来が多様であることが可能であり、天然および合成のいずれもが可能である。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを組み込むことにより、増強することができる（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３巻：５１〜５４４頁（１９８７年）を参照されたい）。１つの例は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製のＡｄＥＡＳＹ−ＸＬ（ＴＭ）システムなど、アデノウイルスベースのベクター系において用いられる、ヒトＣＭＶ前初期プロモーターである。
加えて、挿入した配列の発現を調節するか、または該遺伝子産物を、所望される特定の形で修飾およびプロセシングする宿主細胞株も選択することができる。タンパク質産物に対するこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断または膜への輸送）は、ＶＬＰを作製するのに、またはＶＬＰポリペプチド、もしくはアジュバントなどのさらなるポリペプチド、もしくはさらなる抗原が機能するのに重要であり得る。種々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾について特徴的で特異的な機構を有する。発現する外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確保するために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。この目的で、一次転写物を適正にプロセシングし、遺伝子産物を適正にグリコシル化およびリン酸化するための細胞機構を保有する真核宿主細胞を用いることができる。
宿主細胞には、ｇａｇポリペプチドをコードする第１のベクターと、ウイルス性膜抗原、または抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドをコードする第２のベクターという、本発明の２つの発現ベクターを共トランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）することができる。２つのベクターは、各ＶＬＰポリペプチドの同等の発現を可能とする、同一の選択マーカーを含有し得る。代替的に、ｇａｇポリペプチドと、抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとの両方をコードし、また、これらの両方を発現することが可能な単一のベクターを用いることもできる。
宿主細胞によりＶＬＰが生成されたら、ポリペプチドの精製についての当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特に、該ポリペプチドに付加した任意のアフィニティー精製タグによるアフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ除外クロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）により、またはタンパク質もしくは他の高分子を精製するための他の任意の標準的な技法によりこれを精製することができる。加えて、ＶＬＰポリペプチドを、本明細書で記載されるか、またはこれ以外に当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列に融合させ、ＶＬＰの精製を容易にすることもできる。精製後、ＶＬＰポリペプチドに対する共有結合を介して、または他の非共有結合機構により、さらなる抗原またはアジュバントなどのさらなるエレメントを、ＶＬＰへと物理的に連結することができる。哺乳動物細胞および昆虫細胞など、脂質ラフトドメインを有する宿主細胞内においてＶＬＰポリペプチドを共発現させる好ましい実施形態では、ＶＬＰが自己アセンブルして放出され、これにより、上記の方法のうちのいずれかによるＶＬＰの精製が可能となる。ＶＬＰの好ましい実施形態には、例えば、同種ウイルスのタンパク質から操作されたＶＬＰ、例えば、インフルエンザウイルスに由来するＭ１、ＨＡ、また、場合によってＮＡから構築されたＶＬＰ、また、異種ウイルスのタンパク質から操作されたＶＬＰ、例えば、ＭＬＶもしくはＨＩＶまたは他のレトロウイルスに由来するＧａｇタンパク質を、異なるウイルスに由来する抗原、例えば、インフルエンザＨＡおよびＮＡと共に操作することにより形成したＶＬＰが含まれる。
（ＧａｇベースのＶＬＰを作製する好ましい方法）
当業者に適用可能な任意の方法により、ＶＬＰを容易にアッセンブルすることができ、この結果、ｇａｇポリペプチドと、天然では脂質ラフトと会合しない抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとを包含するＶＬＰがアッセンブルされることが好ましい。好ましい実施形態では、任意の適用可能なタンパク質発現系、好ましくは、哺乳動物細胞による発現系および昆虫細胞による発現系など、脂質内に脂質ラフトドメインを包含する細胞ベースの発現系内において、ポリペプチドを共発現させることができる。
ｇａｇポリペプチドを用いて形成されるＶＬＰ発現の例が数多く公表されており、これにより、ＶＬＰを作製するのに適用可能な発現系の範囲が示されている。複数のレトロウイルスによる研究は、他のウイルス成分の不在下で発現したＧａｇポリペプチドが、細胞表面におけるＶＬＰの形成および出芽に十分であることを裏付けている（ＷｉｌｌｓおよびＣｒａｖｅｎ、ＡＩＤＳ、５巻、６３９〜６５４頁、１９９１年； Ｚｈｏｕら、３． Ｖｉｒｏｌ．、６８巻、２５５６〜２５６９頁、１９９４年； Ｍｏｒｉｋａｗａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８３巻、２８８〜２９７頁、１９９１年； Ｒｏｙｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８４巻、４１７〜４２２頁、１９９１年； Ｇｈｅｙｓｅｎら、Ｃｅｌｌ、５９巻、１０３〜１１２頁、１９８９年； Ｈｕｇｈｅｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９３巻、２４２〜２５５頁、１９９３年； Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２１４巻、５０〜５８頁、１９９５年）。バキュロウイルスベクターを用いる昆虫細胞内において、Ｇａｇ前駆体が発現するとＶＬＰが形成されることについては、複数の研究グループにより裏付けられている（Ｄｅｌｃｈａｍｂｒｅら、ＥＭＢＯ Ｊ．、８巻、２６５３〜２６６０頁、１９８９年； Ｌｕｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７９巻、８７４〜８８０頁、１９９０年； Ｒｏｙｅｒ ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８４巻、４１７〜４２２頁、１９９１年； Ｍｏｒｉｋａｗａ ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８３巻、２８８〜２９７頁、１９９１年； Ｚｈｏｕら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６８巻、２５５６〜２５６９頁、１９９４年； Ｇｈｅｙｓｅｎら、Ｃｅｌｌ、５９巻、１０３〜１１２頁、１９８９年； Ｈｕｇｈｅｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９３巻、２４２〜２５５頁、１９９３年； Ｙａｍｓｈｃｈｉｋｏｖら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２１４巻、５０〜５８頁、１９９５年）。これらのＶＬＰは、未成熟レンチウイルス粒子に類似しており、効率的にアッセンブルされて昆虫細胞の細胞膜から出芽により放出される。
Ｇａｇ前駆体のアミノ末端領域は、ウイルスアセンブリーに必要とされる、細胞表面への輸送および膜結合のためのターゲッティングシグナルであることが報告されている（Ｙｕら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６６巻、４９６６〜４９７１頁、１９９２年； ａｎ， Ｘら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６７巻、６３８７〜６３９４頁、１９９３年； Ｚｈｏｕら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６８巻、２５５６〜２５６９頁、１９９４年； ＬｅｅおよびＬｉｎｉａｌ、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６８巻、６６４４〜６６５４頁、１９９４年； Ｄｏｒｆｍａｎら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６８巻、１６８９〜１６９６頁、１９９４年； Ｆａｃｋｅら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６７巻、４９７２〜４９８０頁、１９９３年）。ワクシニアウイルスによる発現系を用いて、Ｇａｇ構造タンパク質、ならびにＥｎｖ糖タンパク質であるｇｐ１２０およびｇｐ４１を含有する、組換えＨＩＶベースのＶＬＰのアセンブリーが報告されている（Ｈａｆｆａｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６６巻、４２７９〜４２８７頁、１９９２年）。
（エンベロープウイルスベースのＶＬＰ調製物における感染因子を不活化するのに好ましい方法）
電子放射は、エンベロープウイルスベースのＶＬＰの免疫原性を実質的に低下させることなく、感染因子を不活化することが可能なので、不活化の好ましい方法は、電子放射を介する方法である。電磁放射で好ましい３つの方式のすべて（すなわち、光反応性化合物を伴うＵＶ照射、ＵＶ照射単独、およびガンマ照射）には、血液、食品、ワクチンなど、多種多様な試料における病原体を不活化するのに用いられてきた長い歴史があるため、不活化用電磁放射を適用するための多種多様な装置が市販されており、これらは、本明細書で開示される方法を実施するのにほとんど〜まったく改変せずに用いることができる。さらに、当技術分野では、波長および線量の最適化がルーチン化しており、したがって、当業者の能力範囲内で容易に実施される。
（光反応性化合物を伴うＵＶ照射）
電磁放射による例示的な不活化法は、光反応性化合物、好ましくは、感染因子中のポリヌクレオチドと反応する光反応性化合物の存在下における、ＵＶ−Ａ照射などの紫外線照射の組合せである。
好ましい光反応性化合物には、アクチノマイシン、アントラサイクリノン、アントラマイシン、ベンゾジピロン、フルオレン、フルオレノン、フロクマリン、イソアロキサジン、マイトマイシン、ｍｏｎｏｓｔｒａｌ ｆａｓｔ ｂｌｕｅ、ｎｏｒｐｈｉｌｌｉｎ Ａ、フェナントリジン、フェナザチオニウム塩、フェナジン、フェノチアジン、フェニルアジド、キノリン、およびチオキサンテノン（ｔｈｉａｘａｎｔｈｅｎｏｎｅｓ）が含まれる。好ましい種は、２つの主要なカテゴリーのうちの１つに属するフロクマリンである。第１のカテゴリーは、ソラーレン［７Ｈ−フロ（３，２−ｇ）−（１）−ベンゾピラン−７−オン、または６−ヒドロキシ−５−ベンゾフランアクリル酸のデルタ−ラクトン］であり、これらは、直鎖型であり、中央の芳香環部分に付随する２つの酸素残基が１，３の配向性を有し、またさらに、フラン環部分が二環クマリン系の６位に結合している。第２のカテゴリーは、イソソラーレン［２Ｈ−フロ（２，３−ｈ）−（１）−ベンゾピラン−２−オン、または４−ヒドロキシ−５−ベンゾフランアクリル酸のデルタ−ラクトン］であり、これらは、角度型（ａｎｇｕｌａｒ）であり、中央の芳香環部分に付随する２つの酸素残基が１，３の配向性を有し、またさらに、フラン環部分が二環クマリン系の８位に結合している。３、４、５、８、４’、または５’位において直鎖型フロクマリンを置換することによりソラーレン誘導体を作製し得る一方、３、４、５、６、４’、または５位において角度型フロクマリンを置換することによりイソソラーレン誘導体を作製し得る。ソラーレンは、二本鎖核酸の塩基対間にインターカレートすることができ、長波長の紫外光（ＵＶＡ）を吸収すると、ピリミジン塩基に対する共有結合付加体を形成する。例えば、Ｇ． Ｄ． Ｃｉｍｉｎｏら、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５４巻：１１５１頁（１９８５年）； Ｈｅａｒｓｔら、Ｑｕａｒｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１７巻：１頁（１９８４頁）を参照されたい。
好ましいＵＶ（または場合によって、可視光）放射の波長は、適切な反応および／または光付加体が生成される波長に依存し、これは、光反応性化学物質の化学反応に依存する。例示を目的として述べると、多くのソラーレンには、３２０〜３８０ｎｍの波長にあるＵＶ放射が最も有効であり、３３０〜３６０ｎｍが最大の有効性を示す。同様のＵＶ−Ａ波長はまた、４１９ｎｍなどの可視光と組み合わせても用い得る光反応性化合物であるリボフラビンと合わせても、病原体を不活化するのに極めて有効である。
（ＵＶ照射単独）
光反応性化合物の存在下におけるＵＶ照射に加え、感染因子は、ＵＶ照射単独でも不活化することができる。好ましい実施形態では、放射は、波長が、約１８０〜３２０ｎｍ、または約２２５〜２９０ｎｍ、または約２５４ｎｍ（すなわち、ポリヌクレオチドの高い吸光度ピークを有し、タンパク質吸収は低いスペクトル領域）であるＵＶ−Ｃ放射である。ＵＶ−Ｃ放射は、エンベロープを形成する脂質二重層、また、エンベロープ内のタンパク質など、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰの成分に対して、安定性および免疫原性の両面で有害性が低い一方で、感染因子を不活化するのに十分なエネルギーを保持するので好ましい。しかし、例えば、ＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂなど、他の種類のＵＶ放射もまた用いることができる。
（ガンマ照射）
本明細書で開示される方法を実施して組成物を作製するには、ガンマ照射（すなわち、イオン化放射）もまた用いることができる。この好ましい実施形態では、１０〜６０ｋＧｙのガンマ照射線量が、病原体の不活化に有効である。ガンマ照射は、感染因子のゲノムをコードするポリヌクレオチド内において鎖の切断を導入することにより、感染因子を直接的に不活化することもでき、または、該ポリヌクレオチドを攻撃するフリーラジカルを生成することにより、感染因子を間接的に不活化することもできる。ガンマ照射と共にフリーラジカルスカベンジャー（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｅｒ）および低温を用い、ラジカルを介してエンベロープＶＬＰの脂質成分およびタンパク質成分にもたらされる損傷を抑制することができる。
（エンベロープウイルスベースのＶＬＰを用いる好ましい方法）
（処方物）
本明細書で記載されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰの好ましい使用は、ワクチン調製物としての使用である。典型的に、このようなワクチンは、液体溶液または懸濁物の注射剤として調製されるが、注射前に液体中に溶解させるか、または懸濁させるのに適する固体形態もまた調製することができる。このような調製物はまた、乳化させることもでき、乾燥粉末として作製することもできる。免疫原性の有効成分は、薬学的に許容され、また、有効成分に適合する、賦形剤と混合することが多い。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなどであり、また、これらの組合せである。加えて、所望の場合、ワクチンは、保湿剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または該ワクチンの有効性を増強するアジュバントなどの補助物質を含有し得る。
ワクチンは、注射、例えば、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）注射、皮内注射、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）注射、または筋肉内注射を介する、従来の非経口投与が可能である。他の投与方式に適する、さらなる処方物には坐剤が含まれ、場合によっては、経口処方物、鼻腔内処方物、口腔内処方物、舌下処方物、腹腔内処方物、膣内処方物、経肛門処方物、および頭蓋内処方物も含まれる。坐剤の場合、従来の結合剤およびキャリアには、例えば、ポリアルキレングリコール（ｐｏｌｙａｌｋａｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）またはトリグリセリドが含まれる場合があり、このような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲で有効成分を含有する混合物から形成することができる。特定の実施形態では、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物などの低温溶融ワックスをまず溶融させ、本明細書で記載されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰを、例えば、撹拌することにより、均一に分散させる。次いで、溶融した均一の混合物を、好都合なサイズの型に流し込み、冷却して固形化させる。
鼻腔内送達に適する処方物には、液体および乾燥粉末が含まれる。処方物は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、およびキトサンなど、通常用いられる賦形剤を包含する。液体処方物または粉末処方物において、キトサンなどの粘膜付着剤を用いて、粘膜絨毛による、鼻腔内投与された処方物のクリアランスを遅延させることができる。マンニトールおよびスクロースなどの糖を、液体処方物では安定化剤として用いることができ、また、乾燥粉末処方物では安定化剤およびバルキング剤として用いることができる。加えて、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）などのアジュバントを、液体処方物および乾燥粉末処方物の両方において、免疫刺激性アジュバントとして用いることもできる。
経口送達に適する処方物には、液体、固体、半固体、ゲル、錠剤、カプセル、ロゼンジなどが含まれる。経口送達に適する処方物には、錠剤、ロゼンジ、カプセル、ゲル、液体、食品、飲料、栄養補助食品などが含まれる。処方物は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど、通常用いられる賦形剤を包含する。他のエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチン組成物は、溶液、懸濁物、丸薬、持続放出処方物、または粉末の形態を取る場合があり、１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％の有効成分を含有する場合がある。経口処方物の場合、コレラ毒素が興味深い処方物パートナー（また、可能な結合パートナー）である。
膣内投与用に処方する場合、エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンは、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、フォーム、またはスプレーの形態であり得る。前出の処方物のうちのいずれもが、エンベロープウイルスベースのＶＬＰに加えて、キャリアなど、当技術分野で適切であることが公知の薬剤を含有し得る。
一部の実施形態では、エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンを、全身送達用に処方する場合もあり、局所送達用に処方する場合もある。このような処方物は、当技術分野において周知である。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウムによる溶液、乳酸加リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養物質補給剤、電解質補給剤（リンゲルデキストロース液に基づく補給剤など）などが含まれる。全身投与経路および局所投与経路には、例えば、皮内経路、局所適用経路、静脈内経路、筋肉内経路などが含まれる。
エンベロープウイルスベースのＶＬＰは、中性処方物または塩ベースの処方物を含めたワクチンへと処方することができる。薬学的に許容される塩には、酸添加塩（ペプチドの遊離アミノ基と共に形成され、また、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される）が含まれる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、また、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来し得る。
ワクチンは、投薬処方物に適合した形で、また、治療的に有効であり免疫原性となる量で投与することができる。投与量は、例えば、個体の免疫系が免疫反応を起こす能力、また、所望される防御の程度を含め、処置される被験体に依存する。適切な用量範囲は、１回のワクチン接種当たりの有効成分が数百マイクログラムのオーダーであり、好ましい範囲は、約０．５μｇ〜１０００μｇの範囲、好ましくは１μｇ〜５００μｇの範囲、またとりわけ、約１０μｇ〜１００μｇの範囲など、約０．１μｇ〜２０００μｇの範囲である（１〜１０ｍｇの範囲にある高量も意図される）ことが好ましい。初回投与および追加投与に適するレジメンもまた可変的であるが、初回投与にその後の接種または他の投与が続く形が典型的である。
適用方式は多様に変化させることができる。従来のワクチン投与方法のうちのいずれもが適用可能である。これらには、固体の生理学的に許容されるベース上における経口適用、または注射など、生理学的に許容される分散剤による非経口適用が含まれる。ワクチンの用量は、投与経路に依存し、ワクチン接種されるヒトの年齢、および抗原処方物により変化する。
ワクチン処方物の一部は、それだけでワクチンとして十分に免疫原性であるが、他の処方物では、該ワクチンがアジュバント物質をさらに包含すると、免疫反応が増強される場合もある。
とりわけ、鼻腔内ベース、経口ベース、または肺内ベースの送達処方物の場合、送達および免疫原性を改善するには、粘膜付着を改善する送達剤もまた用いることができる。このような化合物の１つである、キチンのＮ−脱アセチル化形態であるキトサンは、多くの医薬処方物で用いられる（３２）。粘膜絨毛によるクリアランスを遅延させ、粘膜による抗原の取込みおよびプロセシングのためのより多くの時間を可能にする能力のために、キトサンは、鼻腔内におけるワクチン送達にとって魅力的な粘膜付着剤である（３３、３４）。加えて、それは、接着結合を一過性に開口させ、これにより、ＮＡＬＴへの抗原の経上皮輸送が増強され得る。近年のヒト試験では、キトサンを伴うが、さらなるアジュバントは伴わない、三価の不活化インフルエンザワクチンを鼻腔内投与したところ、筋肉内接種後に得られたセロコンバージョンおよびＨＩ力価をごくわずかに下回るセロコンバージョンおよびＨＩ力価がもたらされた（３３）。
キトサンはまた、遺伝的操作により解毒したＥ． ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンの変異体であるＬＴＫ６３など、鼻腔内において良好に機能するアジュバントと共に処方することもできる。これは、キトサンにより付与される送達および付着の利益の上に、免疫刺激効果を付加し、その結果、粘膜反応および全身反応の増強をもたらす（３５）。
最後に、キトサン処方物はまた、ワクチンの安定性を改善し、粘膜絨毛によるクリアランスにおいて液体処方物を上回る遅延を結果としてもたらすことが示されている乾燥粉末フォーマットでも調製することができることに注意すべきである（４２）。これは、キトサンと共に処方された、鼻腔内用乾燥粉末によるジフテリア毒素ワクチンを伴う、近年のヒト臨床試験において見られ、ここで、鼻腔内経路は、従来の筋肉内経路と同程度に有効であり、分泌性ＩｇＡ反応の利益が付加された（４３）。該ワクチンはまた、忍容性も極めて良好であった。キトサンおよびＭＰＬを含有する炭疽菌用の鼻腔内乾燥粉末ワクチンは、ウサギにおいて、筋肉内接種より強力な反応を誘導し、また、エアゾールによる胞子チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対しても防御的であった（４４）。
鼻腔内ワクチンは、下気道に対してより良好に作用する非経口投与ワクチンに対して、上気道および下気道に作用し得るので、好ましい処方物を表す。これは、アレルゲンベースのワクチンには忍容性を誘導し、また、病原体ベースのワクチンには免疫性を誘導する点で有益であり得る。
鼻腔内ワクチンは、上気道および下気道の両方において防御をもたらすのに加え、針による接種の煩雑さを回避し、また、粒子抗原および／または可溶性抗原が、鼻咽頭関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）と相互作用することを介して、粘膜および全身における体液性反応および細胞性反応の両方を誘導する手段をもたらす（１６〜１９）。歴史的に、鼻腔内経路は、非経口接種ほど有効ではなかったが、新規の送達処方物であるエンベロープウイルスベースのＶＬＰおよびアジュバントを用いることにより、この枠組みが変わりつつある。実際、鼻腔粘膜内にはシアル酸を含有する受容体が豊富であるため、鼻腔内送達には、機能性の赤血球凝集素ポリペプチドを含有するエンベロープウイルスベースのＶＬＰがとりわけよく適する場合があり、その結果、ＨＡ抗原の結合が増強され、粘膜絨毛によるクリアランスが低減される可能性がある。
（アジュバント）
ワクチンに対するアジュバント効果を達成する各種の方法が公知であり、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰと共に用いることができる。一般的な原理および方法は、「Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、１９９５年、Ｄｕｎｃａｎ Ｅ． Ｓ． Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ（編）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、ＩＳＢＮ ０−４７１−９５１７０−６において詳述されており、また、「Ｖａｃｃｉｎｅｓ： Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、１９９５年、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇら（編）、ニューヨーク、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ社、ＩＳＢＮ ０−３０６−４５２８３−９においても詳述されている。
一部の実施形態では、エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンが、重量ベースの比率約１０：１〜約１０１０：１のエンベロープウイルスベースのＶＬＰ：アジュバント、例えば、約１０：１〜約１００：１、約１００：１〜約１０３：１、約１０３：１〜約１０４：１、約１０４：１〜約１０５：１、約１０５：１〜約１０６：１、約１０６：１〜約１０７：１、約１０７：１〜約１０８：１、約１０８：１〜約１０９：１、または約１０９：１〜約１０１０：１のエンベロープウイルスベースのＶＬＰ：アジュバントで、少なくとも１つのアジュバントと混合したエンベロープウイルスベースのＶＬＰを包含する。当業者は、アジュバントに関する情報、また、最適の比率を決定する日常的実験により、適切な比率を容易に決定することができる。
アジュバントの好ましい例は、エンベロープウイルスベースのＶＬＰのポリペプチド成分と共発現させるか、または該ポリペプチド成分と融合させて、キメラポリペプチドを作製することにより、本明細書で記載されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰに容易に添加し得るポリペプチドアジュバントである。鞭毛の主要なタンパク質構成要素である細菌性フラジェリンは、それが、ｔｏｌｌ様受容体であるＴＬＲ５を介する先天性免疫系により認識されるために、アジュバントタンパク質としてますます注目を集めている、好ましいアジュバントである（６５）。ＴＬＲ５を介するフラジェリンシグナル伝達は、ＤＣの成熟化および移動の他、マクロファージ、好中球、および腸上皮細胞の活性化も誘導することにより、先天性免疫機能および後天性免疫機能の両方に影響を及ぼし、その結果、炎症促進（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）メディエーターを生成させる（６６〜７２）。
ＴＬＲ５は、フラジェリン単量体内における保存的構造（これはフラジェリン単量体タンパク質に固有であり、また、鞭毛機能に必要とされる）を認識し、このことは免疫学的圧力に応答したその変異を妨げる（７３）。該受容体は、１００ｆＭの濃度に対して感受性であるが、完全な線維は認識しない。鞭毛が単量体へと解体されることが、結合および刺激に必要とされる。
アジュバントとしてのフラジェリンは、非経口投与または鼻腔内投与された異種抗原に対する防御反応を誘導する強力な活性を有し（６６、７４〜７７）、また、ＤＮＡワクチンに対するアジュバント効果もまた報告されている（７８）。マウスまたはサルにおいてフラジェリンを用いると、Ｔｈ２バイアス（これは、インフルエンザなどの呼吸器ウイルスには適切である）は観察されるが、ＩｇＥ誘導の証拠は観察されていない。加えて、サルにおける鼻腔内投与または全身投与後における、局所炎症反応も全身炎症反応も報告されていない（７４）。ＴＬＲ５を介して、ＭｙＤ８８依存的な形でなされるフラジェリンシグナル伝達、また、ＴＬＲを介する、他のすべてのＭｙＤ８８依存的シグナルは、Ｔｈ１バイアスを結果としてもたらすことが示されている（６７、７９）ため、フラジェリンを使用した後で誘発される反応がＴｈ２特徴を示すことは、ある意味で驚くべきことである。重要なことに、フラジェリンに対して予め存在する抗体は、アジュバントの有効性に対してさほどの影響を及ぼさない（７４）ことから、フラジェリンは、複数回使用のためのアジュバントとして魅力的となっている。
多くの近年における鼻腔内ワクチン試験における共通の主題は、ワクチンの有効性を改善するアジュバントおよび／または送達系の使用である。このような一研究では、遺伝的に解毒されたＥ． ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンアジュバント（ＬＴ Ｒ１９２Ｇ）を含有するインフルエンザＨ３ワクチンが、Ｈ５チャレンジに対する異種サブタイプ的な防御を結果としてもたらしたが、これは、鼻腔内送達後に限られた。防御は、交差中和抗体の誘導に基づき、これにより、新たなワクチンの開発における鼻腔内経路についての重要な示唆が示された（２２）。
サイトカイン、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦなど）；腫瘍壊死因子；インターロイキン２、インターロイキン７、インターロイキン１２、インターフェロン、および他の同様の増殖因子はまた、アジュバントとして用いることができ、これらは
エンベロープウイルスベースのＶＬＰのポリペプチド成分と混合または融合させることにより、該ワクチン内に容易に組み込み得るので、これらもまた好ましい。
一部の実施形態では、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチン組成物が、５’−ＴＣＧ−３’配列を含む、核酸のＴＬＲ９リガンド；イミダゾキノリンのＴＬＲ７リガンド；置換グアニンのＴＬＲ７／８リガンド；ロキソリビン、７−デアザデオキシグアノシン、７−チア−８−オキソデオキシグアノシン、イミキモド（Ｒ−８３７）、およびレシキモド（Ｒ−８４８）など、他のＴＬＲ７リガンドなど、Ｔｏｌｌ様受容体を介して作用する他のアジュバントを包含し得る。
特定のアジュバントは、樹状細胞などのＡＰＣによるワクチン分子の取込みを促進し、これらを活性化する。非限定的な例は、免疫標的化アジュバント；毒素、サイトカイン、およびマイコバクテリア誘導体などの免疫調節アジュバント；油処方物；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫刺激複合体マトリックス（ＩＳＣＯＭマトリックス）；粒子；ＤＤＡ；アルミニウムアジュバント；ＤＮＡアジュバント；ＭＰＬ；および封入アジュバントからなる群より選択される。
アジュバントのさらなる例には、作用物質、例えば、緩衝生理食塩液中０．０５〜０．１パーセントの溶液として一般的に用いられるアルミニウム塩、例えば、水酸化物またはリン酸塩（ミョウバン）（例えば、Ｎｉｃｋｌａｓ（１９９２年）、Ｒｅｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻：４８９〜４９３頁を参照されたい）、０．２５パーセントの溶液として用いられる糖の合成ポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））との混合物、それぞれ、７０℃〜１０１℃の範囲の温度で３０秒間〜２分間にわたる熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集物が含まれ、また、架橋形成剤による凝集物も可能である。ペプシン処理した、アルブミンに対する抗体（Ｆａｂ断片）での再活性化による凝集物、Ｃ． ｐａｒｖｕｍなどの細菌細胞またはグラム陰性菌の内毒素もしくはリポ多糖成分との混合物、モノオレイン酸マンニド（Ａｒａｃｅｌ Ａ）などの生理学的に許容される油ビヒクルにおけるエマルジョン、または保護置換物として用いられる、ペルフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０パーセント溶液によるエマルジョンもまた用いることができる。スクアレンおよびＩＦＡなどの油との混合物もまた好ましい。
ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）は、アジュバントの興味深い候補物質であるが、フロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバントの他、ＱｕｉｌＡおよびＱＳ２１などのキラヤサポニンもまた興味深い。さらなる可能性には、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（登録商標））、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、およびトレオニルムラミルジペプチド（ｔＭＤＰ）など、リポ多糖のポリ［ジ（カルボキシレートフェノキシ）ホスファゼン］（ｐｏｌｙ［ｄｉ（ｅａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）（ＰＣＰＰ）誘導体が含まれる。例えば、アルミニウム塩と併せた、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの組合せを含めた、主にＴｈ１型の反応をもたらすリポ多糖ベースのアジュバントが好ましい。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社から市販されている（例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号；および同第４，９１２，０９４号を参照されたい）。
リポソーム処方物もまた、アジュバント効果を付与することが知られており、したがって、リポソームアジュバントは、エンベロープウイルスベースのＶＬＰと合わされる、好ましい例である。
免疫刺激複合体マトリックス型（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリックス）アジュバントは、とりわけ、この型のアジュバントが、ＡＰＣによるＭＨＣクラスＩＩ発現を上方制御することが可能であることが示されているため、本発明に従う好ましい選択である。ＩＳＣＯＭマトリックスは、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａに由来する（場合によって分画された）サポニン（トリテルペノイド）、コレステロール、およびリン脂質からなる。ＶＬＰ中のものなどの免疫原性タンパク質と混合する場合、結果として得られる粒子状処方物は、サポニンが６０〜７０％ｗ／ｗを構成することが可能であり、コレステロールおよびリン脂質が１０〜１５％ｗ／ｗを構成することが可能であり、タンパク質が１０〜１５％ｗ／ｗを構成することが可能な、ＩＳＣＯＭ粒子として公知の処方物である。免疫刺激複合体の組成および使用に関する詳細は、例えば、アジュバントを扱う上述の教科書中に見出し得るが、また、Ｍｏｒｅｉｎ Ｂら、１９９５年、Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３巻：４６１〜４７５頁の他、Ｂａｒｒ Ｉ ＧおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ Ｇ Ｆ、１９９６年、Ｉｍｍｕｎｏｌ． ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７４巻：８〜２５頁も、完全な免疫刺激複合体を調製するのに有益な教示を提供している。
本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンとアジュバントの組合せにおいて用い得るサポニンには、それらがＩＳＣＯＭ形態にある場合であれ、そうでない場合であれ、米国特許第５，０５７，５４０号；および「Ｓａｐｏｎｉｎｓ ａｓ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｋｅｎｓｉｌ， Ｃ． Ｒ．、Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ、１９９６年、１２巻（１〜２号）：１〜５５頁；およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１で記載される、Ｑｕｉｌ Ａと称する、Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来するサポニン、また、それらの画分が含まれる。Ｑｕｉｌ Ａの特に好ましい画分は、ＱＳ２１、ＱＳ７、およびＱＳ１７である。
β−エスシンは、本発明のアジュバント組成物中で用いるのに好ましい、別の溶血性サポニンである。エスシンは、「メルクインデックス」（第１２版：エントリー３７３７）において、ラテン名： Ａｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍであるトチノキの種子内で発生するサポニンの混合物として記載されている。クロマトグラフィーおよび精製（Ｆｉｅｄｌｅｒ、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈ．、４巻、２１３頁（１９５３年））による、また、イオン交換樹脂（Ｅｒｂｒｉｎｇら、米国特許第３，２３８，１９０号）によるその単離が記載されている。エスシンの画分は精製されており、生物学的に活性であることが示されている（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｍら（Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ（東京）、１９９６年８月、４４巻（８号）：１４５４〜１４６４頁））。β−エスシン（ｅｓｃｉｎ）はまた、エスシン（ａｅｓｃｉｎ）としても公知である。
本発明において用いるのに好ましい別の溶血性サポニンは、ジギトニンである。ジギトニンは、「メルクインデックス」（第１２版：エントリー３２０４）において、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａの種子に由来し、また、Ｇｉｓｖｏｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｐｈａｒｍ．Ａｓｓｏｃ．、１９３４年、２３巻、６６４頁；およびＲｕｈｅｎｓｔｒｏｔｈ−Ｂａｕｅｒ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９５５年、３０１巻、６２１頁において記載される手順により精製されるサポニンとして記載されている。その使用は、コレステロールを判定するための臨床試薬として記載されている。
アジュバント効果を達成する別の興味深い（したがって、好ましい）可能性は、Ｇｏｓｓｅｌｉｎら、１９９２年において記載される技法を用いることである。略述すると、本発明の抗原などの関与抗原の提示は、該抗原を、単球／マクロファージ上におけるＦＣ受容体に対する抗体（または抗原に結合する抗体断片）に結合体化することにより増強することができる。とりわけ、抗原と抗ＦＣＲＩとの結合体は、ワクチン接種のための免疫原性を増強することが示されている。該抗体は、生成後において、または生成の一部として（エンベロープウイルスベースのＶＬＰのポリペプチド成分のうちのいずれか１つに対する融合体としての発現によることを含む）、エンベロープウイルスベースのＶＬＰに結合体化することができる。
他の可能性は、標的化物質および免疫調節物質（すなわち、サイトカイン）の使用を伴う。加えて、ポリＩ：Ｃなど、合成のサイトカイン誘導物質もまた用いることができる。
適切なマイコバクテリア誘導体は、ムラミルジペプチド、フロイントの完全アジュバント、ＲＩＢＩ（モンタナ州、ハミルトン、ＲｉＢｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅｒｃｈ社製）、ならびに、ＴＤＭおよびＴＤＥなど、トレハロースのジエステルからなる群より選択することができる。
適切な免疫標的化アジュバントの例には、ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ４０抗体、またはこれらの特異的結合断片（上記の議論を参照されたい）、マンノース、Ｆａｂ断片、ならびにＣＴＬＡ−４が含まれる。
適切なポリマーアジュバントの例には、炭水化物、例えば、デキストラン、ＰＥＧ、デンプン、マンナン、およびマンノース；可塑性ポリマー；ならびにラテックスビーズなどのラテックスが含まれる。
免疫反応を調節するさらに別の興味深い方法は、「仮想リンパ節」（ＶＬＮ）（ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ， Ｉｎｃ．， ３６０ Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． １００１７−６５０１により開発された、特許品の医療デバイス）内に免疫原（場合によって、アジュバント、ならびに薬学的に許容されるキャリアおよびビヒクルと併せて）を組み込むことである。ＶＬＮ（細長型の管状デバイス）は、リンパ節の構造および機能を模倣する。ＶＬＮを皮下に挿入することにより、サイトカインおよびケモカインの急増による無菌的炎症部位が創出される。Ｔ細胞およびＢ細胞の他、ＡＰＣも、迅速に危険シグナルに応答し、炎症部位へと至り、ＶＬＮの多孔性マトリックスの内部に蓄積される。ＶＬＮを用いると、抗原に対する免疫反応を誘発するのに必要とされる抗原用量が低下し、ＶＬＮを用いるワクチン接種により付与される免疫的防御が、Ｒｉｂｉをアジュバントとして用いる従来の免疫化を凌駕することが示されている。この技法は、Ｇｅｌｂｅｒ Ｃら、１９９８年、「Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｂｕｓｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｓｍａｌｌ Ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ Ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｔｈｅ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ」、１９９８年１０月１２〜１５日、カリフォルニア州、アプトス、シースケープリゾート、「Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ， Ｂｏｏｋ ｏｆ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ」において略述されている。
エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンと共に、オリゴヌクレオチドをアジュバントとして用いることができ、少なくとも３つの、またはより好ましくは、少なくとも６つ以上のヌクレオチドにより隔てられた２つ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含有することが好ましい。ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていない）は、主にＴｈ１反応を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８、ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号において記載されている。
このようなオリゴヌクレオチドによるアジュバントは、デオキシヌクレオチドであり得る。好ましい実施形態では、該オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド骨格は、ホスホロジチオエート結合であるか、またはより好ましくは、ホスホロチオエート結合であるが、骨格結合が混合したオリゴヌクレオチドを含め、ホスホジエステル骨格、また、ＰＮＡなど他のヌクレオチド骨格も本発明の範囲内にある。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートオリゴヌクレオチドを作製する方法は、米国特許第５，６６６，１５３、米国特許第５，２７８，３０２号、およびＷ０９５／２６２０４において記載されている。
好ましいオリゴヌクレオチドの例は、以下の配列を有する。配列は、ホスホロチオエート修飾されたヌクレオチド骨格を含有することが好ましい。
代替的な好ましいＣｐＧオリゴヌクレオチドには、これらに対する重要でない欠失または付加を伴う上記の配列が含まれる。アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知である任意の方法（例えば、ＥＰ４６８５２０）により合成することができる。自動合成器を用いてこのようなオリゴヌクレオチドを合成し得ることが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドによるアジュバントは、１０〜５０塩基の長さであり得る。別のアジュバント系は、ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドと、サポニン誘導体との組合せを伴い、特に、ＣｐＧとＱＳ２１との組合せが、ＷＯ００／０９１５９において開示されている。
多くの単相または複相のエマルジョン系が記載されている。エマルジョンが、エンベロープウイルスベースのＶＬＰの構造を破壊しないように、当業者は、エンベロープウイルスベースのＶＬＰと共に用いられるこのようなエマルジョン系を容易に適合させることができる。水中油エマルジョンによるアジュバントは、それ自体で、アジュバント組成物として有用であることが示唆されており（ＥＰＯ３９９８４３Ｂ）、また、水中油エマルジョンと他の活性薬剤との組合せも、ワクチン用のアジュバントとして記載されている（ＷＯ９５／１７２１０；ＷＯ９８／５６４１４；ＷＯ９９／１２５６５；ＷＯ９９／１１２４１）。油中水エマルジョン（米国特許第５，４２２，１０９号；ＥＰ ０４８０９８２Ｂ２）、および水中油中水エマルジョン（米国特許第５，４２４，０６７；ＥＰ０４８０９８１Ｂ）など、他の油エマルジョンによるアジュバントが記載されている。
本明細書で記載されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンと共に用いられる油エマルジョンによるアジュバントは、天然の場合もあり、合成の場合もあり、また、鉱油性の場合もあり、有機油性の場合もある。鉱油および有機油の例は、当業者に容易に明らかである。
任意の水中油組成物が、ヒトへの投与に適するためには、エマルジョン系の油相が、代謝性油を包含することが好ましい。代謝性油という用語の意味は、当技術分野において周知である。代謝性とは、「代謝により変換可能であること」と定義することができる（「Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ」、Ｗ．Ｂ． Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ社、第２５版（１９７４年））。油は、レシピエントに毒性でなく、代謝により変換可能な、任意の植物油、魚油、動物油、または合成油であることが可能である。堅果油（ラッカセイ油など）、種油、穀類油が、植物油の一般的な供給源である。合成油もまた本発明の一部であり、これらには、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）および他の油など、市販の油が含まれ得る。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、サメの肝油中に高量で見出され、また、オリーブ油、コムギ胚種油、コメぬか油、および酵母中に低量で見出される不飽和油であり、本発明で用いるのに特に好ましい油である。スクアレンは、コレステロールの生合成における中間体であるという事実により、代謝性油である（「メルクインデックス」、第１０版、エントリー８６１９）。
特に好ましい油エマルジョンは水中油エマルジョンであり、特に、水中スクアレンエマルジョンである。
加えて、本発明の最も好ましい油エマルジョンによるアジュバントには、抗酸化剤が含まれ、油であるα−トコフェロール（ビタミンＥ；ＥＰ０３８２２７１Ｂ１）が好ましい。
ＷＯ９５／１７２１０およびＷＯ９９／１１２４１は、場合によって、免疫刺激剤であるＱＳ２１および／または３Ｄ−ＭＰＬと共に処方される、スクアレン、α−トコフェロール、ＴＷＥＥＮ ８０に基づくエマルジョンアジュバントを開示している。ＷＯ９９／１２５６５は、油相へのステロールの添加による、これらのスクアレンエマルジョンに対する改善を開示している。加えて、エマルジョンを安定化させるために、トリカプリリン（Ｃ２７Ｈ５０Ｏ６）などのトリグリセリドを、油相へと添加することもできる（ＷＯ９８／５６４１４）。
安定的な水中油エマルジョン中で見出される油滴のサイズは、光子相関分光分析により測定したときに、１ミクロン未満であることが好ましく、実質的に３０〜６００ｎｍの範囲内、好ましくは、実質的に直径約３０〜５００ｎｍ、また、最も好ましくは、実質的に直径１５０〜５００ｎｍ、また、特に直径約１５０ｎｍであり得る。この点で、油滴数の８０％が好ましい範囲内にあるべきであり、より好ましくは油滴数の９０％超、また、最も好ましくは油滴数の９５％超が規定のサイズ範囲内にある。本発明の油エマルジョン中に存在する成分の量は、従来、スクアレンなどの油が２〜１０％の範囲内であり；また、存在する場合、アルファトコフェロールが２〜１０％であり、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの界面活性剤が０．３〜３％である。油：アルファトコフェロールの比率は、より安定的なエマルジョンがもたらされるため、１以下であることが好ましい。Ｓｐａｎ ８５もまた、約１％のレベルで存在し得る。一部の場合には、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンが、安定化剤をさらに含有することが有利であり得る。
水中油エマルジョンを作製する方法は、当業者に周知である。一般に、該方法は、油相を、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液などの界面活性剤と混合し、その後、ホモジナイザーを用いるホモジナイゼーションを行うステップを包含するが、該混合物に、シリンジ針内を２回流過させるステップを含む方法が、少量の液体をホモジナイズするのには適切であることが、当業者には明らかである。同様に、当業者は、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍ１１０Ｓ型マイクロ流体作製器；最大入力圧６バールで２分間にわたり、最大５０回の流過（約８５０バールの出力圧））において乳化過程を適合させることで、より少量または多量のエマルジョンを作製することができる。この適合は、必要とされる直径の油滴を有する調製物が達成されるまでの、結果として得られるエマルジョンの測定を含む日常的な実験により達成し得る。
本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰによるワクチン調製物は、該ワクチンを、鼻腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、静脈内投与、または皮下投与を介して投与することにより、ウイルス感染を受けやすいか、またはこれを患う、哺乳動物または鳥類を保護または処置するのに用いることができる。ワクチン調製物を全身投与する方法には、従来のシリンジおよび針、または固体ワクチンを弾道送達（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）するためにデザインされたデバイス（ＷＯ９９／２７９６１）、または針なしの高圧液体ジェットデバイス（米国特許第４，５９６，５５６号；米国特許第５，９９３，４１２号）、または経皮パッチ（ＷＯ９７／４８４４０；ＷＯ９８／２８０３７）が含まれ得る。エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンはまた、皮膚に適用することもできる（経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）送達；ＷＯ９８／２０７３４；ＷＯ９８／２８０３７）。したがって、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンは、エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンまたはアジュバント組成物を予め充填した全身投与用の送達デバイスを包含する。したがって、個体、好ましくは哺乳動物または鳥類において免疫反応を誘導する方法であって、本明細書で記載されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰ組成物のうちのいずれかを含み、また、場合によって、アジュバントおよび／またはキャリアを包含するワクチンを該個体へと投与するステップを含み、該ワクチンが、非経口経路または全身経路により投与される方法が提供される。
本発明のワクチン調製物は、該ワクチンを、経口／経消化管経路、または経鼻経路などの粘膜経路を介して投与することにより、ウイルス感染を受けやすいか、またはこれを患う、哺乳動物または鳥類を保護または処置するのに用い得ることが好ましい。代替的な粘膜経路は、膣内経路および直腸内経路である。好ましい経粘膜経路投与は、経鼻経路を介し、鼻腔内ワクチン接種と称する。免疫化される個体の鼻咽頭内へと、ワクチンの液滴形態、スプレー形態、または乾燥粉末形態を投与することを含め、鼻腔内ワクチン接種の方法は、当技術分野において周知である。したがって、噴霧化またはエアゾール化されたワクチン処方物が、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンの好ましい形態である。経口投与用の胃液耐性のカプセルおよび顆粒などの腸溶処方物、直腸内投与または膣内投与用の坐剤もまた、本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンの処方物である。
本明細書で開示される、好ましいエンベロープウイルスベースのＶＬＰによるワクチン組成物は、経粘膜ワクチン接種により全身ワクチン接種を代替するヒトにおける適用に適する経粘膜ワクチンのクラスの一例である。
エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンはまた、経口経路を介して投与することもできる。このような場合、薬学的に許容される賦形剤にはまた、アルカリ性緩衝液、または腸溶性のカプセルもしくはマイクロ顆粒も含まれ得る。エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンはまた、膣内経路によっても投与することができる。このような場合、薬学的に許容される賦形剤には、乳化剤、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）などのポリマー、また、膣内クリームおよび膣内坐剤の他の公知の安定化剤も含まれ得る。エンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンはまた、直腸内経路によっても投与することができる。このような場合、賦形剤には、直腸内坐剤を形成するために当技術分野で公知のワックスおよびポリマーも含まれ得る。
代替的に、エンベロープウイルスベースのＶＬＰによるワクチン処方物は、キトサン（上記で記載した）または他のポリカチオンポリマー、ポリラクチド粒子およびポリラクチド−コグリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、多糖または化学修飾した多糖からなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子などからなるワクチンビヒクルと組み合わせることができる。サポニンはまた、コレステロールの存在下において処方して、リポソームまたはＩＳＣＯＭなどの粒子構造を形成することもできる。さらに、サポニンは、非粒子状の溶液もしくは懸濁物中、または小ラメラ（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌａｒ）リポソームもしくはＩＳＣＯＭなどの粒子状構造内において、ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステルと併せて処方することもできる。
本明細書で記載されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰを用いる医薬組成物およびワクチン組成物中で用いられる、さらなる例示的なアジュバントには、ＳＡＦ（米国、カリフォルニア州、Ｃｈｉｒｏｎ社製）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ社製、例えば、Ｇｒａｎｏｆｆら（１９９７年）、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．、６５巻（５号）：１７１０〜１７１５頁を参照されたい）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳＢ−ＡＳ２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ社製のアジュバントシステム♯２；ＭＰＬおよびＱＳ２１を含有する水中油エマルジョン）；ＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ社製のアジュバントシステム♯４；ミョウバンおよびＭＰＬを含有する）、ベルギー、リクセンサルト、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ社から市販されている）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社製）、ＲＣ−５１２、ＲＣ−５２２、ＲＣ−５２７、ＲＣ−５２９、ＲＣ−５４４、およびＲＣ−５６０（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社製）、ならびに、係属中の米国特許出願第０８／８５３，８２６号、および同第０９／０７４，７２０号において記載されるものなどの、他のアミノアルキルグルコサミド４−ホスフェート（ＡＧＰ）が含まれる。
アジュバントの他の例には、ＨｕｎｔｅｒによるＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバント（ジョージア州、ノークロス、ＣｙｔＲｘ社製）；Ｇｅｒｂｕアジュバント（ドイツ、ガイベルク、Ｇｅｒｂｕ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ社製）；ニトロセルロース（ＮｉｌｓｓｏｎおよびＬａｒｓｓｏｎ（１９９２年）、Ｒｅｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４３巻：５５３〜５５７頁）；Ｓｅｐｐｉｃ ＩＳＡシリーズのＭｏｎｔａｍｉｄｅアジュバント（例えば、ＩＳＡ−５１、ＩＳＡ−５７、ＩＳＡ−７２０、ＩＳＡ−１５１など；フランス、パリ、Ｓｅｐｐｉｃ社製）など、鉱油エマルジョン、非鉱油エマルジョン、油中水エマルジョン、または水中油エマルジョンを含めたミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）エマルジョンベースの処方物；およびＰＲＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製）；ＯＭ−１７４（脂質Ａと関連するグルコサミンジサッカリド）； Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属の伸長因子；ＣＲＬ １００５など、ミセルを形成する非イオン性のブロックコポリマー；ならびにＳｙｎｔｅｘアジュバント処方物が含まれるがこれらに限定されない。例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎら（２００１年）、Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ．、１８巻（３号）：６９〜８５頁；および「Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ： Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｄ． Ｏ’Ｈａｇａｎ編（２０００年）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ社を参照されたい。
他の好ましいアジュバントには、一般式
ＨＯ（ＣＨ ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ， （Ｉ）
［式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−−Ｃ（Ｏ）−−であり、ＲはＣ１〜５０アルキル、またはフェニルＣ１〜５０アルキルである］のアジュバント分子が含まれる。
本発明の一実施形態は、一般式（Ｉ）［式中、ｎは１〜５０、好ましくは４〜２４、最も好ましくは９であり；Ｒ成分はＣ１〜５０、好ましくはＣ４〜Ｃ２０アルキル、また最も好ましくはＣ１２アルキルであり；また、Ａは結合である］のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン処方物からなる。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、また最も好ましくは０．１〜１％の範囲であるべきである。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−９−ｓｔｅｏｒｙｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、「メルクインデックス」（第１２版；エントリー７７１７）で記載されている。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９で記載されている。
所望の場合、上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルを、別のアジュバントと組み合わせることができる。例えば、好ましいアジュバントの組合せは、上で記載したＣｐＧとの組合せであることが好ましい。
本明細書で開示されるエンベロープウイルスベースのＶＬＰワクチンと共に用いるのに適する、薬学的に許容される賦形剤のさらなる例には、水、リン酸緩衝生理食塩液、等張性緩衝液が含まれる。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解される。本明細書で記載される通り、本発明は、天然では脂質ラフトと会合しない抗原に連結した、任意の種類の脂質ラフト会合ポリペプチドを組み込む、キメラエンベロープウイルスベースのＶＬＰを包含する。以下の実施例では、本発明の代表的な実施形態である、インフルエンザ抗原を伴う、キメラエンベロープウイルスベースのＶＬＰが記載される。
（実施例１−インフルエンザ偽型Ｇａｇ ＶＬＰの作製）
ＭＬＶ Ｇａｇ遺伝子ならびに種々のインフルエンザＡサブタイプのＨＡおよびＮＡ遺伝子を、下に記載の通り個々にｐＦａｓｔＢａｃ１バキュロウイルス導入ベクターのポリヘドリンプロモーターの後ろにクローニングした。「三重遺伝子」発現ベクターを構築するために１つのＨＡおよび１つのＮＡベクターの転写単位全体をＳｎａＢ ＩおよびＨｐａ Ｉでの切断によって切り出し、これらの平滑末端断片をＧａｇ遺伝子導入ベクター中のＧａｇ転写単位のいずれかの側の唯一のＳｎａＢ ＩおよびＨｐａ Ｉクローニング部位にそれぞれ導入した。これは、ヘッドトゥーテール（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）様式で配置された３種の別々の転写単位（ＨＡ、Ｇａｇ、ＮＡ）を含有する単一のプラスミドを生じた。次いで種々のインフルエンザＡサブタイプを示すｐＦＢ−ＨＡ−ｐＧａｇ−ｐＮＡ３重導入ベクターをキット製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって記載された通りバキュロウイルスゲノムへの組み換えのためにＤＨ１０Ｂａｃ細胞中に形質転換した。
（ＭＬＶ ＧａｇならびにインフルエンザＨＡおよびＮＡ遺伝子）
マウス白血病ウイルスのＧａｇ遺伝子はプラスミドｐＡＭＳ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から以下のプライマー：５’ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＣ３’（配列番号６）および５’ＣＴＡＣＴＡＧＴＣＡＴＣＴＡＧＧＧＴＣＡＧＧＡＧ３’（配列番号７）を使用するＰＣＲによって得た。最初のプライマーの５’末端のＣＡＣＣ伸長は、Ｇａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるベクターｐＥＮＴＲ Ｄ−ＴＯＰＯへの一方向性の挿入を促進し、プラスミドｐＥＮＴＲ−Ｇａｇを生じる。Ｇａｇコード配列をＤＮＡ配列決定によって確認し、次いでｐＦａｓｔｂａｃ１に以下の通り導入した：ｐＥＮＴＲ−ＧａｇをＡｓｃ Ｉで切断し、末端をＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼでの処理によって平滑化し、その後ＤＮＡをＮｏｔ Ｉで切断した。最初にｐＦａｓｔｂａｃ１をＳｐｈ Ｉで切断し、末端を平滑化し、次いでＮｏｔ Ｉで切断した後に、得られたＧａｇ断片をｐＦａｓｔｂａｃ１ベクターＤＮＡにライゲーションした。
インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８（Ｈ３Ｎ２）のＨＡおよびＮＡ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲによってクローニングした。ウイルスＲＮＡをＱＩＡｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して卵培養ウイルスから調製し、第１鎖ｃＤＮＡ反応をＡｃｃｕｓｃｒｉｐｔ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して実施した。第１鎖ｃＤＮＡ合成に続いて、ＨＡおよびＮＡ断片を増幅するために標準的ＰＣＲ反応を使用した。ＰＲ／８ Ｈ１遺伝子のためのプライマーは以下の通り：５’ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＧＣＡＡＡＣＣＴＡＣＴＧＧＴＣＣ３’（配列番号８）および５’ＴＣＡＧＡＴＧＣＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＣＴＧＣ３’（配列番号９）。ＰＲ／８ Ｎ１遺伝子のためのプライマーは以下の通り：５’ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＣＣＡＴＴＣＣ３’（配列番号１０）および５’ＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＣ３’（配列番号１１）。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８ Ｈ３遺伝子のためのプライマーは以下の通り：５’ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＴＴＴＧＡＧＣ３’（配列番号１２）および５’ＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＣＡＣＣＴＡＡＴＧＴＴＧＣＣ３’（配列番号１３）。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８ Ｎ２遺伝子のためのプライマーは以下の通り：５’ＡＴＡＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＡＴＡＡＣＡＡＴＴＧＧＣ３’（配列番号１４）および５’ＡＴＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧＧＣＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡＴＧＴＴＣＧＣ３’（配列番号１５）。Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のＨＡおよびＮＡ遺伝子ならびにＡ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８（Ｈ３Ｎ２）のＨＡ遺伝子を最初にｐＥＮＴＲ Ｄ−ＴＯＰＯにクローニングし、配列決定によって確認し、次いで上に記載の通りｐＦａｓｔｂａｃ１に導入した。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８（Ｈ３Ｎ２）のＮＡ遺伝子をＡｓｃＩおよびＮｏｔ ＩでＰＣＲ断片末端を整えた後にＢｓｓＨＩＩ−ＮｏｔＩ切断ｐＦａｓｔｂａｃ１に直接クローニングした。候補クローンを配列決定によって確認した。
Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５のＨ５およびＮ１遺伝子を含有しているプラスミドクローンはＤｒ．Ｒｕｂｅｎ Ｄｏｎｉｓ（Ｂｒａｎｃｈ Ｃｈｉｅｆ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、ＣＤＣ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ ＵＳＡ）から得た。Ｈ５クローンは、成熟切断部位に多塩基領域の欠失を含んでいた。提供されたプラスミドを配列確認用のｐＥＮＴＲ Ｄ−ＴＯＰＯへの挿入のための「Ｖｉｅｔｎａｍ」および「Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ」Ｈ５およびＮ１ ＰＣＲ断片を作製するための鋳型として使用した。Ｈ５プライマーは、以下の通り：５’ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣ３’（配列番号１６）および５’ＴＴＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＡＴＴＧＴＡＡＣＧ３’（配列番号１７）。Ｎ１プライマーは以下の通り：５’ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＡＧＡＡＧＡＴＡＡＴＡＡＣＣ３’（配列番号１８）および５’ＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＧＴＧＡＡＴＧＧＣ３’（配列番号１９）。配列確認後、個々のＨ５およびＮ１遺伝子は、上に記載の通りｐＦａｓｔｂａｃ１に導入した。
Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）のＨＡおよびＮＡ遺伝子をＲＴ−ＰＣＲによって上に記載の通りウイルスＲＮＡからクローニングした。Ｈ３遺伝子のためのプライマーは以下の通り：５’ＡＴＡＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＣＴＡＴＣＡＴＴＧＣＴＴＴＧＡＧＣ３’（配列番号２０）および５’ＡＴＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＣＡＣＣＴＡＡＴＧＴＴＧＣＣ３’（配列番号２１）。Ｎ２遺伝子のためのプライマーは以下の通り：５’ＡＴＡＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＴＡＡＴＡＡＣＧＡＴＴＧＧＣ３’（配列番号２２）および５’ＡＴＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＡＴＡＧＧＣＡＴＧＡＧＡＴＴＧＡＴＧＴＣＣＧ３’（配列番号２３）。Ｈ３およびＮ２遺伝子断片をそれぞれＡｓｃＩおよびＮｏｔＩで整え、ＢｓｓＨＩＩ−ＮｏｔＩ切断ｐＦａｓｔｂａｃ１にクローニングした。
Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６のＨ１およびＮ１遺伝子をコードするカスタム合成遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）から得て、昆虫細胞での発現のためにコドンを最適化した。各断片は、ＮｏｔＩ−ＫｐｎＩ−切断ｐＦａｓｔｂａｃ１への直接クローニング用にＮｏｔＩおよびＫｐｎＩ部位を５’および３’末端にそれぞれ含有した。
組換えＤＮＡの使用を含む作業の実施において、研究者らは組換えＤＮＡ分子に関与する研究のためのガイドラインを遵守した；注、Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ、１９９４年７月５日、第５９巻、第１２７号。
（ＶＬＰの精製）
昆虫細胞Ｓｆ９をＳＦ９００−ＩＩ培地で培養し、１ｍｌあたり細胞５×１０５個で２００ｍｌスピナーフラスコに播種した。細胞を２７℃で１ｍｌあたり細胞２×１０６個の密度まで培養し、その時点でＶＬＰコード組換えバキュロウイルスの第２継代接種材料をおよそ０．１から１．０の感染多重度で加えた。細胞生存率が２０％またはそれより低くまで低下したときに培養液を回収した。培地を２，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離することによって細胞細片を除去し、その後３２ｍｌ一定分量をトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ｐＨ７．４中の３０％ショ糖のクッション４ｍｌ上に重層した。ＶＬＰをショ糖クッションによって２５，０００ｒｐｍ、１時間、１０℃でＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ２８ローター（１００，０００×ｇ）で遠心分離した。培地２００ｍｌ由来のＶＬＰを合計６ｍｌのＴＢＳに再懸濁し、次いで単一の２０〜６０％不連続ショ糖勾配に重層し、２５，０００ｒｐｍ、１時間、１０℃で遠心分離した。ショ糖勾配を底から１．５ｍｌ画分へと分取し、赤血球凝集アッセイおよびノイラミニダーゼアッセイ（下を参照されたい）ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析した。ショ糖勾配精製したＶＬＰをショ糖存在下、４℃で保存し、少なくとも６カ月間安定（ＨＡ活性に関して）であることを見出した。ＶＬＰを播種の前にショ糖溶液から遠心分離し、トリス緩衝生理食塩水に再懸濁した。本明細書において報告する動物実験に利用したＶＬＰワクチンは凍結されていないが、しかしＨ１Ｎ１ ＶＬＰの少なくとも１回の凍結融解をＨＡ活性の測定可能な損失を伴わずに実施できることが測定された。
（赤血球凝集アッセイ）
赤血球凝集アッセイを０．５％ヒヨコ赤血球を使用して、動物インフルエンザ診断および調査についてのＷＨＯ手順書（ＷＨＯ Ｍａｎｕａｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）に記載の通り実施した［４１］。
（ノイラミニダーゼアッセイ）
ノイラミニダーゼ活性を蛍光基質２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＭＵＮ）を使用してＶＬＰ調製物およびショ糖勾配画分中で検出した。ＰＢＳ中のＶＬＰ含有試料の漸増希釈物（５０μｌ）を黒色平底９６ウエルプレートに入れ、ＰＢＳ ５０μｌを各試料ウエルに添加した。ＮＡ活性を３５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．５、４ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３００μＭ ＭＵＮの５０μｌの添加によって検出した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いで８３％エタノール中０．１４Ｎ ＮａＯＨの１ウエルあたり１００μｌでの添加によって停止させた。プレートを励起波長および発光波長それぞれ３６５ｎｍおよび４５５ｎｍを使用して蛍光光度計で読み取った。すべての蛍光データは、基質を含有しているがＶＬＰを含有していない対照ウエルから得たバックグラウンド値に対して補正した。補正した蛍光値を次いでアッセイの線形範囲にあるデータ点を決定するために希釈係数で割った。
Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を示すＨＡ−Ｇａｇ−ＮＡ ＶＬＰを上に記載の「三重遺伝子」組換えバキュロウイルスを感染させたＳｆ９細胞の培地から不連続ショ糖密度勾配での遠心分離によって精製した。赤血球凝集アッセイによる勾配画分の分析は、勾配の中央の顕著な可視バンドに関連したＨＡ活性の強いピーク（図１Ａ）を明らかにした。このピークは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の顕著な６５ｋｄ産物とも一致があり、ＧａｇおよびＨＡの共移動（図１Ｂ）、ならびにＨＡおよびＮＡについてのウェスタンブロットシグナル（図１Ｃ）と一致した。最後に電子顕微鏡によるピーク画分の直接分析は、出芽エンジンとしてのレトロウイルスＧａｇタンパク質の使用から予測される通りインフルエンザよりもガンマレトロウイルスを連想させる多量の１００ｎｍ球状粒子を示した（図１Ｄ）。これらの粒子はインフルエンザウイルスおよびインフルエンザマトリックスベースのＶＬＰとは形態学的に異なると考えられる一方で、プールしたピーク画分での赤血球凝集活性が、勾配精製した卵培養Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスについて観察されたものと同様である総ＶＬＰタンパク質１ｍｇ当たり２〜３×１０５ＨＡ単位の範囲内で測定され、これらの粒子への機能的ＨＡスパイクの顕著な組み込みを実証していることに注目することは重要である。
ＰＲ／８ Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰ中のＧａｇ対ＨＡの比は、Ｇａｇより遅く移動する改変ＨＡ産物を作製するようにＨＡコード配列がそのアミノ末端で伸長された改変ＰＲ／８ Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰ発現ベクターを使用しておよそ３〜４：１と測定された（図１Ｅ）。ＰＲ／８ Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰに関しておよそ３〜４：１のＧａｇ対ＨＡの比は、本発明者らが作製し、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）およびＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４などの現在のヒトインフルエンザ株を示す他のＶＬＰと一致している。これら後者のＶＬＰは、ＳＤＳゲル上でＧａｇよりも天然で遅い移動度を示すＨＡ分子を含有し、同様に３〜４：１のＧａｇ対ＨＡの比を示す（図１Ｆ、Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｉｓｌａｎｄｓ Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰ）。
ＨＡに加えて、顕著なノイラミニダーゼ生物活性もショ糖勾配でのＶＬＰピークにおいて見出されており、これらのデータをＨ５Ｎ１ ＶＬＰについて図２に示す。Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０４／２００４およびＡ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５株を示すＨ５Ｎ１ ＶＬＰを、上に記載のＶＬＰと同様のやり方で同様の収率および赤血球凝集特異的活性を伴って作製した。ＮＡ活性が、ＨＡ活性ピークの重い側にしばしば観察されるＨＡ活性の肩と重なって勾配中深くに広がる傾向があることに注目することは興味深い。このパターンは、今日までに検査したすべてのサブタイプ（Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１）について観察されており、ＶＬＰ集団におけるＨＡ：ＮＡ比が連続的である可能性と一致している（実施例７を参照されたい）。
（実施例２−マウスにおけるＨ１Ｎ１ ＶＬＰ 免疫原性および防御）
実施例２は、Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰでのマウスの免疫化を実証する。
（マウス免疫化およびチャレンジ）
６〜８週齢、雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスをＨＡおよそ０．７〜１．０μｇを含有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中のＶＬＰ処方物で腹腔内接種（１００μｌ）または筋肉内接種（３０μｌ）を用いて免疫化した。初期実験において、モノホスホリルリピドＡ（解毒化脂質Ａ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）２０μｇをアジュバントとして添加した。初回および追加免疫化は、４週間間隔を置いて離し、各免疫化に続いて２週間、側方顔面静脈から血液試料を採取した。免疫化マウスおよび対照マウスをＰＢＳ ５０μｌ中の卵培養Ａ／ＰＲ／８／３４の１０ＬＤ５０で鼻腔内でチャレンジし、体重減少および病的状態について毎日モニターした。瀕死であるかまたは刺激に反応しないことが見出された動物は、ＣＯ２吸入で安楽死させた。動物を使用する研究を実施する際に研究者らは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌの実験動物資源局（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）の実験動物の管理と使用に関する委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）によって作成された「実験動物の管理と使用のための指針」を遵守した［４０］。
（赤血球凝集抑制アッセイ）
赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）アッセイは、０．５％ヒヨコ赤血球を使用して動物インフルエンザ診断および調査についてのＷＨＯ手順書に記載の通り実施した［４１］。Ｈ５Ｎ１特異的ＨＡＩアッセイに関して、１．０％ウマ赤血球も使用し、沈降時間を１時間に延ばした。Ｈ５Ｎ１ ＨＡＩアッセイはまた、精製Ｈ５Ｎ１ ＶＬＰも感染性ウイルスの代替の凝集作用物質として使用した（実施例４を参照されたい）。
ショ糖勾配画分中のＰＲ／８ Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰをＨＡ活性に基づいてプールし、ショ糖から沈降させて取り出し、アジュバントとしてのモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を伴うかまたは伴わない腹腔内または筋肉内経路を用いるマウスの免疫化のためにＰＢＳ中に再懸濁した。１群あたり１６匹の動物が、免疫化あたりＨＡおよそ０．７μｇを含有し、４週間隔てた初回および追加免疫化を受け、無処置動物１６匹は対照とした。図３Ａは、追加後２週間の免疫化マウスにおける強いＡ／ＰＲ／８／３４特異的ＨＡＩ活性を示し、これらの応答はほとんどＩｇＧ２ａアイソタイプのものであった（図３Ｂ）。追加後およそ４週間で各群を１０ＬＤ５０のマウス適合Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）でチャレンジした。Ｈ１Ｎ１特異的液性応答から予測される通り、免疫化したすべての動物は病的状態または体重減少の徴候無くＨ１Ｎ１チャレンジを生き残ったが、Ｈ１Ｎ１チャレンジした無処置動物８匹すべては８匹中７匹の死を伴って強い病的状態および体重減少を示した（図３Ｃ）。この初回試験での免疫応答の強さから、腹腔内経路投与をさらなる実験から除外した。
（実施例３−マウスにおけるＨ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１ ＶＬＰ免疫原性）
実施例３は、Ｈ３Ｎ２またはＨ５Ｎ１ ＶＬＰでのマウスの免疫化を実証する。マウスの免疫化およびチャレンジの方法ならびにＨＡＩアッセイの方法は上の実施例２に記載の通り実施した。
（インフルエンザ特異的抗体ＥＬＩＳＡ）
卵培養インフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／Ａｉｃｈｉ／６８（Ｈ３Ｎ２））を尿膜腔液から、ＴＢＳ中の３０％ショ糖クッションによってＭＬＳ ５０ローター、３６，０００ＲＰＭ（１００，０００×ｇ）、１時間、１０℃での遠心分離で取り出した。ウイルスペレットをＰＢＳに再懸濁し、タンパク質含有量をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって定量し、１ｍｌあたり５μｇに調整し、平底ＥＬＩＳＡプレートを１ウエルあたり１００μｌ、１晩、４℃でコートするために使用した。翌日プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（ＰＢＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１ウエルあたり３５０μｌで３０分間ブロックした。血清試料をＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＰＢＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で１：５００に希釈して最上列に添加し、各カラムで下がる毎に連続的に３倍希釈し、室温で３時間または４℃で１晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＰＢＳ）中に１：１０００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）１００μｌを各ウエルに添加した。プレートをさらに１．５時間室温でインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、次いでＡＢＴＳ基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１００μｌを各ウエルに添加した。プレートを室温、４５分後に４０５ｎｍで読み取った。ＥＬＩＳＡ力価を、バックグラウンド吸光度値の１．７５倍の吸光度値を生じた最も高い血清希釈の逆数を取ることによって算出した。このカットオフレベルは、すべての無処置血清試料対照からのすべての疑陽性を排除した。
Ｈ５Ｎ１特異的ＥＬＩＳＡを、プレートを組換えＨ５ Ｖｉｅｔｎａｍ抗原（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）またはスプリットＨ５Ｎ１ワクチン処方物１ｍｌあたり３μｇ（Ｄｒ．Ｓａｌｌｙ Ｍｏｓｓｍａｎ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍからの寄贈）でコートした以外は同様に実施した。
また、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ特異的ＥＬＩＳＡを、総ＩｇＧではなくＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａに特異的な２次抗体を使用したこと以外は同様のやり方で実施した。定量のために、特異的２次抗体との反応性についての標準曲線を作成するために一連のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ濃度標準を一連のウエルにコートした。
（結果）
Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／６８（Ｈ３Ｎ２）を示すＶＬＰを実施例１に記載の通り作製した。Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１ ＶＬＰ（ＰＲ／８ Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰと共に）の免疫原性を表１に示す通りマウスの免疫化試験において評価した（ＭＰＬアジュバントの存在下で１用量あたりＨＡおよそ１μｇを含有する筋肉内初回および追加免疫化がすべての動物において強いＨＡＩ活性を誘導した）。興味深いことに、相当な交差クレードＨＡＩ活性がＩｎｄｏｎｅｓｉａ Ｈ５Ｎ１免疫化群とＶｉｅｔｎａｍ Ｈ５Ｎ１免疫化群との間でウマＲＢＣ ＨＡＩアッセイを使用して観察され［４３］、Ｈ５Ｎ１チャレンジに対する顕著な交差クレード防御を誘導する可能性を示唆した。
表２は、この同じ実験（Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ａｉｃｈｉ（Ｈ３Ｎ２）および組換えサブユニットＨ５ ＨＡ抗原（Ｖｉｅｔｎａｍ）への強いサブタイプ特異的応答がそれぞれのワクチンについて観察された）からの抗体応答のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。重要なことにＨ５Ｎ１ ＶＬＰは、共通Ｎ１抗原の理由によって予測される（２つのＮ１抗原は約７０年間のドリフトによって分離されているが（１６．１％のアミノ酸配列相違（アラインメントデータ未記載）））Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）に対する弱いＥＬＩＳＡ活性を誘導した。表２はまた、群２のＨ１Ｎ１ ＶＬＰ免疫化マウスを８週間休ませ、次いでＭＰＬアジュバントと共におよび共にではなくＨ３Ｎ２ ＶＬＰ（初回および追加）で再免疫化した再免疫化実験の結果を示す。重要なことに先行する２回のＨ１Ｎ１ ＶＬＰ免疫化後のＨ３Ｎ２応答は、無処置マウスで誘導されたものと同等であった（群３）。これらのデータは、動物が第２のＶＬＰサブタイプで再免疫化された場合にＧａｇおよび共通昆虫細胞膜抗原などの異なるＶＬＰサブタイプ間で共有する抗原に対する既存の免疫応答が強力なインフルエンザ特異的応答の誘発を抑制しないことを示す。再免疫化データは、ワクチン性能がＭＰＬ添加の有無において同一であったことから観察された免疫応答にＭＰＬアジュバントがほとんど寄与しないことも示す。したがってＭＰＬは続く実験から除いた。
（実施例４−インフルエンザ−偽型ＶＬＰはＨＡＩアッセイにおいて生きているウイルスを代替できる）
表１に示すＨ５Ｎ１ ＨＡＩアッセイは、適切なＨ５Ｎ１ウイルス株を入手できないことから生きているウイルスの代替としてＨ５Ｎ１ ＩｎｄｏｎｅｓｉａおよびＶｉｅｔｎａｍ ＶＬＰを使用して実施した。ＨＡＩアッセイを実施例２に記載の通り実施した。インフルエンザ偽型Ｇａｇ ＶＬＰが、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２サブタイプの両方について図４に示す通りＨＡＩアッセイにおいて生きているウイルスの性能をかなりの程度まで模倣できることに注目することは重要である。この実験においてＨ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ ＶＬＰ免疫化マウス由来の免疫血清を生きているウイルスおよび対応するＶＬＰの両方を使用するＨＡＩアッセイについて検査し、アッセイ方法間で顕著に類似する力価を明らかにした。これらの結果は、ＨＡＩアッセイにおける偽型ＶＬＰとウイルスとの間での同様の性能を実証するだけでなく、生きているインフルエンザウイルスをＨＡ活性および密度（ワクチン性能に関して重要であると考えられる）に関して模倣する偽型ＶＬＰの能力についての追加的証拠を提供する。
（実施例５−フェレットにおける高病原性Ｈ５Ｎ１チャレンジ）
マウスにおけるＶＬＰの免疫原性に基づいて本発明者らは、Ｈ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１ ＶＬＰワクチンを使用して、ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１チャレンジに対して誘導され得る防御の程度を決定するためのフェレットの免疫化およびチャレンジ試験を実施した。
（フェレットワクチン接種およびチャレンジ）
３２匹の雄性フェレット、８〜１６週齢（Ｔｒｉｐｌｅ、Ｆ Ｆａｒｍｓ、Ｓａｙｅｒ、ＰＡ）（現在広まっているインフルエンザウイルスに関して赤血球凝集抑制により血清学的に陰性）を、下に記載のＶＬＰワクチン処方物で０日目および２８日目にワクチン接種した。フェレットＶＬＰワクチンは、生理食塩水中にアジュバントを含まずに処方され、１用量あたりＨＡおよそ５μｇを含有した。血液試料（前大静脈を用いて）を０日目、２８日目および４２日目に採取した。体重測定は、チャレンジの１週間前から研究終了（６３日目）まで通して毎日行った。温度をＩＰＴＴ−３００埋め込み型トランスポンダーをＤＡＳ−７０００携帯型プローブ（ＢｉｏＭｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｅａｆｏｒｔ、ＤＥ）と共に用いて測定した。各免疫化群の８匹のフェレットの内７匹をチャレンジのために無作為選択した。動物を筋肉内注射を用いてテラゾール（Ｔｅｌｅｚｏｌ）（１６ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、ＰＢＳ ０．６ｍｌ中のＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４ウイルスの１０６ＴＣＩＤ５０を鼻腔内に接種した。チャレンジウイルスは、Ｄｒ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｋｌｉｍｏｖ（ＣＤＣ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ、ＵＳＡ）によって提供された。フェレットを体温および体重の変化についてモニターし、疾患の臨床徴候について観察した。神経学的機能障害を示したかまたは瀕死になったフェレットは、安楽死させた。動物実験は、実験動物の管理および使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）［４０］に従って、国際実験動物管理評価公認協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）公認動物機関のＢａｔｔｅｌｌｅ施設内動物管理使用委員会（Ｂａｔｔｅｌｌｅ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の指導の下で実施した。
（フェレット鼻洗浄液中のウイルスの定量）
ウイルス流出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）をチャレンジ後３日目および５日目に麻酔したフェレットから採取した鼻洗浄液中で測定した。合計１ｍｌでの鼻洗浄用に軟性カテーテルを繋いだ１ｍＬシリンジを使用してＰＢＳ ５００μＬで各鼻腔を素早く洗い流した。鼻洗浄液を滅菌標本カップに集め、クライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）に移し、ＴＣＩＤ５０での計数まで−７０℃保存した。鼻洗浄液中のウイルスをメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞での組織培養感染用量中央値（ｍｅｄｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ）によって定量した。ウイルスの連続希釈物をＥＭＥＭ（２ｍＭ グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンで増量）中、９６ウエル形式の細胞単層に５連で入れた。単層を９６時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞変性効果（ＣＰＥ）を示したウエルを陽性と記録し、データをＳｐｅａｒｍａｎ Ｋａｒｂｅｒ法［４２］を使用して分析し、ＴＣＩＤ５０／ｍＬとして報告した。
（マイクロ中和アッセイ）
血清中和抗体を標準的マイクロ中和アッセイを使用して測定した。熱不活化、連続希釈検査血清３００μＬを、ウイルス６００ＴＣＩＤ５０を含有する等量のＥＭＥＭ（２ｍＭ グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンで増量）と混合した。３７℃、１時間のインキュベーションに続いて、各希釈物１００μＬを５連で９６ウエル形式中のＭＤＣＫ細胞に入れた。３７℃、５％ＣＯ２での４日間のインキュベーションに続いて、ＣＰＥを含有するウエルを陰性と記録した。データをＳｐｅａｒｍａｎ Ｋａｒｂｅｒ法を使用して分析し、中和用量中央値（ＮＤ５０）として報告した。
３２匹のフェレットを無作為に４群（１群あたり動物８匹）にし、ｇａｇだけのＶＬＰ、Ｈ１Ｎ１（ＰＲ／８／３４）ＶＬＰ、Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ Ｈ５Ｎ１ ＶＬＰ およびＶｉｅｔｎａｍ Ｈ５Ｎ１ ＶＬＰでそれぞれ免疫化した。ＶＬＰをＭＰＬアジュバントを含まない生理食塩水中に処方し、初回および追加免疫化は、４週間離した。免疫化はＨＡおよそ５μｇを含み、筋肉内に投与した。追加免疫化を施した後、各群の動物８匹の内７匹を無作為に選択し、続くチャレンジのために封じ込め施設に移し、順化させた。図５は、Ｈ１Ｎ１への（図５Ａ、実施例２に記載の通り実施したＨＡＩアッセイ）およびＶｉｅｔｎａｍ Ｈ５Ｎ１への（図５Ｂ、マイクロ中和アッセイ）免疫応答を示す（ここで、強いＨ１Ｎ１およびＨ５Ｎ１特異的免疫応答が単回免疫化に続いてのそれぞれのワクチンによって誘発された）。Ｈ１Ｎ１特異的応答は、追加免疫化後にさらに増大しなかったが、Ｈ５Ｎ１マイクロ中和力価は、２回目の免疫化後にわずかに増大した。驚くべきことに低レベルＨ５Ｎ１中和力価が追加免疫化後にＨ１Ｎ１免疫化動物７匹の内の５匹で検出された。Ｈ５Ｎ１中和活性に加えて、ＩｎｄｏｎｅｓｉａおよびＶｉｅｔｎａｍ株の両方に特異的な強いＨ５Ｎ１ ＨＡＩ活性が、ＩｎｄｏｎｅｓｉａおよびＶｉｅｔｎａｍ ＶＬＰを使用するウマＲＢＣ ＨＡＩアッセイを使用して両方のＨ５Ｎ１ワクチン接種群において検出された。顕著な交差クレードＨＡＩ活性が両方のＨ５Ｎ１ワクチン接種群において検出されたこれらのデータを表３に示す。
追加の２週間後、すべてのフェレットを１０６ ＴＣＩＤ５０のＨＰＡＩ Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）でチャレンジし、体重減少／生存およびウイルス力価データをそれぞれ図６および７に示す。チャレンジ前のＨ５Ｎ１中和力価から予測される通り、すべてのＩｎｄｏｎｅｓｉａおよびＶｉｅｔｎａｍ Ｈ５Ｎ１ ＶＬＰワクチン接種動物が病的状態および体重減少をほとんど示さずにチャレンジを生き残ったが、すべてのＧａｇ ＶＬＰワクチン接種対照は強い病的状態を示し、動物７匹のうち６匹が安楽死を必要とした（図６Ａ）。対照群でのこのレベルの病的状態および生存率（７匹の内１匹）は、この同じ用量のＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）チャレンジウイルスについて以前報告された［４４］ものと類似していた。驚くべきことに、Ｈ１Ｎ１ワクチン接種動物７匹のうち６匹に中程度の病的状態が観察されただけであり、この群のフェレットで実験の生活期間において安楽死を必要としたものは無かった。Ｈ１Ｎ１ワクチン接種群の動物について個々の体重減少データを図６Ｂに示す。Ｈ１Ｎ１ワクチン群の動物１匹（フェレット４４９）は経時的に顕著な体重減少を示したが、食欲不振（持続的な症状であるだけである）を伴なう許容できる敏捷性および活動レベルのため安楽死させなかった。フェレット４４９における体重減少は、コホートの平均重量を減少させ、チャレンジ後７日目以降の高い標準偏差を生じさせた。
生存、活動度および体重減少データは、３および５日目の鼻洗浄液からのチャレンジ後のウイルス単離データと明らかに一致していた（図７ＡおよびＢ）。ここで、Ｈ５Ｎ１ ＶＬＰワクチン接種動物は、チャレンジ後に顕著な病的状態を示さず、チャレンジ後３および５日目の鼻洗浄液中に検出可能なウイルスも示さなかった。対照的にＧａｇ ＶＬＰワクチン接種フェレットにおいて観察された強度の病的状態および死亡率は、同様のチャレンジ用量を受けた無処置動物について以前報告されたのと同様のレベルでの、チャレンジ後３および５日後両日における高いウイルスレベルと関連していた［４４、４５］。Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰワクチン接種フェレットにおいて観察された中程度の病的状態と一致して、チャレンジ後のウイルス力価は、対照群と比較して３日目で減少し、５日目には１匹を除くすべての動物において存在しなかった。５日目に鼻洗浄液ウイルス力価を有したＨ１Ｎ１ワクチン接種動物１匹は、より強い病的状態および体重減少を示したのと同じ動物（４４９）であった。Ｈ１Ｎ１群中の残りの動物６匹におけるウイルスの迅速なクリアランスは、軽減された病的状態およびより少ない体重減少と関連していた。
Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰワクチン接種フェレットにおけるＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１チャレンジに対する部分的な防御に関する機序は公知ではないが、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）とＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）とで共有するＮ１抗原に関連する可能性がある。表２のマウス免疫原性研究は、両方のＨ５Ｎ１ ＶＬＰワクチンによる弱いＨ１Ｎ１ ＥＬＩＳＡ反応性の誘発を実証する（実施例３を参照されたい）。同様に表４は、Ｈ１Ｎ１ワクチンによって誘発された部分的な防御と一致して、Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰワクチンがフェレットにおいて卵培養スプリットＨ５Ｎ１ウイルス調製物に対する弱いＥＬＩＳＡ反応性を誘発したこと示す。これらのＥＬＩＳＡデータは、Ｈ５Ｎ１チャレンジに対するＨ１Ｎ１媒介防御でのＮ１応答の役割を確認するものではないが、それらは、この可能性と一致する。
（実施例６−感染性バキュロウイルスはＶＬＰ免疫原性に寄与しない）
生きているバキュロウイルス粒子が顕著な先天免疫刺激およびアジュバント効果を示すこと［４６〜４８］、およびこれらの特性が、除去または不活化されなければＶＬＰなどの昆虫細胞由来産物の免疫原性において役割を演じ得ることが実証されている。この現象を調査するために本発明者らは、ウイルス、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）を示すＶＬＰを精製するために使用したショ糖密度勾配においてバキュロウイルス粒子の力価を計り、同じ画分中の１ｍｌあたり粒子およそ２×１０１２個のＶＬＰ濃度と比較して１ｍｌあたりおよそ２×１０８ｐｆｕのバキュロウイルス力価を見出した。ＶＬＰ粒子定量はＶＬＰのタンパク質濃度を測定し、推定されるＶＬＰ分子量１．２×１０８ダルトン（ガンマレトロウイルス粒子１個あたりＧａｇの複製物１５００個およびＧａｇ対ＨＡの比４：１に基づく）を使用することによって概算した。バキュロウイルスを超える大過剰量のＶＬＰにも関わらず感染性バキュロウイルスがＶＬＰ調製物中に存在し、免疫原性へのその寄与は調査に重要であった。
（ＶＬＰ調製物中のバキュロウイルスの不活化）
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７（Ｈ３Ｎ２）ＶＬＰ調製物中の感染性バキュロウイルスを、ソラーレン誘導体４’−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルソラーレン塩酸塩（ＡＭＴ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｓ、ＭＯ）存在下で長波長ＵＶ照射によって、またはベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）での処理によって不活化した。ＶＬＰを含有するプールしたショ糖勾配画分をＵＶまたはＢＰＬ処理のいずれかに供し、その後ＶＬＰを不活化溶液から１００，０００×ｇ、トリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中の３０％ショ糖クッションによる１時間、１０℃での遠心分離によって回収した。ＵＶ不活化は１ｍｌあたりＡＭＴ３０μｇの添加によって実施し、ＶＬＰ懸濁物の１ｍｌ一定分量を６ウエル滅菌組織培養プレートの個々のウエルに添加した。培養プレート（蓋なし）を予め長波長照射用に再構成したＣＬ−１０００ＵＶ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（ＵＶＰ、Ｕｐｌａｎｄ、ＣＡ）に置き、３６５ｎｍ照射２．０〜２．５ジュールに、０．２５ジュール毎に穏やかに撹拌しながら供した。ＢＰＬ不活化についてはＢＰＬを最終濃度０．２％で添加し、試料を室温で３時間インキュベートした。
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｈ３Ｎ２ ＶＬＰの３つの調製物を長波長ＵＶ／ソラーレン処理、ベータ−プロピオラクトン処理またはモック不活化にそれぞれ供し、ワクチン調製物をバキュロウイルス感染性について力価測定した。両方の不活化処理は、Ｓｆ９細胞でのエンドポイント力価測定によって測定した通り、ワクチン用量あたり１０個未満の感染性バキュロウイルス粒子まで昆虫細胞感染力の低減をもたらした一方で、モック不活化ＶＬＰ調製物は、ワクチン用量あたり１０５から１０６個の間の感染性バキュロウイルス粒子を含有していた。追加的に、ＵＶ／ソラーレン処理ＶＬＰは、ＨＡ活性の損失を示さなかったが、ＢＰＬ処理ＶＬＰは、ＨＡ抗原の直接アルキル化および／またはＶＬＰの完全性の破壊を示すＨＡ活性の１６〜２０の低下を受けた。上の処理ＶＬＰから調製した筋肉内ワクチン用量は、初回免疫化用にはＨＡおよそ１μｇを、追加免疫化用にはＨＡ ０．５μｇを含有した。表５は、ＵＶ／ソラーレン処理を用いるバキュロウイルス不活化後にＶＬＰ免疫原性の損失が無いことを実証する、３つのワクチン調製物についての免疫原性データを示し、これはＨＡ活性の完全な保持と一致する。これらのデータは、観察された偽型ＶＬＰ免疫原性のために感染性バキュロウイルスの潜在的アジュバント特性が必要ではないことを実証している。対照的にＢＰＬ処理ＶＬＰは、大きく減少した免疫原性を示し、ＢＰＬ処理の結果としてのＨＡ活性における顕著な減少と一致した。
（実施例７−考察）
本発明者らは、マウスおよびフェレットにおいて強い免疫原性および防御を示すキメラインフルエンザＶＬＰの作製のためにＭＬＶ Ｇａｇ遺伝子産物の堅調な粒子出芽特性を使用した。Ｇａｇ媒介粒子出芽は、会合の膜部位へのこれらの分子の標的化を補助する翻訳後ミリスチル化に依存し［３１、３２］、Ｇａｇ媒介粒子出芽がＧａｇとカベオリンとの会合を介して脂質ラフトドメインを通って優先的に生じることの証拠が蓄積している［３３］。この工程は、昆虫細胞および哺乳動物細胞の両方において効率的に生じ、Ｇａｇと組み込まれる抗原の細胞質側末端との間での特異的相互作用を必要することなく出芽粒子への脂質ラフト標的化内在性膜抗原の組み込みを可能にする。インフルエンザに加えて、このＶＬＰプラットフォームは、パラミクソウイルス抗原の組み込みに同様に適用できるはずであり、このことは、複数の呼吸器感染疾患に対するキメラＶＬＰワクチンファミリーの開発を可能にする。
本発明者らは、昆虫細胞におけるキメラ粒子のスケールアップ（ｓｃａｌｉｎｇ ｕｐ）作製、ＨＡおよびＮＡ含有量および生物学的活性についての粒子の特徴付けならびに、強い免疫原性および防御効果を示すマウスおよびフェレットにおける多数のワクチン研究の開始によるインフルエンザＨＡのＧａｇ粒子への組み込みの初期の知見に基づいている。Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１サブタイプを示すキメラインフルエンザＶＬＰは、すべてバキュロウイルス昆虫細胞系において同様の効率で産生され、すべてがウイルスまたはＶＬＰタンパク質１ｍｇあたりのＨＡ単位に関して、ショ糖勾配精製された生きているインフルエンザウイルスで観察されたのと同様の赤血球凝集特異的活性を示した。赤血球凝集抑制アッセイにおいてＶＬＰが、生きているインフルエンザウイルスを容易に代替できるという事実に加えて、これらの観察は、キメラＶＬＰ表面上のＨＡ抗原提示および密度が生きているインフルエンザで見られるものをかなりの程度まで模倣するという説得力のある証拠を提供する。本発明者らは、インフルエンザＡ以外のウイルスに向けたこの系の柔軟性を示すインフルエンザＢウイルス抗原含有ＶＬＰの作製も実証している（データ未記載）。
３種すべての遺伝子（ＨＡ、ＧａｇおよびＮＡ）の１種のバキュロウイルスベクターへの組み込みは、ＶＬＰ作製を大きく簡素化し、産物収量は昆虫細胞における感染多重度に決定的には依存しない。今日までに作製されたすべてのキメラインフルエンザＡ ＶＬＰは、同様の収率およびショ糖勾配バンドパターンを示す。電子顕微鏡によりこれらのＶＬＰは、より多形性である生きているインフルエンザまたはインフルエンザマトリックスベースのＶＬＰ粒子とは著しく異なる均一な１００ｎｍ球状粒子であると考えられる。ＶＬＰサイズのこの均一性は、この技術がヒトでの評価用の臨床グレード材料の作製のためにさらにスケールアップされることから重要である。キメラＶＬＰが大きさにおいて均一である場合、図２に示す通り（ここでは、ＨＡおよびＮＡ活性の両方が単一のショ糖勾配全体で測定される）、ＨＡおよびＮＡの相対的含有量は連続的であると考えられる。Ｇａｇとの予測されない物理的相互作用を伴なう、ＨＡおよびＮＡの脂質ラフト中での標的化および選別は、無作為ではない可能性があり、これは、ＨＡおよびＮＡの相対含有量での多様性を示し得るＶＬＰを生じる。これは、ＨＡおよびＮＡ抗原がＶＬＰの表面上に多様な状況で提示されることで免疫学的利益を有する場合がある。バキュロウイルスｇｐ６４エンベロープ糖タンパク質は脂質ラフトタンパク質ではなく、ＶＬＰ中に顕著な程度にまで蓄積するとは予測されないことに注目することも重要である［４９］。
Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１サブタイプを示すキメラＶＬＰは、マウスおよびフェレットにおいて添加アジュバントの非存在下で強く免疫原性であり、ＨＡＩ、中和およびＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定される通りそれらそれぞれのウイルスに対する強い応答をもたらす。これらの強い応答は、マウスでの相同チャレンジ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）およびフェレットでの交差クレードＨ５Ｎ１チャレンジに対する病的状態についての証拠を示さない強固な防御を生じる。フェレットでのＨ５Ｎ１に対するＨ５Ｎ１交差クレード防御は新たなものではないが、本発明者らが、Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ Ｈ５Ｎ１またはＶｉｅｔｎａｍ Ｈ５Ｎ１をワクチン接種した動物においてＶｉｅｔｎａｍウイルスの標準的１×１０６ＴＣＩＤ５０チャレンジ用量を使用したチャレンジ後の鼻洗浄液中にいかなるウイルスも検出できなかったことは注目に値する。すべての先行するフェレットＨ５Ｎ１ワクチン試験は、ホモサブタイプのＨ５Ｎ１チャレンジ後に上気道における顕著な量のウイルス複製を報告している［４５、５０、５１］。
偽型ＶＬＰ媒介防御の機構の理解は、さらなる研究を必要とするが、ワクチン有効性を示すための有力な要因はこれらのワクチンによって誘発される免疫応答全体の強さである。ＶＬＰの強い免疫原性は、本質的に任意の細胞（抗原提示細胞を含む）への効率的な結合を促進できる（これは増強された抗原提示をもたらす）、ＶＬＰ上の機能性ＨＡスパイクの存在に部分的による可能性がある。細胞結合能力についての証拠は、ヒヨコ赤血球を使用する赤血球凝集アッセイおよび赤血球凝集抑制アッセイの両方において観察されたＶＬＰの強いＨＡ活性である。本発明者らは、種々のサブタイプのＶＬＰを用いてヒトＲＢＣに向けた強いＨＡ活性も実証した（データ未記載）。
ＨＡによって媒介される直接細胞結合能力に加えて、生きているバキュロウイルス粒子は短期間先天免疫を刺激でき、他の抗原と混合された場合にアジュバントとして作用できることが実証されていることから、バキュロウイルスベクター由来ＶＬＰワクチンの免疫原性はバキュロウイルス粒子を混入させることによって増強され得ることが示唆されている［４６〜４８］。バキュロウイルス粒子バンドは、本発明者らの手法においてはショ糖勾配でＶＬＰよりもわずかに低く、プラークアッセイによるバキュロウイルスの定量およびタンパク質濃度によるＶＬＰの定量は、ＶＬＰ調製物においてバキュロウイルスをおよそ４桁超えるＶＬＰの存在量を明らかにした。しかし、本発明者らは本明細書において記載する実験のほとんどにおいて使用したＶＬＰ調製物からバキュロウイルスを除外しなかった。しかし表５は、混入バキュロウイルス粒子を長波長ＵＶ／ソラーレン処理またはベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）処理のいずれかによって不活化したＶＬＰ免疫原性実験の結果を示している。不活化の両方法が核酸を広く標的化する一方で、本発明者らは、ＢＰＬ処理後にＶＬＰ関連ＨＡ活性の顕著な減少を観察したが、ＵＶ／ソラーレン処理後にＨＡ活性の減少は観察しなかった。ワクチン接種後のＨＡＩ力価は、昆虫細胞上での力価測定によって測定されたバキュロウイルス感染性の欠如にもかかわらず、ＵＶ／ソラーレン処理ＶＬＰが無処理ＶＬＰと比較して免疫原性の減少を被らなかったことを明らかにした。したがって混入している生きたバキュロウイルスは、これらのＶＬＰに関連する免疫原性にほとんど影響を有さないと考えられる。興味深いことにＢＬＰ処理ＶＬＰは、ＶＬＰ関連ＨＡ活性の１６〜２０分の１への減少によって明らかである通りおそらくＶＬＰの直接アルキル化によってそれらの免疫原性をほとんど失っている。予測外に、混入バキュロウイルス粒子のＵＶ／ソラーレン不活化は、ＶＬＰ免疫原性に効果を有さず、したがってＶＬＰ作製における不活化の理想的方法である。
ＶＬＰ調製物中の低レベルのバキュロウイルス混入の問題は、ＨＡ偽型バキュロウイルス粒子が、観察されたインフルエンザ特異的免疫原性にどの程度寄与できるかについての追加的疑問を提起した。なぜ可能性が低いのかについては、いくつかの原因がある。第１にバキュロウイルス出芽ビリオン（ＢＶ）の会合および出芽は、脂質ラフトドメインを標的化しない［４９］膜結合バキュロウイルスｇｐ６４に依存する［５４］。第２に、ポリヘドリンプロモーターが活性化するとＢＶ産生は遮断されることから、大部分のＢＶ産生は一時的に大部分のＧａｇ−ＶＬＰ会合から外れると予測され、Ｇａｇ−ＨＡ−ＮＡ ＶＬＰ会合をバキュロウイルス感染周期のかなり遅い段階で駆動する。第３に、ＢＶとＶＬＰとの会合の相対位置および時期に幾分かの重複があると仮定すると、ＢＶおよびＶＬＰの相対量における大きな相違が考慮されなければならない。上に記載の通り本発明者らの算定は、混入しているバキュロウイルス粒子の１０４倍過剰であるＶＬＰを示す。そのような比は、使用された投与量レベルにおいて混入ＨＡ偽型ＢＶがワクチン効果に顕著に寄与する可能性を下げる。
要約すると本発明者らは、ＭＬＶ ｇａｇならびに種々のインフルエンザＡサブタイプ由来のインフルエンザＨＡおよびＮＡからなる偽型ＶＬＰの作製およびマウスおよびフェレットでの防御免疫原性を記載する。これらのＶＬＰは、株にかかわらず迅速かつ一定して産生され、強い免疫原性を示す。ＶＬＰ調製物由来のバキュロウイルス粒子を不活化する２つの異なる方法についての本発明者らの研究は、ＵＶ／ソラーレン処理による不活化がＶＬＰにその完全なレベルの免疫原性を保持させるという驚くべき発見をもたらした。これらのＶＬＰの免疫原性を既存のおよび提案されたインフルエンザワクチンと比較するため実験、ならびにこのプラットフォームの有用性を他の呼吸器ウイルスに拡張するための実験は、進行中である。
（実施例８−ＵＶ−Ａ、ＵＶ−Ｃおよび可視光によるウイルス不活化方法）
以下の実施例において本発明者らは、ＵＶ−Ａ／リボフラビン、ＵＶ−Ｃ照射単独および可視光／リボフラビンによるウイルス不活化の好ましい方法を記載する。ウイルス不活化は、バイオリアクター回収物（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｏｆｆｌｏａｄｓ）、遠心分離または濾過によるバイオリアクター回収後の精製開始材料、中間精製画分（連続流式勾配遠心分離画分、クロマトグラフィー素通り画分またはクロマトグラフィー溶出画分）および／または最終精製産物を含むエンベロープＶＬＰの作製において生成された任意の画分について実施され得る。
ウイルス不活化研究用に、エンベロープＶＬＰ含有試料を適切な放射−透明用具（保存袋またはチューブなど）に入れ、ウイルス不活化をこれだけに限らないが、１）単一のまたは複数の放射源を対象の試料を囲む所定の距離だが任意の配置に置く配置；２）所定の試料流路を提供するためにチューブを任意の商業的に入手できる放射源に繋いだ配置（試料は蠕動ポンプの手段によって流路を流れる）または；３）上に記載の流路をエンペロープＶＬＰ精製のための標準的装置操作の一部として（例えばタンジェンシャルフロー濾過またはクロマトグラフィー分離中、インラインで）物理的に統合した配置が挙げられ得るデバイスを使用して実施した。
ＵＶ−Ａ／リボフラビンを使用する病原体不活化のために、エンベロープＶＬＰ試料をリボフラビン濃度１０〜１００μＭに調整し、２６５〜３７０ｎｍの間の照射波長を使用するエネルギー量０〜５０Ｊ／ｃｍ２に供する。ＵＶ−Ｃを使用する病原体不活化は、ＶＬＰ試料を２５４ｎｍの照射波長を使用するエネルギー量０〜２Ｊ／ｃｍ２で処理することによって実施する。可視光／リボフラビンを使用する病原体不活化のために、エンベロープＶＬＰ試料をリボブラビン濃度１００〜５００μＭに調整し、次いで４００〜５００ｎｍの間の照射波長を使用するエネルギー量０〜５００Ｊ／ｃｍ２に供する。上の研究においてｐＨ、温度および遊離ラジカルスカベンジャーの効果などの試料条件を不活化条件を最適化するために評価する。代表的な試料を種々の量の照射に曝露し、ウイルス不活化（例えばバキュロウイルス不活化）を標準的感染性アッセイによって評価する。エンベロープＶＬＰへの最小の損傷を示すために、分析試験のパネルを処理後のエンベロープＶＬＰの同一性、安定性および免疫原性を示すために実施する。適切なウイルス不活化条件が定められれば、移転可能な製造工程のより代表的である材料のレベルにおいて、選択されたウイルス不活化方法の効果を確実にするために、様々な深度の試料においてスケールアップ研究を実施する。
（実施例９−ガンマ照射によるウイルス不活化方法）
ガンマ照射を使用する病原体不活化のために、エンベロープＶＬＰ試料（液体試料および凍結試料の両方として）に、遊離ラジカルスカベンジャーの存在下または非存在下で照射する。代表的な試料を０から６０ｋＧｙに増大させるエネルギー量に供し、ウイルス不活化（例えばバキュロウイルス不活化）を標準的感染性アッセイによって評価する。エンベロープＶＬＰへの最小の損傷を実証するために、分析試験のパネルを処理後のエンベロープＶＬＰの同一性、安定性および免疫原性を示すために実施する。適切なウイルス不活化条件が定められれば、移転可能な製造工程のより代表的である材料のレベルにおいて、選択されたウイルス不活化方法の効果を確実にするために、様々な深度の試料においてスケールアップ研究を実施する。
（さらなる参考文献）

Claims (47)

  1. ヒト用または動物用のワクチンにおいて許容されるレベルの感染因子を有するエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を単離する方法であって、
    （ａ）前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を作製するのに用いられる宿主細胞、または前記宿主細胞の成分から、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物を分離するステップと、
    （ｂ）前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物に電磁放射を適用して前記調製物中の感染因子を不活化するステップと
    を含み、ステップ（ｂ）の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物は、ステップ（ｂ）の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも５０パーセントの免疫原性を有し、１ｍｌあたりの前記感染単位は、ステップ（ｂ）の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも１０分の１に低下している、方法。
  2. 前記分離するステップ（ａ）が、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー−クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合方式クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、およびサイズ除外クロマトグラフィーからなる群より選択される少なくとも１つのクロマトグラフィーステップを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記分離するステップ（ａ）が、ノーマルフロー濾過、限外濾過、またはタンジェンシャルフロー濾過からなる群より選択される少なくとも１つの濾過ステップを含む、請求項１から２のうちのいずれかに記載の方法。
  4. 前記電磁放射が、可視光、ｘ線放射、紫外線放射、およびガンマ放射からなる群より選択される、請求項１から３のうちのいずれかに記載の方法。
  5. 前記紫外線放射が、ＵＶ−Ａ、ＵＶ−Ｂ、およびＵＶ−Ｃからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記紫外線放射の波長が、３２０ｎｍ〜４００ｎｍである、請求項４から５のうちのいずれかに記載の方法。
  7. 前記宿主細胞が昆虫細胞であり、前記昆虫細胞は、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の少なくとも１つの成分を発現するバキュロウイルス発現ベクターで感染させられる、請求項１から６のうちのいずれかに記載の方法。
  8. 前記宿主細胞が、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ宿主細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ宿主細胞、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ宿主細胞、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ宿主細
    胞、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ宿主細胞、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞、Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ宿主細胞、Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ宿主細胞、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ宿主細胞、Ｍａｌａｃｏｓｔｏｍａ ｄｉｓｓｔｒｉａ宿主細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ宿主細胞、Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ宿主細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ宿主細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａ宿主細胞、およびＨｙａｌｏｐｈｏｒａ
    ｃｅｃｒｏｐｉａ宿主細胞からなる群より選択される、請求項１から７のうちのいずれかに記載の方法。
  9. 前記宿主細胞が哺乳動物細胞であり、前記哺乳動物細胞は、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の少なくとも１つの成分を発現する、アデノウイルス発現ベクター、アデノ関連ウイルス発現ベクター、アルファウイルス発現ベクター、ヘルペスウイルス発現ベクター、ポックスウイルス発現ベクター、またはレトロウイルス発現ベクターで感染させられる、請求項１から６のうちのいずれかに記載の方法。
  10. 前記適用するステップ（ｂ）の前に、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物にＤＮＡインターカレート化合物を添加するステップをさらに含む、請求項１から９のうちのいずれかに記載の方法。
  11. 前記ＤＮＡインターカレート化合物が、光反応性である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ＤＮＡインターカレート化合物が、ソラーレン、イソソラーレン、ならびにこれらの誘導体および類似体からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
  13. （ｃ）前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物にアジュバントを添加するステップをさらに含む、請求項１から１２のうちのいずれかに記載の方法。
  14. 前記分離するステップ（ａ）の前に、（ｉ）ｇａｇポリペプチドと、天然では脂質ラフトと会合しない抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとを併せて発現する、１または複数の発現ベクターを供給するステップと；（ｉｉ）前記１または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと；（ｉｉｉ）前記ｇａｇポリペプチドと、前記抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、前記宿主細胞内において前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する、請求項１から１３のうちのいずれかに記載の方法。
  15. 前記分離するステップ（ａ）の前に、（ｉ）ＲＳウイルスＭポリペプチドと、ＲＳウイルスＦポリペプチドとを発現する、１または複数の発現ベクターを供給するステップと；（ｉｉ）前記１または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと；（ｉｉｉ）前記ＲＳウイルスＭポリペプチドと、前記ＲＳウイルスＦポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、前記宿主細胞内において前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する、請求項１から１３のうちのいずれかに記載の方法。
  16. 前記１または複数の発現ベクターが、ＲＳウイルスＧポリペプチドをさらに発現する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記分離するステップ（ａ）の前に、（ｉ）ｇａｇポリペプチドと、インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドとを併せて発現する、１または複数の発現ベクターを供給するステップと；（ｉｉ）前記１または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと；（ｉｉｉ）前記ｇａｇポリペプチドと、前記インフルエンザ赤血球凝集素ポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、前記宿主細胞内において前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する、請求項１から１３のうちのいずれかに記載の方法。
  18. 前記分離するステップ（ａ）の前に、（ｉ）インフルエンザＭ１ポリペプチドと、赤血球凝集素ポリペプチドとを併せて発現する、１または複数の発現ベクターを供給するステップと；（ｉｉ）前記１または複数の発現ベクターを細胞内へと導入するステップと；（ｉｉｉ）前記インフルエンザＭ１ポリペプチドと、前記赤血球凝集素ポリペプチドとを発現させて、前記ウイルス様粒子を作製するステップとにより、前記宿主細胞内において前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を作製する、請求項１から１３のうちのいずれかに記載の方法。
  19. 前記１または複数の発現ベクターが、ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに発現する、請求項１７から１８のうちのいずれかに記載の方法。
  20. 前記１または複数の発現ベクターが、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびレトロウイルスからなる群より選択される、ウイルスベクターである、請求項１４から１９のうちのいずれかに記載の方法。
  21. ウイルスベクターを用いて、前記宿主細胞内において、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の少なくとも１つの成分を発現させる、請求項１から２０のうちのいずれかに記載の方法。
  22. 前記感染因子が、前記ウイルスベクターを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記調製物が、１ミリリットル当たり２０個未満、１５個未満、１０個未満、８個未満、６個未満または５個未満の感染因子を含む、請求項１から２２のうちのいずれかに記載の方法。
  24. ステップ（ｂ）の後の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、ステップ（ｂ）の前の前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも８５パーセント、少なくとも９０パーセントまたは少なくとも９５パーセントの免疫原性を有する、請求項１から２３のうちのいずれかに記載の方法。
  25. 前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、赤血球凝集素ポリペプチドを含み、前記免疫原性が、赤血球凝集抑制アッセイを用いて測定される、請求項１から２４のうちのいずれかに記載の方法。
  26. 感染因子を含まないエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子を含む、エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物であって、前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、感染因子を含まないわけではないエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子の少なくとも５０パーセントの免疫原性を有する、調製物。
  27. 前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、昆虫または哺乳動物グリコシル化をさらに含む、請求項２６に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  28. 前記昆虫グリコシル化が、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ；Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ；Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ；Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ；Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ；Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ；Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ；Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ；Ｍａｌａｃｏｓｔｏｍａ ｄｉｓｓｔｒｉａ；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ；Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ；Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ；Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａ；およびＨｙａｌｏｐｈｏｒａ ｃｅｃｒｏｐｉａからなる群より選択される、請求項２６または２７に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  29. 前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、
    （ａ）ｇａｇポリペプチドと、
    （ｂ）非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチド、または連結を形成するための抗原に連結した脂質ラフト会合ポリペプチドであって、前記抗原は天然では脂質ラフトと会合しない、ポリペプチドと
    を含む、請求項２６から２８のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  30. 前記非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドが、ＧＰＩアンカーポリペプチド、ミリストイル化配列ポリペプチド、パルミトイル化配列ポリペプチド、二重アセチル化配列ポリペプチド、シグナル伝達ポリペプチド、および膜輸送ポリペプチドからなる群より選択される、請求項２９に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  31. 前記非ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドが、ＧＰＩアンカーポリペプチド、ミリストイル化配列ポリペプチド、パルミトイル化配列ポリペプチド、二重アセチル化配列ポリペプチド、カベオリンポリペプチド、フロチリンポリペプチド、シンタクシン−１ポリペプチド、シンタクシン−４ポリペプチド、シナプシンＩポリペプチド、アデューシンポリペプチド、ＶＡＭＰ２ポリペプチド、ＶＡＭＰ／シナプトブレビンポリペプチド、シナプトブレビンＩＩポリペプチド、ＳＮＡＲＥポリペプチド、ＳＮＡＰ−２５ポリペプチド、ＳＮＡＰ−２３ポリペプチド、シナプトタグミンＩポリペプチド、およびシナプトタグミンＩＩポリペプチドからなる群より選択される、請求項２９に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  32. 前記ウイルス性脂質ラフト会合ポリペプチドが、赤血球凝集素ポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、融合タンパク質ポリペプチド、糖タンパク質ポリペプチド、およびエンベロープタンパク質ポリペプチドからなる群より選択される、請求項２９に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  33. 前記連結が、共有結合、イオン性相互作用、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、金属−配位子相互作用、および抗体−抗原相互作用からなる群より選択される、請求項２９から３２のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  34. 前記脂質ラフト会合ポリペプチドが、内在性膜タンパク質である、請求項２９から３３のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  35. 赤血球凝集素ポリペプチドをさらに含む、請求項２６から３４のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  36. ＲＳウイルスＭポリペプチド、Ｇポリペプチドおよび／またはＦポリペプチドをさらに含む、請求項２６から３５のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  37. 前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、
    （ａ）ｇａｇポリペプチドと、
    （ｂ）赤血球凝集素ポリペプチドと
    を含む、請求項２６から２８のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  38. 前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子が、
    （ａ）インフルエンザＭ１ポリペプチドと、
    （ｂ）赤血球凝集素ポリペプチドと
    を含む、請求項２６から２８のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  39. ノイラミニダーゼポリペプチドをさらに含む、請求項２６から３８に記載のエンベロー
    プウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  40. 前記ウイルス様粒子と会合するアジュバントをさらに含む、請求項２６から３９に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  41. 前記アジュバントを、前記ｇａｇポリペプチドと共有結合させて、共有結合を形成させる、請求項４０に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  42. 前記アジュバントを、前記脂質ラフト会合ポリペプチドと共有結合させて、共有結合を形成させる、請求項４０に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  43. 前記アジュバントが、フラジェリンのアジュバント活性断片を含む、請求項４０から４２のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  44. 免疫系の疾患または症状を処置または予防する方法に使用するための、請求項２６から４３のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物、または請求項１から２５のうちのいずれかに記載の方法を用いて単離したエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  45. 免疫原性量で投与される前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物が、被験体において、防御的免疫化反応を誘導するものであることを特徴とする、請求項４４に記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  46. 前記エンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物の投与が、皮下送達、皮内送達、真皮下送達、筋肉内送達、経口による送達、経口送達、鼻腔内送達、口腔内送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、経肛門送達、および頭蓋内送達からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４４から４５のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物。
  47. 免疫原性量の、請求項２６から４３のうちのいずれかに記載のエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物、または請求項１から２５のうちのいずれかに記載の方法を用いて単離したエンベロープウイルスベースのウイルス様粒子調製物と、薬学的に許容されるキャリアとを含む、医薬組成物。
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